Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Undersöka patogenesen av MYH7-mutation Gly823Glu i familjär hypertrofisk kardiomyopati med hjälp av en musmodell

Published: August 8, 2022 doi: 10.3791/63949
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 4, 1,2, 1,2, 1,2, 2,5, 4, 1,2
1Department of Cardiovascular Surgery, Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, 2The Second Clinical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, 3Department of Cardiovascular Surgery, The First Affiliated Hospital, Jinan University, 4Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, 5Department of Anesthesiology, Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Baserat på den familjära ärftliga kardiomyopatifamiljen som finns i vårt kliniska arbete skapade vi en C57BL/6N-musmodell med en punktmutation (G823E) vid musens MYH7-locus genom CRISPR/Cas9-medierad genomteknik för att verifiera denna mutation.

Abstract

Familjär hypertrofisk kardiomyopati (HCM, OMIM: 613690) är den vanligaste kardiomyopatin i Kina. Den underliggande genetiska etiologin för HCM förblir dock svårfångad.

Vi har tidigare identifierat en myosin tung kedja 7 (MYH7) gen heterozygot variant, NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E), i en stor kinesisk Han-familj med HCM. I denna familj kosegregerar variant G823E med en autosomal dominerande sjukdom. Denna variant är belägen i hävarmdomänen i nackregionen av MYH7-proteinet och är mycket bevarad bland homologa myosiner och arter. För att verifiera patogeniciteten hos G823E-varianten tog vi fram en C57BL/6N-musmodell med en punktmutation (G823E) vid musens MYH7-locus med CRISPR/Cas9-medierad genomteknik. Vi designade gRNA-inriktningsvektorer och donatoroligonukleotider (med inriktningssekvenser flankerade av 134 bp homologi). Platsen p.G823E (GGG till GAG) i donatoroligonukleotiden introducerades i exon 23 av MYH7 genom homologistyrd reparation. En ljuddämpad p.R819 (AGG till CGA) sattes också in för att förhindra gRNA-bindning och omklyvning av sekvensen efter homologistyrd reparation. Ekokardiografi avslöjade vänster ventrikulär bakre vägg (LVPW) hypertrofi med systol i MYH7 G823E /- möss vid 2 månaders ålder. Dessa resultat validerades också genom histologisk analys (figur 3).

Dessa resultat visar att G823E-varianten spelar en viktig roll i patogenesen av HCM. Våra resultat berikar spektrumet av MYH7-varianter kopplade till familjär HCM och kan ge vägledning för genetisk rådgivning och fosterdiagnostik i denna kinesiska familj.

Introduction

Hypertrofisk kardiomyopati (HCM, OMIM: 613690) är den vanligaste kardiomyopatin i Kina, med en uppskattad förekomst på 0,2%, vilket påverkar 150 000 personer 1,2.

Den patologiska anatomiska egenskapen som kännetecknar HCM är asymmetrisk ventrikulär hypertrofi, som ofta involverar det ventrikulära utflödeskanalen och / eller interventrikulärt septum3. Den kliniska manifestationen är ansträngningsdyspné, trötthet och bröstsmärta. Den individuella fenotypen av HCM har variationer som sträcker sig från kliniskt lömska till svår hjärtsvikt. Patienter med HCM behöver medicinsk behandling, hjärttransplantation, livsuppehållande utrustning och tvärvetenskaplig uppföljning4.

Under det senaste århundradet har PCR-tekniken förändrat hur vi studerar DNA5. En DNA-sekvenseringsmetod för klinisk diagnos upptäcktes av Sanger och kollegor6. Sanger-tekniken tillämpades därefter på Human Genome Project, men detta tillvägagångssätt var kostsamt och tidskrävande7. Tillkomsten av helgenomsekvensering (WGS) förde insikter om mänsklig genetisk sjukdom till nya höjder, men det förblev oöverkomligt när det gäller kostnad. Whole-exome sequencing (WES) -teknik har länge använts för att upptäcka bakterievarianter8 och har lyckats identifiera somatiska drivmutationer i exom av olika cancerformer9. Detekteringen av DNA-exoner eller kodande regioner av WES kan användas för att avslöja patogena varianter i de flesta mendeliska sjukdomar. Idag, med de minskande kostnaderna för sekvensering, förväntas WGS bli ett viktigt verktyg inom genomikforskning och kan användas i stor utsträckning för att upptäcka patogena varianter i genomet.

WES-teknik har också använts i ärftlig kardiomyopati för att identifiera patogena varianter för att ytterligare belysa etiologin. Nya bevis har implicerat att gener som kodar för sarkomerstrukturella proteingenmutationer, såsom MYH7 10, MYH6 11, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL3 14, TNNT215, TNNI3 16, TNNC1 17 ochTPM1 18 är ansvariga för HCM: s genetiska etiologi. Medvetenhet om patogena varianter i sällsynta sjukdomsframkallande gener (t.ex. obscurin, cytoskeletal calmodulin och titin-interagerande RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)19, verkande alfa 2 (ACTN2, OMIM: 102573)20 och cystein- och glycinrikt protein 3 (CSRP3, OMIM: 600824)21) har också associerats med HCM. Nuvarande genetiska studier har identifierat flera distinkta patogena varianter i den sarkomeriska proteingenen hos cirka 40%-60% av HCM-patienterna, och genetisk testning hos HCM-patienter avslöjade att de flesta patogena varianter förekommer i myosin-tungkedjan (MYH7) och myosinbindande protein C (MYBPC3). Den genetiska grunden för HCM är dock fortfarande svårfångad. Att utforska patogeniciteten hos dessa variationer som ligger till grund för de mänskliga HCM-patienterna är fortfarande en stor utmaning22.

I denna studie rapporterar vi en patogen variant i MYH7 i en kinesisk Han-familj med HCM av WES. För att verifiera patogeniteten hos denna variant etablerade vi en C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) knockinmöss med CRISPR / Cas9-systemet. Vi diskuterar också troliga mekanismer för denna variant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Familjernas historier erhölls genom att intervjua familjemedlemmarna. Studien godkändes av etikkommittén vid Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine (nr 2019074). Informerat skriftligt samtycke erhölls från alla familjemedlemmar. Alla djur behandlas i enlighet med de etiska riktlinjerna från Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine (Guangzhou, Kina).

1. Studera ämnen

OBS: Probandet III-3 sökte medicinsk rådgivning vid avdelningen för kardiovaskulär kirurgi vid Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine i juli 2019.

  1. Få detaljerad familjemedicinsk historia av probandet. Meddela och ring alla familjemedlemmar i probandet. Alla familjemedlemmar har genomgått noggranna fysiska undersökningar.
    1. Utför en systematisk genomgång av alla kliniska data, inklusive medicinska journaler, EKG, ekokardiogram och hjärtkateteriseringsrapporter.
    2. Bekräfta hjärtfenotyper hos alla patienter under intervention eller operation.
  2. Välj totalt 174 populationsbaserade felfria kontroller från den lokala databasen. Samla cirka 4,0 ml perifert venöst blod från varje patient.

2. DNA-extraktion

OBS: DNA extraheras med ett kommersiellt blodkit enligt tillverkarens instruktioner.

  1. Lysera blodkroppar med ett anjoniskt tvättmedel i närvaro av en DNA-stabilisator enligt tillverkarens protokoll.
  2. Tillsätt 10 μL RNas A-lösning till celllysatet och blanda genom att invertera röret 25 gånger. Inkubera vid 37 °C i 15 minuter till 1 timme.
  3. Ta bort proteiner genom saltutfällning. Använd proteinutfällningslösning (0,25 mg bovint serumalbumin upplöst i 25 ml destillerat vatten) och 100% isopropanol för att fälla ut proteiner. Använd sedan 200 μl 70 % etanol och centrifugering vid 12 000 x g/min vid 4 °C i 15 minuter för att tvätta DNA-pelleten.
  4. Återvinn det genomiska DNA genom utfällning med 500 μL 70% etanol. Centrifugera vid 12 000 x g i 30 s. Sug upp pelleten i hydratiseringslösning (1 mM EDTA, 10 mM Tris· Cl, pH 7,5).
  5. Använd en spektrofotometer (t.ex. NanoDrop 2000) för att bestämma renhet. Renat DNA har vanligtvis ett A260/A280-förhållande mellan 1,7 och 1,9 och är upp till 200 kb stort.
  6. Förvara DNA under lång tid vid 2-8, -20 eller -80 °C.

3. Helexomsekvensering och variantanalys

OBS: För att systematiskt söka efter sjukdomsframkallande genmutationer utfördes exomsekvensering hos drabbade individer (II-5, II-7, III-3, III-7, III-8, III-9 och IV-3) och opåverkade individer (III-2, III-5, IV-4).

  1. Använd exomesond enligt tillverkarens instruktioner för att utföra exominfångningen.
  2. Använd de kvalificerade biblioteken på 2 × 150 bp ihopkopplad sekvensering på HiSeq X-ten-plattformen. Se Tilläggsfil 1.
  3. Justera FASTQ-filer till det mänskliga referensgenomet (hg19/GRCh37) med BWA v0.7.1318,19. Sortera de justerade filerna (filer i sam/bam-format) med samtools och flagga sedan dubbletter med Picard. Se Tilläggsfil 1.
  4. Använd GATK, justera om läsningar lokalt och kalibrera om baskvaliteter. Se Tilläggsfil 1.
  5. Generera mappningsstatistik som inkluderar täckning och djup från omkalibrerade filer av BEDTools och interna perl/python-skript.
  6. Genotypvarianter (SNV och indels) från omkalibrerade BAM-filer med hjälp av bearbetningsläget för flera prover i HaplotypeCaller-verktyget från GATK.
  7. Använd VQSR (omkalibrering av variantkvalitetspoäng) för att minska falska positiva resultat av variantanrop.
  8. Kommentera SNV:er och indels med ANNOVAR-programvara21 mot flera databaser, inklusive Exome Aggregation Consortium (ExAC) (http://exac.broadinstitute.org), Exome Sequencing Project (ESP) (https://esp.gs.washington.edu) och 1 000 G (http://www.1000genomes.org). Tolka patogeniciteten hos sekvensvarianterna enligt ACMG-riktlinjerna.

4. Sanger-sekvensering

  1. Utför Sanger-sekvensering för att bekräfta potentiella orsakande varianter och bestämma variantsegregering i familjen med hjälp av en ABI 3500 sequencer23.
  2. Designa primersekvenser för varianten i MYH7-genen (NM_000257) enligt följande: 5'-TTCAAACACAGAGACCTGCAGG-3' och 5'- CGGACTTCTCTAGCGCCTCTT -3'.
  3. Bekräfta en variant, screena alla tillgängliga familjemedlemmar för att bestämma variantsegregering inom familjen23.

5. Generering av C57BL / 6N-MYH7em1 (G823E) knockin-möss

  1. Använd CRISPR/Cas9-systemet för att generera C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockinmöss. Musens Myh7-gen (GenBank-anslutningsnummer: NM_001361607.1; Ensembl: ENSMUSG00000053093) ligger på muskromosom 14 och har 41 exoner. ATG startar kodon i exon 4 och TAG stoppkodon i exon 41, och G823E ligger på exon 23. Välj exon 23 som målwebbplats.
  2. Designa sekvensen av gRNA-inriktningsvektor och donatoroligo (med inriktningssekvens, flankerad av 134 bp homologa sekvenser kombinerade på båda sidor).
    1. Logga in på NCBI:s webbplats och klicka på BLAST-funktionen online primer design till höger.
    2. Klicka på Primer-BLAST-funktionen längst ner på sidan för att designa primers.
    3. Klistra in MYH7 NCBI-referenssekvensnumret NM_000257.4 i rutan PCR-mall.
    4. Förstärk målfragmentet (MYH7 cDNA exon 23 och dess intilliggande exoner) så designa uppströmsprimern på exon 21 (2392-2528) och nedströmsprimern på exon 25 (3205-3350). Ange exonnumret för uppströms- och nedströmsprimrarna i den högra intervallrutan.
    5. Klicka på knappen Hämta primers längst ner för att automatiskt generera flera par primers .
  3. Mata in MYH7-genen i ZFIN-databasen, introducera p.g823e (GGG till GAG) mutationsstället i donatoroligonukleotiden och den tysta mutationen p.r819 (AGG till CGA) i exon 23. Den tysta mutationen förhindrar bindning och omskärning av sekvensen med gRNA efter homologistyrd reparation.
    1. Designa gRNA enligt den allmänna sekvensen, sekvenserna i båda ändarna är TAATACGACTCACTATA- och -GTTTTAGAGCTA. Mitten av sekvensen är målplatsen som nämns ovan.
  4. Saminjicera Cas9 mRNA, gRNA som genereras genom in vitro-transkription och donatoroligo i befruktade ägg för KI-musproduktion.
    1. Använd Cas9 / gRNA-måleffektivitetsdetekteringssatsen för att transkribera det designade gRNA-målet till gRNA in vitro och detektera transkriptets aktivitet (se VK007-kitinstruktionerna för specifika detektionsmetoder) enligt tillverkarens protokoll.
    2. Tina T7 ARCA mRNA-kitkomponenterna, blanda och pulsspinn i en mikrofuge för att samla lösningar till rörens botten. Montera reaktionen vid rumstemperatur i följande ordning: 2x ARCA / NTP-blandning till 10 μL, 1 μg mall-DNA, 2 μL T7 RNA-polymerasblandning och nukleasfritt vatten till 20 μL.
    3. Blanda noggrant och pulsspinn i en mikrofuge. Inkubera vid 37 °C i 30 minuter.
    4. Ta bort mall-DNA genom att tillsätta 2 μL DNas I, blanda väl och inkubera vid 37 °C i 15 minuter för att erhålla mRNA.
    5. Utför intraperitoneal injektion av serumgonadotropin och humant koriongonadotropin i förberedda C57BL/6 honmöss vid cirka 4 veckors ålder med en 0,5 ml spruta i en dos av cirka 5 U per mus med ett intervall mellan de två injektionerna på 48 timmar.
    6. Arton timmar efter dosering, offra C57BL/6 honmöss och en 8-12 veckor gammal C57BL/6 hanmus genom cervikal dislokation efter hormoninjektion. Samla ägg och spermier separat.
    7. Spermierna kapaciteras i kapacitationsvätskan. Ta och släpp spermierna vid vätskans kant i de kortlivade äggcellerna för provrörsbefruktning i 3-4 timmar.
    8. Späd det framgångsrikt transkriberade gRNA och Cas9 mRNA in vitro med RNasfritt vatten till 25 ng / μL och 50 ng / μL. Inför i cytoplasman hos mus befruktade ägg genom mikroinjektion. Transplantera befruktade ägg i gott skick i den förstorade äggledaren hos honmössen. Co-cage med ligerade hanmöss.
  5. Genotyp valparna med PCR. Använd följande PCR-förhållanden: 94 °C i 3 minuter, 35 cykler med 94 °C i 30 s, 60 °C i 35 s och 72 °C i 35 s; 72 °C i 5 min. Följ med sekvensanalys.
    1. Skär svansarna på 4 månader gamla möss med sax och placera dem i 1,5 ml EP-rör. Tillsätt 180 μL buffert-GL, 20 μl proteinas K och 10 μl RNas A per stjärtstycke (2-5 mm) i ett mikrocentrifugrör. Var försiktig så att du inte skär för mycket svans.
    2. Inkubera röret vid 56 °C över natten.
    3. Snurra i ett mikrocentrifugrör vid 1 000 x g i 2 minuter för att avlägsna föroreningar.
    4. Tillsätt 200 μl buffert GB och 200 μl absolut etylalkohol med tillräcklig blandning.
    5. Placera spinnkolonnen i ett uppsamlingsrör. Applicera provet på spinnet och centrifugera vid 1 000 x g i 2 minuter. Kasta genomströmningen.
    6. Tillsätt 500 μl buffert-WA i centrifugeringskolonnen och centrifugera vid 1 000 x g i 1 min. Kasta genomströmningen.
    7. Tillsätt 700 μl buffertWB till centrifugeringskolonnen och centrifugera vid 1 000 x g i 1 min. Kasta genomströmningen.
      OBS: Se till att Buffer WB har förblandats med 100% etanol. När du lägger till Buffer WB, lägg till rörväggen för att tvätta bort det återstående saltet.
    8. Upprepa steg 5.5.7.
    9. Placera spinnkolonnen i ett uppsamlingsrör och centrifugera vid 1 000 x g i 2 minuter.
    10. Placera spinnkolonnen i ett nytt 1,5 ml rör. Tillsätt 50-200 μl steriliserat vatten eller elueringsbuffert till mitten av kolonnmembranet och låt kolonnen stå i 5 min.
      OBS: Uppvärmning av steriliserat vatten eller elueringsbuffert upp till 65 °C kan öka utbytet av eluering.
    11. För att eluera DNA, centrifugera kolonnen vid 1 000 x g i 2 minuter. För att öka utbytet av DNA, tillsätt genomströmningen och/eller 50-200 μl steriliserat vatten eller elueringsbuffert till mitten av spinnkolonnmembranet och låt kolonnen stå i 5 minuter. Centrifugera vid 1 000 x g i 2 minuter.
    12. Kvantifiera det eluterade genomiska DNA:t genom elektrofores.

6. Utvärdering av hjärtmorfologi och funktion

OBS: Använd M-läge ekokardiografi för att bedöma hjärtmorfologi och funktion av C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) knockinmöss.

  1. Sätt knockinmössen i en sluten akryllåda ansluten till anestesimaskinen och justera trevägsgränssnittet så att isofluran (koncentration: 3%) kan strömma in i akryllådan. När knockinmössen upphör att röra sig autonomt, ta bort knockinmössen.
  2. Placera knockinmössen platt på livsövervakningsplattformen för smådjursanestesimaskinen och kontinuerlig inhalationsanestesi blandad med syre (flöde: 0,8 L / min) och isofluran (koncentration: 3%). Applicera ögonsmörjmedel på de bedövade mössen för att förhindra torkning av hornhinnan.
  3. Fixa knockinmössen horisontellt på plattformen. Luta plattformen 30° caudal mot knockinmusen. Ta bort hår på den främre bröstväggen på den knackande musen med en hårborttagningskräm.
  4. Placera sonden vertikalt med stöten mot djurets huvud. Vrid sedan sonden moturs, cirka 45°.
  5. I den parasternala långaxelvyn roterar du sonden 90 ° medurs för att observera den parasternala kortaxelvyn. När du har roterat sonden 90° justerar du y-axelns förskjutning för att få rätt segment.
  6. Observera den långaxliga bilden av hjärtat (bild 1C) och välj sedan mätdata för M-läge.
  7. Hämta ultraljudsdata från parasternala långaxelvyer av möss (figur 1). Hjärtfrekvens (HR), vänster ventrikulär ejektionsfraktion (LVEF), hjärtminutvolym (CO), vänster ventrikulär änddiastolisk dimension (LVDd), LVDs vänstra ventrikulära ändsystoliska dimension (LVSd), interventrikulär septum (IVS) och vänster ventrikulär bakre vägg (LVPW) mäts.
  8. Efter mätningen, förse mössen med syre och placera dem tillbaka i sina respektive burar när de återfår autonom aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Familjernas kliniska profil
HCM: s familjestamtavlor erhölls och visas i figur 2. Alla dokumenterade familjemedlemmar diagnostiserades med HCM vid inskrivningen.

I familjen (figur 2A) var probanden patient III-7, som diagnostiserades med HCM och vänster ventrikulär utflödeskanalobstruktion (LVOTO) vid 46 år gammal och genomgick hjärtkirurgi. Patient III-3 hade mindre HCM som inte krävde kirurgisk behandling. Patient IV-3 hade också mindre HCM, som liknade hans far, patient III-3. Patient II-5 hade HCM och genomgick operation för att reparera defekten vid 51 års ålder på grund av LVOTO. Patient I-1 och patient II-2 dog på grund av hjärtolyckor vid 57 respektive 46 års ålder. Patient I-1: s medicinska historia var inte tillgänglig. Patient II-7 och patient III-9 fick andnöd och fick diagnosen HCM.

Exomsekvensanalys och segregering av varianter
I denna familj genererade exomsekvensering av de fem individerna ett medelvärde av totalt 19 978 731 par sekvenserade läsningar med en genomsnittlig läslängd på 125 bp. Totalt klarade 98,72% av sekvenserade läsningar kvalitetsbedömningen och kartlades till 98,66% av det mänskliga referensgenomet. Även efter filtrering delades mer än 42 varianter (inklusive enstaka nukleotidsubstitutioner och indels) av dessa fyra patienter. Av dessa var 27 missense SNV, 15 förutspåddes förändra skarvning. Slutligen, enligt ACMG-klassificeringsriktlinjer, en heterozygot c.G2468A; p.G823E-varianten av MYH7 (NM_0002571) observerades i proband III-7 samt de andra tre patienterna.

Identifiering av en patogen mutation
Sanger-sekvensering bekräftade samma MYH7 p.G823E-variant hos alla patienter men inte hos de friska individerna i familjerna och 174 kontroller (figur 2B). Den heterozygota MYH7 p.G823E helt segregerad i denna familj. I denna familj ärvde patienter IV-3 som innehöll denna variant den från patient III-3. Patienter III-7 och III-8 bar samma variant, som ärvdes från sin far. Informationen för patient III-9 var inte tillgänglig.

Denna variant, som tidigare beskrivits i HCM av en sporadisk patient24, har inte rapporterats i databaserna 1000 G, ESP6500, ExAC, HGMD, ClinVar eller kontrollpersoner. Glycinresten vid kodon 823 i halsdomänregionen av MYH7 är mycket bevarad i alla tillgängliga myosinsekvenser för ryggradsdjur (figur 2C). MYH7 är en känd HCM-orsakande gen och spelar en viktig roll i hjärtats utveckling eller struktur/funktion. Baserat på ACMG-standarder och riktlinjer förutspåddes MYH7 p.G823E-varianten vara en patogen variant (PVS1 + PS3 + PS4 + PM2). Sammantaget stöder dessa resultat att denna variant är skadlig och bidrar till patogenesen av HCM i dessa familjer.

C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockinmöss utvecklade svår hjärthypertrofi
För att ytterligare verifiera patogenesen av MYH7 p.G823E genererar vi C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockinmöss. C57BL/6N-MYH7em1(G823E) knockinmöss utvecklade en åldersberoende hjärthypertrofi efter födseln (figur 2A,B). Ekokardiografi avslöjade att IVS och LVPW utvecklades med ökad HR i C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) knockinmöss (tabell 1). Dessa resultat validerades också genom histologisk analys (figur 3). Det fanns inga uppenbara skillnader i LVDd, LVD, EF eller CO mellan vildtyp och heterozygota möss (tabell 1).

Figure 1
Figur 1: Ultraljudsdatainsamling . (A) Sonden är belägen på bröstbenets långa axel. (B) Sonden är placerad på bröstbenets korta axel. (C) M-läge ultraljudsbild av bröstbenets långaxelvy. Den gula pilen indikerar placeringen av interventrikulär septum. Den röda pilen indikerar den flytande ventilen. (D) M-läge ultraljudsbild av bröstbenets kortaxelvy. Den gula pilen indikerar placeringen av den främre papillärmuskeln, och utbuktningen nedan är den bakre papillärmuskeln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Den stora familjen som bär den heterozygota MYH7 G823E-varianten . (A) Probandet är markerat med en pil. Fulla och öppna cirklar och rutor indikerar drabbade respektive normala individer. (B) G823E-varianten i MYH7 bekräftad genom Sanger-sekvensering. (C) Bevarande av MYH7 G823E-området för olika arter. Den gula pilen representerar platsen för G823E i aminosyrasekvensen för olika arter, vilket är mycket bevarat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Patologiska förändringar av myokardvävnad . (A) Myokardfibrer är ordnade på ett ordnat sätt, och det finns ingen signifikant skillnad mellan varje del. (B) Ventrikulär muskelfiberhypertrofi, oordnat arrangemang och lesioner är huvudsakligen koncentrerade i den bakre väggen i vänster ventrikel och interventrikulär septum. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockinmöss grupp Kontrollgrupp
(n=4) (n=6)
HR (/min) 451,25 ± 25 786 413,83 ± 12,77 P = 0,015
LVDd (mm) 4.12 ± 0,33 3,95 ± 0,20 P = 0,330
LVD (mm) 2,95 ± 0,44 2,85 ± 0,20 P = 0,626
Utökad(%) 55.02 ± 9.52 54.31 ± 5.11 P = 0,881
CO (ml) 18.46 ± 3.05 15.30 ± 2.39 P = 0,102
IVS (mm) 1.13 ± 0,20 0,67 ± 0,07 P = 0,001
LVPW (mm) 1,40 ± 0,60 0,70 ± 0,06 P = 0,000

Tabell 1: Morfologi och funktionsanalys för p.G823E och vildtyp. Data analyserades med SPSS. Kontinuerliga variabler uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse (SD). Studentens t- eller Wilcoxon-rangsummetester för kontinuerliga variabler. P-värden under 0,05 ansågs statistiskt signifikanta.

Kompletterande fil 1. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna studie beskriver vi en kinesisk Han-familj med HCM. Genetisk analys avslöjade att en heterozygot MYH6-mutation p.G823E samsegregerar med sjukdomen hos familjemedlemmar med autosomalt dominerande arv. För att validera patogeniciteten hos G823E-mutationen och diskutera de underliggande mekanismerna skapade vi en C57BL/6N-musmodell med G823E vid mus Myh7-locus av CRISPR/Cas9-medierad genomteknik.

Fenotypiska egenskaper hos C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockinmöss utvärderades genom ekokardiografi. Multipel trabekulation och ett högre förhållande mellan icke-komprimerat till komprimerat myokardiellt skikt hittades i C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) knockinmöss jämfört med kontrollerna. De transgena mössen visade också LVPW- och IVS-hypertrofi och en ökning av HR. Hjärtats funktion visade dock ingen signifikant förändring mellan de två grupperna. Dessa resultat föreslog att en ökad HR kan uppvisa en kompensatorisk effekt på underhållskammarfunktionen under hjärtombyggnad. Ytterligare studier behövs för att observera och analysera hjärtans morfologi och funktion.

Myosin-7 (MYH7) tillhör familjen myokardiella sarkomeriska strukturella proteiner. MYH7 kodad av MYH7-genen (14q11.2; OMIM: 160760), som finns i den första patogena genen associerad med HCM 1990. Hittills har mer än 300 varianter i MYH7-genen associerats med HCM25,26. Patogeniciteten hos den stora majoriteten av variationen förblir emellertid svårfångad. Med hjälp av detta protokoll skapade vi modellmössen framgångsrikt. Vid planering och design av modellmusen finns det tre huvudfrågor som behandlas. För det första är aminosyrasekvensen för musens MYH7-protein mycket homolog med människa. För det andra uttrycks MYH7 starkt i ventriklar, liksom MYH7 hos människor. Glycinresten vid kodon 823 i MYH7 är mycket bevarad i alla tillgängliga myosinsekvenser.

MYH7 innehåller en bevarad huvudmotordomän vid N-ändpunkten, som binder aktin och har aktinaktiverad Mg· ATPasaktivitet och en nackregion, liksom en myosinsvans, som innehåller en spolad spole (CC) region vid C-terminalen. Glycinresten vid kodon 823 i nackdomänregionen av MYH7 tyder på att denna variation kan påverka hävarmens rotation vid sammandragning27,28,29,30.

WES fokuserar främst på exoner av gener, som bara står för 1,5% 8 av det totala genom-DNA. De flesta av de mänskliga genetiska sjukdomar som har identifierats är emellertid relaterade till exoner31. Detta gör WES allmänt erkänt och tillämpat i klinisk praxis. Det finns vissa etiska problem med den utbredda tillämpningen av WES. Studien av denna typ av mänskliga genetiska sjukdomar involverar ofta gränsöverskridande diskussioner. Även om forskare försöker ta bort personligt identifierbar information så mycket som möjligt, kan den enorma informationen i DNA fortfarande identifiera forskningsindividerna och till och med deras familjer. Endast standardiserade åtgärder för informationsutbyte kan säkerställa en rationell tillämpning av WES. I framtiden har WES stor betydelse för medicinska strategier för specifika genmutationer och individualiserade diagnos- och behandlingsåtgärder för flera sjukdomar.

Sammanfattningsvis identifierade vi en MYH7 heterozygot variant, p.G823E, i en stor kinesisk Han-familj med HCM som använder WES. C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockinmöss visade sig ha tjockare IVS och LVPW, och snabbare HR än vildtypsmöss. P.G823E-varianten kan försämra hävarmens rotation, vilket tyder på att denna mutation spelar en viktig roll i familjär HCM. Vårt arbete breddar informationen om mutationsspektrumet för MYH7-genen associerad med HCM och ger bättre klarhet i lämplig diagnos och genetisk rådgivning av drabbade familjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga ekonomiska intressekonflikter att deklarera.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av projektet Medical Research Fund i Guangdong-provinsen (A2022363) och det stora projektet från Guangdong-kommittén för vetenskap och teknik, Kina (bidrag nr.2022).

Vi vill tacka Qingjian Chen från University of Maryland, College Park för hjälpen under utarbetandet av detta manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5×TBE Shanghai Sangon
2× Taq Master Mix (Dye Plus) Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd.
Agarose Regu
Anesthesia machine for small animals Reward Life Technology Co., Ltd. R500
BEDTools 2.16.1
Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. VK007
DNA Marker Thermo Fisher Scientific
DNA stabilizer Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. DNAstable LD prevent DNA degradation
Electric paraffin microtome Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. HS-S7220-B
GATK v3.5
Gentra Puregene blood kit Santa Clara
Glass slide, coverslip Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd.
Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. C0107-500ml, C0109
HiSeq X-ten platform Illumina perform sequencing on the captured libraries
Injection of chorionic gonadotropin Livzon Pharmaceutical Group Inc.
Injection of pregnant mare serum gonadotropin Livzon Pharmaceutical Group Inc.
Isoflurane Local suppliers inhalation anesthesia
Microinjection microscope Nikon ECLIPSE Ts2
NanoDrop Thermo Fisher Scientific 2000
Paraffin Embedding Machine Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. HS-B7126-B
Picard (2.2.4) 20
Proteinase K Merck KGaA
samtools 1.3
Sequencer Applied Biosystems ABI 3500
Stereomicroscope Nikon SMZ745T
SureSelect Human All Exon V6 Agilent Technology Co., Ltd. exome probe
T7 ARCA mRNA Kit New England BioLabs, Inc. NEB-E2065S
Temperature box BINDER GmbH KBF-S Solid.Line
Trizma Hydrochloride Solution Sigma, Merck KGaA No. T2663
Veterinary ultrasound system Royal Philips CX50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Toepfer, C. N., et al. Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).
  2. Writing Committee Members et al. 2020 AHA/ACC guideline for the diagnosis and treatment of patients with hypertrophic cardiomyopathy: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Joint Committee on Clinical Practice Guidelines. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 162 (1), 23-106 (2021).
  3. Elliott, P., McKenna, W. J. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 363 (9424), 1881-1891 (2004).
  4. Maron, B. J., Maron, M. S. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 381 (9862), 242-255 (2013).
  5. Inoue, T., Orgel, L. E. A nonenzymatic RNA polymerase model. Science. 219 (4586), 859-862 (1983).
  6. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  7. Sachidanandam, R., et al. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature. 409 (6822), 928-933 (2001).
  8. Ng, S. B., et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature. 461 (7261), 272-276 (2009).
  9. Wong, K. M., Hudson, T. J., McPherson, J. D. Unraveling the genetics of cancer: genome sequencing and beyond. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 407-430 (2011).
  10. Mattivi, C. L., et al. Clinical utility of a phenotype-enhanced MYH7-specific variant classification framework in hypertrophic cardiomyopathy genetic testing. Circulation. Genomic and Precision Medicine. 13 (5), 453-459 (2020).
  11. Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342 (6154), New York, N.Y. 111-114 (2013).
  12. Hayashi, T., et al. Genetic background of Japanese patients with pediatric hypertrophic and restrictive cardiomyopathy. Journal of Human Genetics. 63 (9), 989-996 (2018).
  13. Gil, W. S., Ávila Vidal, L. A., Vásquez Salguero, M. A., Cajiao, M. B., Peña, C. V. Genetic variant affecting the myosin light chain 2 related to familial hypertrophic cardiomyopathy. Intractable & Rare Diseases Research. 9 (4), 229-232 (2020).
  14. Berge, K. E., Leren, T. P. Genetics of hypertrophic cardiomyopathy in Norway. Clinical Genetics. 86 (4), 355-360 (2014).
  15. McNamara, J. W., Schuckman, M., Becker, R. C., Sadayappan, S. A novel homozygous intronic variant in TNNT2 associates with feline cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 608473 (2020).
  16. Wang, W., et al. Comparative transcriptome analysis of atrial septal defect identifies dysregulated genes during heart septum morphogenesis. Gene. 575, 303-312 (2016).
  17. Andersen, P. S., et al. Diagnostic yield, interpretation, and clinical utility of mutation screening of sarcomere encoding genes in Danish hypertrophic cardiomyopathy patients and relatives. Human Mutations. 30 (3), 363-370 (2009).
  18. Nakashima, Y., et al. Lifelong clinical impact of the presence of sarcomere gene mutation in Japanese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Journal. 84 (10), 1846-1853 (2020).
  19. Hu, L. R., Kontrogianni-Konstantopoulos, A. Proteomic analysis of myocardia containing the Obscurin R4344Q mutation linked to hypertrophic cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 478 (2020).
  20. Girolami, F., et al. Novel alpha-actinin 2 variant associated with familial hypertrophic cardiomyopathy and juvenile atrial arrhythmias: a massively parallel sequencing study. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (6), 741-750 (2014).
  21. Salazar-Mendiguchia, J., et al. The p.(Cys150Tyr) variant in CSRP3 is associated with late-onset hypertrophic cardiomyopathy in heterozygous individuals. European Journal of Medical Genetics. 63 (12), 104079 (2020).
  22. Teekakirikul, P., Zhu, W., Huang, H. C., Fung, E. Hypertrophic cardiomyopathy: An overview of genetics and management. Biomolecules. 9 (12), 878 (2019).
  23. Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
  24. Song, L., et al. Mutations profile in Chinese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 209-216 (2005).
  25. Marian, A. J., Braunwald, E. Hypertrophic cardiomyopathy: Genetics, pathogenesis, clinical manifestations, diagnosis, and therapy. Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).
  26. Cann, F., et al. Phenotype-driven molecular autopsy for sudden cardiac death. Clinical Genetics. 91 (1), 22-29 (2017).
  27. Lafreniere-Roula, M., et al. Family screening for hypertrophic cardiomyopathy: Is it time to change practice guidelines. European Heart Journal. 40 (45), 3672-3681 (2019).
  28. Winkelmann, D. A., Forgacs, E., Miller, M. T., Stock, A. M. Structural basis for drug-induced allosteric changes to human beta-cardiac myosin motor activity. Nature Communications. 6, 7974 (2015).
  29. García-Giustiniani, D., et al. Phenotype and prognostic correlations of the converter region mutations affecting the β myosin heavy chain. Heart (British Cardiac Society). 101 (13), 1047-1053 (2015).
  30. Moore, J. R., Leinwand, L., Warshaw, D. M. Understanding cardiomyopathy phenotypes based on the functional impact of mutations in the myosin motor. Circulation Research. 111 (3), 375-385 (2012).
  31. Majewski, J., Schwartzentruber, J., Lalonde, E., Montpetit, A., Jabado, N. What can exome sequencing do for you. Journal of Medical Genetics. 48 (9), 580-589 (2011).

Tags

Genetik utgåva 186
Undersöka patogenesen av MYH7-mutation Gly823Glu i familjär hypertrofisk kardiomyopati med hjälp av en musmodell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xia, Y., Hu, J., Li, X., Zheng, S.,… More

Xia, Y., Hu, J., Li, X., Zheng, S., Wang, G., Tan, S., Zou, Z., Ling, Q., Yang, F., Fan, X. Investigating the Pathogenesis of MYH7 Mutation Gly823Glu in Familial Hypertrophic Cardiomyopathy using a Mouse Model. J. Vis. Exp. (186), e63949, doi:10.3791/63949 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter