Summary
Este trabajo describe un protocolo para un cribado genético supresor multicopia en Schizosaccharomyces pombe. Esta pantalla utiliza una biblioteca de plásmidos de todo el genoma para identificar clones supresores de un fenotipo de pérdida de función asociado con una cepa mutante de consulta. Los nuevos supresores genéticos del mutante nulo ell1 se identificaron utilizando esta pantalla.
Abstract
La identificación de interacciones genéticas es una herramienta poderosa para descifrar las funciones de los genes al proporcionar información sobre sus relaciones funcionales con otros genes y la organización en vías y procesos biológicos. Aunque la mayoría de los cribados genéticos se desarrollaron inicialmente en Saccharomyces cerevisiae, una plataforma complementaria para llevar a cabo estos cribados genéticos ha sido proporcionada por Schizosaccharomyces pombe. Uno de los enfoques comunes utilizados para identificar interacciones genéticas es mediante la sobreexpresión de clones de una biblioteca de plásmidos de todo el genoma y alto número de copias en un mutante de pérdida de función, seguido de la selección de clones que suprimen el fenotipo mutante.
Este artículo describe un protocolo para llevar a cabo esta prueba genética basada en la "supresión de múltiples copias" en S. pombe. Este cribado ha ayudado a identificar supresores multicopia del fenotipo genotóxico sensible al estrés asociado con la ausencia del factor de elongación de transcripción Ell1 en S. pombe. La pantalla se inició mediante la transformación de la cepa mutante nula ell1 de consulta con una biblioteca de plásmidos de ADNc de S. pombe de alto número de copias y la selección de los supresores en placas EMM2 que contienen 4-nitroquinolina 1-óxido (4-NQO), un compuesto genotóxico inductor de estrés. Posteriormente, el plásmido se aisló de dos colonias supresoras preseleccionadas y se digirió mediante enzimas de restricción para liberar el ADN insertado. Los plásmidos que liberan un fragmento de ADN insertado se retransformaron en la cepa de deleción ell1 para confirmar la capacidad de estos clones de plásmidos supresores para restaurar el crecimiento del mutante de deleción ell1 en presencia de 4-NQO y otros compuestos genotóxicos. Los plásmidos que muestran un rescate del fenotipo de deleción se secuenciaron para identificar los genes responsables de la supresión del fenotipo sensible al estrés genotóxico asociado a la deleción ell1 .
Introduction
Las redes de interacciones genéticas proporcionan información funcional sobre los genes y delinean vías y procesos biológicos en los que estos genes pueden estar involucrados in vivo. Además, también pueden proporcionar información sobre cómo los diferentes genes interactúan entre sí, lo que resulta en un fenotipo específico 1,2,3. A lo largo de los años, una variedad de pantallas genéticas han sido diseñadas por investigadores para responder preguntas biológicas fundamentales y estudiar enfermedades humanas. Las pantallas para la identificación de interacciones genéticas se pueden realizar de múltiples maneras. Las interacciones genéticas identificadas en diferentes pantallas genéticas pueden representar distintas relaciones mecanicistas entre genes. Además, los estudios han revelado que un conjunto común de interacciones genéticas son compartidas por genes que codifican proteínas pertenecientes a la misma vía o complejo 4,5. Así, las redes de interacción genética pueden ser utilizadas para establecer la organización funcional en una célula, en la que los genes que comparten los perfiles más similares pertenecen al mismo complejo o vía, aquellos genes que comparten perfiles algo menos similares pertenecen al mismo proceso biológico, y aquellos genes que exhiben perfiles superpuestos pero más diversos reflejan miembros pertenecientes al mismo compartimento celular6.
Las pantallas de interacción genética basadas en la supresión de la dosis ("supresión de copia alta o multicopia") son uno de los enfoques comúnmente utilizados. Estas pantallas se pueden realizar transformando una cepa mutante de consulta con una biblioteca genómica o de ADNc de alto número de copias, seguida de ensayos / técnicas de selección adecuadas para identificar la supresión o mejora de las interacciones genéticas 7,8,9. Para garantizar una cobertura completa de todo el genoma, estas pantallas también se han llevado a cabo sobreexpresando un gen específico de interés en una colección de mutantes de pérdida de función de todo el genoma o sobreexpresando una biblioteca genómica o de ADNc codificada por plásmidos de alto número de copias en un mutante de consulta de pérdida de función 9,10,11,12,13,14,15 . La estrategia de multicopia también podría funcionar utilizando un enfoque dominante/de sobreexpresión utilizando un promotor regulable.
Las principales ventajas de usar pantallas basadas en supresores son que la supresión de un fenotipo preexistente en una cepa mutante por otro gen establece una relación genética entre estos dos productos génicos que puede no haberse demostrado utilizando otros enfoques. En segundo lugar, se ha observado que la presencia de una mutación preexistente sensibiliza una vía particular, permitiendo identificar componentes adicionales de esa vía mediante el aislamiento de supresores, que pueden no haber sido identificados por selecciones genéticas más directas. Además, esta pantalla puede ser utilizada para identificar supresores que tienen diferentes mecanismos de supresión16. Las interacciones supresoras generalmente ocurren entre genes que están funcionalmente relacionados y pueden usarse para dilucidar jerarquías en vías. El mecanismo subyacente exacto de supresión puede diferir en función de varios factores, incluido el tipo de mutante de consulta utilizado en la pantalla, las condiciones experimentales y el nivel de expresión génica. Uno de los mecanismos comunes de supresión de dosis implica genes que codifican productos que funcionan juntos en el mismo complejo o en paralelo en el mismo proceso celular / biológico. Los resultados de tales pantallas en organismos modelo más simples, como la levadura, pueden extenderse a organismos eucariotas superiores, ya que la mayoría de las vías y procesos biológicos fundamentales se conservan a lo largo de la evolución.
Estas pruebas genéticas también se pueden modificar de varias maneras para responder a diferentes preguntas biológicas. Por ejemplo, se pueden identificar genes ortólogos de diferentes organismos que pueden suprimir el fenotipo de la cepa mutante de consulta. También se ha utilizado para delinear posibles mecanismos de resistencia y determinar dianas proteicas de nuevos compuestos antibacterianos17,18, antifúngicos19,20, antiparasitarios 21 y 22 anticancerígenos. Esta pantalla también ha sido explotada para identificar supresores de la actividad de fármacos cuyo mecanismo de acción se desconoce. Por lo tanto, en principio, estas pantallas supresoras de copia múltiple se pueden optimizar y utilizar en una variedad de aplicaciones en diferentes organismos. Aunque la mayoría de los cribados genéticos empleados por los investigadores de levaduras han sido desarrollados inicialmente en S. cerevisiae, S. pombe ha surgido como un sistema modelo complementario para la realización de diversos cribados genéticos y ensayos23. Además, la organización genómica y los procesos biológicos en S. pombe, como la aparición de intrones en más genes, la complejidad de los orígenes de la replicación del ADN, la estructura del centrómero, la organización del ciclo celular y la presencia de la maquinaria de ARNi, muestran mayor semejanza entre S. pombe y los eucariotas superiores23,24, subrayando la importancia de diseñar y utilizar herramientas genéticas en S. pombe.
Este artículo describe un protocolo para identificar interactores genéticos basado en la "supresión de dosis" de un fenotipo mutante de pérdida de función en S. pombe. La base de este protocolo es que es un método rápido y eficiente para cribar una biblioteca de ADNc que sobreexpresa genes de tipo salvaje, ya sea en un plásmido multicopia y/o de un promotor fuerte. Este protocolo tiene cuatro pasos principales: transformación de la biblioteca en una cepa mutante de consulta, selección de clones de plásmidos que suprimen el fenotipo deseado de la cepa mutante de consulta, recuperación de los plásmidos de estos clones supresores e identificación del gen responsable de la supresión del fenotipo. Como ocurre con cualquier método basado en la selección e identificación de ADNc de una biblioteca, el éxito de la pantalla depende del uso de una biblioteca de alta calidad y alta complejidad, ya que la pantalla puede recuperar solo aquellos clones de ADNc que están presentes en la biblioteca.
Utilizando este protocolo, hemos identificado con éxito dos nuevos supresores del fenotipo genotóxico sensible al estrés de la consulta S. pombe ell1 mutante nulo. La familia ELL (Eleven Nineteen Lysine Rich Leukemia) de factores de elongación de transcripción suprime la pausa transitoria de la ARN polimerasa II en plantillas de ADN en ensayos bioquímicos in vitro y se conserva en varios organismos, desde levaduras de fisión hasta humanos25. Trabajos anteriores han proporcionado evidencia de que un mutante nulo de S. pombe ell1 muestra sensibilidad al estrés genotóxico en presencia de 4-nitroquinolina 1-óxido (4-NQO) y metanosulfonato de metilo (MMS)26. Por lo tanto, transformamos una biblioteca de ADNc multicopia codificada por plásmidos de S. pombe en la consulta S. pombe ell1 null mutant e identificamos dos clones putativos que exhibían la capacidad de suprimir la sensibilidad al estrés genotóxico del mutante nulo S. pombe ell1 en presencia de 4-NQO, un compuesto que induce lesiones en el ADN. La secuenciación posterior del inserto presente en los clones de plásmidos identificó que los genes que codifican rax2+ y osh6+ eran responsables de suprimir la sensibilidad al estrés genotóxico del mutante nulo ell1 cuando se sobreexpresaba en el mutante nulo ell1.
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Protocol
1. Transformación de la biblioteca de ADNc en la cepa mutante de consulta de S. pombe para detectar supresores de copias múltiples
NOTA: Se siguió el método estándar de acetato de litio27 para transformar la biblioteca de ADNc de S. pombe en la cepa Δ de consulta S. pombe ell1con algunas modificaciones:
- Cultivar la cepa S. pombe ell1Δ a 32 °C en una placa de medio YE (Tabla 1) suplementada con 225 μg/ml de adenina, leucina y uracilo. Inocular un asa llena de inóculo de la cepa ell1Δ de la placa anterior en 15-20 ml de medio YE suplementado con 225 μg/ml de adenina, leucina y uracilo. Incubar durante la noche a 32 °C con agitación (200-250 rpm).
- Al día siguiente, diluir el cultivo nocturno en 100 ml de medio YE fresco con los suplementos deseados a un OD 600 nm (densidad óptica a 600 nm) de 0,3 e incubarlo a 32 °C con agitación a 200-250 rpm hasta que el OD600 nm alcance la fase logarítmica media.
- Dividir el cultivo de 100 ml en dos tubos de centrífuga de 50 ml, seguidos de centrifugación a temperatura ambiente durante 10 min a 4.000 × g.
- Desechar el sobrenadante y lavar el pellet celular con 1 mL de agua estéril, es decir, resuspender las celdas en 1 mL de agua estéril y centrifugar a 4.000 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Deseche el sobrenadante y lave cada gránulo celular con 1 ml de solución LiAc-TE (acetato de litio de 100 mM, Tris-HCl de 10 mM, EDTA de 1 mM, pH 7,5) como se describe en el paso 1.4.
- Retirar el sobrenadante y resuspender cada pellet celular en 250 μL de 1x LiAc-TE. Utilice estas células competentes de S. pombe (500 μL) para la transformación con el ADN de interés. Transfiera 125 μL de las células competentes a cuatro tubos de microcentrífuga estériles diferentes para los pasos posteriores de transformación.
- Hervir el ADN portador de los testículos de salmón o esperma de arenque durante 1 minuto e inmediatamente colocarlo en hielo. Para cada transformación, añadir 10 μL de 10 mg/ml de ADN portador monocatenario desnaturalizado al tubo de microcentrífuga que contiene 125 μL de las células competentes, seguido de una mezcla suave con una punta de micropipeta. Posteriormente, agregue 50 μg de la biblioteca de ADNc de S. pombe al tubo de microcentrífuga competente que contiene una mezcla de ADN portador de células.
- Incubar los tubos de microcentrífuga a temperatura ambiente durante 10 min, y luego añadir 260 μL de solución de polietilenglicol-acetato de litio (40% [p/v] PEG 4.000, 100 mM de acetato de litio, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) a los tubos y mezclar suavemente con la ayuda de una punta de micropipeta.
- Incubar los tubos de microcentrífuga que contienen la mezcla de transformación a 32 °C durante 2 h sin agitar. Añadir 43 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) precalentado al tubo de microcentrífuga y mezclar suavemente. Posteriormente, exponga los tubos a choques térmicos a 42 °C durante 5 min.
- Granular las células a 4.000 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y retire la solución residual de PEG-LiAc-TE con la ayuda de una punta de micropipeta.
- Resuspender las células en 100 μL de agua estéril y placa en una placa EMM2 (Tabla 1) (150 mm) con suplementos requeridos y 0,2 μg/mL de 4-NQO.
- Incubar las placas a 32 °C durante 5-6 días para permitir que aparezcan colonias en las placas. Rayar las colonias obtenidas en la misma placa media en presencia de 0,2 μg/ml de 4-NQO y utilizar para cribado adicional.
- Para un experimento de transformación de biblioteca, utilice 500 μL de células competentes (125 μL de células competentes x 4 tubos de microcentrífuga) para la transformación, como se describe en los pasos 1.8 a 1.14 anteriores.
- Como control, placa 1/10de la mezcla de transformación en una placa EMM2 (150 mm) con suplementos requeridos, pero que carecen de 4-NQO, para calcular el número total de clones de biblioteca obtenidos después de la transformación de la biblioteca, y detectar el aislamiento de los clones supresores.
2. Probar y validar el rescate/supresión del fenotipo asociado con la cepa mutante de consulta por el supresor putativo
NOTA: Los ensayos de puntos de estrés se llevaron a cabo como se describe a continuación para probar y validar el rescate/supresión de la sensibilidad al estrés 4-NQO asociada a la deleción ell1 por los supresores putativos.
- Agregue 100-200 μL de agua estéril en cada uno de los diferentes pocillos de una placa estéril de microtitulación de 96 pocillos.
- Recoger una pequeña cantidad de inóculo de cada una de las diferentes colonias obtenidas después de la transformación de la biblioteca de ADNc en la placa que contiene 4-NQO utilizando un palillo estéril o una punta de micropipeta de 20-200 μL. Añadir el inóculo de cada una de las diferentes colonias en pocillos independientes separados de la placa de microtitulación que contenga 100-200 μL de agua estéril. Homogeneizar.
- Detectar 3 μL de la suspensión celular de cada pocillo en placas de agar EMM2 que contienen adenina (225 μg/ml) y uracilo (225 μg/ml) pero que carecen de leucina (el marcador auxotrofo seleccionable presente en el vector plásmido utilizado para la construcción de la biblioteca utilizada en este trabajo). Agregue concentraciones apropiadas de 4-NQO a las placas según sea necesario.
- Incubar las placas a 32 °C durante 3-4 días para permitir que las células crezcan. Identificar las colonias que muestran crecimiento en presencia de diferentes concentraciones de 4-NQO como supresores putativos.
- Para validar aún más los supresores, cultivar los supresores seleccionados junto con las cepas de control apropiadas durante la noche a 32 °C con agitación (200-250 rpm) en medio EMM2 que contiene 225 μg / ml de adenina y uracilo pero que carece de leucina.
- Al día siguiente, diluir las células a un OD 600 nm de 0,3 en medio EMM2 fresco y cultivarlas a 32 °C con agitación hasta la fase logarítmica media (aproximadamenteOD 600 nm de 0,6-0,8).
- Detectar diluciones seriadas apropiadas (1:10 o 1:5) de cultivos en placas EMM2 con suplementos requeridos que contengan 0,4 μM 4-NQO o 0,01% MMS. Para el control, detecte las cepas en una placa EMM2 con los suplementos requeridos pero que carecen de cualquier agente dañino para el ADN.
- Incubar las placas a 32 °C durante 3-5 días para controlar el crecimiento.
NOTA: Se deben utilizar ensayos adecuados basados en el fenotipo asociado con la cepa mutante de consulta para probar el rescate o la supresión del fenotipo. Por ejemplo, si es necesario identificar supresores de un fenotipo sensible al frío de una cepa mutante de consulta, el ensayo para probar y validar los clones supresores implicaría el crecimiento de transformadores a baja temperatura. - Detecte las cepas mutantes transformadas con gen de interés de longitud completa (Spell1 en este caso) o vector vacío como controles positivos y negativos, respectivamente, junto con los transformadores de biblioteca.
3. Aislamiento del plásmido de los clones supresores de S. pombe
NOTA: El aislamiento de plásmidos de S. pombe se llevó a cabo siguiendo el protocolo descrito en Fission yeast: a laboratory manual28 con algunas modificaciones.
- Inocular una sola colonia de levadura en medio EMM2 que contenga 225 μg/ml de adenina y uracilo y cultivar las células durante la noche a 32 °C con agitación a 200-250 rpm. Al día siguiente, cosechar 5 células O.D. (es decir, 10 mL de cultivo de O.D. 0.5) centrifugando durante 2 min a 4,000 × g a temperatura ambiente.
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 0,2 ml de tampón de lisis (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris HCl (pH 8.0) y 1 mM Na2EDTA).
- Añadir 0,2 ml de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y 0,3 g de perlas de vidrio lavadas con ácido al tubo de microcentrífuga. Vortex el tubo de microcentrífuga durante 2 min a 4 °C e incubar en hielo durante 1 min. Repita este paso 6x.
- Centrifugar el tubo a 10.000 × g durante 15 min a temperatura ambiente. Transfiera la capa acuosa superior a un tubo de microcentrífuga nuevo y añada 200 μL de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1).
- Centrifugar el tubo a 10.000 × g durante 10 min. Transfiera la capa acuosa superior a un tubo nuevo y agregue dos volúmenes de etanol al 100% (~400 μL) y 1/10 de volumen de acetato de sodio (3 M, pH 5.8) (~20 μL) al tubo. Incubar el tubo de microcentrífuga -70 °C durante 1 h.
- Precipitar el ADN por centrifugación a 10.000 × g durante 15 min a 4 °C y retirar el sobrenadante. Lave el pellet de ADN con etanol al 70% (~500 μL) y manténgalo a temperatura ambiente para que se seque al aire.
- Resuspender el ADN en 20 μL de agua estéril. Utilice 2-5 μL de ADN plásmido para la transformación de células competentes de E. coli.
NOTA: El plásmido también se puede aislar de células de levadura utilizando cualquiera de los kits de aislamiento de plásmidos de levadura disponibles comercialmente.
4. Identificación del gen codificado por el clon supresor
- Transformar los plásmidos de levadura aislados en E. coli Top10 cepa [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG] utilizando el protocolo estándar29 y esparcir las células en placas LB (caldo Luria) con los antibióticos necesarios.
- Aislar los plásmidos de los transformadores de E. coli utilizando el protocolo estándar de lisis alcalina29, y seguir las combinaciones apropiadas de enzimas de restricción para verificar la liberación del fragmento de ADN insertado por digestión de restricción.
NOTA: El plásmido supresor 84 fue digerido con la enzima de restricción Bam HI, y el plásmido supresor 104 fue digerido con enzimas de restricción PstI/BamHI. - Retransformar los plásmidos que muestran liberación de inserción después de la digestión de restricción en la cepa ell1 Δ para verificar su capacidad para rescatar el fenotipo genotóxico sensible al estrés de la cepa ell1Δ.
- Seleccione los clones de plásmidos que muestran la supresión de la sensibilidad al estrés genotóxico y secuencie el fragmento de ADN de inserción presente en estos clones de plásmidos utilizando cebadores directos e inversos específicos del vector.
NOTA: En este estudio, se utilizó el cebador universal hacia adelante específico del promotor adh1 (5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3')30. - Para identificar el gen responsable de la supresión, alinee la secuencia obtenida utilizando NCBI nucleótido blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) o herramienta de alineación de secuencia Pombase (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core). Seleccione la secuencia que muestra la alineación máxima e identifíquela como el gen para el plásmido supresor multicopia.
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Representative Results
Detección de supresores multicopia de la sensibilidad al estrés genotóxico asociada a la deleción ell1 en S. pombe
Se realizó el cribado genético utilizando el protocolo descrito anteriormente para identificar supresores multicopia del fenotipo de pérdida de función de la cepa mutante de deleción ell1 de consulta. La sensibilidad relacionada con el crecimiento de la cepa de deleción ell1 observada en presencia del agente genotóxico 4-NQO se adoptó como fenotipo de pérdida de función para seleccionar supresores de copias múltiples. La figura 1 muestra una representación esquemática de la pantalla genética. Para comenzar el cribado, se confirmó por primera vez la sensibilidad al estrés genotóxico del mutante de deleción ell1 (h- ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1 ell1 Δ :: kanMX6) con respecto a su cepa isogénica de tipo salvaje (h- ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1) en presencia de 4-NQO (Figura 2A). Posteriormente, la consulta S. pombe ell1 null mutant se transformó con una biblioteca de ADNc de S. pombe de alto número de copias para seleccionar aquellos clones de plásmidos que podrían suprimir/rescatar la sensibilidad relacionada con el crecimiento 4-NQO del mutante nulo ell1. Esta biblioteca contiene ~6 × 105 fragmentos de ADNc de S. pombe clonados en el vector de sobreexpresión pLEV3 S. pombe bajo el control del promotor adh1 30. Como control, 1/10 de la mezcla de transformación también se colocó en placas EMM2 que carecían de 4-NQO para calcular el número total de clones recombinantes obtenidos después de la transformación de la biblioteca, una indicación de la cobertura de la biblioteca, y se seleccionó para elaislamiento de los clones supresores. Esto es crítico, ya que la detección de menos clones reducirá la posibilidad de identificar los clones supresores.
La Figura 2B muestra imágenes representativas del control y de las placas que contienen 4-NQO. Como se muestra en la figura, se obtiene un gran número de colonias en la placa de control que carece de 4-NQO mostrando una buena cobertura de la biblioteca. Como era de esperar, se obtuvieron menos transformadores en la placa 4-NQO, ya que estos transformadores probablemente representan los supresores putativos de la sensibilidad 4-NQO del mutante nulo ell1 . A continuación, las diferentes colonias de transformadores obtenidas en placas EMM2 que contienen 0,2 μM 4-NQO se rayaron o detectaron en placas EMM2 que contenían 0,2 μM 4-NQO para confirmar la capacidad de estos transformadores para crecer en presencia de 4-NQO. Se observó que 620 colonias de transformadores pudieron crecer en placas EMM2 que contienen 4-NQO de 0,2 μM.
Validación de la capacidad de los clones supresores putativos para restaurar el crecimiento del mutante de deleción ell1 en condiciones de estrés genotóxico
Para confirmar los supresores putativos, es importante probar el rescate del fenotipo deseado en condiciones de mayor rigurosidad, como se muestra en la representación esquemática (Figura 3A). Por lo tanto, los 620 transformadores preseleccionados se detectaron en placas EMM2 con 0,4 μM 4-NQO. Como se puede ver en la Figura 3B, solo 74 transformadores mostraron un crecimiento a 0,4 μM 4-NQO. Posteriormente, estos 74 transformadores fueron detectados en placas EMM2 que contenían 0,8 μM 4-NQO, y se observó que sólo 16 mostraron crecimiento en presencia de 0,8 μM 4-NQO (Figura 3C). Para confirmar aún más estas observaciones, estos 16 transformadores fueron detectados en placas EMM2 con suplementos requeridos, que contenían 0.8 μM 4-NQO o no 4-NQO (control), junto con el mutante de deleción ell1 transformado con vector vacío. Los resultados de estos ensayos de detección revelaron que, como se esperaba, la cepa de deleción ell1 transformada con vector vacío, así como los 16 transformadores, mostraron un crecimiento en la placa que carecía de 4-NQO. En comparación, mientras que el mutante de deleción ell1 que contenía solo el vector vacío no mostró crecimiento a 0.8 μM 4-NQO, seis transformadores exhibieron crecimiento a 0.8 μM 4-NQO (Figura 3D), lo que sugiere que los clones de biblioteca presentes en ellos tenían la capacidad de suprimir el fenotipo de estrés genotóxico del mutante nulo ell1.
Identificación del gen codificado por el clon supresor
A continuación seleccionamos 02 supresores genéticos de la cepa de deleción ell1, sup 84 y sup 104, que muestran una supresión completa de la sensibilidad al crecimiento asociada a ell1 en presencia de 4-NQO. El clon de plásmido de la biblioteca se aisló de estos dos supresores de levadura y se transformó en células competentes de E. coli. Posteriormente, el plásmido fue aislado de células de E. coli utilizando protocolos estándar31. Los dos plásmidos aislados, marcados como 84 y 104, fueron sometidos a digestión restringida, que reveló la presencia de aproximadamente 1.000 pb y 800 pb insertando fragmentos de ADN, respectivamente (Figura 4A,B). Para validar aún más los resultados de esta pantalla supresora, estos plásmidos se retransformaron en el mutante de deleción ell1 y se verificó si podían restaurar el crecimiento del mutante nulo ell1 en presencia de 4-NQO. Los ensayos de puntos de estrés revelaron que los clones de plásmidos supresores resultaron en la supresión de la sensibilidad al crecimiento asociada a 4-NQO cuando se reintrodujeron en el mutante nulo ell1, lo que sugiere que la supresión fue dependiente del plásmido (Figura 4C). Además, decidimos determinar si estos clones supresores también podrían suprimir la sensibilidad relacionada con el crecimiento de la cepa de deleción ell1 en presencia de otro compuesto inductor de daño al ADN, MMS. Los ensayos puntuales demostraron que la transformación de los clones de plásmidos supresores en el mutante nulo ell1 resultó en un mayor crecimiento en el medio que contenía MMS que la transformación del mutante de deleción ell1 con vector vacío, lo que indica que estos clones de plásmidos podrían suprimir la sensibilidad al estrés genotóxico del mutante de deleción ell1 en presencia de ambos agentes genotóxicos, es decir, 4-NQO y MMS (Figura 4D).
A continuación, para identificar el gen presente en estos clones de plásmidos supresores, se llevó a cabo la secuenciación del fragmento de ADN de inserción utilizando el cebador universal30 específico del promotor adh1. La secuencia de nucleótidos obtenida se buscó utilizando la herramienta 'BLAST at Ensembl' disponible en el sitio web de PomBase (https://www.pombase.org), que reveló que los dos clones de plásmidos 84 y 104 contenían los genes rax2+ y osh6+, respectivamente, proporcionando evidencia de que Rax2 y Osh6 eran responsables de suprimir el fenotipo genotóxico sensible al estrés asociado con la ausencia de ell1+ en S. pombe . El conocimiento sobre las funciones de ambas proteínas en S. pombe es limitado. Se ha demostrado que Rax2 regula la localización de For3p para controlar la polaridad celular durante el crecimiento vegetativo en S. pombe32. Osh6 es una proteína de transporte de lípidos que pertenece a la familia de proteínas relacionadas con la proteína de unión al oxiesteroles. Está implicada en el transporte de fosfatidilserina desde el retículo endoplásmico hasta la membrana plasmática33.
Figura 1: Representación esquemática del cribado supresor genético multicopia. Este protocolo tiene cuatro pasos principales: transformación de la biblioteca en una cepa mutante de consulta, selección de clones de plásmidos que suprimen el fenotipo deseado de la cepa mutante de consulta, recuperación de los plásmidos de estos clones supresores e identificación del gen responsable de la supresión del fenotipo. Abreviatura: 4-NQO = 4-nitroquinolina 1-óxido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cribado de supresores multicopia de la sensibilidad al estrés genotóxico asociada a la deleción ell1 en S. pombe. (A) Ensayo de punto de estrés que muestra sensibilidad 4-NQO de la cepa de S. pombe eliminada de ell1 en comparación con su cepa isogénica de tipo salvaje. Se detectaron diluciones seriadas (1:10) de cepas apropiadas en medio EMM2 que contenía 225 μg/ml de adenina, leucina y uracilo con o sin (control) 0,4 μM 4-NQO. Las placas se incubaron durante 3-5 días a 32 °C. (B) Una biblioteca de ADNc de alto número de copias se transformó en la cepa de S. pombe eliminada por ell1, y las colonias transformadas se colocaron en un medio EMM2 que carecía de leucina pero que contenía 0,2 μM 4-NQO. Una pequeña alícuota de la mezcla de transformación también se chapó en placas EMM2 que carecían de 4-NQO, como control. Las placas se incubaron a 32 °C durante 5-6 días y se fotografiaron. El panel B muestra una imagen representativa de estas placas. Abreviatura: 4-NQO = 4-nitroquinolina 1-óxido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Validación de la capacidad de los clones supresores putativos para suprimir la sensibilidad al estrés genotóxico del mutante de deleción ell1 . (A) Una representación esquemática del cribado de los transformadores de biblioteca mediante la prueba de supresión del fenotipo deseado. El crecimiento de 620 transformadores se probó en concentraciones crecientes de 4-NQO mediante la detección de diferentes transformadores en placas EMM2 que carecen de leucina y que contienen (B) 0.4 μM 4-NQO o (C) 0.8 μM 4-NQO. Las placas se incubaron a 32 °C durante 5-6 días y se fotografiaron. Se han mostrado imágenes representativas de las placas. (D) Dieciséis transformadores que mostraban crecimiento en 0,8 μM 4-NQO fueron vistos en placas EMM2 que carecían de leucina pero que contenían 0,8 μM 4-NQO o que no contenían 4-NQO (control), junto con la cepa de deleción ell1 transformada con vector vacío. Las placas se incubaron a 32 °C durante 5-6 días y se fotografiaron. Sólo seis colonias mostraron la capacidad de rescatar ell1 la deleción asociada-genotóxica de la sensibilidad al estrés. Abreviatura: 4-NQO = 4-nitroquinolina 1-óxido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Identificación de los clones de plásmidos supresores. Las imágenes de gel de agarosa de (A) digestión de restricción del plásmido supresor 84 con la enzima de restricción BamHI liberaron un inserto de ~ 1 kb. (B) El plásmido supresor 104 digerido con enzimas de restricción PstI/BamHI liberó un inserto de ~800 pb. (C) 1:10 ell1 mutante nulo diluido en serie transformado con plásmidos, sup 84 o sup 104, fueron vistos en placas EMM2 que carecían de leucina y que contenían 0.4 μM 4-NQO o (D) 0.01% MMS. En las placas de control, no se agregó ningún agente dañino para el ADN. Las placas se incubaron a 32 °C durante 4-5 días y se fotografiaron. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Composición de medios para el crecimiento de S. pombe. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
Las levaduras se han utilizado ampliamente para investigar los procesos biológicos básicos y las vías que se conservan evolutivamente en los organismos eucariotas. La disponibilidad de herramientas genéticas y genómicas, junto con su facilidad para diversos procedimientos bioquímicos, genéticos y moleculares, hacen de las levaduras un excelente organismo modelo para la investigación genética34,35,36. A lo largo de los años, varios investigadores de levaduras han diseñado varias pantallas genéticas para identificar interacciones genéticas que arrojarían luz sobre las funciones de genes individuales, así como las vías y procesos biológicos en los que pueden estar involucrados10,11,17,37. Una de las pantallas comunes y útiles para identificar interacciones genéticas se conoce como "supresión de múltiples copias o alto número de copias".
Esta pantalla requiere una cepa mutante de consulta que exhibe un fenotipo de pérdida de función, seguida de la transformación de esta cepa de consulta mutante con una biblioteca genómica o de ADNc de alto número de copias. Posteriormente, los transformadores obtenidos se criban para identificar aquellos genes, que cuando se sobreexpresan, suprimen el fenotipo asociado con la(s) cepa(s) mutante(s) de consulta. Este tipo de interacción genética entre la cepa mutante específica y el gen o genes presentes en los clones de la biblioteca de plásmidos da lugar al aislamiento e identificación de productos génicos que pueden actuar en la misma vía o afectar el mismo proceso biológico4. Por lo tanto, esta pantalla proporciona información sobre las funciones de los genes de interés y su organización funcional en vías y procesos biológicos in vivo. Tradicionalmente, esta pantalla se ha utilizado ampliamente en S. cerevisiae 38,39,40,41,42.
El objetivo del presente trabajo es describir un protocolo simple y directo para llevar a cabo un cribado genético de supresión multicopia en S. pombe. Realizamos el cribado utilizando una cepa de S. pombe portadora de una deleción del factor de elongación de transcripción ell1. ELL es una familia de factores de elongación de transcripción, que están presentes en una amplia gama de organismos, desde levaduras de fisión hasta humanos. Las funciones de Ell1 sólo están empezando a ser entendidas en S. pombe. Trabajos anteriores habían destacado el papel de Ell1 en el crecimiento óptimo durante condiciones normales de crecimiento y en la supervivencia durante condiciones de estrés genotóxico26. Hemos empleado el cribado supresor de copias múltiples como uno de los enfoques para descubrir el mecanismo molecular subyacente al papel de Ell1 en la sensibilidad al estrés genotóxico en S. pombe26. Una biblioteca de ADNc de S. pombe codificada por plásmidos multicopia se transformó en el mutante nulo S. pombe ell1 que exhibe sensibilidad a 4-NQO. Posteriormente, se seleccionaron aquellos transformadores que podían crecer en presencia de 4-NQO.
El aislamiento de plásmidos de estos transformadores y la secuenciación de los insertos presentes en estos plásmidos condujo a la identificación de dos nuevos interactores genéticos de ell1+ en S. pombe, rax2+ y osh6+. Un estudio previo que utilizó una pantalla genética similar en S. pombe también identificó la proteína antisilenciador, epe1+, como un supresor multicopia de los fenotipos asociados a la deleción ell1 43. También hemos utilizado este método para identificar los supresores multicopia de la subunidad Rpb9 no esencial de la ARN polimerasa II de S. pombe (observaciones no publicadas). En conjunto, estos resultados validan la utilidad del enfoque de detección de supresores genéticos de copias múltiples como un método para identificar genes / proteínas putativas que exhiben interacción genética con un gen de interés deseado, dilucidando la función, las vías y los procesos en los que el gen de interés puede estar involucrado.
Para usar la pantalla descrita en este trabajo, es importante tener primero una cepa mutante de consulta que exhiba un fenotipo claro asociado con la mutación, que se puede usar para aislar los supresores de múltiples copias. Además, el éxito de esta pantalla dependerá de la disponibilidad de una biblioteca representativa de alta calidad y buena que contenga clones que representen el número máximo de genes de tipo salvaje o sus correspondientes ADNc. Tradicionalmente, tanto las bibliotecas genómicas como las de ADNc se han utilizado en estas pantallas, pero las bibliotecas de ADNc tienen la ventaja de estar hechas de ARNm expresados en la célula / organismo. Además, una alta eficiencia de su transformación en las células de levadura es imprescindible para el éxito de la pantalla porque es importante cribar un gran número de transformadores, aumentando la probabilidad de identificar supresores. Si se obtienen menos transformadores en la placa de control después de la transformación de la biblioteca en la cepa mutante de consulta utilizando el protocolo de acetato de litio, entonces se puede usar la electroporación para transformar la biblioteca.
También es recomendable estandarizar primero el protocolo de transformación con otro plásmido antes de transformar la biblioteca. De lo contrario, resultará innecesariamente en la pérdida de la biblioteca. El protocolo descrito aquí utiliza la sensibilidad 4-NQO como fenotipo mutante, pero se deben diseñar métodos / ensayos de detección adecuados para la selección de supresores en función del fenotipo mutante específico de interés. Si no se obtienen transformadores o se obtienen muy pocos transformadores en la placa para seleccionar supresores después de la transformación de la biblioteca en la cepa mutante de consulta, entonces, si es posible, se deben usar condiciones / ensayos menos estrictos al revestir la biblioteca para seleccionar supresores a fin de detectar tantos supresores genéticos como sea posible antes de confirmarlos en condiciones de alta rigurosidad. Además de usar la digestión por restricción para probar la presencia del inserto en los clones de plásmidos supresores identificados, se puede usar PCR con cebadores específicos del vector para amplificar el fragmento de ADN de inserción deseado. Alternativamente, los clones de plásmidos supresores se pueden administrar directamente para la secuenciación, evitando la necesidad de digestión restringida o PCR.
Este cribado también puede adoptarse para levaduras distintas de S. cerevisiae y S . pombe si se dispone de un conjunto de herramientas genéticas con respecto a cepas mutantes, plásmidos y construcciones promotoras apropiadas que faciliten la sobreexpresión de genes, permitiendo el rescate del fenotipo mutante presente en la célula de levadura huésped. Además, con la disponibilidad de recursos para todo el genoma, incluida la colección de mutantes de deleción de todo el genoma44 y bibliotecas de sobreexpresión37, esta pantalla también se puede realizar mediante la transformación de uno o unos pocos plásmidos de consulta en una matriz sistemática de colección de cepas mutantes de levadura o mediante la transformación de una matriz sistemática de colección de plásmidos de sobreexpresión en una o unas pocas cepas de consulta mutantes45 . En conclusión, este enfoque puede generalizarse claramente a una amplia variedad de preguntas experimentales en diferentes organismos.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por una beca de investigación del Departamento de Biotecnología del Gobierno de la India (Subvención No. BT/PR12568/BRB/10/1369/2015) a Nimisha Sharma. Los autores agradecen al Prof. Charles Hoffman (Boston College, EE.UU.) por el regalo de la biblioteca de ADNc de S. pombe y a la Prof. Susan Forsburg por los plásmidos de levadura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-NQO | Sigma | N8141 | |
| Acetic Acid, glacial | Sigma | 1371301000 | |
| Adenine Sulphate | Himedia | GRM033 | |
| Agar | Himedia | GRM026 | |
| Agarose | Lonza | 50004L | |
| Ammonium Chloride | Himedia | MB054 | |
| BamHI | Fermentas | ER0051 | |
| Biotin | Himedia | RM095 | |
| Boric Acid | Himedia | MB007 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C4901 | |
| Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 | Sigma | C0549 | |
| Citric Acid | Himedia | RM1023 | |
| Disodium hydrogen phospahte anhydrous | Himedia | GRM3960 | |
| single stranded DNA from Salmon testes | Sigma | D7656 | |
| EDTA disodium | Sigma | 324503 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Himedia | RM6353 | |
| Glucose | Amresco | 188 | |
| Ionositol | Himedia | GRM102 | |
| Isopropanol | Qualigen | Q26897 | |
| Leucine | Himedia | GRM054 | |
| Lithium Acetatae | Sigma | 517992 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Himedia | MB040 | |
| Molybdic Acid | Himedia | RM690 | |
| Nicotinic Acid | Himedia | CMS177 | |
| PEG, MW 4000 | Sigma | 81240 | |
| Pentothinic Acid | Himedia | TC159 | |
| Phenol | Himedia | MB082 | |
| Plasmid Extraction Kit | Qiagen | 27104 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| Potassium hydrogen Pthallate | Merc | DDD7D670815 | |
| Potassium iodide | Himedia | RM1086 | |
| RNAse | Fermentas | EN0531 | |
| SDS | Himedia | GRM205 | |
| Sodium Hydroxide | Himedia | GRM1183 | |
| Sodium Sulphate | Himedia | RM1037 | |
| Tris free Base | Himedia | MB209 | |
| Uracil | Himedia | GRM264 | |
| Yeast Extract Powder | Himedia | RM668 | |
| Zinc Sulphate Heptahydrate | Merc | DJ9D692580 |
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