Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

نموذج لعلاج التهاب الأوعية الدموية الدماغية بعد السكتة الدماغية الناجمة عن انسداد الشريان الدماغي الأوسط في الفئران

Published: June 22, 2022 doi: 10.3791/63951
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Neuroscience, UConn School of Medicine, 2Division of Neurosurgery, UConn School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

يهدف البروتوكول إلى توفير طرق لتطعيم العضلة العجزية الصدغية الوعائية على السطح العمودي لأنسجة المخ الإقفارية - لعلاج السكتة الدماغية الإقفارية الحادة غير المويامويا. يتم تقييم فعالية النهج في زيادة تولد الأوعية الدموية باستخدام نموذج انسداد الشريان الدماغي الأوسط العابر في الفئران.

Abstract

لا يوجد علاج فعال متاح لمعظم المرضى الذين يعانون من السكتة الدماغية الإقفارية ، مما يجعل تطوير علاجات جديدة أمرا حتميا. قدرة الدماغ على الشفاء الذاتي بعد السكتة الدماغية الإقفارية محدودة بسبب عدم كفاية إمدادات الدم في المنطقة المتأثرة. Encephalomyosynangiosis (EMS) هو إجراء جراحي عصبي يحقق تولد الأوعية الدموية في المرضى الذين يعانون من مرض المويامويا. وهو ينطوي على بضع القحف مع وضع طعم العضلات الصدغية الوعائية على سطح الدماغ الإقفاري. لم تتم دراسة EMS أبدا في وضع السكتة الدماغية الإقفارية الحادة في الفئران. الفرضية التي تقود هذه الدراسة هي أن EMS يعزز تولد الأوعية الدماغية على السطح القشري المحيط بطعم العضلات. يصف البروتوكول الموضح هنا الإجراء ويوفر بيانات أولية تدعم جدوى وفعالية نهج EMS. في هذا البروتوكول ، بعد 60 دقيقة من انسداد الشريان الدماغي الأوسط العابر (MCAo) ، تم اختيار الفئران عشوائيا إما لعلاج MCAo أو MCAo + EMS. تم تنفيذ EMS 3-4 ساعة بعد الانسداد. تم التضحية بالفئران بعد 7 أو 21 يوما من علاج MCAo أو MCAo + EMS. تم قياس جدوى الكسب غير المشروع Temporalis باستخدام فحص النيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد المختزل المختزل للرباعي. قامت مصفوفة تكوين الأوعية الدموية بالفئران بتحديد حجم تعبير البروتين الوعائي والتعديل العصبي. تم استخدام الكيمياء النسيجية المناعية لتصور الترابط غير المشروع مع قشرة الدماغ والتغير في كثافة الأوعية. تشير البيانات الأولية هنا إلى أن العضلات المطعمة ظلت قابلة للحياة بعد 21 يوما من EMS. أظهر التلطيخ المناعي نجاحا في زرع الكسب غير المشروع وزيادة في كثافة الأوعية بالقرب من الطعم العضلي ، مما يشير إلى زيادة تكوين الأوعية. تشير البيانات إلى أن EMS يزيد من عامل نمو الخلايا الليفية (FGF) ويقلل من مستويات osteopontin بعد السكتة الدماغية. بالإضافة إلى ذلك ، لم يزيد EMS بعد السكتة الدماغية من معدل الوفيات مما يشير إلى أن البروتوكول آمن وموثوق. هذا الإجراء الجديد فعال وجيد التحمل ولديه القدرة على توفير معلومات عن التدخلات الجديدة لتعزيز تكوين الأوعية الدموية بعد السكتة الدماغية الإقفارية الحادة.

Introduction

السكتة الدماغية الإقفارية هي إصابة عصبية وعائية حادة مع عقابيل مزمنة مدمرة. يعاني معظم الناجين من السكتة الدماغية ، 650،000 سنويا ، في الولايات المتحدة من إعاقة وظيفية دائمة1. لا يمنح أي من العلاجات المتاحة الحماية العصبية والتعافي الوظيفي بعد المرحلة الحادة من السكتة الدماغية الإقفارية. بعد السكتة الدماغية الإقفارية الحادة ، تتضاءل إمدادات الدم المباشرة والجانبية مما يؤدي إلى خلل وظيفي في خلايا الدماغ وشبكاته ، مما يؤدي إلى عجز عصبي مفاجئ 2,3. لا تزال استعادة إمدادات الدم إلى المنطقة الإقفارية الهدف الأول لعلاج السكتة الدماغية. وبالتالي ، فإن تعزيز تكوين الأوعية الدموية لتعزيز إمدادات الدم في المنطقة الإقفارية هو نهج علاجي واعد ؛ ومع ذلك ، فإن الطرق التي تمت دراستها سابقا لتعزيز تكوين الأوعية الدموية بعد السكتة الدماغية ، بما في ذلك الإريثروبويتين والستاتين وعوامل النمو ، كانت محدودة بمستويات غير مقبولة من السمية أو قابلية الترجمة4.

Encephalomyosynangiosis (EMS) هو إجراء جراحي يعزز تولد الأوعية الدماغية لدى البشر المصابين بمرض المويامويا ، وهي حالة من الشرايين القحفية الضيقة التي غالبا ما تؤدي إلى السكتة الدماغية. يتضمن EMS انفصالا جزئيا لقسم الأوعية الدموية من العضلة الصدغية للمريض من الجمجمة ، يليه بضع القحف وتطعيم العضلات على القشرة المصابة. هذا الإجراء جيد التحمل ويحفز تولد الأوعية الدماغية ، مما يقلل من خطر الإصابة بالسكتة الدماغية الإقفارية في المرضى الذين يعانون من مرض المويامويا 5,6. وبالتالي ، فإن الإجراء يخدم إلى حد كبير دورا وقائيا في هؤلاء المرضى. قد يكون لتكوين الأوعية الدموية الناجم عن هذا الإجراء أيضا دور في تعزيز الحماية العصبية الوعائية والتعافي في وضع السكتة الدماغية الإقفارية. يدعم هذا التقرير الفرضية القائلة بأن تولد الأوعية الدموية الناجم عن EMS لديه القدرة على توسيع فهم والخيارات العلاجية لنقص التروية الدماغية.

بجانب EMS ، هناك العديد من الأساليب الدوائية والجراحية لتحسين تولد الأوعية الدموية ، ولكن لديهم العديد من القيود. تم العثور على النهج الدوائية مثل إدارة عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF) غير كافية أو حتى ضارة بسبب العديد من القيود ، بما في ذلك تشكيل الضفائر الوعائية الفوضوية وغير المنظمة والمتسربة والبدائية ، والتي تشبه تلك الموجودة في أنسجة الورم 7,8 وليس لها آثار مفيدة في التجارب السريرية9.

تشمل الأساليب الجراحية مفاغرة مباشرة مثل مفاغرة الشريان الصدغي السطحي - الشريان الدماغي الأوسط ، والمفاغرة غير المباشرة مثل مفاغرة الشرايين الدماغية - الشرايين - الشرايين (EDAS) ، و encephalomyosyniangiosis (EMS) ، ومجموعات من المفاغرة المباشرة وغير المباشرة10. كل هذه الإجراءات صعبة للغاية من الناحية الفنية وتتطلب في الحيوانات الصغيرة ، باستثناء EMS. في حين أن الإجراءات الأخرى تتطلب مفاغرة الأوعية الدموية المعقدة ، يتطلب EMS ترقيعا عضليا بسيطا نسبيا. علاوة على ذلك ، فإن قرب العضلة الصدغية من القشرة يجعلها خيارا طبيعيا للتطعيم ، حيث لا تحتاج إلى استئصالها أو فصلها تماما عن إمدادات الدم ، كما هو ضروري إذا تم استخدام عضلة أبعد للتطعيم.

تمت دراسة EMS في نماذج نقص التروية الدماغية المزمنة في الفئران 7,11. ومع ذلك ، لم تتم دراسة EMS باستخدام طعم العضلات الصدغي في السكتة الدماغية الإقفارية الحادة في القوارض. هنا ، نصف بروتوكولا جديدا ل EMS في الفئران بعد السكتة الدماغية الإقفارية عبر نموذج انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAo). هذه المخطوطة بمثابة وصف للطرق والبيانات المبكرة لهذا النهج الجديد من EMS في الفئران بعد MCAo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في UConn Health وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية الأمريكية. يجب أن يعمل البروتوكول التالي في أي نوع أو سلالة من القوارض. هنا ، تم استخدام الفئران الذكور من النوع البري C57BL / 6 التي تتراوح أعمارها بين 8 و 12 أسبوعا وعمرها ووزنها. تم تغذية الفئران النظام الغذائي تشاو القياسية والمياه ad libitum. تم الحفاظ على ظروف السكن القياسية عند 72.3 درجة فهرنهايت ورطوبة نسبية 30٪ -70٪ مع دورة ضوء / مظلمة لمدة 12 ساعة.

1. التحضير قبل الجراحة

  1. تعقيم جميع الأدوات عن طريق التعقيم قبل الجراحة. قم بتعقيم سطح التشغيل بنسبة 70٪ من الإيثانول وقم بتسخين سطح التشغيل إلى 37 درجة مئوية باستخدام وسادة تسخين كهربائية.
  2. استخدم غرفة الحث لتخدير الماوس بنسبة 4٪ -5٪ من الأيزوفلوران للتحريض. تقديم 1.5٪ -2.0٪ من الأيزوفلوران عبر مخروط الأنف للصيانة حتى نهاية الجراحة. تأكد قبل الجراحة من تخدير الفأر بشكل صحيح من خلال تقييم عدم وجود استجابة لقرصة القدم الخلفية الصلبة وفقدان رد الفعل الوضعي ومنعكس التصحيح.
  3. ضع الماوس على جانبه الأيسر على سطح التشغيل وضع مرهم العين لحماية كلتا العينين.
  4. حلق الشعر فوق المجال الجراحي (أي الجمجمة الجانبية اليمنى بين العين والأذن) باستخدام ماكينات قص كهربائية. نظف المجال الجراحي في دوائر متحدة المركز إلى الخارج من منتصف الموقع الجراحي ، مع 70٪ من الإيثانول متبوعا بمحلول البوفيدون ، وكرر هذه الخطوات 2x.
    ملاحظة: نظرا لقرب موقع الجراحة من العين، قد لا يكون من الممكن إزالة 150٪ من المنطقة المحيطة بموقع الجراحة لتجنب تهيج العين أو إصابتها العرضية.
  5. إدارة جرعة واحدة من 0.25 ٪ بوبيفاكايين (ما يصل إلى 8 ملغ / كغ من وزن الجسم) عن طريق الحقن تحت الجلد كمسكن قبل الجراحة في موقع الجراحة.
  6. قم بإعداد مجهر جراحي عند تكبير 4x. يستخدم المجهر لجميع الخطوات الجراحية.

2. إجراء الجراحة

ملاحظة: يتم عرض خطوات الجراحة في الشكل 1. بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم تخصيص ثلاثة فئران لمجموعة صورية ، وثلاثة فئران ل EMS وحدها ، و 12 فأرا ل MCAo ، و 23 فأرا لمجموعة MCAo + EMS.

  1. جراحة MCAo
    ملاحظة: MCAo هو نموذج مميز جيدا للسكتة الدماغية الإقفارية في القوارض ، كما هو موضح من قبلنا والآخرين12،13،14. يتم وصف خطوات الجراحة باختصار هنا. تم تحفيز نقص التروية الدماغية العابر البؤري بواسطة MCAo الأيمن لمدة 60 دقيقة تحت تخدير الأيزوفلوران متبوعا بإعادة التروية لمدة 7 أو 21 يوما.
    1. قم بعمل شق في الرقبة البطنية في خط الوسط متبوعا ب MCAo الأيمن من جانب واحد عن طريق تطوير خيوط أحادية اللون مغلفة بالمطاط السيليكوني بطول 10-11 مم من تشعب الشريان السباتي الداخلي عبر جذع الشريان السباتي الخارجي. في الفئران الوهمية ، قم بإجراء عمليات جراحية متطابقة باستثناء تقدم الخيط في الشريان السباتي الداخلي.
    2. قم بقياس درجات حرارة المستقيم باستخدام نظام التحكم في درجة الحرارة ، مع الحفاظ على درجة الحرارة عند ~ 37 درجة مئوية أثناء الجراحة باستخدام وسادة تسخين أوتوماتيكية.
    3. استخدم قياس تدفق دوبلر بالليزر لقياس تدفق الدم الدماغي قبل إدخال خياطة عن طريق وضع مسبار دوبلر على الجمجمة الجانبية (المقابلة لمنطقة MCA) وتسجيل القيمة8. لتأكيد انخفاض الانسداد إلى 15٪ من تدفق الدم الدماغي الأساسي ، استخدم نفس الإجراء بعد تقدم الخياطة. لتأكيد التروية، استخدم نفس الإجراء بعد إزالة الخيط.
    4. إطعام جميع الحيوانات مع الهريس الرطب حتى التضحية و / أو 1 أسبوع بعد الجراحة لضمان التغذية الكافية لنقاط النهاية المزمنة ، لأن الحيوانات تعاني من عجز في التربية بعد السكتة الدماغية.
  2. جراحة نظم الإدارة البيئية
    1. بعد 60 دقيقة من MCAo ، قم بتوزيع الفئران عشوائيا على مجموعات MCAo فقط أو MCAo + EMS. قم بإجراء EMS 4 ساعات بعد MCAo (MCAo + EMS group) أو جراحة صورية لتجارب مختارة (مجموعة EMS فقط). تغيير إلى زوج جديد من القفازات الجراحية المعقمة قبل الجراحة.
      ملاحظة: تعافت الفئران من التخدير بعد 60 دقيقة من MCAo وتم إعادة تخديرها قبل جراحة EMS.
    2. بالنسبة للمجموعات التي تتلقى EMS (MCAo + EMS أو مجموعات EMS فقط) ، قم بعمل شق جلدي 10-15 مم باستخدام مقص ، يمتد من 1-2 مم إلى الأذن اليمنى إلى 1-2 مم ذيلي إلى العين اليمنى.
      ملاحظة: تم استخدام مقص معقم لمنع التلف العرضي للعضلات الصدغية تحتها.
    3. سحب اللوحات الجلدية باستخدام المشابك وتحديد بصريا العضلة الصدغية والجمجمة.
    4. تشريح العضلة الصدغية بصراحة بعيدا عن الجمجمة باستخدام مقص مع تقنية الانتشار. قم بإجراء بضع عضلي موجه بطنيا 2-3 مم على طول الحدود الذيلية للعضلة لتسهيل الانعكاس البطني.
    5. قم بإجراء بضع القحف قطره ~ 5 مم في الجمجمة أسفل العضلة الصدغية المنعكسة باستخدام مثقاب صغير.
    6. قم بإزالة الأم الجافية باستخدام ملاقط لفضح سطح الدماغ الدائري. توخي الحذر الشديد لتجنب الإصابة العرضية للدماغ.
    7. خياطة الحدود الظهرية للعضلة الصدغية إلى الأنسجة تحت الجلد من رفرف الجلد الظهري مع 6-0 خيوط مونوكريل ، مما يجعلها تتدفق إلى القشرة الدماغية المكشوفة.
    8. أغلق شق الجلد مع خياطة 6-0 أحادية الخيط. ضع الماوس مرة أخرى في قفصه وراقبه حتى يتعافى من التخدير. إعادة الماوس إلى منشأة الإسكان الخاصة به.

3. اعتبارات ما بعد الجراحة

  1. راقب الفئران بحثا عن المرض والموقع الجراحي للعدوى يوميا. أعط محلول ملحي طبيعي تحت الجلد (حجم 1٪ من وزن الجسم) يوميا لدعم الترطيب.
  2. مراقبة الجفاف الشديد (فقدان وزن الجسم >20٪) حتى 7 أيام بعد الجراحة. إدارة بلعة إضافية من محلول ملحي طبيعي تحت الجلد 1٪ حجم من وزن الجسم إذا >20٪ فقدان الوزن.
  3. تابع الحقن والمراقبة الفسيولوجية وغيرها من الاختبارات دون اعتبارات خاصة.
    ملاحظة: في هذا الإجراء ، تم تجنب استخدام المواد الأفيونية أو العقاقير المضادة للالتهابات غير الستيرويدية (NSAIDs) لعلاج ما بعد الجراحة بسبب الآثار المعروفة لهذه العوامل على نتائج السكتة الدماغية أو حجم الاحتشاء بالتشاور مع لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية الداخلية15،16،17،18. ومع ذلك ، يتم تشجيع استخدام تسكين ما بعد الجراحة بشكل كبير لجراحة EMS مع نماذج أخرى. يرجى الرجوع إلى اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) لهذا الغرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم استخدام ما مجموعه 41 فأرا لهذه الدراسة. بعد ثلاث وفيات ، واحدة في MCAo واثنان في MCAo + EMS ، تم استخدام ما مجموعه 38 فأرا للحصول على النتائج المعروضة.

الاحصاءات
يتم تقديم البيانات من كل تجربة كمتوسط ± الانحراف المعياري (S.D). تم تحديد الأهمية باستخدام إما اختبار t للطالب غير المقترن لمقارنة مجموعتين أو ANOVA أحادي الاتجاه لأكثر من مجموعتين ، مع اختبار Newman-Keuls بعد مخصص لتصحيح المقارنات المتعددة.

نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (مخفض) - تترازوليوم ريدكتاز (NADH-TR) تلطيخ
تم إجراء هذا التلطيخ لتقييم الجدوى طويلة الأجل للعضلات المطعمة كما هو الحال في Turoczi et al.19. باختصار ، في وقت التضحية ، تم استئصال رفرف العضلات المطعمة بعناية ، وتثبيته بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 30 دقيقة ، وتم حفظه بالتجميد في وسط درجة حرارة القطع المثلى (OCT) عند -80 درجة مئوية. تم تلطيخ العديد من عمليات الاستئصال المبرد بسمك 12 ميكرومتر من الأنسجة العضلية الصدغية للتفاعل الكيميائي النسيجي NADH-TR. تم تحضين الشرائح لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في محلول من رباعي الأزيوليوم النيترو بلو (1.8 ملغم / ديسيلتر) و NADH (15 ملغ / ديسيلتر) في مخزن مؤقت 0.05 M Tris (درجة الحموضة 7.6). تمت إزالة كاشف التترازوليوم غير المستخدم باستخدام زيادة تليها زيادة تليها تركيزات متناقصة من الأسيتون. تم إجراء تقييم كمي للعضلات الملطخة ب NADH-tetrazolium على صور العضلات الملتقطة عند تكبير 40x.

دراسات التلطيخ المناعي
تم استخدام التلطيخ المناعي لتصور الترابط العضلي مع القشرة وكثافة الأوعية الدموية عند تقاطع العضلات والقشرة20,21. لتصور الترابط العضلي مع أنسجة المخ ، تم استخدام الفئران التي خضعت لجراحة EMS هنا. في نهاية كل نقطة زمنية ، تم تخدير الفئران بحقن أفيرتين (50 مجم / كجم من وزن الجسم) ، تليها تروية مع 1x PBS تحتوي على 5 mM Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) والتثبيت مع 4٪ paraformaldehyde. تم قطع الجمجمة بعناية لمنع الانفصال العرضي للعضلة الصدغية (TM) من قشرة الدماغ. ثم تم فصل الكسب غير المشروع TM فوق قشرة الدماغ عن العضلة الصدغية المتبقية. تمت إزالة الدماغ بعناية وبعد إصلاحه في 4٪ paraformaldehyde بين عشية وضحاها. ثم تم تجفيف الدماغ الثابت بنسبة 30٪ من السكروز في 1x PBS حتى غرق الدماغ في قاع القارورة (حوالي 1-3 أيام). تم قطع أقسام الأنسجة بحجم 30 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم التجميد وتركيبها على شرائح.

من أجل التلطيخ المناعي للأوعية الدموية في قشرة الدماغ الجانبية، تم التضحية بالفئران MCAo و MCAo + EMS وفحصها وإصلاحها ومعالجتها على النحو الوارد أعلاه. تم تقسيم شرائح الدماغ بحجم 30 ميكرومتر على ميكروتوم متجمد وتركيبها على جانب زجاجي. تم استرجاع المستضد باستخدام المخزن المؤقت للسترات (الرقم الهيدروجيني 6.0) وتم احتضان الأقسام مع المخزن المؤقت المانع تليها الحضانة بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة الأولية ، وأكتين العضلات الهيكلية المضادة ألفا 1: 200 ، و Lectin-Dy59421,22. تم أخذ ثلاثة أقسام من الدماغ الإكليلي لكل فأر (n = 5 فئران / مجموعة ؛ المجموع = 15 مقطعا) بين 0.45 مم و 0.98 مم من البريجما ، ملطخة ، وتصورها للقياس الكمي عند تكبير 20x عند تقاطع المناطق الأساسية الإقفارية و penumbra. قام مراقب أعمى بقياس كثافة الأوعية الإيجابية لللكتين في حمة الدماغ باستخدام برنامج ImageJ.

لا يزال الكسب غير المشروع للعضلات قابلا للتطبيق بعد 21 يوما من EMS
أحد الشروط الأساسية لنجاح هذه الجراحة هو الجدوى طويلة الأجل للعضلة الصدغية المطعمة. أظهر الطعم TM تلفا عابرا لخلايا العضلات في 7 أيام بعد الجراحة في العضلات المطعمة مقابل العضلات الضابطة (71.32٪ بقاء الخلايا العضلية ± 16.64٪ مقابل 97.19٪ ± 3.81٪). ومع ذلك ، اختفى هذا الفرق بين العضلات المطعمة والعضلات الضابطة ، وتعافت العضلات تماما بعد 21 يوما من الجراحة (98.22٪ ± 3.965 مقابل 96.87٪ ± 2.27٪ ؛ الشكل 2 ألف).

الطعوم العضلية تصنع روابط فضفاضة مع أنسجة المخ
يعد التطعيم الناجح للعضلة الصدغية على سطح قشرة الدماغ شرطا رئيسيا لنجاح هذا النموذج. في كل من نموذج EMS + MCAo و EMS فقط ، التصقت الطعوم العضلية الصدغية بالسطح القشري بعد 21 يوما من EMS ، مما يشير إلى جراحة ناجحة ، وزرع الكسب غير المشروع ، والترابط (الشكل 1B والشكل 2B).

زيادة كثافة الأوعية الدموية في القشرة المحيطة بالآفات بعد EMS
تؤدي السكتة الدماغية الحادة إلى انخفاض حاد في تدفق الدم الدماغي ، وإعاقة تجنيد الأوعية الجانبية ، وتنبت الأوعية الدموية غير الطبيعية ، وتكوين الأوعية الدموية المختل وظيفيا ، مما يساهم في نتائج السكتة الدماغية السيئة23. EMS يزيد بشكل كبير من مساحة سطح الأوعية الدموية والكثافة المتكاملة في القشرة المحيطة بالآفات بعد السكتة الدماغية (p < 0.05 مقابل MCAo فقط ؛ الشكل 3).

تحليل البروتينات الوعائية والعصبية
تم استخدام مصفوفة تولد الأوعية الدموية للفأر لمقارنة التعبير عن البروتينات الوعائية والعصبية المعدلة بعد 7 أيام و 21 يوما من MCAo في MCAo فقط مقابل MCAo + EMS الفئران وفقا لتعليمات الشركة المصنعة24. تم استخدام برنامج ImageJ لقياس كثافة البكسل لكل نقطة بيانات من بقعة نقطة البروتين. تم تسجيل البيانات كنسبة كثافة كل بروتين تم تحليله إلى متوسط كثافة المعايير لكل لطخة.

يتم تنظيم عامل نمو الخلايا الليفية (FGF) الحمضي ويتم تقليل تنظيم osteopontin بعد EMS
أظهرت نتائج مصفوفة البروتين زيادة كبيرة في مستويات البروتين من FGF-acidic (0.677 ± 0.007 مقابل 0.585 ± 0.014 ، p = 0.045) ، وهو عامل وعائي قوي المنشأ ، وانخفاض في مستويات osteopontin ، وهو جزيء متعدد الوظائف يتم التعبير عنه في الظروف الالتهابية (0.692 ± 0.007 مقابل 0.758 ± 0.014 ، p = 0.048) في مجموعة MCAo + EMS بعد 21 يوما من السكتة الدماغية ، مما يشير إلى تحسن تولد الأوعية والحماية العصبية (الشكل 4A).

نتائج الوفيات ل EMS بعد السكتة الدماغية
كل من MCAo و EMS هي تقنيات جراحية غازية قد تسبب بعض الوفيات في الفئران. في هذه التجربة ، كان هناك ما بين 10٪ -11٪ من الوفيات في الفئران بعد 21 يوما من جراحة MCAo ، وهو معدل وفاة مقبول للفئران التي تخضع ل 60 دقيقة من MCAo14. لم يؤد إجراء EMS على الفئران بعد MCAo إلى زيادة معدل الوفيات (الشكل 4B) مما يشير إلى تحمل جراحة EMS حتى بعد MCAo.

Figure 1
الشكل 1. إجراء EMS التدريجي بعد انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAo): (أ) الخطوة 1. يتم إجراء شق جلدي فوق منطقة الشريان الدماغي الأوسط الأيمن. ينعكس الجلد والأنسجة تحت الجلد ، مما يعرض الجمجمة والعضلات الصدغية. الخطوة 2. يتم تشريح العضلة الصدغية بعيدا عن الجمجمة وتنعكس بطنيا. الخطوة 3. يتم إجراء بضع القحف (4-5 مم) ويتم إزالة الجرة بلطف. الخطوة 4. يتم وضع العضلة الصدغية مباشرة على سطح الدماغ لتغطية القشرة المكشوفة. الخطوة 5. يتم خياطة الحافة الظهرية للعضلة الصدغية إلى الأنسجة تحت الجلد من رفرف الجلد الظهري ، وتتدفق مع سطح الدماغ. الخطوة 6. يتم إغلاق الشق ، ويتم إزالة الماوس من التخدير وإعادته إلى قفصه. تم تعديل هذا الجزء من الرقم من25. (ب) التخطيط المفاهيمي لعلاج التهاب الأوعية الدموية الدماغي (EMS) للسكتة الدماغية الناجمة عن MCAo. الاختصارات: FGF = عامل نمو الخلايا الليفية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2. دراسات تلطيخ المناعة. (أ) تحافظ الطعوم العضلية الصدغية على البقاء. تحافظ الطعوم العضلية الصدغية (EMS) على أنسجة القشرة الإقفارية على قابلية عالية للحياة. (يسار) صورة تمثيلية لنيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (المخفض) - رباعي الزوليوم المختزل - خلايا الأنسجة العضلية الملطخة من السيطرة (العضلات الساذجة من الجانب المقابل) والعضلات المطعمة في 7 أيام بعد انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAo) + جراحة التهاب الأوعية الدموية الدماغي (EMS). يظهر السهم الأسود () الخلايا التالفة. (يمين) تحديد كمية خلايا العضلات الحية / الميتة. تظهر خلايا العضلات في 7 أيام بعد EMS بعض الأضرار الخفيفة (p < 0.1 ؛ t-test) التي تعافت تماما في 21 يوما. (n = 5 فئران / نقاط زمنية = إجمالي 10 فئران في هذه المجموعة) البيانات متوسطة ± S.D. Scale bar = 20 ميكرومتر (B) ربط العضلات الصدغية المطعمة بقشرة الدماغ بعد 21 يوما من جراحة EMS. أنسجة EMS ملطخة بالأكتين العضلي الهيكلي المضاد ألفا (الأخضر) و Lectin-Dy594 (الأحمر ؛ علامة الأوعية الدموية) الأجسام المضادة (n = 3 الفئران). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تزيد جراحة التهاب الأوعية الدموية الدماغي الورمي (EMS) من كثافة الأوعية الدموية في الآفات الإقفارية بعد 21 يوما من السكتة الدماغية. (أ) صور تمثيلية لأقسام الدماغ الإكليلي من الفئران المعرضة لانسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAo) (الأيسر) أو (اليمين) MCAo + EMS والملطخة ب L. esculentum (Tomato) Lectin-Dy594 ، والتي ترتبط بالبروتينات السكرية في الغشاء القاعدي للخلايا البطانية. الرسوم البيانية هي مناطق كمية. أظهرت الفئران MCAo + EMS شبكة بطانة أعلى باستخدام معلمات مثل منطقة كسر الأوعية الدموية (B) والكثافة المتكاملة (C). ** p < 0.01 (اختبار t غير مقترن) ، في حين أظهرت الفئران MCAo فقط تلفا قريبا من الآفة الإقفارية (خط متقطع). N = 5 فئران / مجموعة = إجمالي 10 فئران. البيانات هي متوسط ± شريط مقياس S.D. = 100 ميكرومتر. الاختصارات: كونترا = الجانب المعاكس. Ipsi = الجانب الجانبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: يقوم Encephalomyosynangiosis بتعديل البروتينات الوعائية المنشأ بعد السكتة الدماغية . (A) تم استخدام مصفوفة تولد الأوعية الدموية للفئران (ARY015) لتقييم المستويات النسبية ل 53 بروتينا مرتبطا بتكوين الأوعية الدموية للفئران في وقت واحد بعد انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAo) و MCAo + EMS (اليوم 21 بعد MCAo) في تحلل أنسجة المخ من القشرة المحيطة بالآفة. يظهر التحليل الكمي أن جراحة EMS قللت بشكل كبير من osteopontin وزادت من عامل نمو الخلايا الليفية (FGF) - البروتين الحمضي بعد السكتة الدماغية (* p < 0.05 أو ** p < 0.01) مقابل MCAo الجانبي. البيانات هي متوسط ± S.D. ؛ n = 3 فئران / مجموعة / نقطة زمنية = إجمالي 15 فأر. (ب) لم يزيد EMS من الوفيات بعد السكتة الدماغية (MCAo). يظهر منحنى البقاء على قيد الحياة في كابلان ماير أن EMS + MCAO لم يغير معدل الوفيات بعد السكتة الدماغية مقابل MCAO وحده (p = 0.54). بالنسبة ل EMS n = 3 ؛ ل MCAo n = 11 ؛ وبالنسبة ل MCAo + EMS n = 21. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول إجراء EMS ناجحا في نموذج الماوس للسكتة الدماغية التي يسببها MCAo. تظهر البيانات أن الأنسجة المطعمة لا تزال قابلة للحياة ويمكن أن تشكل روابط مع قشرة الدماغ بعد فترة طويلة من جراحة EMS. تدعم هذه النتائج الأساس المنطقي لاستخدام طعم العضلات الدماغية لتطوير بيئة غذائية غنية بالأوعية الدموية تدريجيا في موقع السكتة الدماغية. EMS هو علاج واعد لإصلاح الأنسجة الدماغية المحتقنة المحتملة في نفس البيئة.

تشمل الخطوات الحاسمة للبروتوكول الخطوة 2.2.4: هذه الخطوة تسبب صدمة لا مفر منها ل TM ، مما قد يقلل من قدرته على الارتباط بالقشرة وإطلاق العوامل الغذائية. احرص على الحد من صدمة TM إلى أقصى حد ممكن. استراتيجية بديلة للحد من صدمة الأنسجة هي تشريح TM بصراحة من الجمجمة فقط عند حدودها الظهرية والتخلي عن استئصال العضلات. في هذه الحالة ، سيتم رفع TM بعيدا عن الجمجمة (بدلا من عكسه بالكامل) ، وسيتم إجراء بضع القحف باستخدام حفر بضع القحف تحت العضلات. هذا يقلل من مقدار المساحة المتاحة لتنفيذ هذه الخطوة ولكن مرة أخرى قد يقلل من صدمة TM. علاوة على ذلك ، فإن العناية القصوى والممارسة ضرورية في الخطوتين 2.2.5 و 2.2.6 ، لمنع إصابة قشرة الدماغ الأساسية أثناء بضع القحف والتلاعب بالجافية.

نموذج EMS هذا هو مساعد طبيعي لنموذج MCAo الراسخ. نظرا لأن نموذج MCAo يحاكي عن كثب الفيزيولوجيا المرضية لنقص التروية وتلف شبكة الأوعية الدموية ، وهو أمر شائع في المرضى من البشر ، فمن المرجح أن يكون لنموذج MCAo + EMS مستوى عال من قابلية الترجمة إلى البشر. نموذج EMS المعروض هنا هو أول تدخل علاجي تمت دراسته للسكتة الدماغية الإقفارية في الإعداد قبل السريري الذي يعتمد فقط على الأنسجة الذاتية. علاوة على ذلك ، نظرا لأن طعم TM عضوي وذاتي ، فقد يظهر تفاعلات إشارات باراكرين مع الدماغ المصاب المجاور الذي يعمل على تنظيم إطلاق العوامل الغذائية إلى المستويات المثلى في نقاط زمنية مختلفة.

في حين أن السكتة الدماغية تخلق بيئة مسببة للوعائية وتحفز تكوين الأوعية الدموية نفسها26 ، فإن الاستجابة الجوهرية بعد السكتة الدماغية ليست كافية لتحسين إمدادات الأوعية الدموية في المنطقة المتضررة بسبب مستويات دون العتبة من العوامل الوعائية. هنا ، عزز EMS التعبير عن البروتين الحمضي FGF مقارنة بالحيوانات التي تعاني من السكتة الدماغية فقط. يتحكم هذا البروتين بشكل غير مباشر في الأوعية الدموية الجديدة بالتنسيق مع عوامل النمو الأخرى. يعمل FGF-acidic أيضا كعامل عصبي ، مما يعزز الحماية العصبية وتكوين الخلايا العصبية27,28. يتم التوسط في بعض الآثار العصبية للحمض FGF عن طريق تنشيط مسارات AKT و MAPK / EPK29. بالإضافة إلى FGF ، كان هناك أيضا انخفاض في التعبير عن بروتين osteopontin. Osteopontin هو سيتوكين مؤيد للالتهابات ، متعدد الأضلاع يتم الاعتراف به بشكل متزايد لدوره في الأمراض العصبية المتعددة وعمليات إعادة تشكيل الأنسجة ، من بين وظائف أخرى. دور osteopontin في السكتة الدماغية لا يزال غير مؤكد30. ومع ذلك ، تشير الدراسات الحديثة التي أجريت على البشر إلى أن أوستيوبونتين كعامل تنبؤي ضعيف بعد السكتة الدماغية. تم عرض انخفاض في مستويات أوستيوبونتين في الدم بعد السكتة الدماغية في إحدى الدراسات للتنبؤ بنتائج إيجابية (درجة مقياس رانكين المعدلة < 2 في 90 يوما) في المرضى البشر الذين يعانون من السكتة الدماغية31. أظهرت دراسة أخرى وجود علاقة تعتمد على الجرعة بين مستويات أعلى من أوستيوبونتين البلازما ونتائج الوفاة والعجز لدى المرضى من البشر بعد السكتة الدماغية32. تمشيا مع هذه الدراسات السريرية ، تشير البيانات هنا إلى أن انخفاض osteopontin بعد EMS قد يعزز بيئة مضادة للالتهابات لزيادة تكوين الأوعية الجديدة. بشكل عام ، يشير التعبير التفاضلي عن FGF-acidic و osteopontin إلى الآليات التي تحكم تكوين الأوعية الدموية بعد EMS في نموذج الفأر هذا ويزيد من احتمال أن الإجراء الذي يمكن أن يؤدي أيضا إلى الحماية العصبية والتجديد العصبي بالإضافة إلى تكوين الأوعية.

هناك بعض القيود المحتملة لهذا الإجراء. يعد قياس التدفق الدماغي بسبب زيادة كثافة الأوعية الدموية أمرا صعبا في هذا الإجراء ، حيث تتأثر الإجراءات الشائعة الاستخدام لدوبلر الليزر أو مقياس تدفق بقع الليزر بوجود العضلات الصدغية في الجزء العلوي من القشرة الدماغية والتي تمنع قياس الدم الحقيقي على سطح القشرة. وبالتالي ، قد يحتاج هذا الإجراء إلى فحص بالرنين المغناطيسي للقوارض الصغيرة أكثر تطورا ، ولكن نادرا ما يكون متاحا ، إذا كانت هناك حاجة إلى قياس التدفق في الوقت الفعلي. ومع ذلك ، فإن استخدام قياس كثافة الأوعية الدموية يدعم بشكل غير مباشر نجاح إجراء EMS في تحسين تولد الأوعية الدموية كما هو مقترح في بياناتنا. هناك قيد آخر هو الطبيعة الغازية لتدخلات EMS على قمة MCAo ، وهو في حد ذاته إجراء غازي. في حين لم تكن هناك زيادة في معدل الوفيات مع EMS في هذه الدراسة مقارنة ب MCAo فقط ، فإن متطلبات استئصال نصف الجمجمة قد تحد من قابليتها للترجمة المستقبلية لجميع أنواع السكتة الدماغية. ومع ذلك ، في الممارسة السريرية ، يحتاج >10٪ من المرضى الذين يعانون من سكتة دماغية إقفارية كبيرة إلى استئصال نصف الجمجمة لإدارة الضغط المتزايد داخل الجمجمة23 ، وقد يكون لنموذج EMS هذا قيمة انتقالية لهذه المجموعة الفرعية من مرضى السكتة الدماغية على وجه الخصوص. وأخيرا ، تم اختيار النقطة الزمنية 4 ساعات بعد MCAo لأداء EMS لتقع ضمن نافذة العلاج القياسية ل rT-PA لمعظم المرضى من البشر ، على الرغم من أن الدراسات المستقبلية ستستخدم نقاطا زمنية لاحقة لتقييم النافذة العلاجية ل EMS.

بشكل عام ، يوفر نموذج EMS خيارا جيد التحمل لتحفيز تكوين الأوعية الدموية بعد السكتة الدماغية الإقفارية ، وبالإضافة إلى ترجمته السريرية المحتملة ، يمكن استخدامه في الدراسات المستقبلية التي تدرس الفيزيولوجيا المرضية للسكتة الدماغية وتكوين الأوعية.

يقدم نموذج EMS الموصوف هنا طريقة آمنة لتحقيق تولد الأوعية الدماغية للدراسة قبل السريرية ، مما يغني عن الحاجة إلى التدخلات الدوائية ، والتي غالبا ما تؤدي إلى آثار جانبية غير مرغوب فيها أو تولد الأوعية الدموية غير المنضبط. يحتاج العديد من المرضى الذين يعانون من السكتات الدماغية الإقفارية الكبيرة إلى استئصال نصف الجمجمة خلال الدورة السريرية لإدارة الضغط المتزايد داخل الجمجمة. قد يوفر إجراء EMS هذا ، والذي يتضمن أيضا استئصال نصف الجمجمة في الفئران لتطعيم العضلات ، دليلا قبل سريريا على المفهوم للتطبيق الانتقالي ل EMS في السكتة الدماغية الإقفارية. لذلك ، فإن هذا النموذج لديه القدرة على توسيع معرفة الانتعاش العصبي الوعائي بعد السكتة الدماغية الإقفارية وتسهيل تطوير الابتكار ، الذي هو حاجة الساعة ، في العلاجات للناجين من السكتة الدماغية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل برنامج التميز البحثي - UConn Health (إلى Ketan R Bulsara و Rajkumar Verma) وبدء تشغيل UConn Health (إلى Rajkumar Verma).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-0 monocryl suture Ethilon 697G
70% ethanol to sanitize operating surface Walgreens
Bupivacaine 0.25% solution Midwest Vet
Clamps for tissue retraction Roboz
Doccal suture with silicone coating Doccal Corporation 602145PK10Re
Electric heating pad for operating surface
Isoflurane anesthesia Piramal Critical Care Inc
Isoflurane delivery apparatus B6Surgivet (Isotech 4)
Micro drill Harvard Apparatus
Microdissecting tweezers, curved x2 Piramal Critical Care Inc
mouse angiogenesis panel arrat R& D biotech ARY015
Needle driver Ethilon
Ointment for eye protection Walgreens
Operating microscope Olympus
Operating surface Olympus
Povidone iodine solution Walgreens
Rectal thermometer world precison instrument
Saline or 70% ethanol for irrigation Walgreens
Small electric razor to shave operative site Generic
Surgical scissors Roboz

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stroke, Last updated 10/22/20. , Accessed 11/12/20. https://www.cdc.gov/stroke/index.htm (2020).
  2. Cipolla, M. J., McCall, A. L., Lessov, N., Porter, J. M. Reperfusion decreases myogenic reactivity and alters middle cerebral artery function after focal cerebral ischemia in rats. Stroke. 28 (1), 176-180 (1997).
  3. Arai, K., et al. Cellular mechanisms of neurovascular damage and repair after stroke. Journal of Child Neurology. 26 (9), 1193-1198 (2011).
  4. Ergul, A., Alhusban, A., Fagan, S. C. Angiogenesis: a harmonized target for recovery after stroke. Stroke. 43 (8), 2270-2274 (2012).
  5. Imai, H., et al. The importance of encephalo-myo-synangiosis in surgical revascularization strategies for moyamoya disease in children and adults. World Neurosurgery. 83 (5), 691-699 (2015).
  6. Ravindran, K., Wellons, J. C., Dewan, M. C. Surgical outcomes for pediatric moyamoya: a systematic review and meta-analysis. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 24 (6), 663-672 (2019).
  7. Kim, H. S., et al. The neovascularization effect of bone marrow stromal cells in temporal muscle after encephalomyosynangiosis in chronic cerebral ischemic rats. Journal of Korean Neurosurgical Society. 44 (4), 249-255 (2008).
  8. Srivastava, P., et al. Neuroprotective and neuro-rehabilitative effects of acute purinergic receptor P2X4 (P2X4R) blockade after ischemic stroke. Experimental Neurology. , 329 (2020).
  9. Cao, R., et al. VEGFR1-mediated pericyte ablation links VEGF and PlGF to cancer-associated retinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 856-861 (2010).
  10. Hedlund, E., Hosaka, K., Zhong, Z., Cao, R., Cao, Y. Malignant cell-derived PlGF promotes normalization and remodeling of the tumor vasculature. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17505-17510 (2009).
  11. Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits. Discovery Medicine. 9 (46), 179-184 (2010).
  12. Verma, R., et al. Inhibition of miR-141-3p ameliorates the negative effects of poststroke social isolation in aged mice. Stroke. 49 (7), 1701-1707 (2018).
  13. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  14. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice-middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), 2423 (2011).
  15. Pétrault, M., et al. Neither nefopam nor acetaminophen can be used as postoperative analgesics in a rat model of ischemic stroke. Fundam Clin Pharmacol. (2), 194-200 (2017).
  16. Khansari PS,, Halliwell RF, Mechanisms Underlying Neuroprotection by the NSAID Mefenamic Acid in an Experimental Model of Stroke. (64), (2019).
  17. Mishra, V., Verma, R., Raghubir, R. Neuroprotective effect of flurbiprofen in focal cerebral ischemia: the possible role of ASIC1a. Neuropharmacology. 59 (7-8), 582-588 (2010).
  18. Chen, T. Y., Goyagi, T., Toung, T. J., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Koehler, R. C., Bhardwaj, A. Prolonged opportunity for ischemic neuroprotection with selective kappa-opioid receptor agonist in rats. Stroke. 35 (5), 1180-1185 (2004).
  19. Turóczi, Z., et al. Muscle fiber viability, a novel method for the fast detection of ischemic muscle injury in rats. PLoS ONE. 9 (1), e84783 (2014).
  20. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 299-311 (2019).
  21. Zheng, J., et al. Protective roles of adenosine A1, A2A, and A3 receptors in skeletal muscle ischemia and reperfusion injury. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (6), H3685-H3691 (2007).
  22. Jiao, C., et al. Visualization of mouse choroidal and retinal vasculature using fluorescent tomato lectin perfusion. Translational Vision Science and Technology. 9 (1), (2020).
  23. Simard, J. M., Sahuquillo, J., Sheth, K. N., Kahle, K. T., Walcott, B. P. Managing malignant cerebral infarction. Current Treatment Options in Neurology. 13 (2), 217-229 (2011).
  24. Liu, X., et al. Osteoclasts protect bone blood vessels against senescence through the angiogenin/plexin-B2 axis. Nature Communications. 12 (1), 1832 (2021).
  25. Paro, M., Gamiotea-Turro, D., Blumenfeld, L., Bulsara KR,, Verma, R. A Novel Model for Encephalomyosynangiosis Surgery after Middle Cerebral Artery Occlusion-Induced Stroke in Mice. BioXriv. 10, (2021).
  26. Venkat, P., et al. Treatment with an Angiopoietin-1 mimetic peptide promotes neurological recovery after stroke in diabetic rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 27 (1), 48-59 (2021).
  27. Cheng, X., et al. Acidic fibroblast growth factor delivered intranasally induces neurogenesis and angiogenesis in rats after ischemic stroke. Neurological Research. 33 (7), 675-680 (2011).
  28. Xu, H. Protective effects of mutant of acidic fibroblast growth factor against cerebral ischaemia-reperfusion injury in rats. Injury. 40 (9), 963-967 (2009).
  29. Tsai, M. J., et al. Acidic FGF promotes neurite outgrowth of cortical neurons and improves neuroprotective effect in a cerebral ischemic rat model. Neuroscience. 305, 238-247 (2015).
  30. Meller, R., et al. Neuroprotection by osteopontin in stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 25 (2), 217-225 (2005).
  31. Meseguer, E., et al. Osteopontin predicts three-month outcome in stroke patients treated by reperfusion therapies. Journal of Clinical Medicine. 9 (12), 4028 (2020).
  32. Zhu, Z., et al. Plasma osteopontin levels and adverse clinical outcomes after ischemic stroke. Atherosclerosis. 332, 33-40 (2021).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 184 ،
نموذج لعلاج التهاب الأوعية الدموية الدماغية بعد السكتة الدماغية الناجمة عن انسداد الشريان الدماغي الأوسط في الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Paro, M. R., Gamiotea Turro, D.,… More

Paro, M. R., Gamiotea Turro, D., Mcgonnigle, M., Bulsara, K. R., Verma, R. A Model for Encephalomyosynangiosis Treatment after Middle Cerebral Artery Occlusion-Induced Stroke in Mice. J. Vis. Exp. (184), e63951, doi:10.3791/63951 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter