Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

חקירת הפתוגנזה של מוטציית MYH7 Gly823Glu בקרדיומיופתיה היפרטרופית משפחתית באמצעות מודל עכבר

Published: August 8, 2022 doi: 10.3791/63949
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 4, 1,2, 1,2, 1,2, 2,5, 4, 1,2
1Department of Cardiovascular Surgery, Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, 2The Second Clinical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, 3Department of Cardiovascular Surgery, The First Affiliated Hospital, Jinan University, 4Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, 5Department of Anesthesiology, Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

בהתבסס על משפחת הקרדיומיופתיה התורשתית המשפחתית שנמצאה בעבודה הקלינית שלנו, יצרנו מודל עכבר C57BL/6N עם מוטציה נקודתית (G823E) בלוקוס MYH7 של העכבר באמצעות הנדסת גנום בתיווך CRISPR/Cas9 כדי לאמת מוטציה זו.

Abstract

קרדיומיופתיה היפרטרופית משפחתית (HCM, OMIM: 613690) היא הקרדיומיופתיה הנפוצה ביותר בסין. עם זאת, האטיולוגיה הגנטית הבסיסית של HCM נותרה חמקמקה.

בעבר זיהינו גרסה הטרוזיגוטית של גן מיוזין כבד שרשרת 7 (MYH7), NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E), במשפחת האן סינית גדולה עם HCM. במשפחה זו, גרסה G823E cosegregates עם הפרעה אוטוזומלית דומיננטית. גרסה זו ממוקמת בתחום זרוע המנוף של אזור הצוואר של חלבון MYH7 ונשמרת מאוד בקרב מיוסינים ומינים הומולוגיים. כדי לאמת את הפתוגניות של גרסת G823E, ייצרנו מודל עכבר C57BL/6N עם מוטציה נקודתית (G823E) בלוקוס MYH7 של העכבר עם הנדסת גנום בתיווך CRISPR/Cas9. עיצבנו וקטורים המכוונים ל-gRNA ולאוליגונוקלאוטידים של תורמים (עם רצפי מיקוד עם 134 bp של הומולוגיה). אתר p.G823E (GGG to GAG) באוליגונוקלאוטיד התורם הוכנס לאקסון 23 של MYH7 על ידי תיקון מכוון הומולוגיה. p.R819 מושתק (AGG ל-CGA) הוכנס גם הוא כדי למנוע קשירת gRNA וביקוע מחדש של הרצף לאחר תיקון מכוון הומולוגיה. אקוקרדיוגרפיה חשפה היפרטרופיה של דופן אחורית של החדר השמאלי (LVPW) עם סיסטולה בעכברי MYH7 G823E/- בגיל חודשיים. תוצאות אלה אומתו גם על ידי ניתוח היסטולוגי (איור 3).

תוצאות אלה מראות כי וריאנט G823E ממלא תפקיד חשוב בפתוגנזה של HCM. הממצאים שלנו מעשירים את הספקטרום של וריאנטים MYH7 הקשורים ל- HCM משפחתי ועשויים לספק הדרכה לייעוץ גנטי ואבחון טרום לידתי במשפחה סינית זו.

Introduction

קרדיומיופתיה היפרטרופית (HCM, OMIM: 613690) היא הקרדיומיופתיה הנפוצה ביותר בסין, עם שכיחות מוערכת של 0.2%, המשפיעה על 150,000 אנשים 1,2.

התכונה האנטומית הפתולוגית המאפיינת את HCM היא היפרטרופיה חדרית אסימטרית, שלעתים קרובות מערבת את מערכת היציאה של החדר ו / או מחיצה בין-חדרית3. הביטוי הקליני הוא קוצר נשימה במאמץ, עייפות וכאבים בחזה. לפנוטיפ האינדיבידואלי של HCM יש שונות הנעה בין חתרני קלינית לאי ספיקת לב חמורה. חולים עם HCM זקוקים לטיפול רפואי, השתלת לב, ציוד תומך חיים ומעקב רב-תחומי4.

במאה האחרונה, טכנולוגיית PCR שינתה את האופן שבו אנו חוקרים דנ"א5. שיטת ריצוף DNA לאבחון קליני התגלתה על ידי סנגר ועמיתיו6. טכניקת סנגר יושמה לאחר מכן בפרויקט הגנום האנושי, אך גישה זו הייתה יקרה וגוזלת זמן7. הופעתו של ריצוף גנום שלם (WGS) הביאה את התובנות על מחלות גנטיות אנושיות לגבהים חדשים, אך היא נותרה אסורה מבחינת עלות. טכנולוגיית ריצוף אקסום שלם (WES) שימשה זה מכבר לאיתור גרסאות גרמלין8 והצליחה לזהות מוטציות של נהגים סומטיים באקסום של סוגי סרטן שונים9. ניתן להשתמש בזיהוי של אקסונים של דנ"א או אזורי קידוד על ידי WES כדי לחשוף גרסאות פתוגניות ברוב המחלות המנדליאניות. כיום, עם העלות הפוחתת של ריצוף, WGS צפוי להפוך לכלי חשוב בחקר הגנומיקה וניתן להשתמש בו באופן נרחב באיתור וריאנטים פתוגניים בגנום.

טכנולוגיית WES שימשה גם בקרדיומיופתיה תורשתית לזיהוי וריאנטים פתוגניים כדי להבהיר עוד יותר את האטיולוגיה. עדויות חדשות מצביעות על כך שגנים המקודדים מוטציות בגנים של חלבונים מבניים של סרקומרה, כגון MYH7 10, MYH6 11, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL3 14, TNNT215, TNNI3 16, TNNC1 17 ו-TPM1 18 אחראים לאטיולוגיה הגנטית של HCM. מודעות לווריאנטים פתוגניים בגנים הגורמים למחלות נדירות (למשל, אובסקורין, קלמודולין ציטוסקטלי ו-RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)19, משחק אלפא 2 (ACTN2, OMIM: 102573)20, וחלבון עשיר בציסטאין וגליצין 3 (CSRP3, OMIM: 600824)21) נקשרה גם היא ל-HCM. מחקרים גנטיים עדכניים זיהו מספר גרסאות פתוגניות שונות בגן החלבון הסרקומרי בכ-40%-60% מחולי HCM, ובדיקות גנטיות בחולי HCM גילו כי רוב הווריאנטים הפתוגניים מתרחשים בשרשרת הכבדה של מיוזין (MYH7) ובחלבון קושר מיוזין C (MYBPC3). עם זאת, הבסיס הגנטי ל-HCM נותר חמקמק. חקירת הפתוגניות של וריאציות אלה העומדות בבסיס חולי HCM אנושיים נותרה אתגר גדול22.

במחקר זה אנו מדווחים על וריאנט פתוגני ב-MYH7 במשפחת האן הסינית עם HCM על ידי WES. על מנת לאמת את הפתוגניות של גרסה זו, הקמנו עכברי נוקין C57BL/6N-Myh7em1(G823E) באמצעות מערכת CRISPR/Cas9. אנו דנים גם במנגנונים מתקבלים על הדעת של גרסה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ההיסטוריה של המשפחות הושגה על ידי ראיונות עם בני המשפחה. המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים המחוזי לרפואה סינית בגואנגדונג (מס '2019074). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל בני המשפחה. כל בעלי החיים מטופלים בהתאם להנחיות האתיות של בית החולים המחוזי לרפואה סינית גואנגדונג (גואנגג'ואו, סין).

1. נושאי הלימוד

הערה: הפרובנד III-3 ביקש ייעוץ רפואי במחלקה לניתוחי לב וכלי דם של בית החולים המחוזי לרפואה סינית בגואנגדונג ביולי 2019.

  1. קבל היסטוריה רפואית משפחתית מפורטת של הפרובנד. הודע והתקשר לכל בני המשפחה של הפרובנד. כל בני המשפחה עברו בדיקות גופניות קפדניות.
    1. בצע סקירה שיטתית של כל הנתונים הקליניים, כולל רשומות רפואיות, א.ק.ג., אקו-לב ודוחות צנתור לב.
    2. אשר מחדש פנוטיפים לבביים בכל החולים במהלך התערבות או ניתוח.
  2. בחר בסך הכל 174 פקדים בריאים מבוססי אוכלוסייה ממסד הנתונים המקומי. לאסוף כ 4.0 מ"ל של דם ורידי היקפי מכל חולה.

2. מיצוי דנ"א

הערה: דנ"א מופק עם ערכת דם מסחרית בהתאם להוראות היצרן.

  1. Lyse תאי דם עם דטרגנט אניוני בנוכחות מייצב DNA בהתאם לפרוטוקול של היצרן.
  2. הוסף 10 μL של RNase A תמיסה לתזאט התא ומערבב על ידי היפוך הצינור 25 פעמים. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עד שעה.
  3. הסר חלבונים על ידי משקעי מלח. השתמש בתמיסת משקעי חלבון (0.25 מ"ג של אלבומין בסרום בקר מומס ב -25 מ"ל של מים מזוקקים) ו 100% איזופרופנול כדי לזרז חלבונים. לאחר מכן, השתמש ב-200 μL של 70% אתנול ובצע צנטריפוגה ב-12,000 x g/min ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לשטוף את גלולת הדנ"א.
  4. לשחזר את הדנ"א הגנומי על ידי משקעים עם 500 μL של 70% אתנול. צנטריפוגה ב 12,000 x גרם במשך 30 שניות. יש לשאוף ולאחר מכן להמיס את הכדור בתמיסת הידרציה (1 mM EDTA, 10 mM Tris· Cl, pH 7.5).
  5. השתמש בספקטרופוטומטר (לדוגמה, NanoDrop 2000) כדי לקבוע טוהר. לדנ"א מטוהר יש בדרך כלל יחס A260/A280 בין 1.7 ל-1.9 וגודלו עד 200 קילובייט.
  6. אחסן את הדנ"א לטווח ארוך בטמפרטורה של 2-8, -20 או -80 מעלות צלזיוס.

3. ריצוף אקסום שלם וניתוח וריאנטים

הערה: כדי לחפש באופן שיטתי מוטציות גנטיות הגורמות למחלות, בוצע ריצוף אקסום באנשים מושפעים (II-5, II-7, III-3, III-7, III-8, III-9 ו- IV-3) ובאנשים לא מושפעים (III-2, III-5, IV-4).

  1. השתמש בבדיקת exome בהתאם להוראות היצרן כדי לבצע את לכידת האקסום.
  2. החל את הספריות המאושרות על רצף זוגי של 2 × 150 bp בפלטפורמת HiSeq X-ten. ראה קובץ משלים 1.
  3. יישר קבצי FASTQ לגנום הייחוס האנושי (hg19/GRCh37) עם BWA v0.7.1318,19. מיין את הקבצים המיושרים (קבצים בפורמט sam/bam) עם samtools ולאחר מכן סמן כפילויות באמצעות Picard. ראה קובץ משלים 1.
  4. השתמש ב- GATK, יישר מחדש את הקריאות באופן מקומי וכייל מחדש את איכויות הבסיס. ראה קובץ משלים 1.
  5. צור סטטיסטיקות מיפוי הכוללות כיסוי ועומק מקבצים מכוילים מחדש על ידי BEDTools וסקריפטים פנימיים של perl/python.
  6. גרסאות גנוטיפ (SNVs ו- indels) מקבצי BAM מכוילים מחדש באמצעות מצב העיבוד מרובה הדגימות של הכלי HaplotypeCaller מ- GATK.
  7. השתמש ב-VQSR (כיול מחדש של ציוני איכות הווריאנטים) כדי להפחית תוצאות חיוביות שגויות של קריאות וריאנטים.
  8. הוסף ביאורים ל-SNVs ול-indels באמצעות תוכנת ANNOVAR21 כנגד מסדי נתונים מרובים, כולל קונסורציום הצבירה של Exome (ExAC) (http://exac.broadinstitute.org), פרויקט הריצוף של Exome (ESP) (https://esp.gs.washington.edu) ו-1,000 G (http://www.1000genomes.org). לפרש את הפתוגניות של גרסאות הרצף על פי הנחיות ACMG.

4. רצף סנגר

  1. בצע ריצוף סנגר כדי לאשר וריאנטים סיבתיים פוטנציאליים ולקבוע הפרדת משתנים במשפחה באמצעות רצף ABI 350023.
  2. תכנן רצפי פריימר עבור הווריאנט בגן MYH7 (NM_000257) כדלקמן: 5'-TTCAAACACAGAGACCTGCAGG-3' ו-5'- CGGACTTCTCTCTCGCCTCTT -3'.
  3. אשר וריאנט, סנן את כל בני המשפחה הזמינים כדי לקבוע את הפרדת הווריאנטים בתוך המשפחה23.

5. דור של עכברי C57BL/6N-MYH7em1(G823E)

  1. השתמש במערכת CRISPR/Cas9 כדי ליצור עכברי C57BL/6N-Myh7em1(G823E). הגן Myh7 של העכבר (מספר ההצטרפות של GenBank: NM_001361607.1; Ensembl: ENSMUSG00000053093) ממוקם על כרומוזום 14 של עכבר ויש לו 41 אקסונים. קודון ההתחלה ATG באקסון 4 וקודון עצירת TAG באקסון 41, וה- G823E ממוקם באקסון 23. בחר את exon 23 כאתר היעד.
  2. תכנן את הרצף של וקטור מיקוד gRNA ואוליגו תורם (עם רצף מיקוד, מוקף על ידי 134 bp רצפים הומולוגיים משולבים משני הצדדים).
    1. היכנס לאתר NCBI ולחץ על פונקציית עיצוב הפריימר המקוונת של BLAST מימין.
    2. לחץ על פונקציית Primer-BLAST בתחתית הדף כדי לעצב פריימרים.
    3. הדבק את מספר רצף ההפניות MYH7 NCBI NM_000257.4 בתיבת תבנית ה-PCR.
    4. הגבירו את מקטע המטרה (MYH7 cDNA exon 23 והאקסונים הסמוכים לו) לכן תכננו את הפריימר במעלה הזרם באקסון 21 (2392-2528) ואת הפריימר במורד הזרם באקסון 25 (3205-3350). הזן את מספר האקסון של הפריימרים במעלה ובמורד הזרם בתיבת הטווח הימנית.
    5. לחץ על הלחצן קבל פריימרים בתחתית כדי ליצור באופן אוטומטי זוגות מרובים של פריימרים .
  3. הזן את הגן MYH7 למסד הנתונים של ZFIN, הכנס את אתר המוטציה p.g823e (GGG to GAG) באוליגונוקלאוטיד התורם ואת המוטציה השקטה p.r819 (AGG עד CGA) לאקסון 23. המוטציה השקטה מונעת קשירה וחיתוך מחדש של הרצף על ידי gRNA לאחר תיקון מכוון הומולוגיה.
    1. תכנון gRNA על פי הרצף הכללי, הרצפים בשני הקצוות הם TAATACGACTCACTATA- ו-GTTTTAGAGCTA. אמצע הרצף הוא אתר היעד שהוזכר לעיל.
  4. הזרקה משותפת של Cas9 mRNA, gRNA שנוצר על ידי שעתוק חוץ גופי ואוליגו תורם לביציות מופרות לייצור עכברי KI.
    1. השתמש בערכת זיהוי יעילות היעד Cas9/gRNA כדי לתמלל את יעד ה-gRNA המתוכנן ל-gRNA במבחנה ולזהות את פעילות התעתיק (עיין בהוראות ערכת VK007 לשיטות זיהוי ספציפיות) בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    2. הפשירו את רכיבי ערכת ה-mRNA T7 ARCA, ערבבו וסובבו פולסים במיקרופוגה כדי לאסוף תמיסות לתחתית הצינורות. הרכיבו את התגובה בטמפרטורת החדר בסדר הבא: 2x תערובת ARCA/NTP ל-10 μL, 1 מיקרוגרם דנ"א של תבנית, 2 μL של תערובת T7 RNA פולימראז, ומים נטולי נוקלאז ל-20 μL.
    3. מערבבים היטב ומסובבים את הדופק במיקרופוגה. דגירה ב-37°C למשך 30 דקות.
    4. הסר את הדנ"א של התבנית על ידי הוספת 2 μL של DNase I, ערבב היטב, ודגרה ב 37 °C במשך 15 דקות כדי לקבל mRNA.
    5. בצע הזרקה תוך-צפקית של גונדוטרופין בסרום וגונדוטרופין כוריוני אנושי לתוך נקבות C57BL/6 מוכנות מראש בגיל 4 שבועות בערך עם מזרק של 0.5 מ"ל במינון של כ-5 U לעכבר עם מרווח בין שתי הזריקות של 48 שעות.
    6. שמונה עשרה שעות לאחר המינון, יש להקריב C57BL/6 עכברים נקבות ועכבר זכר C57BL/6 אחד בן 8-12 שבועות על ידי נקע צוואר הרחם לאחר הזרקת הורמונים. לאסוף את הביציות והזרע בנפרד.
    7. הזרע הוא קיבולי בנוזל הקיבול . קח ושחרר את הזרע בקצה הנוזל לתוך תאי הביצית קצרי הימים להפריה חוץ גופית למשך 3-4 שעות.
    8. דלל את ה-gRNA וה-Cas9 mRNA במבחנה שהועתקו בהצלחה עם מים נטולי RNase ל-25 ng/μL ו-50 ng/μL. הכנס לתוך הציטופלסמה של ביציות מופרות עכבר על ידי מיקרו הזרקה. השתלת ביציות מופרות במצב טוב לתוך oviduct מוגדל של נקבת העכברים. כלוב משותף עם עכברים זכרים קשורים.
  5. גנוטיפ הגורים על ידי PCR. השתמש בתנאי ה-PCR הבאים: 94 °C למשך 3 דקות, 35 מחזורים של 94 °C למשך 30 שניות, 60 °C למשך 35 שניות ו- 72 °C למשך 35 שניות; 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. המשך עם ניתוח רצף.
    1. חותכים את הזנבות של עכברים בני 4 חודשים עם מספריים ומניחים אותם לתוך צינור EP של 1.5 מ"ל. הוסף 180 μL של Buffer GL, 20 μL של פרוטאינאז K, ו-10 μL של RNase A לכל חתיכת זנב (2-5 מ"מ) בצינור מיקרוצנטריפוגה. היזהר לא לחתוך יותר מדי זנב.
    2. לדגום את הצינור ב 56 מעלות צלזיוס לילה.
    3. סובב בצינור מיקרוצנטריפוגה בגודל 1,000 x גרם למשך 2 דקות כדי להסיר זיהומים.
    4. הוסף 200 μL של Buffer GB ו- 200 μL של אלכוהול אתילי מוחלט עם ערבוב מספיק.
    5. מניחים את עמודת הסיבוב בצינור איסוף. החל את הדגימה על הספין והצנטריפוגה בגודל 1,000 x g למשך 2 דקות. בטל את הזרימה.
    6. הוסף 500 μL של Buffer WA לעמוד הספין וצנטריפוגה ב- 1,000 x g למשך דקה אחת. בטל את הזרימה.
    7. הוסף 700 μL של Buffer WB לעמוד הספין וצנטריפוגה ב- 1,000 x g למשך דקה אחת. בטל את הזרימה.
      הערה: ודא שה-Buffer WB עורבב מראש עם 100% אתנול. בעת הוספת Buffer WB, יש להוסיף לדופן הצינור כדי לשטוף את שאריות המלח.
    8. חזור על שלב 5.5.7.
    9. מניחים את עמוד הספין בצינור איסוף וצנטריפוגה בגודל 1,000 x גרם למשך 2 דקות.
    10. מקם את עמודת הספין בצינור חדש של 1.5 מ"ל. הוסיפו 50-200 μL של מים מעוקרים או חיץ אלוציוני למרכז קרום העמוד ותנו לעמוד במשך 5 דקות.
      הערה: חימום מים מעוקרים או חיץ מעוקר עד 65 מעלות צלזיוס יכול להגדיל את תפוקת ההארה.
    11. כדי לרומם את הדנ"א, צנטריפוגה של העמודה ב-1,000 x g למשך 2 דקות. כדי להגדיל את תפוקת הדנ"א, הוסיפו את הזרימה ו/או 50-200 μL של מים מעוקרים או חיץ אלוטיון למרכז קרום עמוד הספין ותנו לעמוד במשך 5 דקות. צנטריפוגה ב-1,000 x גרם למשך 2 דקות.
    12. לכמת את הדנ"א הגנומי המלוטש על ידי אלקטרופורזה.

6. הערכת המורפולוגיה והתפקוד הלבביים

הערה: החל אקוקרדיוגרפיה במצב M כדי להעריך את המורפולוגיה והתפקוד של עכברי C57BL/6N-Myh7em1(G823E) של הלב.

  1. הכניסו את עכברי הנוקין לקופסת אקריליק סגורה המחוברת למכונת ההרדמה והתאימו את הממשק התלת-כיווני כדי לאפשר לאיזופלורן (ריכוז: 3%) לזרום לתוך קופסת האקריליק. לאחר שעכברי הנוקין מפסיקים לנוע באופן אוטונומי, הסר את עכברי הנוקין.
  2. הניחו את עכברי הנוקין שטוחים על פלטפורמת ניטור החיים של מכונת ההרדמה של בעלי חיים קטנים, והרדמה בשאיפה מתמשכת מעורבבת עם חמצן (זרימה: 0.8 ליטר לדקה) ואיזופלורן (ריכוז: 3%). יש למרוח חומר סיכה לעיניים על העכברים המורדים כדי למנוע התייבשות של הקרנית.
  3. תקן את עכברי הנוקין אופקית על הרציף. הטה את הפלטפורמה בזווית של 30° לעכבר הנוק-אין. הסר שיער על דופן החזה הקדמית של העכבר דופק באמצעות קרם depilatory.
  4. מקם את הבדיקה אנכית כאשר הבליטה פונה לראש החיה. לאחר מכן, סובב את הבדיקה נגד כיוון השעון, בערך 45°.
  5. בתצוגת הציר הארוך הפאראסטרנלי, סובב את הגשושית ב-90° בכיוון השעון כדי לצפות בתצוגת הציר הקצר הפאראסטרנלית. לאחר סיבוב הבדיקה ב-90°, התאימו את תזוזת ציר ה-y כדי לקבל את הפרוסה הנכונה.
  6. שימו לב לתמונת הציר הארוך של הלב (איור 1C), ולאחר מכן בחרו נתוני מדידה במצב M.
  7. קבל נתוני אולטרסאונד מתצוגות פאראסטרנליות ארוכות צירים של עכברים (איור 1). מדידת דופק (HR), שבר פליטה של חדר שמאל (LVEF), תפוקת לב (CO), ממד אנד-דיאסטולי של חדר שמאל (LVDd), ממד סופי של החדר השמאלי (LVSd), מחיצה בין-חדרית (IVS) ודופן אחורית של החדר השמאלי (LVPW).
  8. לאחר המדידה, ספקו לעכברים חמצן, והחזירו אותם לכלובים שלהם כשהם יחזרו לפעילות אוטונומית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרופיל קליני של המשפחות
אילן היוחסין המשפחתי של HCM התקבלו והם מוצגים באיור 2. כל בני המשפחה המתועדים אובחנו עם HCM בעת ההרשמה.

במשפחה (איור 2A), הפרובנד היה חולה III-7, שאובחן עם HCM וחסימת דרכי היציאה של החדר השמאלי (LVOTO) בגיל 46 ועבר ניתוח לב. לחולה III-3 היה HCM קל שלא הצריך טיפול כירורגי. לחולה IV-3 היה גם HCM קטין, שהיה דומה לאביו, חולה III-3. חולה II-5 עבר HCM ועבר ניתוח לתיקון הפגם בגיל 51 עקב LVOTO. חולה I-1 וחולה II-2 מתו כתוצאה מתאונות לב בגיל 57 ו-46, בהתאמה. ההיסטוריה הרפואית של חולה I-1 לא הייתה זמינה. חולה II-7 וחולה III-9 הוצגו עם קוצר נשימה ואובחנו עם HCM.

ניתוח רצף אקסום והפרדה של גרסאות
במשפחה זו, רצף אקסום של חמשת הפרטים יצר ממוצע של 19,978,731 זוגות של קריאות ברצף עם אורך קריאה ממוצע של 125 bp. בסך הכל, 98.72% מהקריאות המרוצפות עברו את הערכת האיכות ומופו ל-98.66% מגנום הייחוס האנושי. גם לאחר הסינון, יותר מ-42 גרסאות (כולל תחליפי נוקלאוטידים בודדים ואינדלים) חולקו על ידי ארבעת החולים הללו. מתוכם, 27 היו SNVs missense, 15 היו צפויים לשנות שחבור. לבסוף, על פי הנחיות דירוג ACMG, c.G2468A הטרוזיגוטי; גרסת p.G823E של MYH7 (NM_0002571) נצפתה בפרובנד III-7 כמו גם בשלושת החולים האחרים.

זיהוי מוטציה פתוגנית
ריצוף סנגר אישר את אותו וריאנט MYH7 p.G823E בכל החולים, אך לא באנשים הבריאים במשפחות וב-174 הבקרות (איור 2B). MYH7 ההטרוזיגוטי p.G823E נפרד לחלוטין במשפחה זו. במשפחה זו, חולים IV-3 שהחזיקו בווריאנט זה ירשו אותו מחולה III-3. חולים III-7 ו- III-8 נשאו את אותה גרסה, שעברה בירושה מאביהם. המידע עבור חולה III-9 לא היה זמין.

גרסה זו, שתוארה בעבר ב- HCM על ידי חולה ספורדי24, לא דווחה במסדי הנתונים 1000 G, ESP6500, ExAC, HGMD, ClinVar או נושאי בקרה. שאריות הגליצין בקודון 823 באזור תחום הצוואר של MYH7 נשמרות היטב בכל רצפי המיוזין הזמינים של בעלי חוליות (איור 2C). MYH7 הוא גן סיבתי HCM ידוע וממלא תפקיד חשוב בהתפתחות הלב או במבנה/תפקוד הלב. בהתבסס על תקנים והנחיות של ACMG, וריאנט MYH7 p.G823E היה צפוי להיות גרסה פתוגנית (PVS1 + PS3 + PS4 + PM2). יחד, תוצאות אלה תומכות בכך שגרסה זו מזיקה ותורמת לפתוגנזה של HCM במשפחות אלה.

C57BL/6N-Myh7em1(G823E) עכברי נוקין פיתחו היפרטרופיה לבבית חמורה
כדי לאמת עוד יותר את הפתוגנזה של MYH7 p.G823E, אנו מייצרים עכברי נוקין C57BL/6N-Myh7em1(G823E). C57BL/6N-MYH7em1(G823E) עכברי נוקין פיתחו היפרטרופיה לבבית תלוית גיל לאחר הלידה (איור 2A,B). אקוקרדיוגרפיה גילתה כי IVS ו- LVPW התפתחו עם HR מוגבר בעכברי C57BL/6N-Myh7em1(G823E) (טבלה 1). תוצאות אלה אומתו גם על ידי ניתוח היסטולוגי (איור 3). לא היו הבדלים ברורים ב-LVDd, LVDs, EF או CO בין עכברים מסוג בר לעכברים הטרוזיגוטיים (טבלה 1).

Figure 1
איור 1: רכישת נתוני אולטרסאונד . (A) הבדיקה ממוקמת על הציר הארוך של עצם החזה. (B) הבדיקה ממוקמת על הציר הקצר של עצם החזה. (C) תמונת אולטרסאונד במצב M של מבט על הציר הארוך של עצם החזה. החץ הצהוב מציין את מיקום המחיצה הבין-חדרית. החץ האדום מציין את השסתום הצף. (D) תמונת אולטרסאונד במצב M של התצוגה קצרת הציר של עצם החזה. החץ הצהוב מציין את מיקומו של השריר הפפילרי הקדמי, והבליטה שמתחתיו היא השריר הפפילרי האחורי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: המשפחה הגדולה שנושאת את הגרסה ההטרוזיגוטית MYH7 G823E . (A) הפרובנד מסומן בחץ. עיגולים וריבועים מלאים ופתוחים מציינים אנשים מושפעים ונורמליים, בהתאמה. (B) גרסת G823E ב-MYH7 אושרה על ידי ריצוף סנגר. (C) שימור אתר MYH7 G823E במינים שונים. החץ הצהוב מייצג את האתר של G823E ברצף חומצות האמינו של מינים שונים, אשר נשמר מאוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: שינויים פתולוגיים של רקמת שריר הלב. (A) סיבי שריר הלב מסודרים בצורה מסודרת, ואין הבדל משמעותי בין כל חלק. (B) היפרטרופיה של סיבי שריר חדריים, סידור לקוי ונגעים מרוכזים בעיקר בדופן האחורית של החדר השמאלי ובמחיצה הבין-חדרית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

C57BL/6N-Myh7em1(G823E) קבוצת עכברי נוקאין קבוצת ביקורת
(n=4) (n=6)
משאבי אנוש (/min) 451.25 ± 25.786 413.83 ± 12.77 P = 0.015
LVDd (מ"מ) 4.12 ± 0.33 3.95 ± 0.20 P = 0.330
LVDs (מ"מ) 2.95 ± 0.44 2.85 ± 0.20 P = 0.626
EF(%) 55.02 ± 9.52 54.31 ± 5.11 P = 0.881
CO (מ"ל) 18.46 ± 3.05 15.30 ± 2.39 P = 0.102
IVS (מ"מ) 1.13 ± 0.20 0.67 ± 0.07 P = 0.001
LVPW (מ"מ) 1.40 ± 0.60 0.70 ± 0.06 P = 0.000

טבלה 1: מורפולוגיה וניתוח פונקציות עבור p.G823E וסוג פראי. הנתונים נותחו באמצעות SPSS. משתנים רציפים מבוטאים כממוצע ± סטיית תקן (SD). מבחני סכום הדירוג t או Wilcoxon של התלמיד עבור משתנים רציפים. ערכי P מתחת ל-0.05 נחשבו למובהקים סטטיסטית.

קובץ משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר זה אנו מתארים משפחה סינית אחת של בני האן עם HCM. ניתוח גנטי גילה כי מוטציה הטרוזיגוטית MYH6 p.G823E מפרידה יחד עם המחלה אצל בני משפחה עם תורשה אוטוזומלית דומיננטית. כדי לאמת את הפתוגניות של מוטציית G823E ולדון במנגנונים הבסיסיים, יצרנו מודל עכבר C57BL/6N עם G823E בלוקוס Myh7 של עכבר על ידי הנדסת גנום בתיווך CRISPR/Cas9.

מאפיינים פנוטיפיים של C57BL/6N-Myh7em1(G823E) עכברי נוקין הוערכו על ידי אקוקרדיוגרפיה. טרבוקציות מרובות ויחס גבוה יותר של שכבה לא דחוסה לשכבת שריר הלב הדחוסה נמצאו בעכברי הנוקין C57BL/6N-Myh7em1(G823E) בהשוואה לפקדים. העכברים המהונדסים הראו גם היפרטרופיה של LVPW ו- IVS ועלייה ב- HR. עם זאת, תפקוד הלב לא הראה שינוי משמעותי בין שתי הקבוצות. תוצאות אלה הצביעו על כך שעלייה ב-HR עשויה להפגין השפעה מפצה על תפקוד חדרי התחזוקה במהלך שיפוץ הלב. מחקרים נוספים נדרשים כדי לבחון ולנתח את המורפולוגיה והתפקוד של הלב.

מיוזין-7 (MYH7) שייך למשפחה של חלבונים מבניים סרקומריים שריר הלב. MYH7 המקודד על ידי הגן MYH7 (14q11.2; OMIM: 160760), שנמצא בגן הפתוגני הראשון הקשור ל- HCM בשנת 1990. עד כה, יותר מ-300 גרסאות בגן MYH7 נקשרו ל-HCM25,26. עם זאת, הפתוגניות של רוב גדול של וריאציה נשאר חמקמק. באמצעות פרוטוקול זה, יצרנו את עכברי המודל בהצלחה. בעת תכנון ועיצוב עכבר המודל, ישנם שלושה נושאים עיקריים הנדונים. ראשית, רצף חומצות האמינו של חלבון MYH7 של העכבר הוא הומולוגי מאוד עם בני אדם. שנית, MYH7 מתבטא מאוד בחדרים, כמו גם MYH7 בבני אדם. שאריות הגליצין בקודון 823 ב-MYH7 נשמרות היטב בכל רצפי המיוזין הזמינים.

MYH7 מכיל תחום מנוע ראש שמור ב-N-terminus, אשר קושר אקטין ויש לו Mg· המופעל על-ידי אקטין. פעילות ATPase ואזור צוואר, כמו גם זנב מיוזין, המכיל אזור סליל מפותל (CC) ב- C-terminus. שאריות הגליצין בקודון 823 באזור תחום הצוואר של MYH7 מצביעות על כך ששונות זו עשויה להשפיע על סיבוב זרוע המנוף בהתכווצות27,28,29,30.

WES מתמקדת בעיקר באקסונים של גנים, המהווים רק 1.5% 8 מכלל הדנ"א של הגנום. עם זאת, רוב המחלות הגנטיות האנושיות שזוהו קשורות לאקסונים31. זה עושה WES מוכר באופן נרחב מיושם בפועל קליני. ישנן בעיות אתיות מסוימות עם היישום הנרחב של WES. המחקר של סוג זה של מחלה גנטית אנושית כרוך לעתים קרובות בדיונים חוצי גבולות. למרות שחוקרים מנסים להסיר מידע המאפשר זיהוי אישי ככל האפשר, המידע העצום הכלול בדנ"א עדיין יכול לזהות מחדש את אנשי המחקר, ואפילו את משפחותיהם. רק אמצעי חילופי מידע סטנדרטיים יכולים להבטיח את היישום הרציונלי של WES. בעתיד, WES הוא בעל משמעות רבה עבור אסטרטגיות רפואיות עבור מוטציות גנטיות ספציפיות ואמצעי אבחון וטיפול מותאמים אישית עבור מחלות מרובות.

לסיכום, זיהינו גרסה הטרוזיגוטית של MYH7, p.G823E, במשפחת האן סינית גדולה עם HCM באמצעות WES. עכברי הנוקין C57BL/6N-Myh7em1(G823E) נמצאו בעלי IVS ו-LVPW עבים יותר, ו-HR מהיר יותר מעכברים מסוג בר. וריאנט p.G823E עלול לפגוע בסיבוב זרוע המנוף, מה שמרמז על כך שמוטציה זו ממלאת תפקיד חשוב ב-HCM המשפחתי. עבודתנו מרחיבה את המידע על ספקטרום המוטציות של הגן MYH7 הקשור ל-HCM ומספקת בהירות טובה יותר לגבי האבחנה המתאימה והייעוץ הגנטי של משפחות מושפעות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים כספיים להצהיר עליהם.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט קרן המחקר הרפואי של מחוז גואנגדונג (A2022363) והפרויקט הגדול של ועדת גואנגדונג למדע וטכנולוגיה, סין (מענק מס '2022).

ברצוננו להודות לצ'ינגג'יאן צ'ן מאוניברסיטת מרילנד, קולג ' פארק על העזרה במהלך הכנת כתב יד זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5×TBE Shanghai Sangon
2× Taq Master Mix (Dye Plus) Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd.
Agarose Regu
Anesthesia machine for small animals Reward Life Technology Co., Ltd. R500
BEDTools 2.16.1
Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. VK007
DNA Marker Thermo Fisher Scientific
DNA stabilizer Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. DNAstable LD prevent DNA degradation
Electric paraffin microtome Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. HS-S7220-B
GATK v3.5
Gentra Puregene blood kit Santa Clara
Glass slide, coverslip Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd.
Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. C0107-500ml, C0109
HiSeq X-ten platform Illumina perform sequencing on the captured libraries
Injection of chorionic gonadotropin Livzon Pharmaceutical Group Inc.
Injection of pregnant mare serum gonadotropin Livzon Pharmaceutical Group Inc.
Isoflurane Local suppliers inhalation anesthesia
Microinjection microscope Nikon ECLIPSE Ts2
NanoDrop Thermo Fisher Scientific 2000
Paraffin Embedding Machine Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. HS-B7126-B
Picard (2.2.4) 20
Proteinase K Merck KGaA
samtools 1.3
Sequencer Applied Biosystems ABI 3500
Stereomicroscope Nikon SMZ745T
SureSelect Human All Exon V6 Agilent Technology Co., Ltd. exome probe
T7 ARCA mRNA Kit New England BioLabs, Inc. NEB-E2065S
Temperature box BINDER GmbH KBF-S Solid.Line
Trizma Hydrochloride Solution Sigma, Merck KGaA No. T2663
Veterinary ultrasound system Royal Philips CX50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Toepfer, C. N., et al. Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).
  2. Writing Committee Members et al. 2020 AHA/ACC guideline for the diagnosis and treatment of patients with hypertrophic cardiomyopathy: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Joint Committee on Clinical Practice Guidelines. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 162 (1), 23-106 (2021).
  3. Elliott, P., McKenna, W. J. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 363 (9424), 1881-1891 (2004).
  4. Maron, B. J., Maron, M. S. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 381 (9862), 242-255 (2013).
  5. Inoue, T., Orgel, L. E. A nonenzymatic RNA polymerase model. Science. 219 (4586), 859-862 (1983).
  6. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  7. Sachidanandam, R., et al. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature. 409 (6822), 928-933 (2001).
  8. Ng, S. B., et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature. 461 (7261), 272-276 (2009).
  9. Wong, K. M., Hudson, T. J., McPherson, J. D. Unraveling the genetics of cancer: genome sequencing and beyond. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 407-430 (2011).
  10. Mattivi, C. L., et al. Clinical utility of a phenotype-enhanced MYH7-specific variant classification framework in hypertrophic cardiomyopathy genetic testing. Circulation. Genomic and Precision Medicine. 13 (5), 453-459 (2020).
  11. Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342 (6154), New York, N.Y. 111-114 (2013).
  12. Hayashi, T., et al. Genetic background of Japanese patients with pediatric hypertrophic and restrictive cardiomyopathy. Journal of Human Genetics. 63 (9), 989-996 (2018).
  13. Gil, W. S., Ávila Vidal, L. A., Vásquez Salguero, M. A., Cajiao, M. B., Peña, C. V. Genetic variant affecting the myosin light chain 2 related to familial hypertrophic cardiomyopathy. Intractable & Rare Diseases Research. 9 (4), 229-232 (2020).
  14. Berge, K. E., Leren, T. P. Genetics of hypertrophic cardiomyopathy in Norway. Clinical Genetics. 86 (4), 355-360 (2014).
  15. McNamara, J. W., Schuckman, M., Becker, R. C., Sadayappan, S. A novel homozygous intronic variant in TNNT2 associates with feline cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 608473 (2020).
  16. Wang, W., et al. Comparative transcriptome analysis of atrial septal defect identifies dysregulated genes during heart septum morphogenesis. Gene. 575, 303-312 (2016).
  17. Andersen, P. S., et al. Diagnostic yield, interpretation, and clinical utility of mutation screening of sarcomere encoding genes in Danish hypertrophic cardiomyopathy patients and relatives. Human Mutations. 30 (3), 363-370 (2009).
  18. Nakashima, Y., et al. Lifelong clinical impact of the presence of sarcomere gene mutation in Japanese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Journal. 84 (10), 1846-1853 (2020).
  19. Hu, L. R., Kontrogianni-Konstantopoulos, A. Proteomic analysis of myocardia containing the Obscurin R4344Q mutation linked to hypertrophic cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 478 (2020).
  20. Girolami, F., et al. Novel alpha-actinin 2 variant associated with familial hypertrophic cardiomyopathy and juvenile atrial arrhythmias: a massively parallel sequencing study. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (6), 741-750 (2014).
  21. Salazar-Mendiguchia, J., et al. The p.(Cys150Tyr) variant in CSRP3 is associated with late-onset hypertrophic cardiomyopathy in heterozygous individuals. European Journal of Medical Genetics. 63 (12), 104079 (2020).
  22. Teekakirikul, P., Zhu, W., Huang, H. C., Fung, E. Hypertrophic cardiomyopathy: An overview of genetics and management. Biomolecules. 9 (12), 878 (2019).
  23. Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
  24. Song, L., et al. Mutations profile in Chinese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 209-216 (2005).
  25. Marian, A. J., Braunwald, E. Hypertrophic cardiomyopathy: Genetics, pathogenesis, clinical manifestations, diagnosis, and therapy. Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).
  26. Cann, F., et al. Phenotype-driven molecular autopsy for sudden cardiac death. Clinical Genetics. 91 (1), 22-29 (2017).
  27. Lafreniere-Roula, M., et al. Family screening for hypertrophic cardiomyopathy: Is it time to change practice guidelines. European Heart Journal. 40 (45), 3672-3681 (2019).
  28. Winkelmann, D. A., Forgacs, E., Miller, M. T., Stock, A. M. Structural basis for drug-induced allosteric changes to human beta-cardiac myosin motor activity. Nature Communications. 6, 7974 (2015).
  29. García-Giustiniani, D., et al. Phenotype and prognostic correlations of the converter region mutations affecting the β myosin heavy chain. Heart (British Cardiac Society). 101 (13), 1047-1053 (2015).
  30. Moore, J. R., Leinwand, L., Warshaw, D. M. Understanding cardiomyopathy phenotypes based on the functional impact of mutations in the myosin motor. Circulation Research. 111 (3), 375-385 (2012).
  31. Majewski, J., Schwartzentruber, J., Lalonde, E., Montpetit, A., Jabado, N. What can exome sequencing do for you. Journal of Medical Genetics. 48 (9), 580-589 (2011).

Tags

גנטיקה גיליון 186
חקירת הפתוגנזה של מוטציית MYH7 Gly823Glu בקרדיומיופתיה היפרטרופית משפחתית באמצעות מודל עכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xia, Y., Hu, J., Li, X., Zheng, S.,… More

Xia, Y., Hu, J., Li, X., Zheng, S., Wang, G., Tan, S., Zou, Z., Ling, Q., Yang, F., Fan, X. Investigating the Pathogenesis of MYH7 Mutation Gly823Glu in Familial Hypertrophic Cardiomyopathy using a Mouse Model. J. Vis. Exp. (186), e63949, doi:10.3791/63949 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter