Summary
Основываясь на семействе семейных наследственных кардиомиопатий, найденных в нашей клинической работе, мы создали модель мыши C57BL / 6N с точечной мутацией (G823E) в локусе MYH7 мыши с помощью CRISPR / Cas9-опосредованной геномной инженерии для проверки этой мутации.
Abstract
Семейная гипертрофическая кардиомиопатия (HCM, OMIM: 613690) является наиболее распространенной кардиомиопатией в Китае. Тем не менее, основная генетическая этиология HCM остается неуловимой.
Ранее мы идентифицировали гетерозиготный вариант гена миозина тяжелой цепи 7 (MYH7), NM_000257,4: c.G2468A (p.G823E), в большой китайской семье Хань с HCM. В этом семействе вариант G823E косерегируется с аутосомно-доминантным расстройством. Этот вариант расположен в рычажной области шеи белка MYH7 и высоко сохраняется среди гомологичных миозинов и видов. Чтобы проверить патогенность варианта G823E, мы создали модель мыши C57BL/6N с точечной мутацией (G823E) в локусе MYH7 мыши с помощью CRISPR/Cas9-опосредованной геномной инженерии. Мы разработали векторы гРНК, нацеленные на донорские олигонуклеотиды (с последовательностями нацеливания, окруженными 134 bp гомологии). Сайт p.G823E (от GGG до GAG) в донорском олигонуклеотиде был введен в экзон 23 MYH7 путем гомологического репарации. Также был вставлен глушенный p.R819 (от AGG до CGA), чтобы предотвратить связывание гРНК и повторное расщепление последовательности после гомологического репарации. Эхокардиография выявила гипертрофию задней стенки левого желудочка (LVPW) с систолой у мышей MYH7 G823E/- в возрасте 2 месяцев. Эти результаты были также подтверждены гистологическим анализом (рисунок 3).
Эти результаты демонстрируют, что вариант G823E играет важную роль в патогенезе ГКМП. Наши результаты обогащают спектр вариантов MYH7, связанных с семейным HCM, и могут служить руководством для генетического консультирования и пренатальной диагностики в этой китайской семье.
Introduction
Гипертрофическая кардиомиопатия (HCM, OMIM: 613690) является наиболее распространенной кардиомиопатией в Китае, с оценочной заболеваемостью 0,2%, затрагивающей 150 000 человек 1,2.
Патологической анатомической особенностью, характеризующей ГКМП, является асимметричная желудочковая гипертрофия, которая часто включает желудочковый отток и/или межжелудочковую перегородку3. Клиническим проявлением является одышка при физической нагрузке, усталость и боль в груди. Индивидуальный фенотип ГКМП имеет вариабельность, варьирующуюся от клинически коварной до тяжелой сердечной недостаточности. Пациенты с ГКМП нуждаются в медицинском лечении, трансплантации сердца, оборудовании для жизнеобеспечения и междисциплинарном наблюдении4.
В прошлом веке технология ПЦР изменила способ изучения ДНК5. Метод секвенирования ДНК для клинической диагностики был открыт Сэнгером и его коллегами6. Метод Сэнгера был впоследствии применен к проекту «Геном человека», но этот подход был дорогостоящим и трудоемким7. Появление секвенирования всего генома (WGS) вывело понимание генетических заболеваний человека на новые высоты, но оно оставалось непомерно высоким с точки зрения стоимости. Технология секвенирования цельного экзома (WES) уже давно используется для обнаружения вариантов зародышевой линии8 и успешно идентифицирует мутации соматического драйвера в экзоме различных видов рака9. Обнаружение экзонов ДНК или кодирующих областей с помощью WES может быть использовано для выявления патогенных вариантов при большинстве менделевских заболеваний. Сегодня, с уменьшением стоимости секвенирования, WGS, как ожидается, станет важным инструментом в исследованиях геномики и может широко использоваться при обнаружении патогенных вариантов в геноме.
Технология WES также использовалась при наследственной кардиомиопатии для выявления патогенных вариантов для дальнейшего выяснения этиологии. Новые данные свидетельствуют о том, что гены, кодирующие структурные мутации генов саркомера белка, такие как MYH710, MYH611, MYBPC312, MYL213, MYL314, TNNT215, TNNI316, TNNC117 и TPM118 , ответственны за генетическую этиологию ГКМ. Осведомленность о патогенных вариантах в редких болезнетворных генах (например, мракурин, цитоскелетный кальмодулин и титин-взаимодействующий RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)19, действующий альфа 2 (ACTN2, OMIM: 102573)20, а также цистеин и глицин богатый белок 3 (CSRP3, OMIM: 600824)21) также была связана с HCM. Современные генетические исследования выявили несколько различных патогенных вариантов в гене саркомерного белка примерно у 40%-60% пациентов с ГКМП, а генетическое тестирование у пациентов с ГКМП показало, что большинство патогенных вариантов встречаются в тяжелой цепи миозина (MYH7) и миозин-связывающем белке C (MYBPC3). Тем не менее, генетическая основа для HCM остается неуловимой. Изучение патогенности этих вариаций, лежащих в основе пациентов с ГКМП, остается серьезной проблемой22.
В этом исследовании мы сообщаем о патогенном варианте MYH7 в китайской ханьской семье с HCM от WES. Чтобы проверить патогенность этого варианта, мы установили нокаутирующих мышей C57BL/6N-Myh7em1(G823E) с использованием системы CRISPR/Cas9. Мы также обсуждаем правдоподобные механизмы этого варианта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Истории семей были получены путем опроса членов семьи. Исследование было одобрено Комитетом по этике Провинциальной больницы китайской медицины провинции Гуандун (No 2019074). От всех членов семьи было получено информированное письменное согласие. Все животные лечатся в соответствии с этическими принципами Провинциальной больницы китайской медицины провинции Гуандун (Гуанчжоу, Китай).
1. Учебные предметы
ПРИМЕЧАНИЕ: Пробанд III-3 обратился за медицинской консультацией в отделение сердечно-сосудистой хирургии провинциальной больницы китайской медицины провинции Гуандун в июле 2019 года.
- Получите подробную семейную историю болезни пробанда. Сообщите и позвоните всем членам семьи пробанда. Все члены семьи прошли тщательные медицинские осмотры.
- Проведите систематический обзор всех клинических данных, включая медицинские записи, ЭКГ, эхокардиограммы и отчеты о катетеризации сердца.
- Повторное подтверждение сердечных фенотипов у всех пациентов во время вмешательства или операции.
- Выберите в общей сложности 174 работоспособных элемента управления на основе населения из локальной базы данных. Соберите примерно 4,0 мл периферической венозной крови у каждого пациента.
2. Извлечение ДНК
ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК извлекается с помощью коммерческого набора крови в соответствии с инструкциями производителя.
- Лизирование клеток крови анионным моющим средством в присутствии стабилизатора ДНК в соответствии с протоколом производителя.
- Добавьте 10 мкл раствора РНКАЗЫ А к клеточному лизату и перемешайте, перевернув трубку 25 раз. Инкубировать при 37 °C в течение 15 мин до 1 ч.
- Выводите белки путем осаждения соли. Используйте раствор для осаждения белка (0,25 мг бычьего сывороточного альбумина, растворенного в 25 мл дистиллированной воды) и 100% изопропанол для осаждения белков. Затем используйте 200 мкл 70% этанола и выполняйте центрифугирование при 12 000 х г/мин при 4 °C в течение 15 мин для промывки гранул ДНК.
- Восстановление геномной ДНК путем осаждения с 500 мкл 70% этанола. Центрифуга при 12 000 х г в течение 30 с. Аспирировать, а затем растворить гранулы в гидратационном растворе (1 мМ ЭДТА, 10 мМ Трис· Cl, рН 7,5).
- Используйте спектрофотометр (например, NanoDrop 2000) для определения чистоты. Очищенная ДНК обычно имеет соотношение A260/A280 от 1,7 до 1,9 и имеет размер до 200 кб.
- Храните ДНК в течение длительного времени при 2-8, -20 или -80 °C.
3. Секвенирование всего экзома и анализ вариантов
ПРИМЕЧАНИЕ: Для систематического поиска болезнетворных генных мутаций проводилось секвенирование экзома у пораженных лиц (II-5, II-7, III-3, III-7, III-8, III-9 и IV-3) и незатронутых лиц (III-2, III-5, IV-4).
- Используйте экзомный зонд в соответствии с инструкциями производителя для выполнения захвата экзома.
- Применяйте соответствующие библиотеки к 2 × парной последовательности 150 бит/с на платформе HiSeq X-ten. Пожалуйста, ознакомьтесь с дополнительным файлом 1.
- Приведите файлы FASTQ в соответствие с эталонным геномом человека (hg19/GRCh37) с помощью BWA v0.7.1318,19. Отсортируйте выровненные файлы (файлы формата sam/bam) с помощью samtools, а затем пометьте дубликаты с помощью Picard. Пожалуйста, ознакомьтесь с дополнительным файлом 1.
- Используйте GATK, перестраивайте чтение локально и перекалибруйте базовые качества. Пожалуйста, ознакомьтесь с дополнительным файлом 1.
- Создавайте картографическую статистику, включающую охват и глубину из перекалиброванных файлов с помощью BEDTools и собственных скриптов perl/python.
- Варианты генотипов (SNV и indels) из перекалиброванных файлов BAM с использованием режима обработки нескольких образцов инструмента HaplotypeCaller от GATK.
- Используйте VQSR (повторная калибровка оценки качества вариантов) для уменьшения ложных срабатываний вызова вариантов.
- Аннотируйте SNV и indels с помощью программного обеспечения ANNOVAR21 для нескольких баз данных, включая консорциум Агрегации Экзома (ExAC) (http://exac.broadinstitute.org), Проект секвенирования Экзома (ESP) (https://esp.gs.washington.edu) и 1000 G (http://www.1000genomes.org). Интерпретировать патогенность вариантов последовательности в соответствии с руководящими принципами ACMG.
4. Секвенирование Сэнгера
- Выполнение секвенирования Сэнгера для подтверждения потенциальных причинных вариантов и определения сегрегации вариантов в семействе с использованием секвенсора23 ABI 3500.
- Спроектировать последовательности праймеров для варианта в гене MYH7 (NM_000257) следующим образом: 5'-TTCAAACACAGAGACCTGCAGG-3' и 5'-CGGACTTCTCTAGCGCCTCTT-3'.
- Подтвердите вариант, просмотрите всех доступных членов семьи, чтобы определить вариант сегрегации в пределах семьи23.
5. Поколение нокаутирующих мышей C57BL/6N-MYH7em1(G823E)
- Используйте систему CRISPR/Cas9 для генерации нокаутирующих мышей C57BL/6N-Myh7em1(G823E ). Ген мыши Myh7 (номер присоединения GenBank: NM_001361607.1; Ensembl: ENSMUSG00000053093) расположен на хромосоме мыши 14 и имеет 41 экзон. AtG start codon в экзоне 4 и TAG stop codon в экзоне 41, а G823E расположен на экзоне 23. Выберите exon 23 в качестве целевого сайта.
- Спроектируйте последовательность вектора нацеливания на гРНК и донорского олиго (с последовательностью нацеливания, окруженной 134 гомологичными последовательностями bp, объединенными с обеих сторон).
- Войдите на веб-сайт NCBI и нажмите на функцию дизайна онлайн-праймера BLAST справа.
- Нажмите на функцию Primer-BLAST в нижней части страницы, чтобы создать грунтовки.
- Вставьте ссылочный порядковый номер MYH7 NCBI NM_000257.4 в поле шаблона ПЦР.
- Усиливайте целевой фрагмент (экзон 23 кДНК MYH7 и прилегающие к нему экзоны) таким образом спроектируйте восходящую грунтовку на экзоне 21 (2392-2528) и нисходящую грунтовку на экзоне 25 (3205-3350). Введите номер экзона праймеров вверх и вниз по течению в поле правого диапазона.
- Нажмите кнопку Get Primers внизу, чтобы автоматически генерировать несколько пар грунтовок.
- Введите ген MYH7 в базу данных ZFIN, введите сайт мутации p.g823e (от GGG до GAG) в донорском олигонуклеотиде и тихую мутацию p.r819 (AGG to CGA) в экзон 23. Тихая мутация предотвращает связывание и повторное разрезание последовательности гРНК после гомологического репарации.
- Конструкция гРНК в соответствии с общей последовательностью, последовательности на обоих концах taatacgactcactata- и -GTTTTAGAGCTA. Серединой последовательности является целевой сайт, упомянутый выше.
- Совместная инъекция мРНК Cas9, гРНК, генерируемой транскрипцией in vitro и донорским олиго, в оплодотворенные яйцеклетки для производства KI мышей.
- Используйте комплект обнаружения эффективности мишени Cas9/gRNA для транскрибирования разработанной мишени гРНК в гРНК in vitro и обнаружения активности транскрипта (см. инструкции по набору VK007 для конкретных методов обнаружения) в соответствии с протоколом производителя.
- Разморозьте компоненты набора мРНК T7 ARCA, перемешайте и импульсно-спините в микрофуге для сбора растворов на дно трубок. Соберите реакцию при комнатной температуре в следующем порядке: 2x ARCA/NTP смесь на 10 мкл, 1 мкг шаблонной ДНК, 2 мкл смеси T7 РНК-полимеразы и вода без нуклеазы до 20 мкл.
- Тщательно перемешайте и импульсно-вращайте в микрофуге. Инкубировать при 37 °C в течение 30 мин.
- Удалите шаблон ДНК, добавив 2 мкл ДНКазы I, хорошо перемешайте и инкубируйте при 37 °C в течение 15 мин для получения мРНК.
- Выполняют внутрибрюшинную инъекцию сывороточного гонадотропина и хорионического гонадотропина человека предварительно приготовленным самкам мышей C57BL/6 примерно в возрасте около 4 недель с помощью шприца 0,5 мл в дозе примерно 5 ЕД на мышь с интервалом между двумя инъекциями 48 ч.
- Через восемнадцать часов после дозирования принесите в жертву самок мышей C57BL/6 и одну 8-12-недельную самца мышей C57BL/6 вывихом шейки матки после инъекции гормона. Соберите яйцеклетки и сперму отдельно.
- Сперматозоиды капацитируются в емкостной жидкости. Возьмите и опустите сперму на краю жидкости в короткоживущие яйцеклетки для экстракорпорального оплодотворения в течение 3-4 ч.
- Разбавляют успешно транскрибированную гРНК и мРНК Cas9 in vitro без РНКазы водой до 25 нг/мкл и 50 нг/мкл. Вводят в цитоплазму мышиных оплодотворенных яйцеклеток путем микроинъекции. Пересадите оплодотворенные яйцеклетки в хорошем состоянии в увеличенный яйцевод самок мышей. Совместная клетка с лигированными самцами мышей.
- Генотип щенков методом ПЦР. Используйте следующие условия ПЦР: 94 °C в течение 3 мин, 35 циклов 94 °C в течение 30 с, 60 °C в течение 35 с и 72 °C в течение 35 с; 72 °C в течение 5 мин. Затем следует анализ последовательности.
- Отрежьте ножницами хвосты 4-месячных мышей и поместите их в трубку EP объемом 1,5 мл. Добавьте 180 мкл буферного GL, 20 мкл протеиназы K и 10 мкл РНКазы А на хвостовой кусок (2-5 мм) в микроцентрифужную трубку. Будьте осторожны, чтобы не подрезать слишком много хвоста.
- Инкубируйте трубку при температуре 56 °C в течение ночи.
- Открутите в микроцентрифужной трубке при 1000 х г в течение 2 мин для удаления примесей.
- Добавьте 200 мкл буферного ГБ и 200 мкл абсолютного этилового спирта при достаточном перемешивании.
- Поместите отжимную колонну в коллекционную трубку. Нанесите образец на спин и центрифугу при 1 000 х г в течение 2 мин. Отбросьте сквозной поток.
- Добавьте 500 мкл buffer WA в спиновую колонну и центрифугу при 1000 x g в течение 1 мин. Отбросьте сквозной поток.
- Добавьте 700 мкл буферного WB в спиновую колонну и центрифугу при 1000 х г в течение 1 мин. Отбросьте сквозной поток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что Buffer WB был предварительно смешан со 100% этанолом. При добавлении Buffer WB добавьте к стенке трубки, чтобы смыть остаточную соль. - Повторите шаг 5.5.7.
- Поместите отжимную колонну в сборную трубку и центрифугу при 1 000 х г в течение 2 мин.
- Поместите отжимную колонну в новую трубку объемом 1,5 мл. Добавьте 50-200 мкл стерилизованной воды или элюирующего буфера в центр мембраны колонны и дайте колонке постоять в течение 5 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нагревание стерилизованной воды или буфера элюирования до 65 °C может увеличить выход элюирования. - Для элюирования ДНК центрифугируют колонку при 1000 х г в течение 2 мин. Чтобы увеличить выход ДНК, добавьте проточную и/или 50-200 мкл стерилизованной воды или буфера элюирования к центру мембраны спиновой колонны и дайте колонке постоять в течение 5 мин. Центрифуга при 1 000 х г в течение 2 мин.
- Количественная оценка элюированной геномной ДНК с помощью электрофореза.
6. Оценка морфологии и функции сердца
ПРИМЕЧАНИЕ: Применяйте эхокардиографию M-мода для оценки морфологии сердца и функции мышей C57BL/6N-Myh7em1(G823E).
- Поместите мышей в закрытую акриловую коробку, подключенную к анестезиологическому аппарату, и отрегулируйте трехсторонний интерфейс, чтобы позволить изофлурану (концентрация: 3%) поступать в акриловую коробку. После того, как мыши-нокины перестают двигаться автономно, удалите нокин мышей.
- Поместите мышей-нокинов плоско на платформу мониторинга жизни аппарата для анестезии мелких животных и непрерывную ингаляционную анестезию, смешанную с кислородом (расход: 0,8 л / мин) и изофлураном (концентрация: 3%). Нанесите глазную смазку на обезболенных мышей, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
- Зафиксируйте мышей горизонтально на платформе. Наклоняйте платформу на 30° каудально к нокину мыши. Удалите волосы на передней грудной стенке выбивающейся мыши с помощью крема для депиляции.
- Расположите зонд вертикально с шишкой, обращенной к голове животного. Затем поверните зонд против часовой стрелки, примерно на 45°.
- В парастернальном виде с длинной осью поверните зонд на 90° по часовой стрелке, чтобы наблюдать за парастернальным видом с короткой осью. После поворота зонда на 90° отрегулируйте смещение по оси Y, чтобы получить правильный срез.
- Наблюдайте за длинноосевым изображением сердца (рисунок 1C), а затем выберите данные измерений в М-режиме.
- Получение ультразвуковых данных с парастернальных длинноосевых видов мышей (рисунок 1). Измеряется частота сердечных сокращений (HR), фракция выброса левого желудочка (LVEF), сердечный выброс (CO), диастолический размер левого желудочка (LVDd), LVD левого желудочкового конечного систолического размера (LVSd), межжелудочковая перегородка (IVS) и задняя стенка левого желудочка (LVPW).
- После измерения обеспечьте мышей кислородом и поместите их обратно в соответствующие клетки, когда они восстановят автономную активность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Клинический профиль семей
Семейные родословные ГКМП были получены и показаны на рисунке 2. Все зарегистрированные члены семьи были диагностированы с HCM при зачислении.
В семье (Рисунок 2А) пробаном был пациент III-7, у которого в 46 лет была диагностирована ГКМП и обструкция пути оттока левого желудочка (ЛВОТО) и он перенес кардиохирургическую операцию. Пациент III-3 имел незначительный ГКМП, который не требовал хирургического лечения. Пациент IV-3 также имел незначительный ГКМП, который был похож на его отца, пациента III-3. Пациент II-5 перенес HCM и перенес операцию по восстановлению дефекта в возрасте 51 года из-за LVOTO. Пациент I-1 и пациент II-2 умерли из-за сердечных аварий в возрасте 57 и 46 лет соответственно. История болезни пациента I-1 была недоступна. У пациентов II-7 и III-9 наблюдалась одышка и диагноз ГКМП.
Анализ последовательности экзомов и сегрегация вариантов
В этом семействе секвенирование экзома пяти особей дало среднее значение в общей сложности 19 978 731 пары последовательных считываний со средней длиной чтения 125 bp. В общей сложности 98,72% секвенированных считываний прошли оценку качества и были сопоставлены с 98,66% эталонного генома человека. Даже после фильтрации более 42 вариантов (включая однонуклеотидные замены и индели) были общими для этих четырех пациентов. Из них 27 были пропущенными SPV, 15, по прогнозам, изменят сплайсинг. Наконец, согласно рекомендациям ACMG по рейтингу, гетерозиготный c.G2468A; p.G823E вариант MYH7 (NM_0002571) наблюдался у пробанда III-7, а также у трех других пациентов.
Идентификация патогенной мутации
Секвенирование Сэнгера подтвердило один и тот же вариант MYH7 p.G823E у всех пациентов, но не у здоровых людей в семьях и 174 контрольных группах (рисунок 2B). Гетерозиготный MYH7 p.G823E полностью сегрегирован в этом семействе. В этой семье пациенты IV-3, которые имели этот вариант, унаследовали его от пациента III-3. Пациенты III-7 и III-8 несли тот же вариант, который был унаследован от их отца. Информация о пациенте III-9 была недоступна.
Этот вариант, ранее описанный в HCM спорадическим пациентом24, не был зарегистрирован в базах данных 1000 G, ESP6500, ExAC, HGMD, ClinVar или контрольных субъектах. Остаток глицина в кодоне 823 в области домена шеи MYH7 высоко сохраняется во всех доступных последовательностях миозина позвоночных (рисунок 2C). MYH7 является известным ГКМ-каузивным геном и играет важную роль в развитии сердца или структуре/функции. Основываясь на стандартах и рекомендациях ACMG, вариант MYH7 p.G823E был предсказан как патогенный вариант (PVS1 + PS3 + PS4 + PM2). Взятые вместе, эти результаты подтверждают, что этот вариант вреден и способствует патогенезу ГКМП в этих семьях.
У мышей C57BL/6N-Myh7em1(G823E) развилась тяжелая гипертрофия сердца
Для дальнейшей проверки патогенеза MYH7 p.G823E мы генерируем нокаутных мышей C57BL/6N-Myh7em1(G823E). У мышей C57BL/6N-MYH7em1(G823E) после рождения развилась возрастная гипертрофия сердца (рисунок 2A,B). Эхокардиография показала, что IVS и LVPW развивались с повышенным ЧСС у мышей C57BL/6N-Myh7em1(G823E) (таблица 1). Эти результаты были также подтверждены гистологическим анализом (рисунок 3). Не было никаких очевидных различий в LVDd, LVD, EF или CO между мышами дикого типа и гетерозиготными мышами (таблица 1).
Рисунок 1: Сбор ультразвуковых данных. (А) Зонд расположен на длинной оси грудины. (B) Зонд расположен на короткой оси грудины. (C) М-модное ультразвуковое изображение длинноосевого вида грудины. Желтая стрелка указывает на расположение межжелудочковой перегородки. Красная стрелка указывает на плавающий клапан. (D) М-режимное ультразвуковое изображение короткоосевого вида грудины. Желтая стрелка указывает на расположение передней сосочковой мышцы, а выпуклость внизу — заднюю сосочковую мышцу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Большое семейство, несущее гетерозиготный вариант MYH7 G823E. (A) Полоса обозначена стрелкой. Полные и открытые круги и квадраты указывают на пораженных и нормальных людей соответственно. (B) Вариант G823E в MYH7, подтвержденный секвенированием Сэнгера. (C) Сохранение участка MYH7 G823E у различных видов. Желтая стрелка представляет участок G823E в аминокислотной последовательности различных видов, который хорошо сохраняется. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Патологические изменения ткани миокарда. (А) Волокна миокарда расположены упорядоченным образом, и нет существенной разницы между каждой частью. (Б) Гипертрофия желудочковых мышечных волокон, неупорядоченное расположение и поражения в основном сосредоточены в задней стенке левого желудочка и межжелудочковой перегородке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| C57BL/6N-Myh7em1(G823E) группа нокаутирующих мышей | Контрольная группа | ||
| (n=4) | (n=6) | ||
| ЧСС (/мин) | 451.25 ± 25.786 | 413.83 ± 12.77 | P = 0,015 |
| LVDd (мм) | 4.12 ± 0.33 | 3.95 ± 0.20 | P = 0,330 |
| LVD (мм) | 2.95 ± 0.44 | 2.85 ± 0.20 | P = 0,626 |
| ЭФ (%) | 55.02 ± 9.52 | 54.31 ± 5.11 | P = 0,881 |
| CO (мл) | 18.46 ± 3.05 | 15.30 ± 2.39 | P = 0,102 |
| ИВС (мм) | 1.13 ± 0.20 | 0,67 ± 0,07 | P = 0,001 |
| LVPW (мм) | 1.40 ± 0.60 | 0.70 ± 0.06 | P = 0,000 |
Таблица 1: Морфология и анализ функций для p.G823E и дикого типа. Данные анализировались с помощью SPSS. Непрерывные переменные выражаются как среднее ± стандартного отклонения (SD). Тесты на ранговую сумму Стьюдента t или Уилкоксона для непрерывных переменных. Значения P ниже 0,05 были признаны статистически значимыми.
Дополнительный файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании мы описываем одну китайскую ханьскую семью с HCM. Генетический анализ показал, что гетерозиготная мутация MYH6 p.G823E сегрегируется с заболеванием у членов семьи с аутосомно-доминантным наследованием. Чтобы проверить патогенность мутации G823E и обсудить основные механизмы, мы создали модель мыши C57BL / 6N с G823E в локусе Myh7 мыши с помощью CRISPR / Cas9-опосредованной геномной инженерии.
Фенотипические характеристики нокиновых мышей C57BL/6N-Myh7em1(G823E) оценивались с помощью эхокардиографии. Множественная трабекуляция и более высокое соотношение неуплотненного и уплотненного слоя миокарда были обнаружены у мышей C57BL/6N-Myh7em1(G823E) по сравнению с контрольной группой. Трансгенные мыши также показали гипертрофию LVPW и IVS и увеличение ЧСС. Тем не менее, функция сердца не показала существенных изменений между двумя группами. Эти результаты показали, что повышенный ЧСС может проявлять компенсаторное влияние на поддерживающую функцию желудочков во время ремоделирования сердца. Необходимы дальнейшие исследования для наблюдения и анализа морфологии и функции сердца.
Миозин-7 (MYH7) относится к семейству саркомерических структурных белков миокарда. MYH7, кодируемый геном MYH7 (14q11.2; OMIM: 160760), который обнаружен в первом патогенном гене, связанном с HCM в 1990 году. На сегодняшний день более 300 вариантов гена MYH7 были связаны с HCM25,26. Однако патогенность подавляющего большинства вариаций остается неуловимой. Используя этот протокол, мы успешно создали модель мышей. При планировании и проектировании модельной мыши рассматриваются три основных вопроса. Во-первых, аминокислотная последовательность мышиного белка MYH7 очень гомологична человеческой. Во-вторых, MYH7 высоко экспрессируется в желудочках, а также MYH7 у людей. Остаток глицина в кодоне 823 в MYH7 высоко сохраняется во всех доступных последовательностях миозина.
MYH7 содержит сохраненный головной двигательный домен на N-конце, который связывает актин и имеет актин-активированный Mg· Активность АТФазы и область шеи, а также миозиновый хвост, который содержит область спиральной катушки (CC) на С-конце. Остаток глицина в кодоне 823 в области шейного домена MYH7 предполагает, что это изменение может влиять на вращение рычага при сокращении 27,28,29,30.
WES в основном фокусируется на экзонах генов, которые составляют только 1,5% 8 от общей ДНК генома. Тем не менее, большинство генетических заболеваний человека, которые были идентифицированы, связаны с экзонами31. Это делает WES широко признанным и применяемым в клинической практике. Существуют определенные этические проблемы с широким применением WES. Изучение этого вида генетических заболеваний человека часто включает в себя трансграничные дискуссии. Хотя исследователи пытаются максимально удалить личную информацию, огромная информация, содержащаяся в ДНК, все еще может повторно идентифицировать исследователей и даже их семьи. Только стандартизированные меры по обмену информацией могут обеспечить рациональное применение WES. В будущем WES имеет большое значение для медицинских стратегий для конкретных генных мутаций и индивидуальных мер диагностики и лечения нескольких заболеваний.
Таким образом, мы идентифицировали гетерозиготный вариант MYH7, p.G823E, в большой китайской семье Хань с HCM с использованием WES. Было обнаружено, что мыши C57BL/6N-Myh7em1(G823E) имеют более толстые IVS и LVPW и более быстрый HR, чем мыши дикого типа. Вариант p.G823E может ухудшить вращение рычага, предполагая, что эта мутация играет важную роль в семейном HCM. Наша работа расширяет информацию о спектре мутаций гена MYH7, связанного с HCM, и обеспечивает лучшую ясность в соответствующей диагностике и генетическом консультировании пострадавших семей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют финансовых конфликтов интересов для декларирования.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана проектом Фонда медицинских исследований провинции Гуандун (A2022363) и крупным проектом Гуандунского комитета по науке и технологиям, Китай (грант No 2022).
Мы хотели бы поблагодарить Цинцзяня Чэня из Университета Мэриленда, Колледж-Парк за помощь во время подготовки этой рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5×TBE | Shanghai Sangon | ||
| 2× Taq Master Mix (Dye Plus) | Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Agarose | Regu | ||
| Anesthesia machine for small animals | Reward Life Technology Co., Ltd. | R500 | |
| BEDTools | 2.16.1 | ||
| Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit | Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. | VK007 | |
| DNA Marker | Thermo Fisher Scientific | ||
| DNA stabilizer | Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. | DNAstable LD | prevent DNA degradation |
| Electric paraffin microtome | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene blood kit | Santa Clara | ||
| Glass slide, coverslip | Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution | Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. | C0107-500ml, C0109 | |
| HiSeq X-ten platform | Illumina | perform sequencing on the captured libraries | |
| Injection of chorionic gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Injection of pregnant mare serum gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Isoflurane | Local suppliers | inhalation anesthesia | |
| Microinjection microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000 | |
| Paraffin Embedding Machine | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| Proteinase K | Merck KGaA | ||
| samtools | 1.3 | ||
| Sequencer | Applied Biosystems | ABI 3500 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | |
| SureSelect Human All Exon V6 | Agilent Technology Co., Ltd. | exome probe | |
| T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs, Inc. | NEB-E2065S | |
| Temperature box | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma Hydrochloride Solution | Sigma, Merck KGaA | No. T2663 | |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips | CX50 |
References
- Toepfer, C. N., et al. Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).
- Writing Committee Members et al. 2020 AHA/ACC guideline for the diagnosis and treatment of patients with hypertrophic cardiomyopathy: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Joint Committee on Clinical Practice Guidelines. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 162 (1), 23-106 (2021).
- Elliott, P., McKenna, W. J.
- Maron, B. J., Maron, M. S.
- Inoue, T., Orgel, L. E. A nonenzymatic RNA polymerase model. Science. 219 (4586), 859-862 (1983).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Sachidanandam, R., et al. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature. 409 (6822), 928-933 (2001).
- Ng, S. B., et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature. 461 (7261), 272-276 (2009).
- Wong, K. M., Hudson, T. J., McPherson, J. D. Unraveling the genetics of cancer: genome sequencing and beyond. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 407-430 (2011).
- Mattivi, C. L., et al. Clinical utility of a phenotype-enhanced MYH7-specific variant classification framework in hypertrophic cardiomyopathy genetic testing. Circulation. Genomic and Precision Medicine. 13 (5), 453-459 (2020).
- Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342 (6154), New York, N.Y. 111-114 (2013).
- Hayashi, T., et al. Genetic background of Japanese patients with pediatric hypertrophic and restrictive cardiomyopathy. Journal of Human Genetics. 63 (9), 989-996 (2018).
- Gil, W. S., Ávila Vidal, L. A., Vásquez Salguero, M. A., Cajiao, M. B., Peña, C. V. Genetic variant affecting the myosin light chain 2 related to familial hypertrophic cardiomyopathy. Intractable & Rare Diseases Research. 9 (4), 229-232 (2020).
- Berge, K. E., Leren, T. P.
- McNamara, J. W., Schuckman, M., Becker, R. C., Sadayappan, S. A novel homozygous intronic variant in TNNT2 associates with feline cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 608473 (2020).
- Wang, W., et al. Comparative transcriptome analysis of atrial septal defect identifies dysregulated genes during heart septum morphogenesis. Gene. 575, 303-312 (2016).
- Andersen, P. S., et al. Diagnostic yield, interpretation, and clinical utility of mutation screening of sarcomere encoding genes in Danish hypertrophic cardiomyopathy patients and relatives. Human Mutations. 30 (3), 363-370 (2009).
- Nakashima, Y., et al. Lifelong clinical impact of the presence of sarcomere gene mutation in Japanese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Journal. 84 (10), 1846-1853 (2020).
- Hu, L. R., Kontrogianni-Konstantopoulos, A. Proteomic analysis of myocardia containing the Obscurin R4344Q mutation linked to hypertrophic cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 478 (2020).
- Girolami, F., et al. Novel alpha-actinin 2 variant associated with familial hypertrophic cardiomyopathy and juvenile atrial arrhythmias: a massively parallel sequencing study. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (6), 741-750 (2014).
- Salazar-Mendiguchia, J., et al. The p.(Cys150Tyr) variant in CSRP3 is associated with late-onset hypertrophic cardiomyopathy in heterozygous individuals. European Journal of Medical Genetics. 63 (12), 104079 (2020).
- Teekakirikul, P., Zhu, W., Huang, H. C., Fung, E. Hypertrophic cardiomyopathy: An overview of genetics and management. Biomolecules. 9 (12), 878 (2019).
- Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
- Song, L., et al. Mutations profile in Chinese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 209-216 (2005).
- Marian, A. J., Braunwald, E. Hypertrophic cardiomyopathy: Genetics, pathogenesis, clinical manifestations, diagnosis, and therapy. Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).
- Cann, F., et al. Phenotype-driven molecular autopsy for sudden cardiac death. Clinical Genetics. 91 (1), 22-29 (2017).
- Lafreniere-Roula, M., et al. Family screening for hypertrophic cardiomyopathy: Is it time to change practice guidelines. European Heart Journal. 40 (45), 3672-3681 (2019).
- Winkelmann, D. A., Forgacs, E., Miller, M. T., Stock, A. M. Structural basis for drug-induced allosteric changes to human beta-cardiac myosin motor activity. Nature Communications. 6, 7974 (2015).
- García-Giustiniani, D., et al. Phenotype and prognostic correlations of the converter region mutations affecting the β myosin heavy chain. Heart (British Cardiac Society). 101 (13), 1047-1053 (2015).
- Moore, J. R., Leinwand, L., Warshaw, D. M. Understanding cardiomyopathy phenotypes based on the functional impact of mutations in the myosin motor. Circulation Research. 111 (3), 375-385 (2012).
- Majewski, J., Schwartzentruber, J., Lalonde, E., Montpetit, A., Jabado, N. What can exome sequencing do for you. Journal of Medical Genetics. 48 (9), 580-589 (2011).
