Summary
我々の臨床研究で発見された家族性遺伝性心筋症ファミリーに基づいて、CRISPR/Cas9を介したゲノム工学により、マウスMYH7遺伝子座に点突然変異(G823E)を有するC57BL/6Nマウスモデルを作成し、この変異を検証しました。
Abstract
家族性肥大型心筋症(HCM、OMIM:613690)は、中国で最も一般的な心筋症です。しかし、HCMの根底にある遺伝的病因はとらえどころのないままです。
我々は以前、HCMを有する中国の大規模な漢族において、ミオシン重鎖7(MYH7)遺伝子ヘテロ接合型変異体NM_000257.4:c.G2468A(p.G823E)を同定した。このファミリーでは、バリアントG823Eは常染色体優性障害と共離します。この変異体は、MYH7タンパク質の頸部領域のレバーアームドメインに位置し、相同ミオシンおよび種の間で高度に保存されています。G823E変異体の病原性を検証するために、CRISPR/Cas9を介したゲノムエンジニアリングにより、マウスMYH7遺伝子座に点突然変異(G823E)を有するC57BL/6Nマウスモデルを作製しました。gRNAターゲティングベクターとドナーオリゴヌクレオチド(ターゲティング配列に134 bpの相同性)を設計しました。ドナーオリゴヌクレオチド中のp.G823E(GGGからGAG)部位を、相同性指向修復によってMYH7のエクソン23に導入した。サイレンシングされたp.R819(AGGからCGAへ)も挿入され、相同性指向修復後の配列のgRNA結合および再切断を防止した。心エコー検査で生後2カ月齢のMYH7 G823E/-マウスに収縮期を伴う左室後壁(LVPW)肥大を認めた.これらの結果は、同様に組織学的分析によって検証されました(図3)。
これらの結果は、G823E変異体がHCMの病因において重要な役割を果たすことを示しています。今回の知見は、家族性HCMに関連するMYH7変異体のスペクトルを豊かにし、この中国人科における遺伝カウンセリングと出生前診断の指針となる可能性がある。
Introduction
肥大型心筋症(HCM、OMIM:613690)は中国で最も一般的な心筋症であり、推定発生率は0.2%で、15万人が罹患しています1,2。
HCMを特徴付ける病理学的解剖学的特徴は非対称心室肥大であり、これはしばしば心室流出路および/または心室中隔を含む3。臨床症状は、労作性呼吸困難、疲労、および胸痛です。HCMの個々の表現型は、臨床的に潜行性から重度の心不全までの範囲の変動性を有する。HCMの患者は、治療、心臓移植、生命維持装置、および学際的なフォローアップを必要とします4。
前世紀、PCR技術はDNA5の研究方法を変えました。臨床診断のためのDNAシーケンシング法がSangerらによって発見された6。サンガー法はその後、ヒトゲノムプロジェクトに適用されましたが、このアプローチはコストと時間がかかりました7。全ゲノムシーケンス(WGS)の出現により、ヒトの遺伝病に関する洞察が新たな高みに達しましたが、コストの点で法外なままでした。全エクソームシーケンシング(WES)技術は、生殖細胞系列の変異を検出するために長い間使用されており8 、さまざまな癌のエクソームにおける体細胞ドライバー変異の特定に成功しています9。WESによるDNAエクソンまたはコード領域の検出は、ほとんどのメンデル病における病原性多様体を明らかにするために使用することができる。今日、シーケンシングのコストが下がるにつれて、WGSはゲノミクス研究の重要なツールになると期待されており、ゲノム中の病原性多様体の検出に広く使用することができます。
WES技術は、病因をさらに解明するために病原性多様体を特定するために、遺伝性心筋症でも使用されています。新たな証拠は、MYH7 10、MYH6 11、MYBPC3 12、MYL2 13、MYL3 14、TNNT215、TNNI3 16、TNNC1 17、およびTPM1 18などのサルコメア構造タンパク質遺伝子変異をコードする遺伝子がHCMの遺伝的病因の原因であることを示唆している。希少疾患の原因となる遺伝子(例えば、オブスクリン、細胞骨格カルモジュリンおよびチチン相互作用のRhoGEF(OBSCN、OMIM:608616)19、作用アルファ2(ACTN2、OMIM:102573)20、およびシステインおよびグリシンリッチタンパク質3(CSRP3、OMIM:600824)21)における病原性多様体の認識もHCMと関連しています。現在の遺伝学的研究では、HCM患者の約40%〜60%でサルコメアタンパク質遺伝子に複数の異なる病原性多様体が同定されており、HCM患者の遺伝子検査により、ほとんどの病原性多様体はミオシン重鎖(MYH7)およびミオシン結合タンパク質C(MYBPC3)で発生することが明らかになりました。しかし、HCMの遺伝的根拠はとらえどころのないままです。ヒトHCM患者の根底にあるこれらの変動の病原性を調査することは、依然として大きな課題です22。
本研究では、WESによるHCMを有する中国の漢族におけるMYH7の病原性多様体を報告する。この変異株の病原性を検証するために、CRISPR/Cas9システムを使用してC57BL/6N-Myh7em1(G823E) ノックインマウスを樹立しました。また、このバリアントのもっともらしいメカニズムについても説明します。
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Protocol
家族の歴史は、家族にインタビューすることによって得られました。この研究は、広東省中医薬病院の倫理委員会(第2019074号)によって承認されました。家族全員から書面による同意を得た。すべての動物は、広東省中医薬病院(中国、広州)の倫理ガイドラインに従って治療されます。
1. 学習テーマ
注:発端者III-3は、2019年7月に広東省中医薬病院の心臓血管外科で医師の診察を受けました。
- 発端者の詳細な家族病歴を取得します。発端者の家族全員に通知して電話をかけます。家族全員が綿密な身体検査を受けています。
- 医療記録、ECG、心エコー図、心臓カテーテル検査レポートなど、すべての臨床データの系統的レビューを実行します。
- 介入または手術中にすべての患者の心臓表現型を再確認します。
- ローカルデータベースから合計174の人口ベースの健康対照を選択します。各患者から約4.0mLの末梢静脈血を採取します。.
2.DNA抽出
注:DNAは、製造元の指示に従って市販の血液キットで抽出されます。
- メーカーのプロトコルに従って、DNA安定剤の存在下で陰イオン界面活性剤で血球を溶解します。
- 細胞ライセートに10 μLのRNase A溶液を加え、チューブを25回反転させて混合します。37°Cで15分から1時間インキュベートします。
- 塩沈殿によってタンパク質を除去します。タンパク質沈殿溶液(25 mLの蒸留水に溶解した0.25 mgのウシ血清アルブミン)と100%イソプロパノールを使用してタンパク質を沈殿させます。次に、200 μLの70%エタノールを使用し、12,000 x g/minで4°Cで15分間遠心分離を行い、DNAペレットを洗浄します。
- 500 μLの70%エタノールで沈殿させることにより、ゲノムDNAを回収します。12,000 x g で30秒間遠心分離します。ペレットを吸引し、水和溶液(1 mM EDTA、10 mM Tris·Cl, pH 7.5)。
- 分光光度計(NanoDrop 2000など)を使用して純度を測定します。精製されたDNAは通常、A260 / A280の比率が1.7〜1.9で、サイズが最大200kbです。
- DNAを2-8、-20、または-80°Cで長期間保存します。
3. 全エクソームシーケンシングとバリアント解析
注:疾患の原因となる遺伝子変異を系統的に検索するために、影響を受けた個人(II-5、II-7、III-3、III-7、III-8、III-9、およびIV-3)および非影響を受けた個人(III-2、III-5、IV-4)のエクソーム配列決定が行われました。
- 製造元の指示に従ってエクソームプローブを使用して、エクソームキャプチャを実行します。
- 認定ライブラリをHiSeq X-tenプラットフォーム上の2×150 bpのペアエンドシーケンシングに適用します。 補足ファイル1を参照してください。
- FASTQファイルをBWA v0.7.1318,19を使用してヒトリファレンスゲノム(hg19 / GRCh37)にアラインメントします。整列されたファイル(sam / bam形式のファイル)をsamtoolsで並べ替えてから、Picardを使用して重複にフラグを付けます。 補足ファイル1を参照してください。
- GATKを使用し、読み取りをローカルで再調整し、基本品質を再調整します。 補足ファイル1を参照してください。
- BEDToolsと社内のperl/pythonスクリプトによって再調整されたファイルからカバレッジと深度を含むマッピング統計を生成します。
- GATKのHaplotypeCallerツールのマルチサンプル処理モードを使用して再調整されたBAMファイルからの遺伝子型バリアント(SNVおよびインデル)。
- VQSR (バリアント品質スコアの再調整) を使用して、バリアント通話の誤検知を減らします。
- エクソームアグリゲーションコンソーシアム(ExAC)(http://exac.broadinstitute.org)、エクソームシーケンシングプロジェクト(ESP)(https://esp.gs.washington.edu)、1,000 G(http://www.1000genomes.org)などの複数のデータベースに対して、ANNOVARソフトウェア21を使用してSNVとインデルに注釈を付けます。ACMGガイドラインに従って配列変異体の病原性を解釈します。
4. サンガーシーケンシング
- サンガーシーケンシングを実行して、潜在的な原因バリアントを確認し、ABI 3500シーケンサー23を使用してファミリー内のバリアント分離を決定します。
- MYH7遺伝子(NM_000257)における変異体のプライマー配列を以下のように設計する:5'−TTCAAACAGAGACCTGCAGG-3'および5'−CGGACTTCTCTAGCGCCTCTT −3'。
- バリアントを確認し、利用可能なすべてのファミリーメンバーをスクリーニングして、ファミリー23内のバリアント分離を決定します。
5. C57BL/6N-MYH7em1(G823E) ノックインマウスの作製
- CRISPR/Cas9システムを使用して、C57BL/6N-Myh7em1(G823E) ノックインマウスを生成します。マウス Myh7 遺伝子(GenBankアクセッション番号:NM_001361607.1;アンサンブル:ENSMUSG00000053093)は、マウスの染色体14に位置し、41個のエクソンを有する。ATG開始コドンはエクソン4に、TAG終止コドンはエクソン41にあり、G823Eはエクソン23に位置しています。ターゲットサイトとしてエクソン23を選択します。
- gRNAターゲティングベクターとドナーオリゴの配列を設計します(両側に134 bpの相同配列が組み合わされたターゲティング配列で挟まれています)。
- NCBIのウェブサイトにログインし、右側の BLASTオンラインプライマーデザイン 機能をクリックしてください。
- ページ下部の プライマー-BLAST 機能をクリックして、プライマーを設計します。
- MYH7 NCBIリファレンスシーケンス番号NM_000257.4をPCRテンプレートボックスに貼り付けます。
- ターゲットフラグメント(MYH7 cDNAエクソン23とその隣接エクソン)を増幅して、エクソン21(2392-2528)の上流プライマーとエクソン25(3205-3350)の下流プライマーを設計します。上流および下流プライマーのエクソン番号を右の範囲ボックスに入力します。
- 下部にある[プライマー の取得] ボタンをクリックすると、複数のプライマーペアが自動的に生成されます。
- MYH7遺伝子をZFINデータベースに入力し、ドナーオリゴヌクレオチドのp.g823e(GGGからGAG)変異部位を導入し、p.r819(AGGからCGA)をエクソン23に導入します。サイレント変異は、相同性指向修復後のgRNAによる配列の結合および再切断を妨げる。
- 一般的な配列に従ってgRNAを設計し、両端の配列はTAATACGACTCACTATA-および-GTTTTAGAGCTAである。配列の中央は、上記の標的部位である。
- Cas9 mRNA、 in vitro 転写によって生成されたgRNA、およびドナーオリゴをKIマウス生産用の受精卵に共注入します。
- Cas9/gRNAターゲット効率検出キットを使用して、設計されたgRNAターゲットを in vitro でgRNAに転写し、メーカーのプロトコルに従って転写産物の活性を検出します(特定の検出方法についてはVK007キットの説明を参照してください)。
- T7 ARC mRNAキットの成分を解凍し、マイクロフュージで混合し、パルススピンして、チューブの底部に溶液を採取します。室温で、ARCA/NTPミックス2回から10 μL、鋳型DNA1 μg、T7 RNAポリメラーゼミックス2 μL、ヌクレアーゼフリー水20 μLの順に反応を組み立てます。
- 完全に混合し、マイクロフュージでパルススピンします。37°Cで30分間インキュベートします。
- DNase Iを2 μL加えて鋳型DNAを除去し、よく混合し、37°Cで15分間インキュベートしてmRNAを取得します。
- 血清ゴナドトロピンおよびヒト絨毛性ゴナドトロピンを、約4週齢の0.5mLシリンジで0.5mLシリンジで約48時間の2回の注射の間隔で約48時間の間隔で、予め調製されたC57BL / 6雌マウスに腹腔内注射する。
- 投与から18時間後、ホルモン注射後の頸部脱臼により、C57BL / 6雌マウスと8〜12週齢のC57BL / 6雄マウス1匹を屠殺します。.卵子と精子を別々に集めます。
- 精子は能力付与液中で能力付与される。体液の端にある精子を短命の卵細胞に取り、3〜4時間の 体外 受精のために落とします。
- 転写に成功したgRNAおよびCas9 mRNAをRNaseフリー水で in vitro で25 ng/μLおよび50 ng/μLに希釈し、マイクロインジェクションによりマウス受精卵の細胞質に導入する。良好な状態の受精卵を雌マウスの肥大卵管に移植する。結紮された雄マウスとのコケージ。
- PCRによる子犬の遺伝子型決定。次のPCR条件を使用します:94°Cで3分間、94°Cで30秒、60°Cで35秒、72°Cで35秒の35サイクル。72°Cで5分間続いてシーケンス分析を行います。
- 生後4ヶ月のマウスの尾をハサミで切り、1.5mLのEPチューブに入れます。テールピースあたり180 μLのバッファーGL、20 μLのプロテイナーゼK、および10 μLのRNase Aをマイクロ遠心チューブ(2〜5 mm)に追加します。尾を切りすぎないように注意してください。
- チューブを56°Cで一晩インキュベートします。
- 微量遠心チューブ内で1,000 x g で2分間回転させ、不純物を除去します。
- 十分な混合を行いながら、バッファーGB200 μLと無水エチルアルコール200 μLを加えます。
- スピンカラムを収集チューブに入れます。サンプルをスピンに適用し、1,000 x g で2分間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
- 500 μLのバッファーWAをスピンカラムに加え、1,000 x g で1分間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
- 700 μLのバッファーWBをスピンカラムに加え、1,000 x g で1分間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
注意: バッファーWBが100%エタノールと事前に混合されていることを確認してください。バッファーWBを追加する場合は、チューブ壁に追加して残留塩を洗い流します。 - 手順 5.5.7 を繰り返します。
- スピンカラムを収集チューブに入れ、1,000 x g で2分間遠心分離します。
- スピンカラムを新しい1.5 mLチューブに入れます。カラムメンブレンの中央に50〜200 μLの滅菌水または溶出バッファーを加え、カラムを5分間静置します。
注:滅菌水または溶出バッファーを65°Cまで加熱すると、溶出収率が向上します。 - DNAを溶出するには、カラムを1,000 x g で2分間遠心分離します。DNAの収率を高めるには、フロースルーおよび/または50〜200 μLの滅菌水または溶出バッファーをスピンカラムメンブレンの中央に加え、カラムを5分間静置します。1,000 x g で2分間遠心分離します。
- 溶出したゲノムDNAを電気泳動で定量します。
6.心臓の形態と機能の評価
注:Mモード心エコー検査を適用して、C57BL / 6N-Myh7em1(G823E) ノックインマウスの心臓の形態と機能を評価します。
- ノックインマウスを麻酔器に接続された閉じたアクリルボックスに入れ、イソフルラン(濃度:3%)がアクリルボックスに流れるように三方向インターフェースを調整します。ノックインマウスが自律的に動くのをやめたら、ノックインマウスを取り外します。
- ノックインマウスを小動物麻酔器の生命監視プラットフォームに平らに置き、酸素(流量:0.8 L / min)とイソフルラン(濃度:3%)を混合した連続吸入麻酔を行います。麻酔をかけたマウスに眼脂を塗布して、角膜の乾燥を防ぎます。
- ノックインマウスをプラットフォームに水平に固定します。プラットフォームをノックインマウスに対して30°尾側に傾けます。脱毛クリームを使用して、ノックマウスの前胸壁の毛を取り除きます。
- 隆起を動物の頭に向けてプローブを垂直に配置します。次に、プローブを反時計回りに約45°回転させます。
- 胸骨傍長軸ビューで、プローブを時計回りに90°回転させて、傍胸骨短軸ビューを観察します。プローブを90°回転させた後、y軸の変位を調整して正しいスライスを取得します。
- 心臓の長軸画像(図1C)を観察し、Mモード測定データを選択します。
- マウスの胸骨傍長軸図から超音波データを取得します(図1)。心拍数(HR)、左心室駆出率(LVEF)、心拍出量(CO)、左心室拡張末期寸法(LVDd)、LVDの左心室末期収縮期寸法(LVSd)、心室中隔(IVS)、および左心室後壁(LVPW)が測定されます。
- 測定後、マウスに酸素を供給し、自律活動が回復したらそれぞれのケージに戻します。
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Representative Results
家族の臨床プロファイル
HCMの家系血歴が得られ、 図2に示されている。文書化された家族全員が登録時にHCMと診断されました。
家族(図2A)では、発端者は患者III-7であり、46歳でHCMと左心室流出路閉塞(LVOTO)と診断され、心臓手術を受けました。患者III-3は、外科的治療を必要としない軽度のHCMを有していた。患者IV-3も軽度のHCMを有しており、これは彼の父親である患者III-3と同様であった。患者II-5はHCMを患っており、LVOTOによる51歳で欠陥を修復する手術を受けました。患者I-1と患者II-2はそれぞれ57歳と46歳で心臓事故のために死亡しました。患者I-1の病歴は利用できませんでした。患者II-7および患者III-9は息切れを呈し、HCMと診断された。
エクソーム配列解析と変異体の分離
このファミリーでは、5人のエクソームシーケンシングにより、合計19,978,731ペアのシーケンスリードの平均が生成され、平均リード長は125 bpでした。合計で、配列決定されたリードの98.72%が品質評価に合格し、ヒトリファレンスゲノムの98.66%にマッピングされました。フィルタリング後も、42を超える変異体(一塩基置換およびインデルを含む)がこれら4人の患者によって共有されました。これらのうち、27はミスセンスSNVであり、15はスプライシングを変更すると予測されていました。最後に、ACMG評価ガイドラインによれば、ヘテロ接合性c.G2468A;MYH7(NM_0002571)のp.G823E変異体は、発端者III-7および他の3人の患者で観察されました。
病原性突然変異の同定
サンガーシーケンシングにより、すべての患者で同じMYH7 p.G823E変異が確認されましたが、家族の健康な個人と174人の対照では確認されませんでした(図2B)。ヘテロ接合型MYH7 p.G823Eは、このファミリーで完全に共離しました。このファミリーでは、この変異体を保有していた患者IV-3が患者III-3からそれを継承しました。患者III-7およびIII-8は、父親から受け継いだ同じ変異体を持っていました。患者III-9の情報は入手できなかった。
この変異体は、散発性患者24によってHCMにおいて以前に記載されたが、1000G、ESP6500、ExAC、HGMD、ClinVarデータベースまたは対照対象では報告されていない。MYH7のネックドメイン領域のコドン823のグリシン残基は、利用可能なすべての脊椎動物のミオシン配列において高度に保存されています(図2C)。MYH7はHCMの原因となる既知の遺伝子であり、心臓の発生または構造/機能において重要な役割を果たします。ACMGの基準とガイドラインに基づいて、MYH7 p.G823Eバリアントは病原性バリアント(PVS1 + PS3 + PS4 + PM2)であると予測されました。まとめると、これらの結果は、この変異体が有害であり、これらのファミリーにおけるHCMの病因に寄与することを裏付けています。
C57BL/6N-Myh7em1(G823E) ノックインマウスが重篤な心肥大を発症
MYH7 p.G823Eの病態をさらに検証するために、C57BL/6N-Myh7em1(G823E) ノックインマウスを作製します。C57BL/6N-MYH7em1(G823E) ノックインマウスは、出生後に加齢依存性心肥大を発症しました(図2A、B)。心エコー検査では、C57BL/6N-Myh7em1(G823E) ノックインマウスにおいて、IVSおよびLVPWがHRの増加とともに発症することが明らかになりました(表1)。これらの結果は、同様に組織学的分析によって検証されました(図3)。野生型マウスとヘテロ接合型マウスの間で、LVDd、LVD、EF、またはCOに明らかな差はありませんでした(表1)。
図1:超音波データ収集 。 (A)プローブは胸骨の長軸上にあります。(B)プローブは胸骨の短軸上にあります。(C)胸骨の長軸図のMモード超音波画像。黄色の矢印は心室中隔の位置を示す。赤い矢印はフローティングバルブを示します。(d)胸骨の短軸図のMモード超音波画像。黄色の矢印は前乳頭筋の位置を示し、下の膨らみは後乳頭筋です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ヘテロ接合型MYH7 G823E変異体を持つ大家族 。 (A)発端者は矢印でマークされています。完全な円と白の円と四角は、それぞれ影響を受けた個人と正常な個人を示します。(B)サンガーシーケンシングによって確認されたMYH7のG823Eバリアント。(C)異なる種におけるMYH7 G823Eサイトの保全。黄色の矢印は、高度に保存されている異なる種のアミノ酸配列におけるG823Eの部位を表す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:心筋組織の病理学的変化 。 (A)心筋線維は整然と配列しており、各部に大きな差はない。 (B)心室筋線維肥大、乱れた配置、病変は、主に左心室の後壁と心室中隔に集中しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| C57BL/6N-Myh7em1(G823E)ノックインマウス群 | 対照群 | ||
| (n=4) | (n=6) | ||
| 本塁打 (/分) | 451.25 ± 25.786 | 413.83 ± 12.77 | P = 0.015 |
| LVDd (ミリメートル) | 4.12 ± 0.33 | 3.95± 0.20 | P = 0.330 |
| LVD (ミリメートル) | 2.95± 0.44 | 2.85±0.20 | P = 0.626 |
| EF(%) | 55.02 ± 9.52 | 54.31± 5.11 | P = 0.881 |
| 一酸化炭素(ミリリットル) | 18.46 ± 3.05 | 15.30 ± 2.39 | P = 0.102 |
| IVS (ミリメートル) | 1.13 ± 0.20 | ±0.67± ±0.07 | P = 0.001 |
| LVPW (ミリメートル) | 1.40 ± 0.60 | 0.70± ±0.06 | P = 0.000 |
表1:p.G823Eおよび野生型の形態および機能解析。 データはSPSSを用いて解析した。連続変数は、標準偏差 (SD) ±平均値で表されます。スチューデントのtまたはウィルコクソンの順位和は、連続変数の検定です。0.05未満のp値は統計的に有意であると見なされました。
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Discussion
本研究では,HCMを有する中国漢族の家族について述べる。遺伝学解析により、ヘテロ接合型のMYH6変異p.G823Eは、常染色体優性遺伝の家族において疾患と共分離することが明らかになりました。G823E変異の病原性を検証し、そのメカニズムを議論するために、CRISPR/Cas9を介したゲノムエンジニアリングにより、マウスMyh7遺伝子座にG823Eを備えたC57BL/6Nマウスモデルを作成しました。
C57BL/6N-Myh7em1(G823E) ノックインマウスの表現型特性を心エコー検査により評価した。C57BL/6N-Myh7em1(G823E) ノックインマウスでは、対照と比較して、多重線維柱帯と非圧縮心筋層の比率が高いことが見られました。トランスジェニックマウスはまた、LVPWおよびIVS肥大およびHRの増加を示した。しかし、心臓の機能は2つのグループ間で有意な変化を示さなかった。これらの結果から,HRの増加は心臓リモデリング時の脳室機能の維持に代償効果を示す可能性が示唆された。心臓の形態と機能を観察および分析するには、さらなる研究が必要です。
ミオシン-7(MYH7)は、心筋サルコメア構造タンパク質のファミリーに属する。MYH7遺伝子によってコードされるMYH7(14q11.2;OMIM:160760)、これは1990年にHCMに関連する最初の病原性遺伝子で発見されました。現在までに、MYH7遺伝子の300を超える変異体がHCM25,26に関連付けられています。しかしながら、変動の大部分の病原性はとらえどころのないままである。このプロトコルを使用して、モデルマウスを正常に作成しました。モデルマウスを計画および設計する場合、考慮すべき3つの主要な問題があります。まず、マウスMYH7タンパク質のアミノ酸配列は、ヒトと高度に相同である。第二に、MYH7は心室で高度に発現し、MYH7はヒトで高度に発現します。MYH7のコドン823のグリシン残基は、利用可能なすべてのミオシン配列において高度に保存されています。
MYH7は、N末端に保存された頭部モータードメインを含み、アクチンに結合し、アクチン活性化Mg·ATPアーゼ活性および頸部領域、ならびにC末端にコイルドコイル(CC)領域を含むミオシンテール。MYH7のネックドメイン領域のコドン823のグリシン残基は、この変動が収縮におけるレバーアームの回転に影響を与える可能性があることを示唆しています27、28、29、30。
WESは主に遺伝子のエクソンに焦点を当てており、これは全ゲノムDNAの1.5%8 しか占めていません。しかし、同定されているヒト遺伝病のほとんどはエクソン31に関連している。これにより、WESは広く認識され、臨床現場で適用されています。WESの広範な適用には特定の倫理的問題があります。この種のヒト遺伝病の研究には、国境を越えた議論が含まれることがよくあります。研究者は個人を特定できる情報を可能な限り削除しようとしますが、DNAに含まれる膨大な情報は、研究者の個人、さらにはその家族を再識別することができます。標準化された情報交換手段のみがWESの合理的な適用を保証することができます。将来的には、WESは特定の遺伝子変異に対する医療戦略や、複数の疾患に対する個別の診断と治療手段にとって非常に重要です。
要約すると、WESを使用して、HCMを有する中国の大規模な漢族において、MYH7ヘテロ接合型バリアントp.G823Eを同定した。C57BL/6N-Myh7em1(G823E) ノックインマウスは、野生型マウスよりもIVSとLVPWが厚く、HRが速いことがわかりました。p.G823E変異体はレバーアームの回転を損なう可能性があり、この変異が家族性HCMにおいて重要な役割を果たすことを示唆しています。私たちの研究は、HCMに関連するMYH7遺伝子の突然変異スペクトルに関する情報を広げ、影響を受けた家族の適切な診断と遺伝カウンセリングをより明確にします。
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Disclosures
著者は、宣言する金銭的利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、広東省の医学研究基金プロジェクト(A2022363)および中国広東省科学技術委員会の主要プロジェクト(助成金番号2022)によってサポートされました。
この原稿の準備に協力してくれたメリーランド大学カレッジパーク校のQingjian Chenに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5×TBE | Shanghai Sangon | ||
| 2× Taq Master Mix (Dye Plus) | Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Agarose | Regu | ||
| Anesthesia machine for small animals | Reward Life Technology Co., Ltd. | R500 | |
| BEDTools | 2.16.1 | ||
| Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit | Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. | VK007 | |
| DNA Marker | Thermo Fisher Scientific | ||
| DNA stabilizer | Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. | DNAstable LD | prevent DNA degradation |
| Electric paraffin microtome | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene blood kit | Santa Clara | ||
| Glass slide, coverslip | Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution | Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. | C0107-500ml, C0109 | |
| HiSeq X-ten platform | Illumina | perform sequencing on the captured libraries | |
| Injection of chorionic gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Injection of pregnant mare serum gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Isoflurane | Local suppliers | inhalation anesthesia | |
| Microinjection microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000 | |
| Paraffin Embedding Machine | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| Proteinase K | Merck KGaA | ||
| samtools | 1.3 | ||
| Sequencer | Applied Biosystems | ABI 3500 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | |
| SureSelect Human All Exon V6 | Agilent Technology Co., Ltd. | exome probe | |
| T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs, Inc. | NEB-E2065S | |
| Temperature box | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma Hydrochloride Solution | Sigma, Merck KGaA | No. T2663 | |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips | CX50 |
References
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