Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Генетический скрининг для идентификации мультикопийных супрессоров в Schizosaccharomyces pombe

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/63967
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1University School of Biotechnology, G.G.S. Indraprastha University
* These authors contributed equally

Summary

В этой работе описывается протокол для генетического скрининга мультикопийного супрессора в Schizosaccharomyces pombe. Этот экран использует библиотеку плазмид для всего генома для идентификации клонов-супрессоров фенотипа потери функции, связанного с мутантным штаммом запроса. Новые генетические супрессоры нулевого мутанта ell1 были идентифицированы с помощью этого экрана.

Abstract

Идентификация генетических взаимодействий является мощным инструментом для расшифровки функций гена (генов), предоставляя представление об их функциональных отношениях с другими генами и организации биологических путей и процессов. Хотя большинство генетических скринингов были первоначально разработаны в Saccharomyces cerevisiae, дополнительная платформа для проведения этих генетических скринингов была предоставлена Schizosaccharomyces pombe. Одним из распространенных подходов, используемых для идентификации генетических взаимодействий, является чрезмерная экспрессия клонов из общегеномной библиотеки плазмид с высоким числом копий в мутанте с потерей функции с последующим отбором клонов, которые подавляют фенотип мутанта.

В этой статье описывается протокол для проведения этого генетического скрининга на основе «подавления мультикопии» у S. pombe. Этот скрининг помог идентифицировать мультикопийный супрессор (ы) генотоксического стресс-чувствительного фенотипа, связанного с отсутствием фактора удлинения транскрипции Ell1 у S. pombe. Экран был инициирован преобразованием нулевого мутантного штамма запроса ell1 с библиотекой плазмид s. pombe cDNA с высоким числом копий и выбором супрессоров на пластинах EMM2, содержащих 4-нитрохинолин 1-оксид (4-NQO), генотоксическое стресс-индуцирующее соединение. Впоследствии плазмиду выделяли из двух колоний-супрессоров и переваривали ферментами рестрикции для высвобождения вставленной ДНК. Плазмиды, высвобождающие вставной фрагмент ДНК, были ретрансформированы в штамм делеции ell1 , чтобы подтвердить способность этих клонов плазмиды-супрессора восстанавливать рост мутанта делеции ell1 в присутствии 4-NQO и других генотоксических соединений. Те плазмиды, которые показали спасение фенотипа делеции, были секвенированы для идентификации гена (генов), ответственного за подавление генотоксического стресс-чувствительного фенотипа, связанного с делецией ell1 .

Introduction

Сети генетических взаимодействий предоставляют функциональную информацию о генах и очерчивают пути и биологические процессы, в которых эти гены могут быть вовлечены in vivo. Кроме того, они также могут дать представление о том, как различные гены взаимодействуют друг с другом, что приводит к определенному фенотипу 1,2,3. На протяжении многих лет исследователи разрабатывали различные генетические скрининги, чтобы ответить на фундаментальные биологические вопросы и изучить болезни человека. Скрининги для идентификации генетических взаимодействий могут быть выполнены несколькими способами. Генетические взаимодействия, идентифицированные в различных генетических скринингах, могут представлять собой различные механистические отношения между генами. Кроме того, исследования показали, что общий набор генетических взаимодействий разделяют гены, которые кодируют белки, принадлежащие к одному и тому же пути или комплексу 4,5. Таким образом, сети генетического взаимодействия могут быть использованы для установления функциональной организации в клетке, в которой гены, разделяющие наиболее похожие профили, принадлежат к одному и тому же комплексу или пути, эти гены, имеющие несколько менее похожие профили, принадлежат к одному и тому же биологическому процессу, а те гены, которые демонстрируют перекрывающиеся, но более разнообразные профили, отражают членов, принадлежащих к одному и тому же клеточному компартменту6.

Скрининги генетического взаимодействия, основанные на подавлении дозы («подавление высокой копии или мультикопии»), являются одним из широко используемых подходов. Эти экраны могут быть выполнены путем преобразования мутантного штамма запроса с помощью геномной библиотеки или библиотеки кДНК с высоким числом копий, за которой следуют подходящие анализы / методы отбора для выявления подавляющих или усиливающих генетических взаимодействий 7,8,9. Чтобы обеспечить всесторонний охват всего генома, эти скрининги также проводились путем сверхэкспрессии конкретного гена, представляющего интерес, в коллекции мутанта потери функции по всему геному или путем чрезмерной экспрессии геномной библиотеки с высоким числом копий плазмид или кДНК в мутанте запроса на потерю функции 9,10,11,12,13,14,15 . Стратегия мультикопии может также работать с использованием подхода доминанты/сверхвыражения с использованием регулируемого промотора.

Основные преимущества использования скринингов на основе супрессоров заключаются в том, что подавление ранее существовавшего фенотипа в мутантном штамме другим геном устанавливает генетическую связь между этими двумя генными продуктами, которая, возможно, не была продемонстрирована с использованием других подходов. Во-вторых, было замечено, что наличие ранее существовавшей мутации сенсибилизирует определенный путь, позволяя идентифицировать дополнительные компоненты этого пути путем выделения супрессоров, которые, возможно, не были идентифицированы более прямым генетическим отбором. Более того, этот экран может быть использован для идентификации подавителей, которые имеют различные механизмы подавления16. Супрессорные взаимодействия обычно происходят между генами, которые функционально связаны и могут быть использованы для выяснения иерархий в путях. Точный основной механизм подавления может отличаться в зависимости от нескольких факторов, включая тип мутанта запроса, используемого на экране, экспериментальные условия и уровень экспрессии генов. Один из распространенных механизмов подавления дозы включает гены, кодирующие продукты, которые функционируют вместе в одном комплексе или параллельно в одном и том же клеточном / биологическом процессе. Результаты таких скринингов в более простых модельных организмах, таких как дрожжи, могут быть распространены на высшие эукариотические организмы, поскольку большинство фундаментальных биологических путей и процессов сохраняются на протяжении всей эволюции.

Эти генетические экраны также могут быть модифицированы несколькими способами, чтобы ответить на различные биологические вопросы. Например, могут быть идентифицированы ортологичные гены разных организмов, которые могут подавлять фенотип мутантного штамма. Он также был использован для определения потенциальных механизмов резистентности и определения белковых мишеней новых антибактериальныхсоединений 17,18, противогрибковых19,20, противопаразитарных21 и противоопухолевыхсоединений 22. Этот экран также был использован для выявления супрессоров активности фармацевтических препаратов, механизм действия которых неизвестен. Таким образом, в принципе, эти мультикопийные супрессорные экраны могут быть оптимизированы и использованы в различных приложениях в различных организмах. Хотя большинство генетических скринингов, используемых исследователями дрожжей, были первоначально разработаны в S. cerevisiae, S. pombe появился как дополнительная модельная система для проведения различных генетических скринингов и анализов23. Кроме того, геномная организация и биологические процессы у S. pombe, такие как встречаемость интронов в большем количестве генов, сложность происхождения репликации ДНК, структура центромеры, организация клеточного цикла и наличие механизма RNAi, показывают большее сходство между S. pombe и высшими эукариотами23,24, подчеркивая важность разработки и использования генетических инструментов в S. pombe.

В этой статье описывается протокол идентификации генетических интеракторов на основе «подавления дозы» мутантного фенотипа с потерей функции у S. pombe. Основой этого протокола является то, что это быстрый и эффективный метод скрининга библиотеки кДНК, чрезмерно экспрессирующей гены дикого типа либо на мультикопийной плазмиде, либо на сильном промоторе. Этот протокол состоит из четырех основных этапов: преобразование библиотеки в мутантный штамм запроса, выбор плазмидных клонов, которые подавляют желаемый фенотип мутантного штамма запроса, извлечение плазмиды (плазмид) из этих клонов-супрессоров и идентификация гена, ответственного за подавление фенотипа. Как и для любого метода, основанного на выборе и идентификации cDNAs из библиотеки, успех экрана зависит от использования высококачественной и сложной библиотеки, поскольку экран может извлекать только те клоны кДНК, которые присутствуют в библиотеке.

Используя этот протокол, мы успешно идентифицировали два новых супрессора генотоксического стресс-чувствительного фенотипа запроса S. pombe ell1 нулевого мутанта. Семейство факторов удлинения транскрипции ELL (Eleven Nineteen Lysine Rich Leukemia) подавляет преходящую паузу РНК-полимеразы II на шаблонах ДНК в биохимических анализах in vitro и сохраняется в различных организмах, от дрожжей деления до людей25. Более ранняя работа предоставила доказательства того, что нулевой мутант S. pombe ell1 демонстрирует генотоксическую стрессовую чувствительность в присутствии 4-нитрохинолина 1-оксида (4-NQO) и метилметансульфоната (MMS)26. Поэтому мы преобразовали мультикопийную библиотеку кДНК, кодируемую плазмидой S. pombe , в нулевой мутант S. pombe ell1 и идентифицировали два предполагаемых клона, которые продемонстрировали способность подавлять генотоксическую стрессовую чувствительность нулевого мутанта S. pombe ell1 в присутствии 4-NQO, соединения, которое индуцирует поражения ДНК. Последующее секвенирование вставки, присутствующей в плазмидных клонах, показало, что гены, кодирующие rax2+ и osh6+, были ответственны за подавление генотоксической стрессовой чувствительности нулевого мутанта ell1 при сверхэкспрессии в нулевом мутанте ell1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Преобразование библиотеки кДНК в запрос S. pombe мутантного штамма для скрининга мультикопийных супрессоров

ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартный литий-ацетатный метод27 использовался для преобразования библиотеки s. pombe cDNA в запрос S. pombe ell1Δ штамм с несколькими модификациями:

  1. Вырастите штамм S. pombe ell1Δ при 32 °C на ye-среде (таблица 1), дополненной 225 мкг/мл аденина, лейцина и урацила. Инокулируют петлю, полную инокулята штамма ell1Δ из вышеуказанной пластины в 15-20 мл YE-среды, дополненной 225 мкг/мл аденина, лейцина и урацила. Высиживать его в течение ночи при 32 °C с встряхиванием (200-250 об/мин).
  2. На следующий день разводят культуру на ночь в 100 мл свежей среды YE с желаемыми добавками до OD600 нм (оптическая плотность при 600 нм) 0,3 и инкубируют ее при 32 °C с встряхиванием при 200-250 об/мин до тех пор, пока OD600 нм не достигнет средней фазы log.
  3. Разделите культуру 100 мл на две 50 мл центрифужные трубки с последующим центрифугированием при комнатной температуре в течение 10 мин при 4000 × г.
  4. Откажитесь от надосадочного вещества и промыть ячейку гранулы 1 мл стерильной воды, т.е. повторно суспендировать клетки в 1 мл стерильной воды и центрифугу при 4000 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  5. Откажитесь от надосадочного вещества и промыть каждую ячейку гранулы 1 мл 1x LiAc-TE (100 мМ ацетата лития, 10 мМ Tris-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5), как описано на этапе 1.4.
  6. Удалите супернатант и повторно суспендируйте каждую ячейку гранулы в 250 мкл 1x LiAc-TE. Используйте эти S . pombe компетентные клетки (500 мкл) для трансформации с интересующей ДНК. Переведите 125 мкл компетентных клеток в четыре различные стерильные микроцентрифужные трубки для последующих стадий трансформации.
  7. Отварите ДНК носителя из яичек лосося или спермы сельди в течение 1 мин и сразу же поместите на лед. Для каждой трансформации добавляйте 10 мкл 10 мг/мл денатурированной одноцепочечной НЕСУЩЕЙ ДНК в микроцентрифужную трубку, содержащую 125 мкл компетентных клеток, с последующим мягким перемешиванием с использованием наконечника микропипетки. Впоследствии добавьте 50 мкг библиотеки кДНК S. pombe в компетентную клетку-носительную смесь ДНК-содержащую микроцентрифужную трубку.
  8. Инкубируют микроцентрифужные трубки при комнатной температуре в течение 10 мин, а затем добавляют в трубки 260 мкл раствора полиэтиленгликоля-ацетата лития (40% [мас./об.] ПЭГ 4000, 100 мМ ацетата лития, 10 мМ Tris-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5) и аккуратно перемешивают с помощью наконечника микропипетки.
  9. Инкубировать микроцентрифужные трубки, содержащие трансформационную смесь при 32 °С, в течение 2 ч без встряхивания. Добавьте 43 мкл предварительно расплавленного диметилсульфоксида (ДМСО) в микроцентрифужную трубку и аккуратно перемешайте. Впоследствии подвергайте трубки тепловому удару при 42 °C в течение 5 мин.
  10. Гранулируют ячейки по 4000 × г в течение 5 мин при комнатной температуре. Выбросьте супернатант и удалите остаточный раствор PEG-LiAc-TE с помощью наконечника микропипетки.
  11. Повторно суспендируют клетки в 100 мкл стерильной воды и пластине на одной пластине EMM2 (таблица 1) (150 мм) с необходимыми добавками и 0,2 мкг/мл 4-NQO.
  12. Инкубируйте пластины при 32 °C в течение 5-6 дней, чтобы на пластинах появились колонии. Проведите полученные колонии на той же средней пластине в присутствии 0,2 мкг/мл 4-NQO и используйте для дальнейшего скрининга.
  13. Для одного эксперимента по преобразованию библиотеки используйте 500 мкл компетентных клеток (125 мкл компетентных ячеек x 4 микроцентрифужных трубки) для преобразования, как описано на этапах 1.8-1.14 выше.
  14. В качестве контрольной пластины 1/10-й трансформационной смеси на одной пластине EMM2 (150 мм) с необходимыми добавками, но не имеющей 4-NQO, вычисляют общее количество клонов библиотеки, полученных после преобразования библиотеки, и экран для выделения клонов-супрессоров.

2. Протестируйте и подтвердите спасение/подавление фенотипа, связанного с мутантным штаммом запроса предполагаемым супрессором

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализы точечного напряжения проводились, как описано ниже, для проверки и проверки спасения/подавления ell1-ассоциированной с делецией чувствительности к стрессу 4-NQO предполагаемым супрессором (супрессорами).

  1. Добавьте 100-200 мкл стерильной воды в каждую из различных скважин стерильной 96-луночной микротитровой пластины.
  2. Выберите небольшое количество инокулята из каждой из различных колоний, полученных после преобразования библиотеки кДНК на пластине, содержащей 4-NQO, с помощью стерильной зубочистки или наконечника микропипетки объемом 20-200 мкл. Добавьте инокулят из каждой из различных колоний в отдельные независимые лунки микротитровой пластины, содержащие 100-200 мкл стерильной воды. Тщательно перемешать.
  3. Поместите 3 мкл клеточной суспензии из каждой скважины на агаровые пластины EMM2, содержащие аденин (225 мкг/мл) и урацил (225 мкг/мл), но лишенные лейцина (выбираемый ауксотрофный маркер, присутствующий на плазмидном векторе, используемом для построения библиотеки, используемой в этой работе). Добавьте соответствующие концентрации 4-NQO к пластинам по мере необходимости.
  4. Инкубируйте пластины при 32 °C в течение 3-4 дней, чтобы клетки росли. Определите колонии, которые показывают рост в присутствии различных концентраций 4-NQO в качестве предполагаемых супрессоров.
  5. Для дальнейшей проверки супрессоров выращивают выбранные супрессоры вместе с соответствующими контрольными штаммами в течение ночи при 32 °C с встряхиванием (200-250 об/мин) в среде EMM2, содержащей по 225 мкг/мл аденина и урацила, но лишенной лейцина.
  6. На следующий день разводят клетки до OD600 нм 0,3 в свежей среде EMM2 и выращивают их при 32 °C с встряхиванием до середины фазы (приблизительно OD600 нм 0,6-0,8).
  7. Выявляйте соответствующие последовательные разведения (1:10 или 1:5) культур на пластинах EMM2 с необходимыми добавками, содержащими либо 0,4 мкМ 4-NQO, либо 0,01% MMS. Для контроля определите штаммы на пластине EMM2 с необходимыми добавками, но без какого-либо агента, повреждающего ДНК.
  8. Инкубируйте пластины при 32 °C в течение 3-5 дней для мониторинга роста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подходящие анализы, основанные на фенотипе, связанном с мутантным штаммом запроса, должны использоваться для проверки спасения или подавления фенотипа. Например, если необходимо идентифицировать супрессоры холодочувствительного фенотипа мутантного штамма запроса, анализ для тестирования и валидации клонов супрессора будет включать выращивание трансформантов при низкой температуре.
  9. Обнаружите мутантные штаммы, преобразованные полноразмерным геном интереса (в данном случае Spell1 ) или пустым вектором в качестве положительного и отрицательного элементов управления, соответственно, вместе с библиотекой трансформантов.

3. Выделение плазмиды из клонов супрессора S. pombe

ПРИМЕЧАНИЕ: Выделение плазмид из S. pombe осуществляли по протоколу, описанному в делении дрожжей: лабораторное руководство28 с несколькими модификациями.

  1. Инокулируют одну колонию дрожжей в среде EMM2, содержащей 225 мкг/мл аденина и урацила, и выращивают клетки в течение ночи при 32 °C с встряхиванием при 200-250 об/мин. На следующий день собирают 5 O.D. клеток (т.е. 10 мл культуры O.D. 0.5) путем центрифугирования в течение 2 мин при 4000 × г при комнатной температуре.
  2. Удалите супернатант и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 0,2 мл лизисного буфера (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 мМ NaCl, 10 мМ Tris HCl (рН 8,0) и 1 мМ Na2ЭДТА).
  3. Добавьте 0,2 мл фенола:хлороформа:изоамилового спирта (25:24:1) и 0,3 г промытых кислотой стеклянных шариков в микроцентрифужную трубку. Вращайте трубку микроцентрифуги в течение 2 мин при 4 °C и насиживайте на льду в течение 1 мин. Повторите этот шаг 6x.
  4. Центрифугируйте пробирку при 10 000 × г в течение 15 мин при комнатной температуре. Переложите верхний водный слой в свежую микроцентрифужную трубку и добавьте 200 мкл фенола:хлороформа:изоамилового спирта (25:24:1).
  5. Центрифугируйте пробирку при 10 000 × г в течение 10 мин. Переложите верхний водный слой в свежую трубку и добавьте в трубку два объема 100% этанола (~400 мкл) и 1/10 объема ацетата натрия (3 М, рН 5,8) (~20 мкл). Инкубировать микроцентрифужную трубку -70 °C в течение 1 ч.
  6. Осаждение ДНК центрифугированием при 10 000 × г в течение 15 мин при 4 °C и удаление супернатанта. Вымойте гранулу ДНК 70% этанолом (~500 мкл) и держите ее при комнатной температуре до высыхания на воздухе.
  7. Повторное суспендирование ДНК в 20 мкл стерильной воды. Используйте 2-5 мкл плазмидной ДНК для трансформации компетентных клеток кишечной палочки .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмида также может быть выделена из дрожжевых клеток с использованием любого из коммерчески доступных наборов для выделения плазмиды дрожжей.

4. Идентификация гена, закодированного клоном-супрессором

  1. Трансформируют изолированные плазмиды дрожжей в штамм E. coli Top10 [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG] с использованием стандартного протокола29 и распределяют клетки на пластины LB (Luria Broth) с необходимыми антибиотиками.
  2. Выделяют плазмиду (плазмиды) из трансформантов E. coli с использованием стандартного протоколащелочного лизиса 29 и следуют соответствующим комбинациям ферментов рестрикции для проверки высвобождения вставленного фрагмента ДНК путем рестрикционного пищеварения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Супрессорная плазмида 84 переваривалась ферментом рестрикции BamHI, а плазмида-супрессор 104 переваривалась ферментами рестрикции PstI/BamHI.
  3. Ретрансформировать плазмиды, показывающие высвобождение вставки после рестрикции пищеварения в штамме ell1Δ, чтобы проверить их способность спасать генотоксический стресс-чувствительный фенотип штамма ell1Δ.
  4. Выберите плазмидные клоны, показывающие подавление генотоксической чувствительности к стрессу, и секвенируйте вставленный фрагмент ДНК, присутствующий в этих плазмидных клонах, используя векторно-специфические прямые и обратные праймеры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании использовалась универсальная передняя грунтовка для промотора adh1 (5'CATTGGTCCCCCGCTCCG 3')30.
  5. Чтобы идентифицировать ген, ответственный за подавление, выровняйте последовательность, полученную с помощью нуклеотидного бласта NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) или инструмента выравнивания последовательности Pombase (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core). Выберите последовательность, показывающую максимальное выравнивание, и определите ее как ген плазмиды мультикопийного супрессора.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Скрининг мультикопийного супрессора (подавителей) генотоксической стресс-ассоциированной чувствительности к ell1 у S. pombe
Мы провели генетический скрининг с использованием протокола, описанного выше, для идентификации мультикопийных супрессоров фенотипа потери функции мутантного штамма ell1 deletion. Связанная с ростом чувствительность штамма делеции ell1, наблюдаемая в присутствии генотоксического агента 4-NQO, была принята в качестве фенотипа потери функции для выбора мультископических супрессоров. На рисунке 1 показано схематическое изображение генетического экрана. Для начала скрининга впервые была подтверждена генотоксическая стрессовая чувствительность мутанта делеции ell1 (h-ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1 ell1Δ :: kanMX6) в отношении его изогенного штамма дикого типа (h-ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1) в присутствии 4-NQO (рисунок 2A). Впоследствии запрос нулевого мутанта S. pombe ell1 был преобразован с помощью библиотеки s. pombe cDNA с высоким числом копий для выбора тех плазмидных клонов, которые могли бы подавить/спасти чувствительность нулевого мутанта ell1, связанную с ростом 4-NQO. Эта библиотека содержит ~6 × 10фрагментов кДНК 5S. pombe, клонированных в векторе сверхэкспрессии pLEV3 S. pombe под контролем промотора30 adh1. В качестве контроля 1/10трансформационной смеси также наносили на пластины EMM2, лишенные 4-NQO, для расчета общего числа рекомбинантных клонов, полученных после преобразования библиотеки, индикации покрытия библиотеки, и экранировали на выделение клонов супрессора. Это очень важно, так как скрининг меньшего количества клонов уменьшит возможность идентификации клонов-супрессоров. 

На рисунке 2B показаны репрезентативные изображения контрольных и 4-NQO-содержащих пластин. Как показано на рисунке, большое количество колоний получается на контрольной пластине, не имеющей 4-NQO, показывающей хороший охват библиотеки. Как и ожидалось, на пластине 4-NQO было получено меньше трансформантов, поскольку эти трансформаторы, вероятно, представляют собой предполагаемые супрессоры чувствительности 4-NQO нулевого мутанта ell1 . Затем различные колонии трансформантов, полученные на пластинах EMM2, содержащих 0,2 мкМ 4-NQO, были дополнительно растянуты или обнаружены на пластинах EMM2, содержащих 0,2 мкМ 4-NQO, чтобы подтвердить способность этих трансформантов расти в присутствии 4-NQO. Было отмечено, что 620 колоний трансформантов смогли вырасти на пластинах EMM2, содержащих 0,2 мкМ 4-NQO.

Валидация способности предполагаемых клонов-супрессоров восстанавливать рост мутанта делеции ell1 в условиях генотоксического стресса
Чтобы подтвердить предполагаемые супрессоры, важно проверить спасение желаемого фенотипа в условиях более высокой жесткости, как показано в схематическом представлении (рисунок 3A). Таким образом, 620 трансформаторов, вошедших в шорт-лист, были замечены на пластинах EMM2 с 0,4 мкМ 4-NQO. Как видно на рисунке 3B, только 74 трансформатора показали рост на 0,4 мкМ 4-NQO. Впоследствии эти 74 трансформатора были обнаружены на пластинах EMM2, содержащих 0,8 мкМ 4-NQO, и было замечено, что только 16 показали рост в присутствии 0,8 мкМ 4-NQO (рисунок 3C). Чтобы еще больше подтвердить эти наблюдения, эти 16 трансформантов были обнаружены на пластинах EMM2 с необходимыми добавками, содержащими либо 0,8 мкМ 4-NQO, либо без 4-NQO (контроль), вместе с мутантом делеции ell1 , преобразованным с пустым вектором. Результаты этих пятнистых анализов показали, что, как и ожидалось, деформация делеции ell1 , преобразованная пустым вектором, а также все 16 трансформантов показали рост на пластине, лишенной 4-NQO. Для сравнения, в то время как мутант делеции ell1 , содержащий только пустой вектор, не показал роста при 0,8 мкМ 4-NQO, шесть трансформантов продемонстрировали рост при 0,8 мкМ 4-NQO (рисунок 3D), предполагая, что клон(ы) библиотеки, присутствующий в них, обладал способностью подавлять фенотип генотоксического стресса нулевого мутанта ell1 .

Идентификация гена, закодированного клоном-супрессором
Затем мы выбрали 02 генетических супрессора штамма делеции ell1, sup 84 и sup 104, демонстрируя полное подавление ell1-ассоциированной чувствительности роста в присутствии 4-NQO. Библиотечный плазмидный клон (клоны) был выделен из этих двух дрожжевых супрессоров и преобразован в компетентные клетки E. coli. Впоследствии плазмиду выделили из клеток E. coli с использованием стандартных протоколов31. Две изолированные плазмиды, помеченные как 84 и 104, были подвергнуты рестрикционному пищеварению, которое выявило наличие примерно 1000 bp и 800 bp вставных фрагментов ДНК соответственно (рисунок 4A, B). Для дальнейшей проверки результатов этого скрининга супрессора эти плазмиды были ретрансформированы в мутант делеции ell1 и проверены, могут ли они восстановить рост нулевого мутанта ell1 в присутствии 4-NQO. Анализы стрессовых пятен показали, что клоны плазмиды-супрессоры приводили к подавлению 4-NQO-ассоциированной чувствительности роста при повторном введении в нулевой мутант ell1, предполагая, что подавление было плазмидно-зависимым (рисунок 4C). Кроме того, мы решили определить, могут ли эти клоны-супрессоры также подавлять связанную с ростом чувствительность штамма делеции ell1 в присутствии другого соединения, вызывающего повреждение ДНК, MMS. Точечные анализы показали, что трансформация клонов плазмиды-супрессора в нулевой мутант ell1 привела к большему росту на СРЕДЕ, содержащей MMS, чем трансформация мутанта делеции ell1 с пустым вектором, что указывает на то, что эти плазмидные клоны могут подавлять генотоксическую стрессовую чувствительность мутанта делеции ell1 в присутствии обоих генотоксических агентов. т.е. 4-NQO и MMS (рисунок 4D).

Далее, чтобы идентифицировать ген, присутствующий в этих клонах плазмиды-супрессора, секвенирование вставленного фрагмента ДНК проводили с использованием промотор-специфического для промотора adh1 универсального прямого праймера30. Полученная нуклеотидная последовательность была найдена с помощью инструмента «BLAST at Ensembl», доступного на веб-сайте PomBase (https://www.pombase.org), который показал, что два плазмидных клона 84 и 104 содержали гены rax2+ и osh6+ соответственно, предоставляя доказательства того, что Rax2 и Osh6 были ответственны за подавление генотоксического стресс-чувствительного фенотипа, связанного с отсутствием ell1+ в S. pombe . Знания о функциях обоих этих белков у S. pombe ограничены. Было показано, что Rax2 регулирует локализацию For3p для контроля полярности клеток во время вегетативного роста у S. pombe32. Osh6 является липидным транспортным белком, который принадлежит к семейству белков, связанных с оксистерин-связывающими белками. Он участвует в транспорте фосфатидилсерина из эндоплазматического ретикулума к плазматической мембране33.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое изображение экрана генетического мультикопийного супрессора. Этот протокол состоит из четырех основных этапов: преобразование библиотеки в мутантный штамм запроса, выбор плазмидных клонов, которые подавляют желаемый фенотип мутантного штамма запроса, извлечение плазмиды (плазмид) из этих клонов-супрессоров и идентификация гена, ответственного за подавление фенотипа. Аббревиатура: 4-NQO = 4-нитрохинолин 1-оксид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Скрининг мультикопийного супрессора (подавителей) ell1-ассоциированной генотоксической стрессовой чувствительности у S. pombe. (A) Анализ точечного напряжения, показывающий чувствительность 4-NQO ell1-исключенного штамма S. pombe по сравнению с его изогенным штаммом дикого типа. Серийные разведения (1:10) соответствующих штаммов были обнаружены на среде EMM2, содержащей по 225 мкг/мл аденина, лейцина и урацила с или без (контроль) 0,4 мкМ 4-NQO. Затем пластины инкубировали в течение 3-5 дней при 32 °C. (B) Библиотеку кДНК с высоким числом копий трансформировали в ell1-удаленный штамм S. pombe, и преобразованные колонии покрывали средой EMM2, в которой отсутствовал лейцин, но содержали 0,2 мкМ 4-NQO. Небольшая аликвота трансформационной смеси также была покрыта на пластинах EMM2, лишенных 4-NQO, в качестве контроля. Пластины инкубировали при 32 °C в течение 5-6 дней и фотографировали. На панели B показано репрезентативное изображение этих пластин. Аббревиатура: 4-NQO = 4-нитрохинолин 1-оксид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Проверка способности предполагаемых клонов-супрессоров подавлять генотоксическую стрессовую чувствительность мутанта делеции ell1 . (A) Схематическое изображение скрининга библиотечных трансформантов путем тестирования подавления желаемого фенотипа. Рост 620 трансформантов был протестирован на повышении концентрации 4-NQO путем обнаружения различных трансформаторов на пластинах EMM2, лишенных лейцина и содержащих либо (B) 0,4 мкМ 4-NQO, либо (C) 0,8 мкМ 4-NQO. Пластины инкубировали при 32 °C в течение 5-6 дней и фотографировали. Были показаны репрезентативные изображения пластин. (D) Шестнадцать трансформаторов, которые демонстрировали рост на 0,8 мкМ 4-NQO, были обнаружены на пластинах EMM2, в которых отсутствовал лейцин, но содержали либо 0,8 мкМ 4-NQO, либо не содержали 4-NQO (контроль), наряду со штаммом делеции ell1 , преобразованным с пустым вектором. Пластины инкубировали при 32 °C в течение 5-6 дней и фотографировали. Только шесть колоний продемонстрировали способность спасать ell1 делецию, связанную с генотоксической стрессовой чувствительностью. Аббревиатура: 4-NQO = 4-нитрохинолин 1-оксид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Идентификация клонов плазмиды-супрессора. Изображения агарозного геля (А) рестрикции переваривания плазмиды-супрессора 84 с ферментом рестрикции BamHI высвобождают вставку ~1 кб. (B) Супрессорная плазмида 104, переваренная ферментами рестрикции PstI/BamHI, высвобождала вставку ~800 bp. (C) 1:10 последовательно разбавленный ell1 нулевой мутант, преобразованный плазмидами, sup 84 или sup 104, был замечен на пластинах EMM2, лишенных лейцина и содержащих либо 0,4 мкМ 4-NQO, либо (D) 0,01% MMS. В контрольные пластины не было добавлено агента, повреждающего ДНК. Пластины инкубировали при 32 °C в течение 4-5 дней и фотографировали. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Состав сред для роста S. pombe. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Дрожжи широко используются для исследования основных биологических процессов и путей, которые эволюционно сохраняются в эукариотических организмах. Наличие генетических и геномных инструментов наряду с их пригодностью к различным биохимическим, генетическим и молекулярным процедурам делают дрожжи отличным модельным организмом для генетических исследований 34,35,36. На протяжении многих лет исследователи дрожжей разрабатывали различные генетические скрининги для выявления генетических взаимодействий, которые проливали бы свет на функции отдельных генов, а также на пути и биологические процессы, в которых они могут быть вовлечены 10,11,17,37. Один из распространенных и полезных экранов для идентификации генетических взаимодействий известен как «мультикопия или подавление большого числа копий».

Этот экран требует запроса мутантного штамма (штаммов), демонстрирующего фенотип потери функции, с последующим преобразованием этого мутантного штамма (штаммов) запроса с геномной библиотекой с высоким числом копий или кДНК. Впоследствии полученные трансформанты проходят скрининг для идентификации тех генов, которые при сверхэкспрессии подавляют фенотип, связанный с запросом мутантного штамма (штаммов). Этот тип генетического взаимодействия между специфическим мутантным штаммом и геном (генами), присутствующими в клонах библиотеки плазмид, приводит к выделению и идентификации генных продуктов, которые, вероятно, будут действовать в том же пути или влиять на один и тот же биологический процесс4. Таким образом, этот экран дает представление о функциях интересующего гена (генов) и их функциональной организации в путях и биологических процессах in vivo. Традиционно этот экран широко использовался в S. cerevisiae 38,39,40,41,42.

Целью настоящей работы является описание простого и понятного протокола для проведения генетического скрининга подавления мультикопии у S. pombe. Мы провели скрининг с использованием штамма S. pombe , несущего удаление коэффициента удлинения транскрипции ell1 . ELL - это семейство факторов удлинения транскрипции, которые присутствуют в широком спектре организмов, от дрожжей деления до человека. Функции Ell1 только начинают пониматься у S. pombe. Более ранняя работа подчеркивала роль Ell1 в оптимальном росте в нормальных условиях роста и в выживании во время генотоксических стрессовых состояний26. Мы использовали скрининг мультикопийных супрессоров в качестве одного из подходов к раскрытию молекулярного механизма, лежащего в основе роли Ell1 в генотоксической чувствительности к стрессу у S. pombe26. Мультикопийная библиотека кДНК S. pombe была преобразована в нулевой мутант S. pombe ell1 , который проявляет чувствительность к 4-NQO. Впоследствии были выбраны те трансформанты, которые могли расти в присутствии 4-NQO.

Выделение плазмид из этих трансформантов и секвенирование вставок, присутствующих в этих плазмидах, привело к идентификации двух новых генетических интеракторов ell1+ у S. pombe, rax2+ и osh6+. Предыдущее исследование с использованием аналогичного генетического скрининга у S. pombe также идентифицировало антимолавливающий белок epe1+ в качестве мультикопийного супрессора фенотипов43, связанных с делецией ell1. Мы также использовали этот метод при идентификации мультикопийных супрессоров несущественной субъединицы Rpb9 S. pombe РНК-полимеразы II (неопубликованные наблюдения). В совокупности эти результаты подтверждают полезность подхода к скринингу генетических мультикопийных супрессоров в качестве метода идентификации предполагаемых генов / белков, которые проявляют генетическое взаимодействие с желаемым геном, представляющим интерес, выясняя функцию, пути и процессы, в которых может быть вовлечен интересующий ген.

Чтобы использовать экран, описанный в этой работе, важно сначала иметь мутантный штамм запроса, который демонстрирует четкий фенотип, связанный с мутацией, который может быть использован для изоляции мультикопийного супрессора (ов). Кроме того, успех этого экрана будет зависеть от наличия качественной и хорошей репрезентативной библиотеки, содержащей клоны, представляющие максимальное количество генов дикого типа или соответствующих им cDNAs. Традиционно на этих экранах использовались как геномные, так и кДНК-библиотеки, но библиотеки кДНК имеют преимущество в том, что они сделаны из мРНК, экспрессированных в клетке / организме. Кроме того, высокая эффективность его превращения в дрожжевые клетки является обязательным условием для успеха экрана, поскольку важно просеивать большое количество трансформантов, увеличивая вероятность выявления супрессоров. Если после преобразования библиотеки в мутантный штамм запроса с использованием протокола ацетата лития на управляющей пластине получается меньше трансформаторов, то для преобразования библиотеки можно использовать электропорацию.

Также рекомендуется сначала стандартизировать протокол преобразования с другой плазмидой перед преобразованием библиотеки. В противном случае это приведет к излишней потере библиотеки. Протокол, описанный здесь, использует чувствительность 4-NQO в качестве мутантного фенотипа, но подходящие методы скрининга / анализы должны быть разработаны для выбора супрессоров на основе конкретного мутантного фенотипа, представляющего интерес. Если на пластине не получено или получено очень мало трансформантов для выбора для супрессоров после преобразования библиотеки в мутантный штамм запроса, то, если это возможно, при покрытии библиотеки следует использовать менее строгие условия / анализы для выбора супрессоров, чтобы обнаружить как можно больше генетических супрессоров до подтверждения тех, которые находятся в условиях высокой жесткости. В дополнение к использованию рестрикционного пищеварения для проверки наличия вставки в идентифицированных плазмидных клонах-супрессорах, ПЦР с использованием векторно-специфических праймеров может быть использована для амплиации желаемого фрагмента ДНК вставки. Альтернативно, клоны плазмиды-супрессоры могут быть непосредственно даны для секвенирования, избегая необходимости в рестрикционном пищеварении или ПЦР.

Этот экран также может быть принят для дрожжей, отличных от S. cerevisiae и S. pombe , если доступен набор генетических инструментов в отношении соответствующих мутантных штаммов, плазмид и промоторных конструкций, которые облегчают сверхэкспрессию генов, позволяя спасти мутантный фенотип, присутствующий в клетке дрожжей-хозяев. Кроме того, при наличии общегеномных ресурсов, включая коллекцию геномных мутантов делеции44 ибиблиотеки 37 сверхэкспрессии, этот экран также может быть выполнен путем преобразования одной или нескольких плазмид запроса в систематический массив коллекции штаммов мутантов дрожжей или путем преобразования систематического массива коллекции плазмид сверхэкспрессии в один или несколько мутантных штаммов запроса45 . В заключение, этот подход может быть четко обобщен на широкий спектр экспериментальных вопросов в различных организмах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась за счет исследовательского гранта Департамента биотехнологии правительства Индии (грант No. BT/PR12568/BRB/10/1369/2015) — Нимише Шарме. Авторы благодарят профессора Чарльза Хоффмана (Бостонский колледж, США) за дар библиотеки кДНК S. pombe и профессора Сьюзан Форсбург за дрожжевые плазмиды.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-NQO Sigma N8141
Acetic Acid, glacial Sigma 1371301000
Adenine Sulphate Himedia GRM033
Agar Himedia GRM026
Agarose Lonza 50004L
Ammonium Chloride Himedia MB054
BamHI Fermentas ER0051
Biotin Himedia RM095
Boric Acid Himedia MB007
Calcium Chloride  Sigma C4901
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 Sigma C0549
Citric Acid Himedia RM1023
Disodium hydrogen phospahte anhydrous Himedia GRM3960
single stranded DNA from Salmon testes Sigma D7656
EDTA disodium Sigma 324503
Ferric Chloride Hexahydrate Himedia RM6353
Glucose Amresco 188
Ionositol Himedia GRM102
Isopropanol Qualigen Q26897
Leucine Himedia GRM054
Lithium Acetatae Sigma 517992
Magnesium Chloride Hexahydrate Himedia MB040
Molybdic Acid Himedia RM690
Nicotinic Acid Himedia CMS177
PEG, MW 4000 Sigma 81240
Pentothinic Acid Himedia TC159
Phenol Himedia MB082
Plasmid Extraction Kit Qiagen 27104
Potassium Chloride Sigma P9541
Potassium hydrogen Pthallate Merc DDD7D670815
Potassium iodide Himedia RM1086
RNAse Fermentas EN0531
SDS Himedia GRM205
Sodium Hydroxide Himedia GRM1183
Sodium Sulphate Himedia RM1037
Tris free Base Himedia MB209
Uracil Himedia GRM264
Yeast Extract Powder Himedia RM668
Zinc Sulphate Heptahydrate Merc DJ9D692580

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zuk, O., Hechter, E., Sunyaev, S. R., Lander, E. S. The mystery of missing heritability: Genetic interactions create phantom heritability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1193-1198 (2012).
  2. Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. -L. V., Kruglyak, L. Finding the sources of missing heritability in a yeast cross. Nature. 494 (7436), 234-237 (2013).
  3. Bloom, J. S., et al. Genetic interactions contribute less than additive effects to quantitative trait variation in yeast. Nature Communications. 6 (1), 8712 (2015).
  4. Tong, A. H. Y., et al. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303 (5659), New York, N.Y. 808-813 (2004).
  5. Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327 (5964), New York, N.Y. 425-431 (2010).
  6. Costanzo, M., et al. A global genetic interaction network maps a wiring diagram of cellular function. Science. 353 (6306), New York, N.Y. (2016).
  7. Mullen, J. R., Kaliraman, V., Ibrahim, S. S., Brill, S. J. Requirement for three novel protein complexes in the absence of the Sgs1 DNA helicase in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (1), 103-118 (2001).
  8. Kaplan, Y., Kupiec, M. A role for the yeast cell cycle/splicing factor Cdc40 in the G1/S transition. Current Genetics. 51 (2), 123-140 (2007).
  9. Carlsson, M., Hu, G. -Z., Ronne, H. Gene dosage effects in yeast support broader roles for the LOG1, HAM1 and DUT1 genes in detoxification of nucleotide analogues. PLOS One. 13 (5), 0196840 (2018).
  10. Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Molecular Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
  11. Duffy, S., et al. Overexpression screens identify conserved dosage chromosome instability genes in yeast and human cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 9967-9976 (2016).
  12. Appling, D. R. Genetic approaches to the study of protein-protein interactions. Methods (San Diego, Calif). 19 (2), 338-349 (1999).
  13. Forsburg, S. L. The art and design of genetic screens: yeast. Nature Reviews. Genetics. 2 (9), 659-668 (2001).
  14. Kitazono, A. A., Tobe, B. T. D., Kalton, H., Diamant, N., Kron, S. J. Marker-fusion PCR for one-step mutagenesis of essential genes in yeast. Yeast (Chichester, England). 19 (2), 141-149 (2002).
  15. Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nature Reviews. Genetics. 8 (6), 437-449 (2007).
  16. Prelich, G. Suppression mechanisms: themes from variations. Trends in Genetics. 15 (7), 261-266 (1999).
  17. Li, X., et al. Multicopy suppressors for novel antibacterial compounds reveal targets and drug efflux susceptibility. Chemistry & Biology. 11 (10), 1423-1430 (2004).
  18. Apfel, C. M., et al. Peptide deformylase as an antibacterial drug target: Target validation and resistance development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1058-1064 (2001).
  19. Tsukahara, K., et al. Medicinal genetics approach towards identifying the molecular target of a novel inhibitor of fungal cell wall assembly. Molecular Microbiology. 48 (4), 1029-1042 (2003).
  20. Calabrese, D., Bille, J., Sanglard, D. A novel multidrug efflux transporter gene of the major facilitator superfamily from Candida albicans (FLU1) conferring resistance to fluconazole. Microbiology. 146 (11), 2743-2754 (2000).
  21. Cotrim, P. C., Garrity, L. K., Beverley, S. M. Isolation of genes mediating resistance to inhibitors of nucleoside and ergosterol metabolism in leishmania by overexpression/selection. Journal of Biological Chemistry. 274 (53), 37723-37730 (1999).
  22. Nodake, Y., Yamasaki, N. Some properties of a macromolecular conjugate of lysozyme prepared by modification with a monomethoxypolyethylene glycol derivative. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 64 (4), 767-774 (2000).
  23. Sunnerhagen, P. Prospects for functional genomics in Schizosaccharomyces pombe. Current Genetics. 42 (2), 73-84 (2002).
  24. Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).
  25. Sharma, N. Regulation of RNA polymerase II-mediated transcriptional elongation: Implications in human disease. IUBMB Life. 68 (9), 709-716 (2016).
  26. Sweta, K., Dabas, P., Jain, K., Sharma, N. The amino-terminal domain of ELL transcription elongation factor is essential for ELL function in Schizosaccharomyces pombe. Microbiology. 163 (11), Reading, England. 1641-1653 (2017).
  27. Murray, J. M., Watson, A. T., Carr, A. M. Transformation of Schizosaccharomyces pombe: Lithium acetate/dimethyl sulfoxide procedure. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4), 090969 (2016).
  28. Hagan, I., Carr, A. M., Grallert, A., Nurse, P. Fission yeast: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2016).
  29. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and transformation of competent E. coli using calcium chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), 3932 (2006).
  30. Janoo, R. T., Neely, L. A., Braun, B. R., Whitehall, S. K., Hoffman, C. S. Transcriptional regulators of the Schizosaccharomyces pombefbp1 gene include two redundant Tup1p-like corepressors and the CCAAT binding factor activation complex. Genetics. 157 (3), 1205-1215 (2001).
  31. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of plasmid DNA by alkaline lysis with SDS: Maxipreparation. CSH Protocols. 2006 (1), 4090 (2006).
  32. Choi, E., Lee, K., Song, K. Function of rax2p in the polarized growth of fission yeast. Molecules and Cells. 22 (2), 146-153 (2006).
  33. Eisenreichova, A., Różycki, B., Boura, E., Humpolickova, J. Osh6 revisited: Control of PS transport by the concerted actions of PI4P and Sac1 phosphatase. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 747601 (2021).
  34. Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), New York, N.Y. 1259-1260 (1997).
  35. Forsburg, S. L. The yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe: models for cell biology research. Gravitational and Space Biology Bulletin: Publication of the American Society for Gravitational and Space Biology. 18 (2), 3-9 (2005).
  36. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  37. Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nature Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
  38. Kitada, K., Johnson, A. L., Johnston, L. H., Sugino, A. A multicopy suppressor gene of the Saccharomyces cerevisiae G1 cell cycle mutant gene dbf4 encodes a protein kinase and is identified as CDC5. Molecular and Cellular Biology. 13 (7), 4445-4457 (1993).
  39. Melnykov, A. V., Elson, E. L. MCH4 is a multicopy suppressor of glycine toxicity in Saccharomyces cerevisiae. , 653444 (2019).
  40. Kosodo, Y., et al. Multicopy suppressors of the sly1 temperature-sensitive mutation in the ER-Golgi vesicular transport in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 18 (11), 1003-1014 (2001).
  41. Nakamura, T., Takahashi, S., Takagi, H., Shima, J. Multicopy suppression of oxidant-sensitive eos1 mutation by IZH2 in Saccharomyces cerevisiae and the involvement of Eos1 in zinc homeostasis: Eos1 involvement in zinc homeostasis. FEMS Yeast Research. 10 (3), 259-269 (2010).
  42. Hernández-López, M. J., García-Marqués, S., Randez-Gil, F., Prieto, J. A. Multicopy suppression screening of Saccharomyces cerevisiae identifies the ubiquitination machinery as a main target for improving growth at low temperatures. Applied and Environmental Microbiology. 77 (21), 7517-7525 (2011).
  43. Sweta, K., Sharma, N. Functional interaction between ELL transcription elongation factor and Epe1 reveals the role of Epe1 in the regulation of transcription outside heterochromatin. Molecular Microbiology. 116 (1), 80-96 (2021).
  44. Kim, D. -U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 617-623 (2010).
  45. Adames, N. R., Gallegos, J. E., Peccoud, J. Yeast genetic interaction screens in the age of CRISPR/Cas. Current Genetics. 65 (2), 307-327 (2019).

Tags

Биология Выпуск 187 Генетический скрининг Мультикопиальные супрессоры Schizosaccharomyces pombe Ell1 Регуляция генов удлинение транскрипции
Генетический скрининг для идентификации мультикопийных супрессоров в <em>Schizosaccharomyces pombe</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhardwaj, V., Sweta, K., Gyala, D.,… More

Bhardwaj, V., Sweta, K., Gyala, D., Sharma, N. Genetic Screen for Identification of Multicopy Suppressors in Schizosaccharomyces pombe. J. Vis. Exp. (187), e63967, doi:10.3791/63967 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter