Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Undersøkelse av patogenesen av MYH7-mutasjonen Gly823Glu i familiær hypertrofisk kardiomyopati ved hjelp av en musemodell

Published: August 8, 2022 doi: 10.3791/63949
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 4, 1,2, 1,2, 1,2, 2,5, 4, 1,2
1Department of Cardiovascular Surgery, Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, 2The Second Clinical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, 3Department of Cardiovascular Surgery, The First Affiliated Hospital, Jinan University, 4Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, 5Department of Anesthesiology, Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Basert på den familiære arvelige kardiomyopatifamilien som ble funnet i vårt kliniske arbeid, opprettet vi en C57BL / 6N musemodell med en punktmutasjon (G823E) ved musen MYH7-lokus gjennom CRISPR / Cas9-mediert genomteknikk for å verifisere denne mutasjonen.

Abstract

Familiær hypertrofisk kardiomyopati (HCM, OMIM: 613690) er den vanligste kardiomyopatien i Kina. Imidlertid forblir den underliggende genetiske etiologien til HCM unnvikende.

Vi har tidligere identifisert en myosin tung kjede 7 (MYH7) gen heterozygot variant, NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E), i en stor kinesisk Han-familie med HCM. I denne familien kosegregerer variant G823E med en autosomal dominant lidelse. Denne varianten ligger i spakarmdomenet til nakkeområdet til MYH7-proteinet og er svært konservert blant homologe myosiner og arter. For å verifisere patogeniteten til G823E-varianten produserte vi en C57BL/6N-musemodell med punktmutasjon (G823E) ved musens MYH7-lokus med CRISPR/Cas9-mediert genomteknikk. Vi designet gRNA-målrettingsvektorer og donoroligonukleotider (med målrettingssekvenser flankert av 134 bp homologi). P.G823E (GGG til GAG) -stedet i donoroligonukleotid ble introdusert i ekson 23 av MYH7 ved homologi-rettet reparasjon. En lydløs p.R819 (AGG til CGA) ble også satt inn for å forhindre gRNA-binding og re-spalting av sekvensen etter homologi-rettet reparasjon. Ekkokardiografi viste venstre ventrikkels bakre vegg (LVPW) hypertrofi med systole i MYH7 G823E/- mus ved 2 måneders alder. Disse resultatene ble også validert ved histologisk analyse (figur 3).

Disse resultatene viser at G823E-varianten spiller en viktig rolle i patogenesen av HCM. Våre funn beriker spekteret av MYH7-varianter knyttet til familiær HCM og kan gi veiledning for genetisk rådgivning og fosterdiagnostikk i denne kinesiske familien.

Introduction

Hypertrofisk kardiomyopati (HCM, OMIM: 613690) er den vanligste kardiomyopatien i Kina, med en estimert forekomst på 0,2%, som påvirker 150 000 personer 1,2.

Det patologiske anatomiske trekket som karakteriserer HCM er asymmetrisk ventrikkelhypertrofi, som ofte involverer ventrikkels utstrømningskanal og/eller interventrikulær septum3. Den kliniske manifestasjonen er anstrengende dyspné, tretthet og brystsmerter. Den individuelle fenotypen av HCM har variabilitet som spenner fra klinisk lumsk til alvorlig hjertesvikt. Pasienter med HCM krever medisinsk behandling, hjertetransplantasjon, livsstøtteutstyr og tverrfaglig oppfølging4.

I det siste århundret har PCR-teknologi endret måten vi studerer DNA5 på. En DNA-sekvenseringsmetode for klinisk diagnose ble oppdaget av Sanger og kolleger6. Sanger-teknikken ble senere brukt på Human Genome Project, men denne tilnærmingen var kostbar og tidkrevende7. Ankomsten av helgenomsekvensering (WGS) brakte innsikt i menneskelig genetisk sykdom til nye høyder, men det forble uoverkommelig når det gjelder kostnad. Hel-eksomsekvenseringsteknologi (WES) har lenge vært brukt til å oppdage kimlinjevarianter8 og har vært vellykket i å identifisere somatiske drivermutasjoner i eksomet av ulike kreftformer9. Påvisning av DNA-eksoner eller kodende regioner ved WES kan brukes til å avsløre patogene varianter i de fleste mendelske sykdommer. I dag, med de reduserte kostnadene ved sekvensering, forventes WGS å bli et viktig verktøy i genomforskning og kan brukes mye i påvisning av patogene varianter i genomet.

WES-teknologi har også blitt brukt i arvelig kardiomyopati for å identifisere patogene varianter for ytterligere å belyse etiologien. Nye bevis har implisert at gener som koder for sarkomere strukturelle proteingenmutasjoner, som MYH7 10, MYH6 11, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL3 14, TNNT215, TNNI3 16, TNNC117 ogTPM1 18 er ansvarlige for HCMs genetiske etiologi. Bevissthet om patogene varianter i sjeldne sykdomsfremkallende gener (f.eks. obscurin, cytoskeletal calmodulin og titin-interagerende RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)19, virkende alfa 2 (ACTN2, OMIM: 102573)20, og cystein- og glycinrikt protein 3 (CSRP3, OMIM: 600824)21) har også vært assosiert med HCM. Nåværende genetiske studier har identifisert flere forskjellige patogene varianter i det sarkomeriske proteingenet hos ca. 40% -60% av HCM-pasientene, og genetisk testing hos HCM-pasienter viste at de fleste patogene varianter forekommer i myosin tung kjede (MYH7) og myosinbindende protein C (MYBPC3). Imidlertid er det genetiske grunnlaget for HCM fortsatt unnvikende. Å utforske patogeniteten til disse variasjonene som ligger til grunn for de menneskelige HCM-pasientene, er fortsatt en stor utfordring22.

I denne studien rapporterer vi en patogen variant i MYH7 i en kinesisk Han-familie med HCM av WES. For å verifisere patogeniteten til denne varianten, etablerte vi en C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) knockinmus ved hjelp av CRISPR / Cas9-systemet. Vi diskuterer også plausible mekanismer for denne varianten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Historiene til familiene ble innhentet ved å intervjue familiemedlemmene. Studien ble godkjent av etikkkomiteen ved Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine (nr. 2019074). Det ble innhentet informert skriftlig samtykke fra alle familiemedlemmene. Alle dyrene behandles i samsvar med de etiske retningslinjene fra Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine (Guangzhou, Kina).

1. Studieemner

MERK: Proband III-3 søkte medisinsk rådgivning ved Institutt for kardiovaskulær kirurgi ved Guangdong provinssykehus for kinesisk medisin i juli 2019.

  1. Få detaljert familiemedisinsk historie av probandet. Gi beskjed og ring alle familiemedlemmene til probandet. Alle familiemedlemmene har gjennomgått grundige fysiske undersøkelser.
    1. Utfør en systematisk gjennomgang av alle kliniske data, inkludert medisinske journaler, EKG, ekkokardiogrammer og hjertekateteriseringsrapporter.
    2. Bekrefte hjertefenotyper hos alle pasientene under intervensjon eller kirurgi.
  2. Velg totalt 174 befolkningsbaserte sunne kontroller fra den lokale databasen. Samle ca. 4,0 ml perifert venøst blod fra hver pasient.

2. DNA-ekstraksjon

MERK: DNA ekstraheres med et kommersielt blodsett i henhold til produsentens instruksjoner.

  1. Lyse blodceller med et anionisk vaskemiddel i nærvær av en DNA-stabilisator etter produsentens protokoll.
  2. Tilsett 10 μL RNase A-oppløsning til cellelysatet og bland ved å invertere røret 25 ganger. Inkuber ved 37 °C i 15 minutter til 1 time.
  3. Fjern proteiner ved saltutfelling. Bruk proteinutfellingsoppløsning (0,25 mg bovint serumalbumin oppløst i 25 ml destillert vann) og 100% isopropanol for å utfelle proteiner. Bruk deretter 200 μL 70% etanol og utfør sentrifugering ved 12 000 x g / min ved 4 ° C i 15 minutter for å vaske DNA-pelleten.
  4. Gjenopprett genomisk DNA ved utfelling med 500 μL 70% etanol. Sentrifuge ved 12 000 x g i 30 s. Aspirer og oppløs deretter pelleten i hydreringsløsning (1 mM EDTA, 10 mM Tris· Cl, pH 7,5).
  5. Bruk et spektrofotometer (f.eks. NanoDrop 2000) for å bestemme renheten. Renset DNA har vanligvis et A260/A280-forhold mellom 1,7 og 1,9 og er opptil 200 kb i størrelse.
  6. Oppbevar DNA i lang tid ved 2-8, -20 eller -80 °C.

3. Hele eksomsekvensering og variantanalyse

MERK: For systematisk å søke etter sykdomsfremkallende genmutasjoner ble eksomsekvensering hos berørte individer (II-5, II-7, III-3, III-7, III-8, III-9 og IV-3) og upåvirkede individer (III-2, III-5, IV-4) utført.

  1. Bruk eksomsonde i henhold til produsentens instruksjoner for å utføre eksomfangsten.
  2. Bruk de kvalifiserte bibliotekene på 2 × 150 bp paired-end sekvensering på HiSeq X-ten-plattformen. Se Tilleggsfil 1.
  3. Juster FASTQ-filer til det menneskelige referansegenomet (hg19/GRCh37) med BWA v0.7.1318,19. Sorter de justerte filene (sam/bam-formatfiler) med samtools, og flagg deretter duplikater ved hjelp av Picard. Se Tilleggsfil 1.
  4. Bruk GATK, juster avlesninger lokalt og kalibrer basekvaliteter på nytt. Se Tilleggsfil 1.
  5. Generer kartstatistikk som inkluderer dekning og dybde fra rekalibrerte filer av BEDTools og interne perl/python-skript.
  6. Genotypevarianter (SNV-er og indels) fra rekalibrerte BAM-filer ved hjelp av multi-sample prosesseringsmodusen til HaplotypeCaller-verktøyet fra GATK.
  7. Bruk VQSR (rekalibrering av variantkvalitetspoeng) for å redusere falske positiver ved variantanrop.
  8. Kommenter SNV-er og indels ved hjelp av ANNOVAR-programvare21 mot flere databaser, inkludert Exome Aggregation Consortium (ExAC) (http://exac.broadinstitute.org), Exome Sequencing Project (ESP) (https://esp.gs.washington.edu) og 1000 G (http://www.1000genomes.org). Tolke patogeniteten til sekvensvariantene i henhold til ACMG-retningslinjene.

4. Sanger-sekvensering

  1. Utfør Sanger-sekvensering for å bekrefte potensielle årsaksvarianter og bestemme variantsegregering i familien ved hjelp av en ABI 3500 sequencer23.
  2. Design primersekvenser for varianten i MYH7-genet (NM_000257) som følger: 5'-TTCAAACACAGAGACCTGCAGG-3' og 5'- CGGACTTCTCTAGCGCCTCTT -3'.
  3. Bekreft en variant, skjerm alle tilgjengelige familiemedlemmer for å bestemme variantsegregering i familien23.

5. Generering av C57BL/6N-MYH7em1(G823E) knockinmus

  1. Bruk CRISPR/Cas9-systemet til å generere C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockinmus. Musen Myh7-genet (GenBank-tiltredelsesnummer: NM_001361607.1; Ensembl: ENSMUSG00000053093) ligger på musekromosom 14 og har 41 eksoner. ATG starter kodon i ekson 4 og TAG stoppkodon i ekson 41, og G823E ligger på ekson 23. Velg ekson 23 som målsted.
  2. Design sekvensen av gRNA-målrettingsvektor og donoroligo (med målrettingssekvens, flankert av 134 bp homologe sekvenser kombinert på begge sider).
    1. Logg inn på NCBI-nettstedet og klikk på BLAST online primerdesignfunksjon til høyre.
    2. Klikk på Primer-BLAST-funksjonen nederst på siden for å designe primere.
    3. Lim inn MYH7 NCBI-referansesekvensnummeret NM_000257.4 i PCR-malboksen.
    4. Forsterk målfragmentet (MYH7 cDNA exon 23 og dets tilstøtende eksoner) slik at oppstrøms primer på ekson 21 (2392-2528) og nedstrøms primer på ekson 25 (3205-3350). Skriv inn eksonnummeret til primerne oppstrøms og nedstrøms i boksen til høyre.
    5. Klikk på Get Primers-knappen nederst for automatisk å generere flere par primere.
  3. Legg inn MYH7-genet i ZFIN-databasen, introduser p.g823e (GGG til GAG) mutasjonsstedet i donoroligonukleotidet og den stille mutasjonen p.r819 (AGG til CGA) i ekson 23. Den stille mutasjonen forhindrer binding og re-cutting av sekvensen av gRNA etter homologi-rettet reparasjon.
    1. Design gRNA i henhold til den generelle sekvensen, sekvensene i begge ender er TAATACGACTCACTATA- og -GTTTTAGAGCTA. Midt i sekvensen er målstedet nevnt ovenfor.
  4. Co-inject Cas9 mRNA, gRNA generert ved in vitro transkripsjon og donor oligo i befruktede egg for KI museproduksjon.
    1. Bruk Cas9/gRNA-måleffektivitetsdeteksjonssettet til å transkribere det utformede gRNA-målet til gRNA in vitro og oppdage aktiviteten til transkripsjonen (se VK007-settinstruksjonene for spesifikke deteksjonsmetoder) i henhold til produsentens protokoll.
    2. Tine T7 ARCA mRNA-settkomponentene, bland og pulsspinn i en mikrofuge for å samle løsninger til bunnen av rørene. Monter reaksjonen ved romtemperatur i følgende rekkefølge: 2x ARCA / NTP-blanding til 10 μL, 1 μg mal-DNA, 2 μL T7 RNA-polymeraseblanding og nukleasefritt vann til 20 μL.
    3. Bland grundig og pulsspinn i en mikrofuge. Inkuber ved 37 °C i 30 minutter.
    4. Fjern mal-DNA ved å tilsette 2 μL DNase I, bland godt og inkuber ved 37 °C i 15 minutter for å oppnå mRNA.
    5. Utfør intraperitoneal injeksjon av serumgonadotropin og humant choriongonadotropin i forhåndstilberedte C57BL/6 hunnmus ved ca. 4 ukers alder med en 0,5 ml sprøyte i en dose på ca. 5 E per mus med et intervall mellom de to injeksjonene på 48 timer.
    6. Atten timer etter dosering ofrer C57BL/6 hunnmus og en 8-12 uker gammel C57BL/6 hannmus ved cervikal dislokasjon etter hormoninjeksjon. Samle egg og sæd separat.
    7. Sperma er kapasitert i kapasiteringsvæsken. Ta og slipp sæden på kanten av væsken inn i de kortvarige eggcellene for in vitro befruktning i 3-4 timer.
    8. Fortynn det vellykket transkriberte gRNA og Cas9 mRNA in vitro med RNasefritt vann til 25 ng / μL og 50 ng / μL. Introduser cytoplasma av mus befruktede egg ved mikroinjeksjon. Transplanterte befruktede egg i god stand inn i den forstørrede ovidukten til hunnmusene. Co-bur med ligerte hannmus.
  5. Genotype valpene ved PCR. Bruk følgende PCR-forhold: 94 °C i 3 minutter, 35 sykluser på 94 °C i 30 s, 60 °C i 35 s og 72 °C i 35 s; 72 °C i 5 min. Følg med sekvensanalyse.
    1. Klipp halene til 4 måneder gamle mus med saks og legg dem i 1,5 ml EP-rør. Tilsett 180 μL buffer GL, 20 μL proteinase K og 10 μL RNase A per halestykke (2-5 mm) i et mikrosentrifugerør. Vær forsiktig så du ikke kutter for mye hale.
    2. Inkuber tuben ved 56 °C over natten.
    3. Spinn i et mikrosentrifugerrør ved 1000 x g i 2 minutter for å fjerne urenheter.
    4. Tilsett 200 μL buffer GB og 200 μL absolutt etylalkohol med tilstrekkelig blanding.
    5. Plasser spinnsøylen i et oppsamlingsrør. Påfør prøven på spinn og sentrifuge ved 1000 x g i 2 minutter. Kast gjennomstrømningen.
    6. Tilsett 500 μL buffer WA i spinnkolonnen og sentrifuger ved 1 000 x g i 1 min. Kast gjennomstrømningen.
    7. Tilsett 700 μL buffer WB i spinnkolonnen og sentrifuger ved 1 000 x g i 1 min. Kast gjennomstrømningen.
      MERK: Kontroller at Buffer WB er forhåndsblandet med 100% etanol. Når du tilsetter Buffer WB, legg til rørveggen for å vaske av restsaltet.
    8. Gjenta trinn 5.5.7.
    9. Plasser spinnsøylen i et oppsamlingsrør og sentrifuger ved 1000 x g i 2 minutter.
    10. Plasser spinnsøylen i et nytt 1,5 ml rør. Tilsett 50-200 μL sterilisert vann eller elueringsbuffer til midten av kolonnemembranen og la kolonnen stå i 5 minutter.
      MERK: Oppvarming av sterilisert vann eller elueringsbuffer opp til 65 °C kan øke utbyttet av eluering.
    11. For å eluere DNA, sentrifuger kolonnen ved 1000 x g i 2 min. For å øke utbyttet av DNA, tilsett gjennomstrømningen og / eller 50-200 μL sterilisert vann eller elueringsbuffer til midten av spinnkolonnemembranen og la kolonnen stå i 5 minutter. Sentrifuge på 1000 x g i 2 min.
    12. Kvantifiser det eluerte genomiske DNA ved elektroforese.

6. Evaluering av hjertemorfologi og funksjon

MERK: Bruk M-modus ekkokardiografi for å vurdere hjertemorfologi og funksjon av C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) knockinmus.

  1. Sett knockinmusene i en lukket akrylboks koblet til anestesimaskinen og juster treveisgrensesnittet slik at isofluran (konsentrasjon: 3%) strømmer inn i akrylboksen. Etter at knockinmusene slutter å bevege seg autonomt, fjern knockinmusene.
  2. Plasser knockinmusene flatt på livsovervåkingsplattformen til anestesimaskinen for små dyr, og kontinuerlig innåndingsbedøvelse blandet med oksygen (strømning: 0,8 l / min) og isofluran (konsentrasjon: 3%). Påfør øye smøremiddel til de bedøvede musene for å forhindre tørking av hornhinnen.
  3. Fest knockinmusene horisontalt på plattformen. Vipp plattformen 30° kaudal mot knockinmusen. Fjern hår på den fremre brystveggen til den bankende musen ved hjelp av en hårfjerningskrem.
  4. Plasser sonden vertikalt med støtet vendt mot dyrets hode. Drei deretter sonden mot klokken, ca. 45°.
  5. I den parasternale langaksevisningen roterer du sonden 90° med klokken for å observere den parasternale kortaksevisningen. Etter å ha rotert sonden 90°, juster y-akseforskyvningen for å få riktig skive.
  6. Vær oppmerksom på hjertets langaksebilde (figur 1C), og velg deretter måledata for M-modus.
  7. Innhente ultralyddata fra parasternale langaksevisninger av mus (figur 1). Hjertefrekvens (HR), venstre ventrikkels ejeksjonsfraksjon (LVEF), hjerteutgang (CO), venstre ventrikulær endediastolisk dimensjon (LVDd), LVDs venstre ventrikulære endesystoliske dimensjon (LVSd), interventrikulær septum (IVS) og venstre ventrikkels bakre vegg (LVPW) måles.
  8. Etter målingen, gi musene oksygen, og plasser dem tilbake i sine respektive bur når de gjenvinner autonom aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Klinisk profil av familiene
Familiens stamtavler av HCM ble oppnådd og er vist i figur 2. Alle de dokumenterte familiemedlemmene ble diagnostisert med HCM ved innmelding.

I familien (figur 2A) var proband pasient III-7, som ble diagnostisert med HCM og venstre ventrikkel utstrømningskanalobstruksjon (LVOTO) ved 46 år og ble hjerteoperert. Pasient III-3 hadde mindre HCM som ikke krevde kirurgisk behandling. Pasient IV-3 hadde også mindre HCM, som var lik sin far, pasient III-3. Pasient II-5 hadde HCM og ble operert for å reparere feilen i en alder av 51 år på grunn av LVOTO. Pasient I-1 og pasient II-2 døde av hjerteulykker ved henholdsvis 57 og 46 år. Anamnese til pasient I-1 var utilgjengelig. Pasient II-7 og pasient III-9 presenterte kortpustethet og ble diagnostisert med HCM.

Eksomsekvensanalyse og segregering av varianter
I denne familien genererte eksomsekvensering av de fem individene et gjennomsnitt på totalt 19 978 731 par sekvenserte avlesninger med en gjennomsnittlig leselengde på 125 bp. Totalt besto 98,72% av sekvenserte avlesninger kvalitetsvurderingen og ble kartlagt til 98,66% av det menneskelige referansegenomet. Selv etter filtrering ble mer enn 42 varianter (inkludert enkeltnukleotidsubstitusjoner og indels) delt av disse fire pasientene. Av disse var 27 missense SNVs, 15 ble spådd å endre spleising. Til slutt, i henhold til ACMG-vurderingsretningslinjer, en heterozygot c.G2468A; p.G823E-varianten av MYH7 (NM_0002571) ble observert i proband III-7 så vel som de tre andre pasientene.

Identifisering av en patogen mutasjon
Sanger-sekvensering bekreftet samme MYH7 p.G823E-variant hos alle pasienter, men ikke hos de friske personene i familiene og 174 kontrollpersoner (figur 2B). Den heterozygote MYH7 p.G823E fullstendig co-segregert i denne familien. I denne familien arvet pasienter IV-3 som hadde denne varianten den fra pasient III-3. Pasienter III-7 og III-8 bar samme variant, som ble arvet fra sin far. Informasjonen for pasient III-9 var ikke tilgjengelig.

Denne varianten, tidligere beskrevet i HCM av en sporadisk pasient24, er ikke rapportert i databasene 1000 G, ESP6500, ExAC, HGMD, ClinVar eller kontrollpersoner. Glycinresten ved kodon 823 i halsdomeneområdet til MYH7 er sterkt konservert i alle tilgjengelige vertebrate myosinsekvenser (figur 2C). MYH7 er et kjent HCM-forårsakende gen og spiller en viktig rolle i hjerteutvikling eller struktur / funksjon. Basert på ACMG-standarder og retningslinjer ble MYH7 p.G823E-varianten spådd å være en patogen variant (PVS1 + PS3 + PS4 + PM2). Samlet sett støtter disse resultatene at denne varianten er skadelig og bidrar til patogenesen av HCM i disse familiene.

C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockinmus utviklet alvorlig hjertehypertrofi
For ytterligere å verifisere patogenesen til MYH7 p.G823E, genererer vi C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) knockinmus. C57BL/6N-MYH7em1(G823E) knockinmus utviklet en aldersavhengig hjertehypertrofi etter fødselen (figur 2A,B). Ekkokardiografi viste at IVS og LVPW utviklet med økt HR i C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockinmus (tab 1). Disse resultatene ble også validert ved histologisk analyse (figur 3). Det var ingen åpenbare forskjeller i LVDd, LVD, EF eller CO mellom villtype og heterozygote mus (tabell 1).

Figure 1
Figur 1: Ultralyddatainnsamling . (A) Sonden er plassert på brystbenets lange akse. (B) Sonden er plassert på brystbenets korte akse. (C) M-modus ultralydbilde av langaksevisningen av brystbenet. Den gule pilen indikerer plasseringen av interventrikulær septum. Den røde pilen indikerer den flytende ventilen. (D) M-modus ultralydbilde av kortaksevisningen av brystbenet. Den gule pilen indikerer plasseringen av den fremre papillære muskelen, og bulen under er den bakre papillære muskelen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Den store familien som bærer den heterozygote MYH7 G823E-varianten . (A) Proband er merket med en pil. Fulle og åpne sirkler og firkanter indikerer henholdsvis berørte og normale individer. (B) G823E-varianten i MYH7 bekreftet ved Sanger-sekvensering. (C) Bevaring av MYH7 G823E-området i forskjellige arter. Den gule pilen representerer stedet for G823E i aminosyresekvensen til forskjellige arter, som er svært konservert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Patologiske forandringer i myokardvev . (A) Myokardfibre er ordnet på en ordnet måte, og det er ingen signifikant forskjell mellom hver del. (B) Ventrikulær muskelfiberhypertrofi, uordnet arrangement og lesjoner er hovedsakelig konsentrert i bakre vegg av venstre ventrikel og interventrikulær septum. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockin mus gruppe Kontrollgruppe
(n=4) (n=6)
HR (/min) 451.25 ± 25.786 413,83 ± 12,77 P = 0,015
LVDd (mm) 4,12 ± 0,33 3,95 ± 0,20 P = 0,330
LVD (mm) 2,95 ± 0,44 2,85 ± 0,20 P = 0,626
EF(%) 55.02 ± 9.52 54,31 ± 5,11 P = 0,881
CO (ml) 18.46 ± 3.05 15.30 ± 2.39 P = 0,102
IVS (mm) 1.13 ± 0.20 0,67 ± 0,07 P = 0,001
LVPW (mm) 1,40 ± 0,60 0,70 ± 0,06 P = 0.000

Tabell 1: Morfologi og funksjonsanalyse for p.G823E og villtype. Data ble analysert ved hjelp av SPSS. Kontinuerlige variabler uttrykkes som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Studentens t eller Wilcoxon rangerer sumtester for kontinuerlige variabler. P-verdier under 0,05 ble ansett som statistisk signifikante.

Tilleggsfil 1. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne studien beskriver vi en kinesisk Han-familie med HCM. Genetikkanalyse viste at en heterozygot MYH6-mutasjon p.G823E samsegregerer med sykdommen hos familiemedlemmer med autosomal dominant arv. For å validere patogeniteten til G823E-mutasjonen og diskutere de underliggende mekanismene, opprettet vi en C57BL / 6N musemodell med G823E ved mus Myh7-lokus ved CRISPR / Cas9-mediert genomteknikk.

Fenotypiske egenskaper av C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockinmus ble evaluert ved ekkokardiografi. Multippel trabekulasjon og et høyere forhold mellom ikke-komprimert og komprimert myokardlag ble funnet i C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) knockinmus sammenlignet med kontrollene. De transgene musene viste også LVPW og IVS hypertrofi og en økning i HR. Hjertets funksjon viste imidlertid ingen signifikant endring mellom de to gruppene. Disse resultatene antydet at økt HR kan vise en kompenserende effekt på vedlikeholdsventrikkelfunksjonen under hjerteombygging. Videre studier er nødvendig for å observere og analysere hjertets morfologi og funksjon.

Myosin-7 (MYH7) tilhører familien av myokardiale sarkomeriske strukturelle proteiner. MYH7 kodet av MYH7-genet (14q11.2; OMIM: 160760), som finnes i det første patogene genet assosiert med HCM i 1990. Til dags dato har mer enn 300 varianter i MYH7-genet vært assosiert med HCM25,26. Patogeniteten til det store flertallet av variasjon forblir imidlertid unnvikende. Ved hjelp av denne protokollen opprettet vi modellmusene vellykket. Når du planlegger og designer modellmusen, er det tre hovedspørsmål som vurderes. For det første er aminosyresekvensen til musens MYH7-protein svært homolog med menneske. For det andre er MYH7 sterkt uttrykt i ventrikler, så vel som MYH7 hos mennesker. Glycinresten ved kodon 823 i MYH7 er svært konservert i alle tilgjengelige myosinsekvenser.

MYH7 inneholder et konservert hodemotordomene ved N-terminalen, som binder aktin og har aktinaktivert mg · ATPase-aktivitet og en nakkeregion, samt en myosinhale, som inneholder en coiled-coil (CC) -region ved C-terminalen. Glycinresten ved kodon 823 i halsdomeneområdet til MYH7 antyder at denne variasjonen kan påvirke spakarmens rotasjon i sammentrekning27,28,29,30.

WES fokuserer hovedsakelig på eksoner av gener, som bare står for 1,5%8 av det totale genom-DNA. Imidlertid er de fleste av de menneskelige genetiske sykdommene som er identifisert, relatert til ekson31. Dette gjør WES allment anerkjent og anvendt i klinisk praksis. Det er visse etiske problemer med den utbredte anvendelsen av WES. Studien av denne typen menneskelig genetisk sykdom involverer ofte grenseoverskridende diskusjoner. Selv om forskere prøver å fjerne personlig identifiserbar informasjon så mye som mulig, kan den enorme informasjonen i DNA fortsatt identifisere forskningspersonene, og til og med deres familier. Bare standardiserte informasjonsutvekslingstiltak kan sikre rasjonell anvendelse av WES. I fremtiden har WES stor betydning for medisinske strategier for spesifikke genmutasjoner og individualiserte diagnose- og behandlingstiltak for flere sykdommer.

Oppsummert identifiserte vi en MYH7 heterozygot variant, p.G823E, i en stor kinesisk Han-familie med HCM ved bruk av WES. C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) knockinmus ble funnet å ha tykkere IVS og LVPW, og raskere HR enn villtype mus. P.G823E-varianten kan svekke spakarmens rotasjon, noe som tyder på at denne mutasjonen spiller en viktig rolle i familiær HCM. Vårt arbeid utvider informasjonen om mutasjonsspekteret av MYH7-genet assosiert med HCM og gir bedre klarhet i riktig diagnose og genetisk rådgivning av berørte familier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen økonomiske interessekonflikter å oppgi.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av det medisinske forskningsfondsprosjektet i Guangdong-provinsen (A2022363) og det store prosjektet til Guangdong Committee of Science and Technology, Kina (grant no.2022).

Vi vil gjerne takke Qingjian Chen fra University of Maryland, College Park for hjelpen under utarbeidelsen av dette manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5×TBE Shanghai Sangon
2× Taq Master Mix (Dye Plus) Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd.
Agarose Regu
Anesthesia machine for small animals Reward Life Technology Co., Ltd. R500
BEDTools 2.16.1
Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. VK007
DNA Marker Thermo Fisher Scientific
DNA stabilizer Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. DNAstable LD prevent DNA degradation
Electric paraffin microtome Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. HS-S7220-B
GATK v3.5
Gentra Puregene blood kit Santa Clara
Glass slide, coverslip Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd.
Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. C0107-500ml, C0109
HiSeq X-ten platform Illumina perform sequencing on the captured libraries
Injection of chorionic gonadotropin Livzon Pharmaceutical Group Inc.
Injection of pregnant mare serum gonadotropin Livzon Pharmaceutical Group Inc.
Isoflurane Local suppliers inhalation anesthesia
Microinjection microscope Nikon ECLIPSE Ts2
NanoDrop Thermo Fisher Scientific 2000
Paraffin Embedding Machine Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. HS-B7126-B
Picard (2.2.4) 20
Proteinase K Merck KGaA
samtools 1.3
Sequencer Applied Biosystems ABI 3500
Stereomicroscope Nikon SMZ745T
SureSelect Human All Exon V6 Agilent Technology Co., Ltd. exome probe
T7 ARCA mRNA Kit New England BioLabs, Inc. NEB-E2065S
Temperature box BINDER GmbH KBF-S Solid.Line
Trizma Hydrochloride Solution Sigma, Merck KGaA No. T2663
Veterinary ultrasound system Royal Philips CX50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Toepfer, C. N., et al. Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).
  2. Writing Committee Members et al. 2020 AHA/ACC guideline for the diagnosis and treatment of patients with hypertrophic cardiomyopathy: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Joint Committee on Clinical Practice Guidelines. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 162 (1), 23-106 (2021).
  3. Elliott, P., McKenna, W. J. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 363 (9424), 1881-1891 (2004).
  4. Maron, B. J., Maron, M. S. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 381 (9862), 242-255 (2013).
  5. Inoue, T., Orgel, L. E. A nonenzymatic RNA polymerase model. Science. 219 (4586), 859-862 (1983).
  6. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  7. Sachidanandam, R., et al. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature. 409 (6822), 928-933 (2001).
  8. Ng, S. B., et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature. 461 (7261), 272-276 (2009).
  9. Wong, K. M., Hudson, T. J., McPherson, J. D. Unraveling the genetics of cancer: genome sequencing and beyond. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 407-430 (2011).
  10. Mattivi, C. L., et al. Clinical utility of a phenotype-enhanced MYH7-specific variant classification framework in hypertrophic cardiomyopathy genetic testing. Circulation. Genomic and Precision Medicine. 13 (5), 453-459 (2020).
  11. Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342 (6154), New York, N.Y. 111-114 (2013).
  12. Hayashi, T., et al. Genetic background of Japanese patients with pediatric hypertrophic and restrictive cardiomyopathy. Journal of Human Genetics. 63 (9), 989-996 (2018).
  13. Gil, W. S., Ávila Vidal, L. A., Vásquez Salguero, M. A., Cajiao, M. B., Peña, C. V. Genetic variant affecting the myosin light chain 2 related to familial hypertrophic cardiomyopathy. Intractable & Rare Diseases Research. 9 (4), 229-232 (2020).
  14. Berge, K. E., Leren, T. P. Genetics of hypertrophic cardiomyopathy in Norway. Clinical Genetics. 86 (4), 355-360 (2014).
  15. McNamara, J. W., Schuckman, M., Becker, R. C., Sadayappan, S. A novel homozygous intronic variant in TNNT2 associates with feline cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 608473 (2020).
  16. Wang, W., et al. Comparative transcriptome analysis of atrial septal defect identifies dysregulated genes during heart septum morphogenesis. Gene. 575, 303-312 (2016).
  17. Andersen, P. S., et al. Diagnostic yield, interpretation, and clinical utility of mutation screening of sarcomere encoding genes in Danish hypertrophic cardiomyopathy patients and relatives. Human Mutations. 30 (3), 363-370 (2009).
  18. Nakashima, Y., et al. Lifelong clinical impact of the presence of sarcomere gene mutation in Japanese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Journal. 84 (10), 1846-1853 (2020).
  19. Hu, L. R., Kontrogianni-Konstantopoulos, A. Proteomic analysis of myocardia containing the Obscurin R4344Q mutation linked to hypertrophic cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 478 (2020).
  20. Girolami, F., et al. Novel alpha-actinin 2 variant associated with familial hypertrophic cardiomyopathy and juvenile atrial arrhythmias: a massively parallel sequencing study. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (6), 741-750 (2014).
  21. Salazar-Mendiguchia, J., et al. The p.(Cys150Tyr) variant in CSRP3 is associated with late-onset hypertrophic cardiomyopathy in heterozygous individuals. European Journal of Medical Genetics. 63 (12), 104079 (2020).
  22. Teekakirikul, P., Zhu, W., Huang, H. C., Fung, E. Hypertrophic cardiomyopathy: An overview of genetics and management. Biomolecules. 9 (12), 878 (2019).
  23. Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
  24. Song, L., et al. Mutations profile in Chinese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 209-216 (2005).
  25. Marian, A. J., Braunwald, E. Hypertrophic cardiomyopathy: Genetics, pathogenesis, clinical manifestations, diagnosis, and therapy. Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).
  26. Cann, F., et al. Phenotype-driven molecular autopsy for sudden cardiac death. Clinical Genetics. 91 (1), 22-29 (2017).
  27. Lafreniere-Roula, M., et al. Family screening for hypertrophic cardiomyopathy: Is it time to change practice guidelines. European Heart Journal. 40 (45), 3672-3681 (2019).
  28. Winkelmann, D. A., Forgacs, E., Miller, M. T., Stock, A. M. Structural basis for drug-induced allosteric changes to human beta-cardiac myosin motor activity. Nature Communications. 6, 7974 (2015).
  29. García-Giustiniani, D., et al. Phenotype and prognostic correlations of the converter region mutations affecting the β myosin heavy chain. Heart (British Cardiac Society). 101 (13), 1047-1053 (2015).
  30. Moore, J. R., Leinwand, L., Warshaw, D. M. Understanding cardiomyopathy phenotypes based on the functional impact of mutations in the myosin motor. Circulation Research. 111 (3), 375-385 (2012).
  31. Majewski, J., Schwartzentruber, J., Lalonde, E., Montpetit, A., Jabado, N. What can exome sequencing do for you. Journal of Medical Genetics. 48 (9), 580-589 (2011).

Tags

Genetikk utgave 186
Undersøkelse av patogenesen av MYH7-mutasjonen Gly823Glu i familiær hypertrofisk kardiomyopati ved hjelp av en musemodell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xia, Y., Hu, J., Li, X., Zheng, S.,… More

Xia, Y., Hu, J., Li, X., Zheng, S., Wang, G., Tan, S., Zou, Z., Ling, Q., Yang, F., Fan, X. Investigating the Pathogenesis of MYH7 Mutation Gly823Glu in Familial Hypertrophic Cardiomyopathy using a Mouse Model. J. Vis. Exp. (186), e63949, doi:10.3791/63949 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter