Summary
Das Protokoll zielt darauf ab, Methoden für die Enzephalomomyosynangiose - Transplantation eines vaskulären Temporalis-Muskellappens auf der Pialoberfläche des ischämischen Hirngewebes - zur Behandlung des akuten ischämischen Schlaganfalls ohne Moyamoya bereitzustellen. Die Wirksamkeit des Ansatzes bei der Steigerung der Angiogenese wird anhand eines vorübergehenden Verschlussmodells der mittleren Hirnarterien bei Mäusen bewertet.
Abstract
Für die meisten Patienten, die an einem ischämischen Schlaganfall leiden, gibt es keine wirksame Behandlung, was die Entwicklung neuartiger Therapeutika zwingend erforderlich macht. Die Fähigkeit des Gehirns, sich nach einem ischämischen Schlaganfall selbst zu heilen, ist durch eine unzureichende Blutversorgung im betroffenen Bereich eingeschränkt. Die Enzephalomyosynangiose (EMS) ist ein neurochirurgisches Verfahren, das bei Patienten mit Morbus Moyamoya eine Angiogenese erreicht. Es handelt sich um eine Kraniotomie mit Platzierung eines vaskulären Temporalis-Muskeltransplantats auf der ischämischen Gehirnoberfläche. EMS wurde noch nie im Rahmen eines akuten ischämischen Schlaganfalls bei Mäusen untersucht. Die Hypothese, die dieser Studie zugrunde liegt, ist, dass EMS die zerebrale Angiogenese an der kortikalen Oberfläche um das Muskeltransplantat herum verbessert. Das hier gezeigte Protokoll beschreibt das Verfahren und liefert erste Daten, die die Machbarkeit und Wirksamkeit des EMS-Ansatzes belegen. In diesem Protokoll wurden Mäuse nach 60 Minuten vorübergehendem mittleren Hirnarterienverschluss (MCAo) randomisiert entweder einer MCAo- oder MCAo + EMS-Behandlung unterzogen. Das EMS wurde 3-4 h nach der Okklusion durchgeführt. Die Mäuse wurden 7 oder 21 Tage nach der MCAo- oder MCAo + EMS-Behandlung geopfert. Die Lebensfähigkeit des Temporalis-Transplantats wurde mit dem Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-reduzierten Tetrazoliumreduktase-Assay gemessen. Ein Mausangiogenese-Array quantifizierte die angiogene und neuromodulierende Proteinexpression. Die Immunhistochemie wurde verwendet, um die Transplantatbindung mit der Hirnrinde und die Veränderung der Gefäßdichte zu visualisieren. Die vorläufigen Daten hier deuten darauf hin, dass der transplantierte Muskel 21 Tage nach dem EMS lebensfähig blieb. Die Immunfärbung zeigte eine erfolgreiche Transplantatimplantation und eine Zunahme der Gefäßdichte in der Nähe des Muskeltransplantats, was auf eine erhöhte Angiogenese hinweist. Die Daten zeigen, dass EMS den Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) erhöht und den Osteopontinspiegel nach einem Schlaganfall senkt. Darüber hinaus erhöhte EMS nach einem Schlaganfall die Mortalität nicht, was darauf hindeutet, dass das Protokoll sicher und zuverlässig ist. Dieses neuartige Verfahren ist wirksam und gut verträglich und hat das Potenzial, Informationen über neuartige Interventionen zur verbesserten Angiogenese nach akutem ischämischen Schlaganfall zu liefern.
Introduction
Der ischämische Schlaganfall ist eine akute neurovaskuläre Verletzung mit verheerenden chronischen Folgeerkrankungen. Die meisten Schlaganfallüberlebenden, 650.000 pro Jahr, in den USA leiden an einer dauerhaften funktionellen Behinderung1. Keine der verfügbaren Behandlungen bietet Neuroprotektion und funktionelle Erholung nach der akuten Phase des ischämischen Schlaganfalls. Nach einem akuten ischämischen Schlaganfall sind sowohl die direkte als auch die kollaterale Blutversorgung vermindert, was zu Funktionsstörungen von Gehirnzellen und Netzwerken führt, was zu plötzlichen neurologischen Ausfällen führt 2,3. Die Wiederherstellung der Blutversorgung der ischämischen Region bleibt das oberste Ziel der Schlaganfalltherapie. Daher ist die Verbesserung der Angiogenese zur Förderung der Blutversorgung im ischämischen Territorium ein vielversprechender therapeutischer Ansatz; Zuvor untersuchte Methoden zur Förderung der Angiogenese nach Schlaganfall, einschließlich Erythropoietin, Statine und Wachstumsfaktoren, wurden jedoch durch inakzeptable Toxizitäts- oder Übersetzbarkeitsniveaus eingeschränkt4.
Die Enzephalomyosynangiose (EMS) ist ein chirurgisches Verfahren, das die zerebrale Angiogenese bei Menschen mit Moyamoya-Krankheit verbessert, einem Zustand verengter Schädelarterien, der häufig zu einem Schlaganfall führt. EMS beinhaltet eine teilweise Ablösung eines vaskulären Abschnitts des Temporalismuskels des Patienten vom Schädel, gefolgt von einer Kraniotomie und einer Transplantation des Muskels auf den betroffenen Kortex. Dieses Verfahren ist gut verträglich und induziert eine zerebrale Angiogenese, wodurch das Risiko eines ischämischen Schlaganfalls bei Patienten mit Moyamoya-Krankheit verringertwird 5,6. Somit erfüllt das Verfahren bei diesen Patienten weitgehend eine präventive Rolle. Die durch dieses Verfahren hervorgerufene Angiogenese kann auch eine Rolle bei der Förderung des neurovaskulären Schutzes und der Erholung im Rahmen eines ischämischen Schlaganfalls spielen. Dieser Bericht unterstützt die Hypothese, dass die durch EMS hervorgerufene Angiogenese das Potenzial hat, das Verständnis und die therapeutischen Optionen für zerebrale Ischämie zu erweitern.
Neben EMS gibt es mehrere pharmakologische und chirurgische Ansätze zur Verbesserung der Angiogenese, aber sie haben mehrere Einschränkungen. Pharmakologische Ansätze wie die Verabreichung des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) erwiesen sich aufgrund mehrerer Einschränkungen, einschließlich der Bildung chaotischer, desorganisierter, undichter und primitiver Gefäßplexus, die denen im Tumorgewebe ähneln 7,8 und in klinischen Studien keine positiven Auswirkungen haben9.
Chirurgische Ansätze umfassen direkte Anastomose wie oberflächliche temporale Arterien-mittlere Hirnarterienanastomose, indirekte Anastomose wie Enzephalo-Duro-Arterio-Synangiose (EDAS), Enzephalomyosynangiose (EMS) und Kombinationen von direkter und indirekter Anastomose10. Alle diese Verfahren sind bei Kleintieren technisch sehr anspruchsvoll und anspruchsvoll, mit Ausnahme von EMS. Während die anderen Verfahren eine komplexe vaskuläre Anastomose erfordern, erfordert EMS ein relativ einfaches Muskeltransplantat. Darüber hinaus macht die Nähe des Musculus temporalis zum Kortex ihn zu einer natürlichen Wahl für die Transplantation, da er nicht vollständig herausgeschnitten oder von seiner Blutversorgung getrennt werden muss, wie es notwendig wäre, wenn ein weiter entfernter Muskel zum Pfropfen verwendet würde.
EMS wurde in chronischen zerebralen Hypoperfusionsmodellen an Ratten untersucht 7,11. EMS mit einem Temporalis-Muskeltransplantat wurde jedoch noch nie bei akutem ischämischem Schlaganfall bei Nagetieren untersucht. Hier beschreiben wir ein neuartiges EMS-Protokoll bei Mäusen nach einem ischämischen Schlaganfall über ein mittleres Hirnarterienverschlussmodell (MCAo). Dieses Manuskript dient als Beschreibung von Methoden und frühen Daten für diesen neuartigen Ansatz des EMS bei Mäusen nach MCAo.
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Protocol
Alle Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee von UConn Health genehmigt und gemäß den US-Richtlinien durchgeführt. Das folgende Protokoll sollte bei jeder Art oder jedem Nagetierstamm funktionieren. Hier wurden 8 bis 12 Wochen alte, alters- und gewichtsangepasste C57BL/6-Wildtyp-Männchen verwendet. Mäuse wurden mit Standardfutter und Wasser ad libitum gefüttert. Die Standard-Gehäusebedingungen wurden bei 72,3 ° F und 30% -70% relativer Luftfeuchtigkeit mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12 Stunden beibehalten.
1. Vorbereitung vor der Operation
- Sterilisieren Sie alle Instrumente vor der Operation durch Autoklavieren. Desinfizieren Sie die Bedienfläche mit 70% Ethanol und erwärmen Sie die Bedienfläche mit einem elektrischen Heizkissen auf 37 °C.
- Verwenden Sie eine Induktionskammer, um die Maus mit 4% -5% Isofluran zur Induktion zu betäuben. Verabreichen Sie 1,5% -2,0% Isofluran über den Nasenkonus zur Aufrechterhaltung bis zum Ende der Operation. Stellen Sie vor der Operation sicher, dass die Maus ordnungsgemäß betäubt wird, indem Sie das Fehlen einer Reaktion auf eine feste Hinterfußklemme und den Verlust der Haltungsreaktion und des Aufrichtreflexes beurteilen.
- Legen Sie die Maus auf die linke Seite auf die Operationsfläche und tragen Sie eine Augensalbe auf, um beide Augen zu schützen.
- Rasieren Sie Haare über dem Operationsfeld (d.h. rechter lateraler Schädel zwischen Auge und Ohr) mit elektrischen Haarschneidemaschinen. Reinigen Sie das Operationsfeld in konzentrischen Kreisen von der Mitte der Operationsstelle nach außen mit 70% Ethanol gefolgt von Povidonlösung und wiederholen Sie diese Schritte 2x.
HINWEIS: Da sich die Operationsstelle in der Nähe des Auges befindet, ist es möglicherweise nicht möglich, 150% des Bereichs um eine Operationsstelle herum zu entfernen, um Reizungen oder versehentliche Verletzungen des Auges zu vermeiden. - Verabreichen Sie eine Einzeldosis von 0,25% Bupivacain (bis zu 8 mg/kg Körpergewicht) durch subkutane Injektion als präoperative Analgesie an der Operationsstelle.
- Stellen Sie ein Operationsmikroskop mit 4-facher Vergrößerung auf. Das Mikroskop wird für alle chirurgischen Schritte verwendet.
2. Chirurgischer Eingriff
HINWEIS: Die Operationsschritte sind in Abbildung 1 dargestellt. Für dieses Protokoll wurden drei Mäuse der Scheingruppe, drei Mäuse für EMS allein, 12 Mäuse für MCAo und 23 Mäuse für MCAo + EMS-Gruppe zugeordnet.
- MCAo-Chirurgie
HINWEIS: MCAo ist ein gut charakterisiertes Modell des ischämischen Schlaganfalls bei Nagetieren, wie von uns und anderen beschrieben12,13,14. Die Operationsschritte werden hier kurz beschrieben. Die fokale transiente zerebrale Ischämie wurde durch eine 60-minütige rechte MCAo unter Isoflurananästhesie induziert, gefolgt von einer Reperfusion für 7 oder 21 Tage.- Machen Sie einen ventralen Nackenschnitt in der Mittellinie, gefolgt von einem einseitigen rechten MCAo, indem Sie ein 10-11 mm langes 6.0-Silikongummi-beschichtetes Monofilament von der inneren Karotis-Arterienbifurkation über einen äußeren Karotis-Arterienstumpf vorschieben. Führen Sie bei Scheinmäusen identische Operationen durch, mit Ausnahme des Vorrückens der Naht in die Arteria carotis interna.
- Messen Sie die Rektaltemperaturen mit einem Temperaturkontrollsystem und halten Sie die Temperatur während der Operation mit einem automatischen Heizkissen bei ~ 37 ° C.
- Verwenden Sie die Laser-Doppler-Durchflussmessung, um den zerebralen Blutfluss vor dem Nahteinführen zu messen, indem Sie die Dopplersonde gegen den lateralen Schädel (entsprechend dem MCA-Territorium) legen und den Wert8 aufzeichnen. Um die Okklusionsreduktion auf 15% des zerebralen Blutflusses zu bestätigen, verwenden Sie das gleiche Verfahren, nachdem die Naht vorgeschoben wurde. Um die Reperfusion zu bestätigen, verwenden Sie das gleiche Verfahren, nachdem die Naht entfernt wurde.
- Füttern Sie alle Tiere mit nassem Brei bis zum Opfer und/oder 1 Woche nach der Operation, um eine angemessene Ernährung für chronische Endpunkte zu gewährleisten, da die Tiere nach einem Schlaganfall Aufzuchtdefizite aufweisen.
- EMS-Chirurgie
- Nach 60 Minuten MCAo randomisieren Sie Mäuse in MCAo-only- oder MCAo + EMS-Gruppen. Führen Sie EMS 4 h nach MCAo (MCAo + EMS-Gruppe) oder Scheinoperationen für ausgewählte Experimente (EMS-only-Gruppe) durch. Wechseln Sie vor der Operation in ein neues Paar sterile OP-Handschuhe.
HINWEIS: Die Mäuse erholten sich nach 60 Minuten MCAo von der Anästhesie und wurden vor der EMS-Operation erneut betäubt. - Für Gruppen, die EMS erhalten (MCAo + EMS oder EMS-only-Gruppen), machen Sie einen 10-15 mm Hautschnitt mit einer Schere, der sich von 1-2 mm rostral zum rechten Ohr bis 1-2 mm kaudal zum rechten Auge erstreckt.
HINWEIS: Eine sterile Schere wurde verwendet, um eine versehentliche Beschädigung der darunter liegenden Temporalis-Muskeln zu verhindern. - Ziehen Sie Hautlappen mit Klemmen zurück und identifizieren Sie visuell den Temporalismuskel und den Schädel.
- Sezieren Sie den Musculus temporalis stumpf vom Schädel weg, indem Sie eine Schere mit einer Spreiztechnik verwenden. Führen Sie eine 2-3 mm Myotomie durch, die ventral entlang der kaudalen Grenze des Muskels gerichtet ist, um die ventrale Reflexion zu erleichtern.
- Führen Sie eine Kraniotomie ~ 5 mm Durchmesser am Schädel unter dem reflektierten Temporalismuskel mit einem Mikrobohrer durch.
- Entfernen Sie die Dura mater mit einer Pinzette, um die Pialoberfläche des Gehirns freizulegen. Seien Sie äußerst vorsichtig, um versehentliche Verletzungen des Gehirns zu vermeiden.
- Vernähen Sie den dorsalen Rand des Musculus temporalis mit dem Unterhautgewebe des dorsalen Hautlappens mit 6-0 Monokrylfilamenten, wodurch er bündig zur freiliegenden Großhirnrinde wird.
- Schließen Sie den Hautschnitt mit einer 6-0-Monofilamentnaht. Setzen Sie die Maus zurück in den Käfig und überwachen Sie, bis sie sich von der Narkose erholt hat. Bringen Sie die Maus in ihre Wohneinrichtung zurück.
- Nach 60 Minuten MCAo randomisieren Sie Mäuse in MCAo-only- oder MCAo + EMS-Gruppen. Führen Sie EMS 4 h nach MCAo (MCAo + EMS-Gruppe) oder Scheinoperationen für ausgewählte Experimente (EMS-only-Gruppe) durch. Wechseln Sie vor der Operation in ein neues Paar sterile OP-Handschuhe.
3. Postoperative Überlegungen
- Überwachen Sie die Mäuse täglich auf Krankheiten und die Operationsstelle auf Infektionen. Geben Sie täglich subkutane normale Kochsalzlösung (1% Volumen nach Körpergewicht), um die Hydratation zu unterstützen.
- Überwachung auf schwere Dehydratation (Verlust des Körpergewichts >20%) bis 7 Tage nach der Operation. Verabreichen Sie einen zusätzlichen Bolus von subkutaner normaler Kochsalzlösung 1% Volumen nach Körpergewicht, wenn >20% Gewichtsverlust.
- Fahren Sie mit Injektionen, physiologischer Überwachung und anderen Tests ohne besondere Überlegungen fort.
HINWEIS: Bei diesem Verfahren wurde die Verwendung von Opioiden oder nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAIDs) zur Behandlung nach der Operation aufgrund der bekannten Auswirkungen dieser Mittel auf das Schlaganfallergebnis oder die Infarktgröße in Absprache mit dem internen institutionellen Tierpflege- und -verwendungsausschuss15,16,17,18 vermieden. Die Verwendung von postoperativer Analgesie wird jedoch für EMS-Operationen mit anderen Modellen dringend empfohlen. Bitte wenden Sie sich hierzu an das Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
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Representative Results
Insgesamt wurden 41 Mäuse für diese Studie verwendet. Nach drei Mortalitäten, eine in MCAo und zwei in MCAo + EMS, wurden insgesamt 38 Mäuse verwendet, um die gezeigten Ergebnisse zu erhalten.
Statistik
Die Daten aus jedem Experiment werden als Mittelwert ± Standardabweichung (S.D.) dargestellt. Die Signifikanz wurde entweder unter Verwendung des ungepaarten studentischen t-Tests zum Vergleich zweier Gruppen oder der Einweg-ANOVA für mehr als zwei Gruppen bestimmt, wobei ein Newman-Keuls-Post-hoc-Test zur Korrektur mehrerer Vergleiche verwendet wurde.
Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-(reduziert)-Tetrazoliumreduktase (NADH-TR)-Färbung
Diese Färbung wurde durchgeführt, um die langfristige Lebensfähigkeit des transplantierten Muskels zu beurteilen, wie in Turoczi et al.19. Kurz gesagt, zum Zeitpunkt des Opfers wurde der gepfropfte Muskellappen sorgfältig herausgeschnitten, 30 min lang mit 4% Paraformaldehyd fixiert und in optimaler Schnitttemperatur (OCT) bei -80 °C kryokonserviert. Mehrere 12 μm dicke Kryosektionen von Temporalis-Muskelgewebe wurden für die NADH-TR-Enzym-histochemische Reaktion gefärbt. Objektträger wurden für 30 min bei 37 °C in einer Lösung von nitroblauem Tetrazolium (1,8 mg/dl) und NADH (15 mg/dl) in 0,05 M Tris-Puffer (pH 7,6) inkubiert. Nicht verwendetes Tetrazoliumreagenz wurde mit zunehmenden, gefolgt von abnehmenden Acetonkonzentrationen entfernt. Die quantitative Bewertung von NADH-Tetrazolium-gefärbten Muskeln wurde anhand von Muskelbildern durchgeführt, die mit 40-facher Vergrößerung aufgenommen wurden.
Immunfärbungsstudien
Die Immunfärbung wurde verwendet, um die Bindung von Muskeltransplantaten mit Kortex und Blutgefäßdichte an der Verbindung von Muskel und Kortex zu visualisieren20,21. Zur Visualisierung der Muskelbindung mit Hirngewebe wurden hier Mäuse verwendet, die sich einer EMS-Operation unterzogen hatten. Am Ende des jeweiligen Zeitpunkts wurden die Mäuse mit einer Avertin Injektion (50 mg/kg Körpergewicht) betäubt, gefolgt von einer Perfusion mit 1x PBS mit 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und einer Fixierung mit 4% Paraformaldehyd. Der Schädel wurde sorgfältig geschnitten, um eine versehentliche Ablösung des Temporalismuskels (TM) vom Hirnkortex zu verhindern. Das TM-Transplantat oberhalb der Hirnrinde wurde dann vom verbleibenden Musculus temporalis getrennt. Das Gehirn wurde sorgfältig entfernt und über Nacht in 4% Paraformaldehyd nachfixiert. Das fixierte Gehirn wurde dann mit 30% Saccharose in 1x PBS dehydriert, bis das Gehirn auf den Boden der Durchstechflasche sank (ca. 1-3 Tage). Gewebeschnitte von 30 μm Größe wurden mit Gefriermikrotom geschnitten und auf Objektträger montiert.
Für die Immunfärbung von Blutgefäßen in der ipsilateralen Hirnrinde wurden MCAo- und MCAo + EMS-Mäuse wie oben geopfert, durchblutet, fixiert und verarbeitet. Gehirnschnitte von 30 μm Größe wurden auf einem gefrierenden Mikrotom geschnitten und auf einer Glasseite montiert. Die Antigengewinnung erfolgte unter Verwendung eines Citratpuffers (pH 6,0) und Abschnitte wurden mit Blockierungspuffer inkubiert, gefolgt von einer Inkubation über Nacht mit primären Antikörpern, Anti-Alpha-Skelettmuskelaktin 1:200 und Lectin-Dy59421,22. Drei koronale Hirnschnitte pro Maus (n = 5 Mäuse/Gruppe; insgesamt = 15 Schnitte) wurden zwischen 0,45 mm und 0,98 mm aus Bregma entnommen, gefärbt und zur Quantifizierung bei 20-facher Vergrößerung an der Kreuzung der ischämischen Kern- und Penumbraregion visualisiert. Ein verblindeter Beobachter quantifizierte die Lektin-positive Gefäßdichte im Hirnparenchym mit der ImageJ-Software.
Muskeltransplantat bleibt 21 Tage nach EMS lebensfähig
Eine Voraussetzung für den Erfolg dieser Operation ist die langfristige Lebensfähigkeit des transplantierten Musculus temporalis. Das TM-Transplantat zeigte 7 Tage nach der Operation eine vorübergehende Schädigung der Muskelzellen im transplantierten Muskel vs. Kontrollmuskel (71,32% Muskelzellüberleben ± 16,64% vs. 97,19% ± 3,81%). Dieser Unterschied zwischen transplantiertem und dem Kontrollmuskel verschwand jedoch, und die Muskeln erholten sich 21 Tage nach der Operation vollständig (98,22% ± 3,965 vs. 96,87% ± 2,27%; Abbildung 2A).
Muskeltransplantate lösen Bindungen mit Hirngewebe
Die erfolgreiche Transplantation des Musculus temporalis auf die Oberfläche der Hirnrinde ist eine wesentliche Voraussetzung für den Erfolg dieses Modells. Sowohl im EMS + MCAo- als auch im EMS-only-Modell haften die Temporalis-Muskeltransplantate 21 Tage nach dem EMS an der kortikalen Oberfläche, was auf eine erfolgreiche Operation, Transplantatimplantation und Bindung hindeutet (Abbildung 1B und Abbildung 2B).
Blutgefäßdichte steigt im periläsionalen Kortex nach EMS
Ein akuter Schlaganfall führt zu einer akuten Verringerung des zerebralen Blutflusses, einer behinderten Rekrutierung von Kollateralgefäßen, abnormalem Gefäßkeimen und dysfunktionaler Angiogenese, die zu schlechten Schlaganfallergebnissen beitragen23. EMS erhöht signifikant die Blutgefäßoberfläche und die integrierte Dichte im periläsionalen Kortex nach Schlaganfall (p < 0,05 vs. MCAo-only; Abbildung 3).
Analyse angiogener und neuromodulierender Proteine
Ein Maus-Angiogenese-Array wurde verwendet, um die Expression von angiogenen und neuromodulierenden Proteinen 7 Tage und 21 Tage nach MCAo in MCAo-only vs. MCAo + EMS-Mäusen gemäß den Anweisungen des Herstellerszu vergleichen 24. Die ImageJ-Software wurde verwendet, um die Pixeldichte für jeden Datenpunkt des Proteinpunkt-Blots zu quantifizieren. Die Daten wurden als Verhältnis der Dichte jedes analysierten Proteins zur gemittelten Dichte der Standards für jeden Blot aufgezeichnet.
Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF)-sauer wird hochreguliert und Osteopontin wird nach EMS herunterreguliert
Die Protein-Array-Ergebnisse zeigten einen signifikanten Anstieg der Proteinspiegel von FGF-sauer (0,677 ± 0,007 vs. 0,585 ± 0,014, p = 0,045), einem starken angiogenen Faktor, und eine Abnahme der Osteopontinspiegel, eines multifunktionalen Moleküls, das bei entzündlichen Zuständen (0,692 ± 0,007 vs. 0,758 ± 0,014, p = 0,048) in der MCAo + EMS-Gruppe 21 Tage nach Schlaganfall exprimiert wird, was auf eine verbesserte Angiogenese und Neuroprotektion hindeutet (Abbildung 4A).
Mortalitätsergebnisse für EMS nach Schlaganfall
Sowohl MCAo als auch EMS sind invasive chirurgische Techniken, die bei Mäusen zu einer gewissen Mortalität führen können. In diesem Experiment gab es 21 Tage nach der MCAo-Operation eine Mortalität zwischen 10% und 11%, was eine akzeptierte Todesrate für Mäuse ist, die 60 Minuten MCAo14 ausgesetzt waren. Die Durchführung von EMS an Mäusen nach MCAo erhöhte die Mortalität nicht (Abbildung 4B), was auf eine Toleranz einer EMS-Operation auch nach MCAo hindeutet.
Abbildung 1. Schrittweise EMS-Verfahren nach Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCAo): (A) Schritt 1. Ein Hautschnitt wird über dem rechten mittleren Hirnarteriengebiet gemacht. Die Haut und das Unterhautgewebe werden reflektiert und legen den Schädel- und Temporalismuskel frei. Schritt 2. Der Musculus temporalis wird vom Schädel weg seziert und ventral reflektiert. Schritt 3. Eine Kraniotomie wird durchgeführt (4-5 mm) und die Dura wird sanft entfernt. Schritt 4. Der Musculus temporalis wird direkt auf die Gehirnoberfläche gelegt, um den exponierten Kortex zu bedecken. Schritt 5. Der dorsale Rand des Musculus temporalis wird mit dem Unterhautgewebe des dorsalen Hautlappens vernäht und bündig mit der Hirnoberfläche vernäht. Schritt 6. Der Schnitt wird geschlossen, und die Maus wird aus der Anästhesie entfernt und in ihren Käfig zurückgebracht. Dieser Teil der Abbildung wurde von25 geändert. (B) Konzeptuelles Schema für die Behandlung der Enzephalomyosynangiose (EMS) des MCAo-induzierten Schlaganfalls. Abkürzungen: FGF = Fibroblasten-Wachstumsfaktor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2. Immunfärbungsstudien. (A) Temporalis-Muskeltransplantate erhalten die Lebensfähigkeit. Temporalis-Muskeltransplantate (EMS) auf ischämischem Kortexgewebe erhalten eine hohe Lebensfähigkeit. (Links) Repräsentatives Bild von Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (reduziert)-Tetrazoliumreduktase-gefärbten Muskelgewebezellen aus Kontrolle (naiver Muskel von kontralateraler Seite) und transplantiertem Muskel 7 Tage nach mittlerem Hirnarterienverschluss (MCAo) + Enzephalomyosynangiose (EMS) Operation. Schwarzer Pfeil () zeigt beschädigte Zellen an. (Rechts) Quantifizierung von lebenden/toten Muskelzellen. Muskelzellen zeigen 7 Tage nach EMS leichte Schäden (p < 0,1; t-Test), die sich nach 21 Tagen vollständig erholten. (n = 5 Mäuse/Zeitpunkte = insgesamt 10 Mäuse in dieser Gruppe) Die Daten sind Mittelwert ± S.D. Maßstabsbalken = 20 μm. (B) Bindung des transplantierten Temporalismuskels mit der Hirnrinde 21 Tage nach der EMS-Operation. EMS-Gewebe, gefärbt mit Anti-Alpha-Skelettmuskelaktin (grün) und Lectin-Dy594 (rot; Blutgefäßmarker) Antikörper (n = 3 Mäuse). Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Die Enzephalomyosynangiose (EMS) erhöht die Blutgefäßdichte bei ischämischen Läsionen 21 Tage nach dem Schlaganfall . (A) Repräsentative Bilder von koronalen Hirnschnitten von Mäusen, die einem (linken) mittleren Hirnarterienverschluss (MCAo) oder (rechts) MCAo + EMS unterzogen und mit L. esculentum (Tomato) Lectin-Dy594 gefärbt wurden, das an Glykoproteine in der Basalmembran von Endothelzellen bindet. Diagramme sind quantifizierte Bereiche. MCAo + EMS-Mäuse zeigten ein höheres Endothelnetzwerk unter Verwendung von Parametern wie vaskulärer Fraktionsfläche ( B) und integrierter Dichte (C). **p < 0,01 (ungepaarter t-Test), während reine MCAo-Mäuse Schäden nahe der ischämischen Läsion (gestrichelte Linie) zeigten. N = 5 Mäuse/Gruppe = 10 Mäuse insgesamt. Die Daten sind Mittelwert ± S.D. Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzungen: Contra = kontralaterale Seite; Ipsi = ipsilaterale Seite. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Enzephalomyosynangiose moduliert angiogene Proteine nach Schlaganfall . (A) Ein Mausangiogenese-Array (ARY015) wurde verwendet, um gleichzeitig die relativen Spiegel von 53 Mausangiogenese-verwandten Proteinen nach mittlerem Hirnarterienverschluss (MCAo) und MCAo + EMS (Tag 21 nach MCAo) in Hirngewebelysaten aus der periläsionalen Kortex zu bestimmen. Die quantitative Analyse zeigt, dass die EMS-Operation Osteopontin signifikant reduzierte und das saure Protein des Fibroblastenwachstumsfaktors (FGF) nach Schlaganfall (*p < 0,05 oder **p < 0,01) im Vergleich zu ipsilateralem MCAo erhöhte. Die Daten sind Mittelwert ± S.D.; n = 3 Mäuse/Gruppe/Zeitpunkt = insgesamt 15 Mäuse. (B) EMS erhöhte nicht die Mortalität nach Schlaganfall (MCAo). Die Kaplan-Meier-Überlebenskurve zeigt, dass EMS + MCAO die Mortalität nach Schlaganfall im Vergleich zu MCAO allein nicht veränderte (p = 0,54). Für EMS n = 3; für MCAo n = 11; und für MCAo + EMS n = 21. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt ein erfolgreiches EMS-Verfahren in einem Mausmodell des MCAo-induzierten Schlaganfalls. Die Daten zeigen, dass transplantiertes Gewebe lebensfähig bleibt und lange nach der EMS-Operation Bindungen mit der Hirnrinde eingehen kann. Diese Ergebnisse unterstützen die Begründung für die Verwendung eines zerebralen Muskeltransplantats, um allmählich eine reich vaskuläre trophische Umgebung am Ort des Schlaganfalls zu entwickeln. EMS ist eine vielversprechende Therapie zur potenziellen Reparatur von infarktiertem Hirngewebe in derselben Umgebung.
Zu den kritischen Schritten des Protokolls gehört Schritt 2.2.4: Dieser Schritt verursacht ein unvermeidliches Trauma der TM, das ihre Fähigkeit, sich mit dem Kortex zu verbinden und trophische Faktoren freizusetzen, verringern kann. Achten Sie darauf, das TM-Trauma so weit wie möglich zu begrenzen. Eine alternative Strategie zur Reduzierung von Gewebetraumata besteht darin, die TM nur an ihrer dorsalen Grenze stumpf aus dem Schädel zu sezieren und auf die Myotomie zu verzichten. In diesem Fall würde die TM vom Schädel weggehoben (anstatt vollständig reflektiert) und die Kraniotomie würde mit dem Kraniotomiebohrer unter dem Muskel durchgeführt werden. Dies reduziert die Menge an Platz, die für die Durchführung dieses Schritts zur Verfügung steht, kann aber auch das TM-Trauma reduzieren. Darüber hinaus ist in den Schritten 2.2.5 und 2.2.6 äußerste Sorgfalt und Übung erforderlich, um eine Verletzung der darunter liegenden Hirnrinde während der Kraniotomie und die Manipulation der Dura zu verhindern.
Dieses EMS-Modell ist eine natürliche Ergänzung zum etablierten MCAo-Modell. Da das MCAo-Modell die Pathophysiologie von Ischämie und vaskulären Netzwerkschäden, die bei menschlichen Patienten üblich ist, genau simuliert, hat das MCAo + EMS-Modell wahrscheinlich eine hohe Übersetzbarkeit auf den Menschen. Das hier vorgestellte EMS-Modell ist die erste therapeutische Intervention, die für ischämische Schlaganfälle im präklinischen Umfeld untersucht wurde, das nur auf autologem Gewebe beruht. Da das TM-Transplantat organisch und autolog ist, kann es außerdem parakrine Signalwechselwirkungen mit dem angrenzenden verletzten Gehirn zeigen, die dazu dienen, die Freisetzung trophischer Faktoren zu verschiedenen Zeitpunkten auf ein optimales Niveau zu regulieren.
Während der Schlaganfall eine proangiogene Umgebung schafft und die Angiogenese selbst stimuliert26, reicht die intrinsische Post-Schlaganfall-Reaktion aufgrund von Unterschwellenwerten angiogener Faktoren nicht aus, um die Gefäßversorgung in der geschädigten Region zu verbessern. Hier verbesserte EMS die FGF-saure Proteinexpression im Vergleich zu reinen Schlaganfalltieren weiter. Dieses Protein steuert indirekt die Neovaskularisation zusammen mit anderen Wachstumsfaktoren. FGF-sauer wirkt auch als neurotropher Faktor und fördert Neuroprotektion und Neurogenese27,28. Einige der neuroprotektiven Wirkungen von FGF-acidic werden durch die Aktivierung von AKT- und MAPK/EPK-Signalwegen vermittelt29. Neben FGF gab es auch eine verminderte Expression des Proteins Osteopontin. Osteopontin ist ein entzündungsförderndes, pleotropes Zytokin, das zunehmend für seine Rolle bei multiplen Neuropathologien und Gewebeumbauprozessen anerkannt wird. Die Rolle von Osteopontin bei Schlaganfall ist noch ungewiss30. Neuere Studien am Menschen weisen jedoch auf Osteopontin als schlechten prognostischen Faktor nach einem Schlaganfall hin. In einer Studie wurde eine Abnahme der Serum-Osteopontinspiegel nach einem Schlaganfall gezeigt, um günstige Ergebnisse (modifizierter Rankin-Skala-Score < 2 nach 90 Tagen) bei menschlichen Patienten mit Schlaganfall vorherzusagen31. Eine weitere Studie zeigte einen dosisabhängigen Zusammenhang zwischen höheren Osteopontinspiegeln im Plasma und den Ergebnissen von Tod und Behinderung bei menschlichen Patienten nach Schlaganfall32. Im Einklang mit diesen klinischen Studien deuten die Daten hier darauf hin, dass reduziertes Osteopontin nach EMS eine entzündungshemmende Umgebung fördern kann, um die Neo-Gefäßbildung zu erhöhen. Insgesamt weist die differentielle Expression von FGF-Säure und Osteopontin auf Mechanismen hin, die die Angiogenese nach EMS in diesem Mausmodell steuern und erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass das Verfahren neben der Angiogenese auch Neuroprotektion und Neuroregeneration bewirken kann.
Es gibt einige mögliche Einschränkungen dieses Verfahrens. Die Messung des zerebralen Flusses aufgrund einer erhöhten Blutgefäßdichte ist bei diesem Verfahren eine Herausforderung, da häufig verwendete Verfahren des Laser-Doppler- oder Laser-Speckle-Durchflussmessers durch das Vorhandensein von Temporalis-Muskeln auf der Oberseite des Kortex beeinflusst werden, die eine echte Blutmessung auf kortikaler Oberfläche verhindern. Daher erfordert dieses Verfahren möglicherweise einen ausgefeilteren, aber selten verfügbaren kleinen Nagetier-MRT-Scan, wenn eine Echtzeit-Durchflussmessung erforderlich ist. Die Verwendung der Blutgefäßdichtemessung unterstützt jedoch indirekt den Erfolg des EMS-Verfahrens bei der Verbesserung der Angiogenese, wie aus unseren Daten hervorgeht. Eine weitere Einschränkung ist die invasive Natur von EMS-Interventionen auf der Oberseite von MCAo, das selbst ein invasives Verfahren ist. Während es in dieser Studie keine erhöhte Mortalität mit EMS im Vergleich zu MCAo gab, kann die Notwendigkeit einer Hemikraniektomie ihre zukünftige Übersetzbarkeit für alle Arten von Schlaganfall einschränken. In der klinischen Praxis benötigen jedoch >10% der Patienten mit großem ischämischen Schlaganfall eine Hemikraniektomie, um einen erhöhten intrakraniellen Druck zu bewältigen23, und dieses EMS-Modell kann insbesondere für diese Untergruppe von Schlaganfallpatienten translationalen Wert haben. Schließlich wurde der Zeitpunkt von 4 h nach MCAo für die Durchführung von EMS so gewählt, dass er für die meisten menschlichen Patienten in das Standardbehandlungsfenster von rT-PA fällt, obwohl zukünftige Studien spätere Zeitpunkte verwenden werden, um das therapeutische Fenster für EMS zu bewerten.
Insgesamt bietet das EMS-Modell eine gut verträgliche Option zur Induktion der Angiogenese nach ischämischem Schlaganfall und kann zusätzlich zu seiner potenziellen klinischen Übersetzung in zukünftigen Studien verwendet werden, die die Pathophysiologie von Schlaganfall und Angiogenese untersuchen.
Das hier beschriebene EMS-Modell bietet eine sichere Methode zur Zerebralangiogenese für präklinische Studien, wodurch pharmakologische Interventionen vermieden werden, die oft zu unerwünschten Nebenwirkungen oder unkontrollierter Angiogenese führen. Viele Patienten mit großen ischämischen Schlaganfällen benötigen während ihres klinischen Verlaufs eine Hemikraniektomie, um den steigenden intrakraniellen Druck zu bewältigen. Dieses EMS-Verfahren, das auch die Hemikraniektomie bei Mäusen zur Muskeltransplantation umfasst, kann einen präklinischen Machbarkeitsnachweis für die translationale Anwendung von EMS bei ischämischem Schlaganfall liefern. Daher hat dieses Modell das Potenzial, das Wissen über die neurovaskuläre Erholung nach einem ischämischen Schlaganfall zu erweitern und die Entwicklung von Innovationen, die das Gebot der Stunde sind, in Therapeutika für Schlaganfallüberlebende zu erleichtern.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Research Excellence Program-UConn Health (an Ketan R Bulsara und Rajkumar Verma) und UConn Health Start-up (an Rajkumar Verma) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 monocryl suture | Ethilon | 697G | |
| 70% ethanol to sanitize operating surface | Walgreens | ||
| Bupivacaine 0.25% solution | Midwest Vet | ||
| Clamps for tissue retraction | Roboz | ||
| Doccal suture with silicone coating | Doccal Corporation | 602145PK10Re | |
| Electric heating pad for operating surface | |||
| Isoflurane anesthesia | Piramal Critical Care Inc | ||
| Isoflurane delivery apparatus | B6Surgivet (Isotech 4) | ||
| Micro drill | Harvard Apparatus | ||
| Microdissecting tweezers, curved x2 | Piramal Critical Care Inc | ||
| mouse angiogenesis panel arrat | R& D biotech | ARY015 | |
| Needle driver | Ethilon | ||
| Ointment for eye protection | Walgreens | ||
| Operating microscope | Olympus | ||
| Operating surface | Olympus | ||
| Povidone iodine solution | Walgreens | ||
| Rectal thermometer | world precison instrument | ||
| Saline or 70% ethanol for irrigation | Walgreens | ||
| Small electric razor to shave operative site | Generic | ||
| Surgical scissors | Roboz |
References
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