Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Genetisk skjerm for identifisering av multikopiundertrykkere i Schizosaccharomyces pombe

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/63967
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1University School of Biotechnology, G.G.S. Indraprastha University
* These authors contributed equally

Summary

Dette arbeidet beskriver en protokoll for en multicopy suppressor genetisk skjerm i Schizosaccharomyces pombe. Denne skjermen bruker et genom-bredt plasmidbibliotek for å identifisere suppressor klone (er) av et tap av funksjon fenotype assosiert med en spørring mutant stamme. Nye genetiske suppressorer av ell1 null mutant ble identifisert ved hjelp av denne skjermen.

Abstract

Identifisering av genetiske interaksjoner er et kraftig verktøy for å dechiffrere funksjonene til gen (er) ved å gi innsikt i deres funksjonelle forhold til andre gener og organisering i biologiske veier og prosesser. Selv om flertallet av de genetiske skjermene opprinnelig ble utviklet i Saccharomyces cerevisiae, har en komplementær plattform for å utføre disse genetiske skjermene blitt gitt av Schizosaccharomyces pombe. En av de vanligste tilnærmingene som brukes til å identifisere genetiske interaksjoner, er ved overekspresjon av kloner fra et genom-bredt, høyt kopi-nummer plasmidbibliotek i en tap-av-funksjon mutant, etterfulgt av valg av kloner som undertrykker den mutante fenotypen.

Dette papiret beskriver en protokoll for å utføre denne "multicopy suppression"-baserte genetiske skjermen i S. pombe. Denne skjermen har bidratt til å identifisere multikopiundertrykker(e) av den gentoksiske stressfølsomme fenotypen assosiert med fraværet av Ell1-transkripsjonsforlengelsesfaktoren i S. pombe. Skjermen ble initiert ved transformasjon av spørringen ell1 null mutantstamme med et høyt kopinummer S. pombe cDNA-plasmidbibliotek og valg av suppressorer på EMM2-plater som inneholder 4-nitrokinolin 1-oksid (4-NQO), en genotoksisk stressfremkallende forbindelse. Deretter ble plasmid isolert fra to kortlistede suppressorkolonier og fordøyd av restriksjonsenzymer for å frigjøre innsats-DNA. Plasmider som frigjorde et sett inn DNA-fragment ble retransformert til ell1-delesjonsstammen for å bekrefte evnen til disse suppressorplasmidklonene til å gjenopprette veksten av ell1-slettingsmutanten i nærvær av 4-NQO og andre genotoksiske forbindelser. De plasmidene som viste en redning av delesjonsfenotypen ble sekvensert for å identifisere genet (e) som var ansvarlige for undertrykkelse av den ell1-delesjonsassosierte gentoksiske stressfølsomme fenotypen.

Introduction

Nettverk av genetiske interaksjoner gir funksjonell informasjon om gener og avgrensede veier og biologiske prosesser som disse genene kan være involvert i in vivo. I tillegg kan de også gi innsikt i hvordan forskjellige gener interagerer med hverandre, noe som resulterer i en bestemt fenotype 1,2,3. Gjennom årene har en rekke genetiske skjermer blitt designet av forskere for å svare på grunnleggende biologiske spørsmål og studere menneskelige sykdommer. Skjermer for identifisering av genetiske interaksjoner kan utføres på flere måter. Genetiske interaksjoner identifisert i forskjellige genetiske skjermer kan representere forskjellige mekanistiske forhold mellom gener. Videre har studier vist at et felles sett med genetiske interaksjoner deles av gener som koder for proteiner som tilhører samme vei eller kompleks 4,5. Dermed kan genetiske interaksjonsnettverk brukes til å etablere den funksjonelle organisasjonen i en celle, hvor gener som deler de mest like profilene tilhører samme kompleks eller vei, de genene som deler noe mindre like profiler tilhører samme biologiske prosess, og de genene som viser overlappende, men mer varierte profiler gjenspeiler medlemmer som tilhører samme cellulære rom6.

Genetiske interaksjonsskjermer basert på doseundertrykkelse ("high-copy or multicopy suppression") er en av de mest brukte tilnærmingene. Disse skjermbildene kan utføres ved å transformere en spørringsmutantstamme med et genomisk eller cDNA-bibliotek med høyt kopinummer, etterfulgt av passende analyser / seleksjonsteknikker for å identifisere undertrykke eller forbedre genetiske interaksjoner 7,8,9. For å sikre en omfattende genom-bred dekning, har disse skjermene også blitt utført ved å overuttrykke et bestemt gen av interesse for en samling av genom-wide tap-of-function mutant eller ved å overuttrykke et høyt kopi-nummer plasmidkodet genomisk eller cDNA-bibliotek i et tap-av-funksjon spørring mutant 9,10,11,12,13,14,15 . Multikopistrategien kan også fungere ved hjelp av en dominerende / overuttrykksmetode ved hjelp av en regulerbar promotor.

De viktigste fordelene ved å bruke suppressorbaserte skjermer er at undertrykkelse av en eksisterende fenotype i en mutantstamme av et annet gen etablerer et genetisk forhold mellom disse to genproduktene som kanskje ikke har blitt demonstrert ved hjelp av andre tilnærminger. For det andre har det blitt observert at tilstedeværelsen av en eksisterende mutasjon sensibiliserer en bestemt vei, slik at ytterligere komponenter i den banen kan identifiseres ved isolering av suppressorer, som kanskje ikke er identifisert av mer direkte genetiske valg. Videre kan denne skjermen brukes til å identifisere suppressorer som har forskjellige mekanismer for undertrykkelse16. Suppressor-interaksjoner oppstår vanligvis mellom gener som er funksjonelt relatert og kan brukes til å belyse hierarkier i veier. Den eksakte underliggende undertrykkelsesmekanismen kan variere basert på flere faktorer, inkludert typen spørringsmutant som brukes i skjermen, eksperimentelle forhold og nivået av genuttrykk. En av de vanligste doseringsundertrykkelsesmekanismene involverer gener som koder for produkter som fungerer sammen i samme kompleks eller parallelt i samme cellulære / biologiske prosess. Resultatene av slike skjermer i enklere modellorganismer som gjær kan utvides til høyere eukaryote organismer siden de fleste grunnleggende biologiske veier og prosesser er bevart over evolusjonen.

Disse genetiske skjermene kan også modifiseres på flere måter for å svare på forskjellige biologiske spørsmål. For eksempel kan ortologe gener fra forskjellige organismer som kan undertrykke fenotypen av spørringsmutantstammen identifiseres. Det har også blitt brukt til å avgrense potensielle resistensmekanismer og bestemme proteinmål for nye antibakterielle17,18, antifungal19,20, antiparasittiske21 og anticancer22-forbindelser. Denne skjermen har også blitt utnyttet til å identifisere undertrykkere av aktiviteten til farmasøytiske legemidler hvis virkningsmekanisme ikke er kjent. Dermed kan disse multikopi-suppressorskjermene i prinsippet optimaliseres og brukes i en rekke applikasjoner i forskjellige organismer. Selv om de fleste genetiske skjermene som brukes av gjærforskere opprinnelig er utviklet i S. cerevisiae, har S. pombe dukket opp som et komplementært modellsystem for å utføre ulike genetiske skjermer og analyser23. Videre viser genomisk organisering og biologiske prosesser i S. pombe, som forekomst av introner i flere gener, kompleksitet av opprinnelsen til DNA-replikasjon, sentromerstruktur, organisering av cellesyklusen og tilstedeværelse av RNAi-maskineriet, større likhet mellom S. pombe og høyere eukaryoter23,24, og understreker viktigheten av å designe og bruke genetiske verktøy i S. pombe.

Dette papiret beskriver en protokoll for å identifisere genetiske interaktorer basert på "doseringsundertrykkelse" av en tap-av-funksjon mutant fenotype i S. pombe. Grunnlaget for denne protokollen er at det er en rask og effektiv metode for å skjerme et cDNA-bibliotek som overuttrykker villtypegener enten på et multikopiplasmid og / eller fra en sterk promotor. Denne protokollen har fire hovedtrinn: transformasjon av biblioteket til en spørringsmutantstamme, utvalg av plasmidkloner som undertrykker den ønskede fenotypen av spørringsmutantstammen, henting av plasmidet (e) fra disse suppressorklonene, og identifisering av genet som er ansvarlig for undertrykkelsen av fenotypen. Som det gjelder for enhver metode basert på valg og identifisering av cDNA-er fra et bibliotek, er skjermens suksess avhengig av å bruke et bibliotek av høy kvalitet og høy kompleksitet, da skjermen bare kan hente de cDNA-klonene som er til stede i biblioteket.

Ved hjelp av denne protokollen har vi identifisert to nye suppressorer av den genotoksiske stressfølsomme fenotypen til spørringen S. pombe ell1 null mutant. ELL -familien (Eleven Nineteen Lysine Rich Leukemia) av transkripsjonsforlengelsesfaktorer undertrykker forbigående pause av RNA-polymerase II på DNA-maler i in vitro biokjemiske analyser og er konservert på tvers av forskjellige organismer, fra fisjonsgjær til mennesker25. Tidligere arbeid har gitt bevis for at en S. pombe ell1 null mutant viser gentoksisk spenningsfølsomhet i nærvær av 4-nitrokinolin 1-oksid (4-NQO) og metylmetansulfonat (MMS)26. Derfor transformerte vi et S. pombe plasmidkodet multikopi cDNA-bibliotek til spørringen S. pombe ell1 null mutant og identifiserte to antatte kloner som viste evnen til å undertrykke den genotoksiske stressfølsomheten til S. pombe ell1 null mutant i nærvær av 4-NQO, en forbindelse som induserer DNA-lesjoner. Etterfølgende sekvensering av innsatsen tilstede i plasmidklonene identifiserte at genene som koder for rax2+ og osh6+ var ansvarlige for å undertrykke den gentoksiske spenningsfølsomheten til ell1 null mutant når den ble overuttrykt i ell1 nullmutanten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Transformasjon av cDNA-biblioteket til spørringen S. pombe mutant stamme for å skjerme for multicopy suppressors

MERK: Standard litiumacetatmetoden27 ble fulgt for å transformere S. pombe cDNA-biblioteket til spørringen S. pombe ell1Δ-stammen med noen få modifikasjoner:

  1. Dyrk S. pombe ell1Δ-stammen ved 32 °C på et YE-medium (tabell 1) plate supplert med 225 μg/ml hver av adenin, leucin og uracil. Inokulere en sløyfe full av inokulum av ell1Δ-stamme fra ovennevnte plate i 15-20 ml YE-medium supplert med 225 μg / ml hver av adenin, leucin og uracil. Inkuber den over natten ved 32 °C med risting (200-250 o/min).
  2. Neste dag, fortynn nattkulturen i 100 ml ferskt YE-medium med de ønskede kosttilskuddene til en OD 600 nm (optisk tetthet ved 600 nm) på 0,3 og inkuberer den ved 32 ° C med risting ved 200-250 o / min til OD600 nm når midt i loggfasen.
  3. Del 100 ml kulturen i to 50 ml sentrifugerør, etterfulgt av sentrifugering ved romtemperatur i 10 minutter ved 4000 × g.
  4. Kast supernatanten og vask cellepelleten med 1 ml sterilt vann, dvs. resuspender cellene i 1 ml sterilt vann og sentrifuge ved 4000 × g i 5 minutter ved romtemperatur.
  5. Kast supernatanten og vask hver cellepellet med 1 ml 1x LiAc-TE (100 mM litiumacetat, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) løsning som beskrevet i trinn 1.4.
  6. Fjern supernatanten og resuspender hver cellepellet i 250 μL 1x LiAc-TE. Bruk disse S. pombe kompetente cellene (500 μL) for transformasjon med DNA av interesse. Overfør 125 μL av de kompetente cellene til fire forskjellige sterile mikrosentrifugerør for påfølgende transformasjonstrinn.
  7. Kok bærer-DNA fra laksetestikler eller sildesperm i 1 min og legg det umiddelbart på is. For hver transformasjon, tilsett 10 μL 10 mg / ml denaturert, enkeltstrenget bærer-DNA til mikrosentrifugerøret som inneholder 125 μL av de kompetente cellene, etterfulgt av mild blanding ved hjelp av en mikropipettespiss. Deretter tilsettes 50 μg av S. pombe cDNA-biblioteket til det kompetente celler-bærer DNA-blandingsholdige mikrosentrifugerøret.
  8. Inkuber mikrosentrifugerørene ved romtemperatur i 10 minutter, og tilsett deretter 260 μL polyetylenglykol-litiumacetatoppløsning (40% [w / v] PEG 4,000, 100 mM litiumacetat, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) til rørene og bland forsiktig ved hjelp av en mikropipettespiss.
  9. Inkuber mikrosentrifugerørene som inneholder transformasjonsblandingen ved 32 °C i 2 timer uten risting. Tilsett 43 μL forvarmet dimetylsulfoksid (DMSO) til mikrosentrifugerøret og bland forsiktig. Deretter utsetter du rørene for varmesjokk ved 42 °C i 5 minutter.
  10. Pellet cellene ved 4000 × g i 5 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten og fjern den gjenværende PEG-LiAc-TE-løsningen ved hjelp av en mikropipettespiss.
  11. Resuspender cellene i 100 μL sterilt vann og plate på en EMM2 (tabell 1) plate (150 mm) med nødvendige tilskudd og 0,2 μg / ml 4-NQO.
  12. Inkuber platene ved 32 °C i 5-6 dager for å la kolonier vises på platene. Strek de oppnådde koloniene på samme mediumplate i nærvær av 0,2 μg / ml 4-NQO og bruk til videre screening.
  13. For et bibliotektransformasjonseksperiment, bruk 500 μL kompetente celler (125 μL kompetente celler x 4 mikrosentrifugerør) for transformasjon som beskrevet i trinn 1.8 til 1.14 ovenfor.
  14. Som en kontroll, plate 1/10th av transformasjonsblandingen på en EMM2-plate (150 mm) med nødvendige kosttilskudd, men mangler 4-NQO, for å beregne det totale antallet bibliotekkloner oppnådd etter transformasjon av biblioteket, og skjerm for isolering av suppressorklonene.

2. Test og valider redningen/undertrykkelsen av fenotypen assosiert med spørringsmutantstammen av den antatte suppressoren

MERK: Stresspunktanalyser ble utført som beskrevet nedenfor for å teste og validere redning / undertrykkelse av ell1-delesjonsassosiert 4-NQO-stressfølsomhet av den antatte suppressoren (e).

  1. Tilsett 100-200 μL sterilt vann i hver av de forskjellige brønnene i en steril 96-brønns mikrotiterplate.
  2. Velg en liten mengde inokulum fra hver av de forskjellige koloniene oppnådd etter cDNA-bibliotektransformasjon på platen som inneholder 4-NQO ved hjelp av en steril tannpirker eller en 20-200 μL mikropipettespiss. Tilsett inokulumet fra hver av de forskjellige koloniene i separate uavhengige brønner på mikrotiterplaten som inneholder 100-200 μL sterilt vann. Bland godt.
  3. Spot 3 μL av cellesuspensjonen fra hver brønn på EMM2 agarplater som inneholder adenin (225 μg / ml) og uracil (225 μg / ml), men mangler leucin (den valgbare auxotrofiske markøren som er tilstede på plasmidvektoren som brukes til konstruksjon av biblioteket som brukes i dette arbeidet). Tilsett passende konsentrasjoner av 4-NQO til platene etter behov.
  4. Inkuber platene ved 32 °C i 3-4 dager for å la cellene vokse. Identifiser koloniene som viser vekst i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av 4-NQO som antatte suppressorer.
  5. For ytterligere å validere suppressorene, vokse de valgte suppressorene sammen med passende kontrollstammer over natten ved 32 ° C med risting (200-250 rpm) i EMM2 medium som inneholder 225 μg / ml hver av adenin og uracil, men mangler leucin.
  6. Neste dag, fortynn cellene til en OD 600 nm på 0,3 i fersk EMM2 medium og vokse dem ved 32 ° C med risting til midten av loggfasen (ca.OD 600 nm på 0,6-0,8).
  7. Spot passende serielle fortynninger (1:10 eller 1:5) av kulturer på EMM2 plater med nødvendige kosttilskudd som inneholder enten 0,4 μM 4-NQO eller 0,01% MMS. For kontroll, se stammene på en EMM2-plate med nødvendige kosttilskudd, men mangler noe DNA-skadelig middel.
  8. Inkuber platene ved 32 °C i 3-5 dager for å overvåke veksten.
    MERK: Egnede analyser basert på fenotypen assosiert med spørringsmutantstammen bør brukes til å teste redning eller undertrykkelse av fenotypen. For eksempel, hvis suppressorer av en kaldfølsom fenotype av en spørringsmutantstamme må identifiseres, vil analysen for testing og validering av suppressorklonene innebære voksende transformanter ved lav temperatur.
  9. Spot mutantstammene transformert med full lengde gen av interesse (Spell1 i dette tilfellet) eller tom vektor som henholdsvis positive og negative kontroller, sammen med bibliotekets transformanter.

3. Isolering av plasmidet fra S. pombe suppressor kloner

MERK: Plasmidisolasjon fra S. pombe ble utført ved å følge protokollen beskrevet i Fisjonsgjær: en laboratoriehåndbok28 med noen få modifikasjoner.

  1. Inokulere en enkelt gjærkoloni i EMM2 medium som inneholder 225 μg / ml adenin og uracil og vokse cellene over natten ved 32 ° C med risting ved 200-250 rpm. Neste dag høster du 5 O.D. celler (dvs. 10 ml kultur av OD 0,5) ved sentrifugering i 2 minutter ved 4000 × g ved romtemperatur.
  2. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 0,2 ml lysisbuffer (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris HCl (pH 8,0) og 1 mM Na2EDTA).
  3. Tilsett 0,2 ml fenol:kloroform:isoamylalkohol (25:24:1) og 0,3 g syrevaskede glassperler til mikrosentrifugerøret. Vortex mikrosentrifugerøret i 2 minutter ved 4 °C og inkuber på is i 1 min. Gjenta dette trinnet 6x.
  4. Sentrifuge røret ved 10.000 × g i 15 minutter ved romtemperatur. Overfør det øvre vandige laget til et friskt mikrosentrifugerør og tilsett 200 μL fenol: kloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1).
  5. Sentrifuge røret på 10.000 × g i 10 min. Overfør det øvre vandige laget til et friskt rør og tilsett to volumer 100% etanol (~ 400 μL) og 1/10 volum natriumacetat (3 M, pH 5,8) (~ 20 μL) til røret. Inkuber mikrosentrifugerøret -70 °C i 1 time.
  6. Utfell DNA ved sentrifugering ved 10 000 × g i 15 minutter ved 4 °C og fjern supernatanten. Vask DNA-pelleten med 70% etanol (~ 500 μL) og hold den ved romtemperatur for å lufttørke.
  7. Resuspender DNA i 20 μL sterilt vann. Bruk 2-5 μL plasmid-DNA for transformasjon av kompetente E. coli-celler.
    MERK: Plasmid kan også isoleres fra gjærceller ved hjelp av noen av de kommersielt tilgjengelige gjærplasmidisolasjonssettene.

4. Identifikasjon av genet kodet av suppressorklonen

  1. Transformer de isolerte gjærplasmidene til E. coli Top10-stammen [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG] ved hjelp av standardprotokollen29 og spre cellene på LB (Luria Broth) plater med nødvendige antibiotika.
  2. Isoler plasmidet (e) fra E. coli-transformanter ved bruk av standard alkalisk lyseprotokoll29, og følg de riktige kombinasjonene av restriksjonsenzymer for å kontrollere frigjøringen av innstikks-DNA-fragmentet ved begrensning av fordøyelsen.
    MERK: Suppressor plasmid 84 ble fordøyd med Bam HI restriksjonsenzym, og Suppressor plasmid 104 ble fordøyd med PstI / BamHI restriksjonsenzymer.
  3. Retransformer plasmidene som viser innsatsfrigivelse etter restriksjonsfordøyelse i ell1 Δ-stammen for å sjekke om deres evne til å redde den genotoksiske stressfølsomme fenotypen til ell1Δ-stammen.
  4. Velg plasmidklonene som viser undertrykkelse av den genotoksiske spenningsfølsomheten og sekvenser sett inn DNA-fragmentet som er tilstede i disse plasmidklonene ved hjelp av vektorspesifikke fremover- og reversprimere.
    MERK: I denne studien ble den adh1 promotorspesifikke universelle fremoverprimeren (5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3') brukt30.
  5. For å identifisere genet som er ansvarlig for undertrykkelsen, juster sekvensen oppnådd ved bruk av NCBI-nukleotideksplosjon (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) eller Pombase-sekvensjusteringsverktøy (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core). Velg sekvensen som viser maksimal justering og identifiser den som genet for multikopiundertrykkerplasmidet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Screening for multikopiundertrykker(e) av ell1 delesjonsassosiert gentoksisk stresssensitivitet i S. pombe
Vi utførte den genetiske skjermen ved hjelp av protokollen beskrevet ovenfor for å identifisere multikopiundertrykkere av tap-av-funksjon fenotypen av spørringen ell1 sletting mutant stamme. Den vekstrelaterte følsomheten til ell1-delesjonsstammen observert i nærvær av 4-NQO gentoksisk middel ble vedtatt som tap av funksjonsfenotype for å velge for multikopiundertrykkere. Figur 1 viser en skjematisk fremstilling av den genetiske skjermen. For å starte skjermen ble den gentoksiske spenningsfølsomheten til ell1-delesjonsmutanten (h- ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1 ell1Δ :: kanMX6) først bekreftet med hensyn til dens isogene villtypestamme (h- ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1) i nærvær av 4-NQO (figur 2A). Deretter ble spørringen S. pombe ell1 null mutant transformert med et høyt kopinummer S. pombe cDNA-bibliotek for å velge for de plasmidklonene som kunne undertrykke / redde den 4-NQO vekstrelaterte følsomheten til ell1 nullmutanten. Dette biblioteket inneholder ~6 × 105 S. pombe cDNA-fragmenter klonet i pLEV3 S. pombe-overekspresjonsvektoren under kontroll av adh1-promotoren 30. Som en kontroll ble 1/10th av transformasjonsblandingen også belagt på EMM2-plater som manglet 4-NQO for å beregne det totale antallet rekombinante kloner oppnådd etter transformasjon av biblioteket, en indikasjon på dekningen av biblioteket, og screenet for isolering av suppressorklonene. Dette er kritisk, da screening færre kloner vil redusere muligheten for å identifisere suppressorklonene. 

Figur 2B viser representative bilder av kontroll- og 4-NQO-holdige plater. Som vist i figuren er et stort antall kolonier oppnådd på kontrollplaten som mangler 4-NQO som viser en god dekning av biblioteket. Som forventet ble færre transformanter oppnådd på 4-NQO-platen, da disse transformantene sannsynligvis representerer de antatte suppressorene av 4-NQO-følsomheten til ell1 nullmutanten. Deretter ble de forskjellige transformante koloniene oppnådd på EMM2-plater som inneholdt 0,2 μM 4-NQO ytterligere stripet eller oppdaget på EMM2-plater som inneholdt 0,2 μM 4-NQO for å bekrefte evnen til disse transformantene til å vokse i nærvær av 4-NQO. Det ble observert at 620 transformante kolonier var i stand til å vokse på 0,2 μM 4-NQO-holdige EMM2-plater.

Validering av evnen til de antatte suppressorklonene til å gjenopprette veksten av ell1-delesjonsmutant under genotoksiske stressforhold
For å bekrefte de antatte suppressorene er det viktig å teste redningen av ønsket fenotype under høyere stringensforhold som vist i skjematisk representasjon (figur 3A). Derfor ble de 620 kortlistede transformantene oppdaget på EMM2-plater med 0,4 μM 4-NQO. Som det fremgår av figur 3B, viste bare 74 transformanter vekst ved 0,4 μM 4-NQO. Deretter ble disse 74 transformantene oppdaget på EMM2-plater som inneholdt 0,8 μM 4-NQO, og det ble observert at bare 16 viste vekst i nærvær av 0,8 μM 4-NQO (figur 3C). For ytterligere å bekrefte disse observasjonene ble disse 16 transformantene oppdaget på EMM2-plater med nødvendige kosttilskudd, som inneholdt enten 0,8 μM 4-NQO eller ingen 4-NQO (kontroll), sammen med ell1-slettingsmutanten transformert med tom vektor. Resultatene av disse spottinganalysene viste at, som forventet, viste ell1-slettingsstammen transformert med tom vektor, så vel som alle de 16 transformantene, vekst på platen som manglet 4-NQO. Til sammenligning, mens ell1-delesjonsmutanten som bare inneholdt den tomme vektoren ikke viste noen vekst ved 0,8 μM 4-NQO, viste seks transformanter vekst ved 0,8 μM 4-NQO (figur 3D), noe som tyder på at bibliotekklonen(e) som var tilstede i dem hadde evnen til å undertrykke den gentoksiske stressfenotypen til ell1 nullmutanten.

Identifikasjon av genet kodet av suppressorklonen
Vi valgte deretter 02 genetiske suppressorer av ell1-delesjonsstammen, sup 84 og sup 104, som viser fullstendig undertrykkelse av ell1-assosiert vekstfølsomhet i nærvær av 4-NQO. Bibliotekplasmidklonen(e) ble isolert fra disse to gjærundertrykkerne og omdannet til kompetente E. coli-celler. Deretter ble plasmid isolert fra E. coli-celler ved bruk av standardprotokoller31. De to isolerte plasmidene, merket som 84 og 104, ble utsatt for restriksjonsfordøyelse, noe som avslørte tilstedeværelsen av henholdsvis ca. 1000 bp og 800 bp innstikk DNA-fragmenter (figur 4A, B). For ytterligere å validere resultatene av denne suppressorskjermen, ble disse plasmidene retransformert til ell1-slettingsmutanten og sjekket om de kunne gjenopprette veksten av ell1 nullmutanten i nærvær av 4-NQO. Stresspunktanalysene viste at suppressorplasmidklonene resulterte i undertrykkelse av den 4-NQO-assosierte vekstfølsomheten når de ble gjeninnført i ell1 nullmutanten, noe som tyder på at undertrykkelsen var plasmidavhengig (figur 4C). Videre bestemte vi oss for å avgjøre om disse suppressorklonene også kunne undertrykke den vekstrelaterte følsomheten til ell1-slettingsstammen i nærvær av en annen DNA-skadefremkallende forbindelse, MMS. Spotanalysene viste at transformasjon av suppressorplasmidklonene til ell1 nullmutanten resulterte i mer vekst på MMS-holdig medium enn transformasjon av ell1-delesjonsmutanten med tom vektor, noe som indikerer at disse plasmidklonene kunne undertrykke den gentoksiske spenningsfølsomheten til ell1-delesjonsmutanten i nærvær av begge gentoksiske midler, dvs. 4-NQO og MMS (figur 4D).

Deretter, for å identifisere genet som er tilstede i disse suppressorplasmidklonene, ble sekvensering av innsats-DNA-fragmentet utført ved bruk av adh1 promotorspesifikk universell fremoverprimer30. Nukleotidsekvensen oppnådd ble søkt ved å bruke 'BLAST at Ensembl' -verktøyet tilgjengelig på PomBase-nettstedet (https://www.pombase.org), som viste at de to plasmidklonene 84 og 104 inneholdt henholdsvis rax2+ og osh6+-gener, noe som ga bevis for at Rax2 og Osh6 var ansvarlige for å undertrykke den gentoksiske stressfølsomme fenotypen assosiert med fravær av ell1+ i S. pombe . Kunnskapen om funksjonene til begge disse proteinene i S. pombe er begrenset. Rax2 har vist seg å regulere lokaliseringen av For3p for å kontrollere cellepolariteten under vegetativ vekst i S. pombe32. Osh6 er et lipidtransportprotein som tilhører den oksysterolbindende proteinrelaterte proteinfamilien. Det er involvert i transport av fosfatidylserin fra endoplasmatisk retikulum til plasmamembranen33.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av den genetiske multikopisuppressorskjermen. Denne protokollen har fire hovedtrinn: transformasjon av biblioteket til en spørringsmutantstamme, utvalg av plasmidkloner som undertrykker den ønskede fenotypen av spørringsmutantstammen, henting av plasmidet (e) fra disse suppressorklonene, og identifisering av genet som er ansvarlig for undertrykkelsen av fenotypen. Forkortelse: 4-NQO = 4-nitrokinolin 1-oksid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Screening for multikopiundertrykker(e) av ell1 delesjonsassosiert gentoksisk stresssensitivitet i S. pombe. (A) Stresspunktanalyse som viser 4-NQO-følsomhet for ell1-slettet S. pombe-stamme sammenlignet med dens isogene villtypestamme. Serielle fortynninger (1:10) av passende stammer ble oppdaget på EMM2 medium som inneholder 225 μg / ml hver av adenin, leucin og uracil med eller uten (kontroll) 0,4 μM 4-NQO. Plater ble deretter inkubert i 3-5 dager ved 32 °C. (B) Et cDNA-bibliotek med høyt kopinummer ble transformert i ell1-slettet S. pombe-stamme , og transformerte kolonier ble belagt på EMM2-medium som manglet leucin, men inneholdt 0,2 μM 4-NQO. En liten aliquot av transformasjonsblandingen ble også belagt på EMM2-plater som manglet 4-NQO, som en kontroll. Platene ble inkubert ved 32 °C i 5-6 dager og fotografert. Panel B viser et representativt bilde av disse platene. Forkortelse: 4-NQO = 4-nitrokinolin 1-oksid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Validering av antatt suppressorkloners evne til å undertrykke den gentoksiske spenningsfølsomheten til ell1-delesjonsmutanten. (A) En skjematisk fremstilling av screeningen av bibliotekets transformanter ved å teste undertrykkelse av ønsket fenotype. Vekst av 620 transformanter ble testet på økende konsentrasjoner av 4-NQO ved å oppdage forskjellige transformanter på EMM2-plater som mangler leucin og inneholder enten (B) 0,4 μM 4-NQO eller (C) 0,8 μM 4-NQO. Platene ble inkubert ved 32 °C i 5-6 dager og fotografert. Det er vist representative bilder av plater. (D) Seksten transformanter som viste vekst på 0,8 μM 4-NQO ble oppdaget på EMM2-plater som manglet leucin, men inneholdt enten 0,8 μM 4-NQO eller ikke inneholdt 4-NQO (kontroll), sammen med ell1-slettingsstammen transformert med tom vektor. Platene ble inkubert ved 32 °C i 5-6 dager og fotografert. Bare seks kolonier viste evnen til å redde ell1-delesjon assosiert genotoksisk stressfølsomhet. Forkortelse: 4-NQO = 4-nitrokinolin 1-oksid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Identifikasjon av suppressorplasmidklonene. Agarose gel bilder av (A) begrensning fordøyelse av suppressor plasmid 84 med BamHI begrensning enzym utgitt et innlegg på ~ 1 kb. (B) Suppressor plasmid 104 fordøyd med PstI / BamHI restriksjon enzymer utgitt et innlegg på ~ 800 bp. (C) 1: 10 serielt fortynnet ell1 null mutant transformert med plasmider, sup 84 eller sup 104, ble oppdaget på EMM2 plater mangler leucin og inneholder enten 0,4 μM 4-NQO eller (D) 0,01% MMS. I kontrollplater ble det ikke tilsatt DNA-skadelig middel. Platene ble inkubert ved 32 °C i 4-5 dager og fotografert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1: Sammensetning av medier for vekst av S. pombe. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gjær har blitt mye brukt til å undersøke de grunnleggende biologiske prosessene og veiene som er evolusjonært konservert over eukaryote organismer. Tilgjengeligheten av genetiske og genomiske verktøy sammen med deres egnethet til ulike biokjemiske, genetiske og molekylære prosedyrer gjør gjær til en utmerket modellorganisme for genetisk forskning34,35,36. Gjennom årene har ulike genetiske skjermer blitt designet av gjærforskere for å identifisere genetiske interaksjoner som vil kaste lys over funksjonene til individuelle gen (er), samt veier og biologiske prosesser der de kan være involvert 10,11,17,37. En av de vanlige og nyttige skjermene for å identifisere genetiske interaksjoner er kjent som "multikopi eller høy kopinummerundertrykkelse".

Denne skjermen krever en spørringsmutantstamme (r) som viser en tap-av-funksjon-fenotype, etterfulgt av transformasjon av denne mutante spørringsstammen (e) med et genomisk eller cDNA-bibliotek med høyt kopinummer. Deretter screenes de oppnådde transformantene for å identifisere de gener, som når de overuttrykkes, undertrykker fenotypen assosiert med spørringsmutantstammen (e). Denne typen genetisk interaksjon mellom den spesifikke mutantstammen og genet (e) som er tilstede i plasmidbibliotekklonene, resulterer i isolering og identifisering av genprodukter som sannsynligvis vil virke i samme vei eller påvirke den samme biologiske prosessen4. Dermed gir denne skjermen innsikt i funksjonene til genet (e) av interesse og deres funksjonelle organisering i veier og biologiske prosesser in vivo. Tradisjonelt har denne skjermen blitt mye brukt i S. cerevisiae 38,39,40,41,42.

Målet med det foreliggende arbeidet er å beskrive en enkel og grei protokoll for å utføre en multikopi undertrykkelse genetisk skjerm i S. pombe. Vi utførte skjermen ved hjelp av en S. pombe-stamme som bærer en sletting av ell1-transkripsjonsforlengelsesfaktoren. ELL er en familie av transkripsjonsforlengelsesfaktorer, som er tilstede i et bredt spekter av organismer, fra fisjonsgjær til mennesker. Funksjonene til Ell1 begynner bare å bli forstått i S. pombe. Tidligere arbeid hadde fremhevet rollen til Ell1 i optimal vekst under normale vekstforhold og i overlevelse under genotoksiske stressforhold26. Vi har benyttet multicopy suppressor screening som en av tilnærmingene for å avdekke den molekylære mekanismen som ligger til grunn for rollen til Ell1 i gentoksisk stressfølsomhet i S. pombe26. Et multikopi plasmidkodet S. pombe cDNA-bibliotek ble transformert til S. pombe ell1 null mutant som utviser følsomhet for 4-NQO. Deretter ble de transformanter som kunne vokse i nærvær av 4-NQO valgt.

Isolering av plasmider fra disse transformantene og sekvensering av innlegg tilstede i disse plasmidene førte til identifisering av to nye genetiske interaktorer av ell1+ i S. pombe, rax2+ og osh6+. En tidligere studie ved hjelp av en lignende genetisk skjerm i S. pombe har også identifisert anti-silencing protein, epe1 +, som en multikopi suppressor av ell1 delesjon-assosierte fenotyper43. Vi har også brukt denne metoden til å identifisere multikopiundertrykkerne til den ikke-essensielle Rpb9-underenheten av S. pombe RNA-polymerase II (upubliserte observasjoner). Samlet validerer disse resultatene nytten av den genetiske multikopiundertrykkende screening-tilnærmingen som en metode for å identifisere antatte gener / proteiner som utviser genetisk interaksjon med et ønsket gen av interesse, og belyser funksjonen, veiene og prosessene der genet av interesse kan være involvert.

For å bruke skjermen som er beskrevet i dette arbeidet, er det viktig å først ha en spørringsmutantstamme som viser en klar fenotype assosiert med mutasjonen, som kan brukes til å isolere multikopiundertrykkeren (e). Videre vil suksessen til denne skjermen avhenge av tilgjengeligheten av et høykvalitets og godt representativt bibliotek som inneholder kloner som representerer det maksimale antallet villtypegener eller deres tilsvarende cDNAer. Tradisjonelt har både genomiske og cDNA-biblioteker blitt brukt i disse skjermene, men cDNA-biblioteker har fordelen av å være laget av mRNA uttrykt i cellen / organismen. Videre er en høy effektivitet av transformasjonen til gjærcellene avgjørende for suksessen til skjermen fordi det er viktig å skjerme et stort antall transformanter, noe som øker sannsynligheten for å identifisere suppressorer. Hvis færre transformanter oppnås på kontrollplaten etter transformasjon av biblioteket til spørringsmutantstammen ved bruk av litiumacetatprotokollen, kan elektroporering brukes til å transformere biblioteket.

Det anbefales også å først standardisere transformasjonsprotokollen med et annet plasmid før du transformerer biblioteket. Ellers vil det unødvendig føre til tap av biblioteket. Protokollen beskrevet her bruker 4-NQO-sensitivitet som mutantfenotype, men egnede screeningmetoder/analyser bør utformes for seleksjon av suppressorer basert på den spesifikke mutante fenotypen av interesse. Hvis det oppnås ingen eller svært få transformanter på platen for å velge for suppressorer etter transformasjon av biblioteket til spørringsmutantstammen, bør om mulig mindre strenge betingelser / analyser brukes ved plating av biblioteket for å velge for suppressorer for å oppdage så mange genetiske suppressorer som mulig før de bekreftes under høystrenghetsforhold. I tillegg til å bruke restriksjonsfordøyelse for å teste for tilstedeværelsen av innsatsen i de identifiserte suppressorplasmidklonene, kan PCR ved hjelp av vektorspesifikke primere brukes til å forsterke ønsket sett inn DNA-fragment. Alternativt kan suppressorplasmidklonene gis direkte for sekvensering, og unngår behovet for begrensningsfordøyelse eller PCR.

Denne skjermen kan også vedtas for andre gjær enn S. cerevisiae og S . pombe hvis et genetisk verktøysett med hensyn til passende mutantstammer, plasmider og promotorkonstruksjoner er tilgjengelig som vil lette overekspresjon av gener, noe som gjør det mulig å redde mutant fenotype tilstede i vertsgjærcellen. Videre, med tilgjengeligheten av genomomfattende ressurser, inkludert innsamling av genom-brede slettingsmutanter44 og overekspresjonsbiblioteker37, kan denne skjermen også utføres ved transformasjon av en eller noen få spørringsplasmider til et systematisk utvalg av gjærmutantstammesamling eller ved transformasjon av et systematisk utvalg av overekspresjonsplasmidsamling til en eller noen få mutante spørringsstammer45 . Avslutningsvis kan denne tilnærmingen klart generaliseres til et bredt spekter av eksperimentelle spørsmål i forskjellige organismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av et forskningsstipend fra Institutt for bioteknologi, Indias regjering (Grant nr. BT/PR12568/BRB/10/1369/2015) til Nimisha Sharma. Forfatterne takker prof. Charles Hoffman (Boston College, USA) for gaven fra S. pombe cDNA-biblioteket og prof. Susan Forsburg for gjærplasmidene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-NQO Sigma N8141
Acetic Acid, glacial Sigma 1371301000
Adenine Sulphate Himedia GRM033
Agar Himedia GRM026
Agarose Lonza 50004L
Ammonium Chloride Himedia MB054
BamHI Fermentas ER0051
Biotin Himedia RM095
Boric Acid Himedia MB007
Calcium Chloride  Sigma C4901
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 Sigma C0549
Citric Acid Himedia RM1023
Disodium hydrogen phospahte anhydrous Himedia GRM3960
single stranded DNA from Salmon testes Sigma D7656
EDTA disodium Sigma 324503
Ferric Chloride Hexahydrate Himedia RM6353
Glucose Amresco 188
Ionositol Himedia GRM102
Isopropanol Qualigen Q26897
Leucine Himedia GRM054
Lithium Acetatae Sigma 517992
Magnesium Chloride Hexahydrate Himedia MB040
Molybdic Acid Himedia RM690
Nicotinic Acid Himedia CMS177
PEG, MW 4000 Sigma 81240
Pentothinic Acid Himedia TC159
Phenol Himedia MB082
Plasmid Extraction Kit Qiagen 27104
Potassium Chloride Sigma P9541
Potassium hydrogen Pthallate Merc DDD7D670815
Potassium iodide Himedia RM1086
RNAse Fermentas EN0531
SDS Himedia GRM205
Sodium Hydroxide Himedia GRM1183
Sodium Sulphate Himedia RM1037
Tris free Base Himedia MB209
Uracil Himedia GRM264
Yeast Extract Powder Himedia RM668
Zinc Sulphate Heptahydrate Merc DJ9D692580

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zuk, O., Hechter, E., Sunyaev, S. R., Lander, E. S. The mystery of missing heritability: Genetic interactions create phantom heritability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1193-1198 (2012).
  2. Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. -L. V., Kruglyak, L. Finding the sources of missing heritability in a yeast cross. Nature. 494 (7436), 234-237 (2013).
  3. Bloom, J. S., et al. Genetic interactions contribute less than additive effects to quantitative trait variation in yeast. Nature Communications. 6 (1), 8712 (2015).
  4. Tong, A. H. Y., et al. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303 (5659), New York, N.Y. 808-813 (2004).
  5. Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327 (5964), New York, N.Y. 425-431 (2010).
  6. Costanzo, M., et al. A global genetic interaction network maps a wiring diagram of cellular function. Science. 353 (6306), New York, N.Y. (2016).
  7. Mullen, J. R., Kaliraman, V., Ibrahim, S. S., Brill, S. J. Requirement for three novel protein complexes in the absence of the Sgs1 DNA helicase in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (1), 103-118 (2001).
  8. Kaplan, Y., Kupiec, M. A role for the yeast cell cycle/splicing factor Cdc40 in the G1/S transition. Current Genetics. 51 (2), 123-140 (2007).
  9. Carlsson, M., Hu, G. -Z., Ronne, H. Gene dosage effects in yeast support broader roles for the LOG1, HAM1 and DUT1 genes in detoxification of nucleotide analogues. PLOS One. 13 (5), 0196840 (2018).
  10. Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Molecular Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
  11. Duffy, S., et al. Overexpression screens identify conserved dosage chromosome instability genes in yeast and human cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 9967-9976 (2016).
  12. Appling, D. R. Genetic approaches to the study of protein-protein interactions. Methods (San Diego, Calif). 19 (2), 338-349 (1999).
  13. Forsburg, S. L. The art and design of genetic screens: yeast. Nature Reviews. Genetics. 2 (9), 659-668 (2001).
  14. Kitazono, A. A., Tobe, B. T. D., Kalton, H., Diamant, N., Kron, S. J. Marker-fusion PCR for one-step mutagenesis of essential genes in yeast. Yeast (Chichester, England). 19 (2), 141-149 (2002).
  15. Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nature Reviews. Genetics. 8 (6), 437-449 (2007).
  16. Prelich, G. Suppression mechanisms: themes from variations. Trends in Genetics. 15 (7), 261-266 (1999).
  17. Li, X., et al. Multicopy suppressors for novel antibacterial compounds reveal targets and drug efflux susceptibility. Chemistry & Biology. 11 (10), 1423-1430 (2004).
  18. Apfel, C. M., et al. Peptide deformylase as an antibacterial drug target: Target validation and resistance development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1058-1064 (2001).
  19. Tsukahara, K., et al. Medicinal genetics approach towards identifying the molecular target of a novel inhibitor of fungal cell wall assembly. Molecular Microbiology. 48 (4), 1029-1042 (2003).
  20. Calabrese, D., Bille, J., Sanglard, D. A novel multidrug efflux transporter gene of the major facilitator superfamily from Candida albicans (FLU1) conferring resistance to fluconazole. Microbiology. 146 (11), 2743-2754 (2000).
  21. Cotrim, P. C., Garrity, L. K., Beverley, S. M. Isolation of genes mediating resistance to inhibitors of nucleoside and ergosterol metabolism in leishmania by overexpression/selection. Journal of Biological Chemistry. 274 (53), 37723-37730 (1999).
  22. Nodake, Y., Yamasaki, N. Some properties of a macromolecular conjugate of lysozyme prepared by modification with a monomethoxypolyethylene glycol derivative. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 64 (4), 767-774 (2000).
  23. Sunnerhagen, P. Prospects for functional genomics in Schizosaccharomyces pombe. Current Genetics. 42 (2), 73-84 (2002).
  24. Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).
  25. Sharma, N. Regulation of RNA polymerase II-mediated transcriptional elongation: Implications in human disease. IUBMB Life. 68 (9), 709-716 (2016).
  26. Sweta, K., Dabas, P., Jain, K., Sharma, N. The amino-terminal domain of ELL transcription elongation factor is essential for ELL function in Schizosaccharomyces pombe. Microbiology. 163 (11), Reading, England. 1641-1653 (2017).
  27. Murray, J. M., Watson, A. T., Carr, A. M. Transformation of Schizosaccharomyces pombe: Lithium acetate/dimethyl sulfoxide procedure. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4), 090969 (2016).
  28. Hagan, I., Carr, A. M., Grallert, A., Nurse, P. Fission yeast: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2016).
  29. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and transformation of competent E. coli using calcium chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), 3932 (2006).
  30. Janoo, R. T., Neely, L. A., Braun, B. R., Whitehall, S. K., Hoffman, C. S. Transcriptional regulators of the Schizosaccharomyces pombefbp1 gene include two redundant Tup1p-like corepressors and the CCAAT binding factor activation complex. Genetics. 157 (3), 1205-1215 (2001).
  31. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of plasmid DNA by alkaline lysis with SDS: Maxipreparation. CSH Protocols. 2006 (1), 4090 (2006).
  32. Choi, E., Lee, K., Song, K. Function of rax2p in the polarized growth of fission yeast. Molecules and Cells. 22 (2), 146-153 (2006).
  33. Eisenreichova, A., Różycki, B., Boura, E., Humpolickova, J. Osh6 revisited: Control of PS transport by the concerted actions of PI4P and Sac1 phosphatase. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 747601 (2021).
  34. Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), New York, N.Y. 1259-1260 (1997).
  35. Forsburg, S. L. The yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe: models for cell biology research. Gravitational and Space Biology Bulletin: Publication of the American Society for Gravitational and Space Biology. 18 (2), 3-9 (2005).
  36. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  37. Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nature Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
  38. Kitada, K., Johnson, A. L., Johnston, L. H., Sugino, A. A multicopy suppressor gene of the Saccharomyces cerevisiae G1 cell cycle mutant gene dbf4 encodes a protein kinase and is identified as CDC5. Molecular and Cellular Biology. 13 (7), 4445-4457 (1993).
  39. Melnykov, A. V., Elson, E. L. MCH4 is a multicopy suppressor of glycine toxicity in Saccharomyces cerevisiae. , 653444 (2019).
  40. Kosodo, Y., et al. Multicopy suppressors of the sly1 temperature-sensitive mutation in the ER-Golgi vesicular transport in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 18 (11), 1003-1014 (2001).
  41. Nakamura, T., Takahashi, S., Takagi, H., Shima, J. Multicopy suppression of oxidant-sensitive eos1 mutation by IZH2 in Saccharomyces cerevisiae and the involvement of Eos1 in zinc homeostasis: Eos1 involvement in zinc homeostasis. FEMS Yeast Research. 10 (3), 259-269 (2010).
  42. Hernández-López, M. J., García-Marqués, S., Randez-Gil, F., Prieto, J. A. Multicopy suppression screening of Saccharomyces cerevisiae identifies the ubiquitination machinery as a main target for improving growth at low temperatures. Applied and Environmental Microbiology. 77 (21), 7517-7525 (2011).
  43. Sweta, K., Sharma, N. Functional interaction between ELL transcription elongation factor and Epe1 reveals the role of Epe1 in the regulation of transcription outside heterochromatin. Molecular Microbiology. 116 (1), 80-96 (2021).
  44. Kim, D. -U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 617-623 (2010).
  45. Adames, N. R., Gallegos, J. E., Peccoud, J. Yeast genetic interaction screens in the age of CRISPR/Cas. Current Genetics. 65 (2), 307-327 (2019).

Tags

Biologi utgave 187 Genetisk skjerm Multikopiundertrykkere Schizosaccharomyces pombe Ell1 Genregulering Transkripsjonsforlengelse
Genetisk skjerm for identifisering av multikopiundertrykkere i <em>Schizosaccharomyces pombe</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhardwaj, V., Sweta, K., Gyala, D.,… More

Bhardwaj, V., Sweta, K., Gyala, D., Sharma, N. Genetic Screen for Identification of Multicopy Suppressors in Schizosaccharomyces pombe. J. Vis. Exp. (187), e63967, doi:10.3791/63967 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter