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Biology

समर्थित लिपिड बाइलेयर पर मेम्ब्रेन-टेथर्ड मिनिमल एक्टिन कॉर्टिक्स का पुनर्गठन

Published: July 12, 2022 doi: 10.3791/63968
Automatic Translation
1, 2, 2, 2
1Centre for Mechanochemical Cell Biology and Division of Biomedical Sciences, Warwick Medical School, University of Warwick, 2National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research

Summary

यह प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पुनर्गठित, झिल्ली-टेथर्ड साइटोस्केलेटल नेटवर्क की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए समर्थित लिपिड बाइलेयर के गठन और साइटोस्केलेटल फिलामेंट्स और मोटर प्रोटीन के अतिरिक्त का वर्णन करता है।

Abstract

एक जीवित कोशिका की सतह कई सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए एक बहुमुखी सक्रिय मंच प्रदान करती है, जो अंतर्निहित एक्टिन कॉर्टेक्स के साथ प्लाज्मा झिल्ली के अंतःक्रिया से उत्पन्न होती है। पिछले दशकों में, एक्टिन फिलामेंट नेटवर्क के साथ संयोजन में समर्थित लिपिड बाइलेयर पर आधारित पुनर्गठित, न्यूनतम प्रणालियां झिल्ली-टेथर्ड एक्टिन नेटवर्क के बुनियादी तंत्र और परिणामों को उजागर करने के साथ-साथ व्यक्तिगत झिल्ली से जुड़े प्रोटीन के कार्यों का अध्ययन करने में बहुत महत्वपूर्ण साबित हुई हैं। यहां, हम वर्णन करते हैं कि विट्रो में ऐसे सक्रिय समग्र प्रणालियों का पुनर्गठन कैसे किया जाए जिसमें द्रव समर्थित लिपिड बाइलेयर होते हैं जो झिल्ली से जुड़े एक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन के माध्यम से गतिशील एक्टिन फिलामेंट्स और मायोसिन मोटर्स के लिए युग्मित होते हैं जिन्हें कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के माध्यम से आसानी से देखा जा सकता है। एक ओपन-चैंबर डिज़ाइन सिस्टम को चरण-दर-चरण तरीके से इकट्ठा करने और लिंकर प्रोटीन एकाग्रता, एक्टिन एकाग्रता, एक्टिन फिलामेंट लंबाई, एक्टिन / मायोसिन अनुपात, साथ ही एटीपी स्तर जैसे कई मापदंडों को व्यवस्थित रूप से नियंत्रित करने की अनुमति देता है। अंत में, हम चर्चा करते हैं कि सिस्टम की गुणवत्ता को कैसे नियंत्रित किया जाए, आमतौर पर होने वाली समस्याओं का पता कैसे लगाया जाए और समस्या निवारण कैसे किया जाए, और जीवित कोशिका की सतह की तुलना में इस प्रणाली की कुछ सीमाएं।

Introduction

एक जीवित पशु कोशिका की प्लाज्मा झिल्ली लगातार आसन्न एक्टिन साइटोस्केलेटन के साथ बातचीत करती है, और साथ में वे एक सक्रिय समग्र सामग्री बनाते हैं जो सेलुलर कार्यों की भीड़ को पूरा करता है 1,2. इस लिपिड झिल्ली-एक्टिन इंटरफ़ेस पर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, समर्थित लिपिड बाइलेयर (एसएलबी) के शीर्ष पर साइटोस्केलेटल नेटवर्क का पुनर्गठन बहुत मददगार साबित हुआ है। यह न्यूनतम सिस्टम दृष्टिकोण साइटोस्केलेटन नेटवर्क घटकों और लिपिड संरचना के सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है। विशाल यूनिलैमेलर पुटिकाओं के मुक्त-स्थायी लिपिड झिल्ली की तुलना में, एसएलबी की प्लानर ज्यामिति अत्याधुनिक माइक्रोस्कोपी तकनीकों जैसे सुपर-रिज़ॉल्यूशन3,4, कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) 5,6,7, या इंटरफेरोमेट्रिक प्रकीर्णन8 के कुशल उपयोग की अनुमति देती है। साइटोस्केलेटल नेटवर्क के स्थानिक संगठन और गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए। टीआईआरएफ फ्लोरोसेंटली लेबल वाले घटकों के लिए उच्चतम कंट्रास्ट प्रदान करता है, क्योंकि पृष्ठभूमि संकेत में योगदान देने वाले समाधान में अनबाउंड लेबल अणुओं का संकेत न्यूनतम है।

यहां, हम समर्थित लिपिड बाइलेयर से जुड़े एक्टोमायोसिन नेटवर्क के गठन के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो सक्रिय, अर्ध-2 डी नेटवर्क 9,10,11 की भौतिकी और झिल्ली संगठन 3,5,12,13,14,15,16 पर उनके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से क्षेत्र में उपयोग किए जाते हैं (चित्रा 1)। ). यह दृष्टिकोण एक्टिन-आधारित नेटवर्क तक सीमित नहीं है, बल्कि सूक्ष्मनलिकाएं, मध्यवर्ती फिलामेंट्स, या मिश्रित प्रकृति के समग्र नेटवर्क का पता लगाने और सतह-संवेदनशील माइक्रोस्कोपी विधियों का उपयोग करके लिपिड झिल्ली प्रोटीन और साइटोस्केलेटल घटकों के बीच विभिन्न प्रकार की बातचीत का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल को केंद्रित रखने के लिए, हमने एक्टिन और मायोसिन प्रोटीन के शुद्धिकरण और लेबलिंग का विस्तृत विवरण या एक्टोमायोसिन नेटवर्क के अनुबंध और संगठन को ट्यून और नियंत्रित करने के तरीके के बारे में विवरण को बाहर रखा है। किसी को अन्य प्रोटोकॉल का उल्लेख करना चाहिए जो इसके साथ प्रकाशित होते हैं जो जोवे मेथड्स कलेक्शन, बायोमैटेरियल्स, बायोफिज़िक्स और एक्टिव मैटर रिसर्च17 के लिए साइटोस्केलेटन नेटवर्क के इन विट्रो पुनर्गठन में प्रकाशित होते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: इन विट्रो एक्टिन-झिल्ली सक्रिय समग्र प्रणाली का योजनाबद्ध। बायोरेंडर के साथ बनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Protocol

1. अभिकर्मक और उपकरण

  1. तालिका 1 में सूचीबद्ध ताजा बफर तैयार करें। 25 डिग्री सेल्सियस पर 18.2 M.cm की प्रतिरोधकता के साथ अल्ट्राप्योर, विआयनीकृत पानी का उपयोग करें। वैक्यूम के तहत 0.22 μm फिल्टर के माध्यम से पारित करके सभी बफर को निष्फल करें। कॉलम क्रोमैटोग्राफी के लिए उपयोग किए जाने वाले बफर को डेगास करें।
  2. कंकाल की मांसपेशी एक्टिन को शुद्ध करें जैसा कि पहलेवर्णित 18,19 है। अंतिम शुद्ध जी-एक्टिन समाधान में 20% ग्लिसरॉल जोड़ें और 500 μL (लेबलिंग या थोक प्रयोगों के लिए) और 10 μL (व्यक्तिगत प्रयोगों के लिए) मात्रा के एलिकोट बनाएं। फ्लैश ट्यूबों को तरल नाइट्रोजन में 30 सेकंड के लिए डुबोकर एलिकोट को फ्रीज करें और फिर उन्हें 18 महीने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, शुद्ध एक्टिन या एसीटोन पाउडर व्यावसायिक रूप से खरीदा जा सकता है।
  3. किसी भी फ्लोरोसेंट मैलिमाइड रंगों के साथ शुद्ध कंकाल की मांसपेशी जी-एक्टिन को लेबल करें जैसा कि पहले वर्णितहै। एक्टिन के लिए सही ए290 एनएम (एक्टिन = 26,600 एम -1सेमी -1) और डाई के ए 20मैक्स का उपयोग करके स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा प्रोटीन की एकाग्रता और लेबलिंग की डिग्री निर्धारित करें। ट्यूबों को 30 सेकंड के लिए तरल नाइट्रोजन में डुबोकर 10 μL और फ्लैश फ्रीज के एलिकोट बनाएं और 18 महीने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: लाइसिन-वैवाहिक एनएचएस-एस्टर के साथ लेबलिंग गैर-कार्यात्मक एक्टिन बनाएगी और इससे बचा जाना चाहिए।
  4. प्रोटोकॉल20 का पालन करके कंकाल की मांसपेशी मायोसिन II को शुद्ध करें। प्रोटीन21 के शुद्धता स्तर को निर्धारित करने के लिए 10% पॉलीक्रिलामाइड जेल का उपयोग करके एसडीएस-पेज चलाएं। शुद्ध कंकाल की मांसपेशी मायोसिन -2 को 50% ग्लिसरॉल के साथ मायोसिन II बफर में तरल रूप में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: संग्रहीत मायोसिन II का उपयोग 2 साल तक किया जा सकता है।
  5. किसी भी फ्लोरोसेंट मैलिमाइड रंगों के साथ शुद्ध मायोसिन -2 लेबल करें जैसा कि पहले वर्णितहै। एनएचएस-एस्टर रंगों के साथ मायोसिन मोटर्स को लेबल करने से बचें। डाई के मायोसिन II के सही ए280 एनएम और ए 280 एनएम का उपयोग करके स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा लेबलिंगकी एकाग्रता और डिग्री निर्धारित करें। पुनर्नवीनीकरण मायोसिन II (अंधेरे या लेबल) को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और 6 सप्ताह के भीतर उपयोग करें।
  6. कैपिंग प्रोटीन का शुद्धिकरण
    1. पहले प्रोटोकॉल22 का पालन करके मुराइन कैपिंग प्रोटीन प्राप्त करें। प्रोटीन के शुद्धता स्तर को निर्धारित करने के लिए 10% पॉलीक्रिलामाइड जेल का उपयोग करके एसडीएस-पेज चलाएं। कैपिंग प्रोटीन के280 एनएम (εसीपी = 99,530 एम -1 सेमी -1) का उपयोग करके एकाग्रता को मापें।
    2. प्रोटीन समाधान में 20% ग्लिसरॉल जोड़ें और 200 μL पीसीआर ट्यूबों में 5 μL एलिकोट बनाएं। ट्यूबों को तरल नाइट्रोजन में डुबोएं और उन्हें 2 साल तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: कैपिंग प्रोटीन गतिविधि को विभिन्न कैपिंग प्रोटीन मात्राओं की उपस्थिति में फ्लोरोसेंट जी-एक्टिन की निश्चित मात्रा को पॉलीमराइज करके जांचा जाता है। फिलामेंट्स को तब एक माइक्रोस्कोप के तहत चित्रित किया जाता है, और उनकी लंबाई वितरण की मात्रा निर्धारित की जाती है। कैपिंग प्रोटीन की सापेक्ष एकाग्रता जितनी अधिक होगी, एक्टिन फिलामेंट वितरण उतना ही छोटा होगा। कोस्टर एट अल.5 देखें।
  7. एक फ्लोरोसेंट झिल्ली-एक्टिन लिंकर प्रोटीन व्यक्त करें, उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल के लिए 10xHis-YFP-EzrinABD (HYE) का उपयोग करें, इसे Bl21DE3 * एस्चेरिचिया कोलाई में व्यक्त करें, और जैसा कि पहले वर्णितकिया गया है। स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा प्रोटीन की एकाग्रता निर्धारित करें।
  8. प्रोटीन को जेल-निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी बफर (या किसी अन्य उपयुक्त बफर) में -80 डिग्री सेल्सियस पर 20% ग्लिसरॉल के साथ छोटे एलिकोट में स्टोर करें। इन स्थितियों के तहत, प्रोटीन 2 साल से अधिक समय तक स्थिर होता है।
    नोट: एक्टिन-झिल्ली लिंकर प्रोटीन और फ्लोरोसेंट मार्कर की पसंद उस प्रश्न के प्रकार पर निर्भर करती है जिसे कोई संबोधित कर रहा है। पिछले वर्षों में लिपिड-लिंकिंग रणनीतियों की एक विस्तृत श्रृंखला विकसित की गई है जिसमें हिस्टिडाइन-टैग प्रोटीन24, बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन25 और एकल-फंसे डीएनए26 शामिल हैं।
  9. बहु-लैमेलर पुटिकाओं (एमएलवी) की तैयारी
    नोट: एमएलवी से समर्थित लिपिड बाइलेयर तक वर्कफ़्लो चित्रा 2 में दर्शाया गया है।
    1. 200 एमएल ग्लास बीकर में 5-10 एम्बर ग्लास शीशियां रखें। बीकर को 2% सफाई समाधान के साथ भरें, बस कांच की शीशियों को डुबोने के लिए पर्याप्त है। उन्हें पूर्ण पल्स और 65 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए पानी के स्नान में रखें।
    2. शीशियों को घोल से निकालें और उन्हें आसुत जल से अच्छी तरह से धो लें। शीशियों को एक ग्लास बीकर में रखें जिसमें 2 एन एनओएच और सोनिकेट 20 मिनट के लिए हो। इस चरण के दौरान कोई हीटिंग की आवश्यकता नहीं है।
    3. एनएओएच घोल से शीशियों को निकालें और आसुत जल से अच्छी तरह से कुल्ला करें। 2 घंटे या उससे अधिक समय के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सेट गर्म हवा ओवन के अंदर शीशियों को सुखाएं।
    4. साफ शीशियों को पारदर्शी फिल्म के साथ सील किए गए एक साफ बीकर में 6 सप्ताह तक स्टोर करें।
      चेतावनी: रासायनिक फ्यूम हुड के अंदर निम्नलिखित चरणों का पालन करें। प्लास्टिक द्वारा संदूषण से बचने के लिए गैस-तंग हैमिल्टन ग्लास सिरिंज के साथ क्लोरोफॉर्म और लिपिड समाधान को संभालें।
    5. हैमिल्टन सिरिंज और कुछ एम्बर ग्लास शीशियों को शुद्ध क्लोरोफॉर्म के साथ कई बार धोएं। -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से ग्लास एम्प्यूल्स में संग्रहीत लिपिड पाउडर लें और लिपिड पाउडर को 10-25 मिलीग्राम / एमएल की सांद्रता में भंग करने के लिए पर्याप्त मात्रा में क्लोरोफॉर्म जोड़ें।
    6. घोल को एम्प्यूल से ताजा साफ किए गए एम्बर ग्लास शीशी में स्थानांतरित करें और इसे उचित रूप से लेबल करें। क्लोरोफॉर्म के वाष्पीकरण को कम करने के लिए बर्फ पर यह चरण करें।
    7. 10-25 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता के साथ डीओपीसी स्टॉक समाधान बनाएं और 1-10 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता के साथ डीजीएस-एनटीए-एनआई2 + बनाएं।
    8. एक कार्यशील लिपिड मिश्रण बनाने के लिए, एक साफ कांच की शीशी लें और इसे क्लोरोफॉर्म के साथ 2 गुना कुल्ला करें। घटकों के बेहतर मिश्रण के लिए आधार के रूप में काम करने के लिए शीशी में शुद्ध क्लोरोफॉर्म का 300 μL जोड़ें। यह लिपिड की अंतिम सांद्रता को प्रभावित नहीं करेगा क्योंकि अगले चरणों में सभी क्लोरोफॉर्म सूख जाएंगे।
    9. वांछित कार्यशील लिपिड मिश्रण बनाने के लिए शीशी में स्टॉक लिपिड समाधान की मापी गई मात्रा जोड़ें। लिपिड पुनर्जलीकरण बफर में लक्ष्य लिपिड एकाग्रता 4 एमएम है। कमरे के तापमान पर रासायनिक हुड के अंदर एन2 गैस की धीमी धारा के तहत लिपिड मिश्रण को सुखाएं। यह चरण प्रत्येक शीशी के लिए 30 मिनट तक ले सकता है।
    10. सभी विलायक के सूख जाने के बाद, क्लोरोफॉर्म के किसी भी निशान को हटाने के लिए कमरे के तापमान पर लिपिड फिल्म को >2 घंटे के लिए वैक्यूम-डिसिकेट करें। 4 एमएम की अंतिम लिपिड एकाग्रता के लिए लिपिड पुनर्जलीकरण बफर में डिसिकेटेड लिपिड मिश्रण को फिर से निलंबित करें।
    11. लिपिड के पुनर्जलीकरण की अनुमति देने के लिए 5-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। वोर्टेक्स एमएलवी बनाने के लिए लगभग 30 सेकंड के लिए लिपिड समाधान है।
    12. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में एमएलवी के 0.5-1 एमएल एलिकोट बनाएं। ट्यूबों को तरल नाइट्रोजन में डुबोएं, एक पारदर्शी फिल्म के साथ सील करें, और -20 डिग्री सेल्सियस (6 सप्ताह तक) पर स्टोर करें।
      नोट: लिपिड स्टॉक सांद्रता को पर्याप्त रूप से बड़ी मात्रा की अनुमति देने के लिए चुना जाता है जो हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग करके विश्वसनीय पिपेटिंग की अनुमति देता है। यदि स्टॉक बनाने के लिए आवश्यक मात्रा सूखे लिपिड पाउडर को भंग करने के लिए बहुत बड़ी है, तो विभिन्न लिपिड के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मिश्रण को सुनिश्चित करने के लिए स्टॉक के कई कमजोर पड़ने बनाएं।
  10. छोटे यूनिलैमेलर पुटिकाओं (एसयूवी) की तैयारी
    1. -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण से एमएलवी का एक एलिकोट निकालें और इसे कमरे के तापमान पर पिघलाएं। फ्लैश माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को तरल नाइट्रोजन में 15-30 सेकंड के लिए डुबोकर पुटिकाओं को फ्रीज करें और तुरंत इसे 45 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान सेट में रखें जब तक कि समाधान पूरी तरह से पिघल न जाए (1-2 मिनट)। उपरोक्त फ्रीज-पिघलना चक्र 10x-15x को तब तक दोहराएं जब तक कि समाधान कम खराब न दिखे।
      नोट: समान लिपिड मिश्रण की अनुमति देने के लिए लिपिड मिश्रण के संक्रमण तापमान से अधिक पानी के स्नान का तापमान निर्धारित करें।
    2. एसयूवी रिहाइड्रेशन बफर के साथ 80 एनएम पोर आकार पॉली कार्बोनेट फिल्टर झिल्ली से सुसज्जित एक सिरिंज-आधारित मिनी एक्सट्रूडर को बराबर करें। सुनिश्चित करें कि सिस्टम में कोई रिसाव या बुलबुले नहीं हैं। जबकि एक्सट्रूज़न विधि न्यूनतम लिपिड क्षति के साथ मोनोस्प्रेट एसयूवी पैदा करती है, नकारात्मक चार्ज के साथ लिपिड मिश्रण पॉली कार्बोनेट झिल्ली से चिपक सकते हैं।
    3. धीरे से पिघले हुए लिपिड समाधान को पूर्व-समतुल्य एक्सट्रूडर के माध्यम से एक तरफ से दूसरी तरफ और फिर वापस पास करें। चक्र को 5x-10x तब तक दोहराएं जब तक कि लिपिड समाधान स्पष्ट रूप से स्पष्ट न हो जाए, जो ~ 100 एनएम व्यास के साथ एसयूवी के गठन का संकेत देता है।
    4. लिपिड मलबे को नीचे निकालने के लिए 60 मिनट के लिए 15,000 x g पर एक्सट्रूडेड सस्पेंशन (या टिप-सोनिकेट समाधान; नीचे नोट देखें) को सेंट्रीफ्यूज करें। गोली को परेशान किए बिना और बुलबुले बनाए बिना समाधान के शीर्ष 80% एकत्र करें। एसयूवी युक्त सुपरनैटेंट को एक ताजा माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 6 दिनों तक बर्फ पर स्टोर करें।
      नोट: सेंट्रीफ्यूजेशन का एक विकल्प टिप सोनिकेशन निम्नानुसार किया जाता है। एक माइक्रोटिप सोनिकेटर चालू करें और निम्नलिखित सेटिंग्स सेट करें: आयाम = अधिकतम का 30%, ऑन टाइम = 10 एस, ऑफ टाइम = 60 एस। माइक्रो-सोनिकेटर की नोक को विआयनीकृत पानी के साथ साफ करें, इसके बाद 2 एन एनओएच, क्लोरोफॉर्म, और फिर से विआयनीकृत पानी। इन समाधानों में से प्रत्येक में सोनिकेटर टिप को डुबोएं और उपरोक्त सेटिंग्स का उपयोग करके 1-2 चक्रों के लिए सोनिकेट करें। फ्रीज-पिघले हुए पुटिका समाधान में साफ नोक को डुबोएं और बर्फ पर 3-6 चक्रों के लिए सोनिकेट करें जब तक कि समाधान स्पष्ट न हो जाए।
    5. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, उच्च लिपिड गिरावट या असफल लिपिड एक्सट्रूज़न के संकेतों की जांच करें क्योंकि एक पतली सफेद फिल्म और / या स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाली गोली का गठन होता है। इन मामलों में, आगे न बढ़ें और एसयूवी तैयार करने के चरणों को फिर से दोहराएं।
      नोट: एसयूवी की शेल्फ लाइफ विभिन्न लिपिड मिश्रणों के लिए भिन्न हो सकती है। डीओपीसी से बनी एसयूवी: डीजीएस-एनटीए-नी2+ इन प्रयोगों के प्रयोजनों के लिए 6 दिनों तक स्थिर हैं। सामान्य समस्याओं को हल करने के लिए युक्तियाँ तालिका 2 में पाई जा सकती हैं।

Figure 2
चित्रा 2: मल्टीलैमेलर पुटिकाओं और छोटे यूनिलैमेलर पुटिकाओं को तैयार करने से लेकर समर्थित लिपिड बाइलेयर के गठन तक वर्कफ़्लो को दिखाने वाला योजनाबद्ध। बायोरेंडर के साथ बनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. झिल्ली-टेथर्ड एक्टिन नेटवर्क का पुनर्गठन

  1. नमूना कक्षों की तैयारी
    1. 3-5 आयताकार ग्लास कवरलिप लें और उन्हें कोप्लिन जार के अंदर रखें। स्नान सोनिकेटर चालू करें और तापमान को 65 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। कवरलिप्स को पूरी तरह से जलमग्न करने के लिए कोप्लिन जार को 2% सफाई समाधान के साथ भरें और इसे पूर्ण पल्स मोड पर 30 मिनट के लिए सोनिकेटर में रखें।
    2. जार से कवरलिप्स को एक-एक करके हटाने के लिए कुंद पीटीएफई-लेपित फोर्स का उपयोग करें। उन्हें आसुत जल से अच्छी तरह से धो लें और उन्हें 2 एन एनएओएच से भरे एक अन्य कोप्लिन जार में रखें।
    3. पूर्ण पल्स मोड पर 20 मिनट के लिए कवरलिप्स को सोनिकेट करें। कवरलिप्स को एक-एक करके हटा दें, आसुत पानी से अच्छी तरह से कुल्ला करें, और आसुत पानी से भरे दूसरे कोप्लिन जार में रखें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, कवरलिप्स को आसुत जल में 20 मिनट के लिए रखें और फिर उन्हें आसुत जल से फिर से धो लें।
    4. प्रयोग शुरू करने से तुरंत पहले, एन2 गैस की आपूर्ति के साथ फिट किए गए रासायनिक हुड में कवरलिप्स युक्त जार लें।
    5. परीक्षण और त्रुटि द्वारा एन2 गैस स्ट्रीम के हवा के दबाव को अनुकूलित करें ताकि यह इसे तोड़ने के बिना कवरस्लिप सतह से पानी को विस्थापित करने के लिए पर्याप्त हो। कवरस्लिप को तोड़ने की संभावना को कम करने के लिए कवरस्लिप विमान के समानांतर एन2 गैस के प्रवाह को संरेखित करें।
    6. एन2 स्ट्रीम के नीचे उन्हें सुखाने के लिए जार से एक-एक करके कवरलिप्स को हटाने के लिए दस्ताने और फोर्स का उपयोग करें। प्रत्येक कवरस्लिप के दोनों किनारों को सुखाएं और उन्हें कवर के साथ एक साफ प्लास्टिक ग्रिड पर रखें। हवा में धूल के कणों के संपर्क से बचने के लिए कवरलिप्स के साथ बॉक्स को एक डेसिकेटर में रखें।
      नोट: एन2-सूखे कवरलिप्स को एक डेसिकेटर में संग्रहीत किया जा सकता है जहां वे 2 दिनों तक हाइड्रोफिलिक रह सकते हैं। यह रणनीति उपयोगी हो सकती है जब प्रयोग के लिए कई बाइलेयर की आवश्यकता होती है या यदि प्रयोग में 8 घंटे से अधिक समय लगता है।
    7. ऑटोक्लेव पीसीआर ट्यूब लें और एक तेज सर्जिकल ब्लेड के साथ उनके ढक्कन और निचले शंक्वाकार हिस्सों को काट लें। बेलनाकार आधा कट ट्यूबों को एक-एक करके लें, प्रत्येक कट ट्यूब के चिकनी रिम पर यूवी इलाज योग्य चिपकने वाला लागू करें, और इसे ताजा साफ किए गए कवरस्लिप पर उल्टा रखें ताकि रिम कवरस्लिप पर सपाट बैठे।
    8. कवरस्लिप पर स्थित होने के बाद सिलेंडर को पार्श्व रूप से न हिलाएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि गोंद कक्ष के केंद्रीय स्थान पर न फैले। आयताकार कवरलिप आराम से तीन प्रतिक्रिया कक्षों को समायोजित कर सकते हैं, और गोल लोग केंद्र में केवल एक को समायोजित कर सकते हैं (चित्रा 1)।
    9. ओ2 आपूर्ति और वैक्यूम (या यूवी इलुमिनेटर का उपयोग करें) के साथ यूवी ओजोन क्लीनर के अंदर चैंबर-असर कवरलिप्स रखें। यूवी प्रकाश चालू करें और चिपकने वाले को बहुलक बनाने की अनुमति देने के लिए 3-5 मिनट के लिए रोशन करें। कवर ग्लास की हाइड्रोफिलिसिटी में सुधार करने के लिए लंबी रोशनी (10-15 मिनट) करें और इसलिए, लिपिड बाइलेयर की गुणवत्ता।
    10. हवा में धूल के कणों के संपर्क को कम करने के लिए पारदर्शी फिल्म में लपेटे गए छोटे प्लास्टिक बक्से (जैसे खाली आयताकार कवरस्लिप बॉक्स) के अंदर 8 घंटे तक सूखे यूवी-रोशन नमूना कक्षों को स्टोर करें।
      नोट: यूवी प्रकाश की उपस्थिति में ओ2 की एक स्थिर धारा ओजोन और ऑक्सीजन कण बनाती है जो कवरस्लिप की सतह से कार्बनिक अशुद्धियों को हटा सकती है। एक वैक्यूम प्रक्रिया के दौरान बनने वाले विषाक्त ओजोन के रिसाव को रोक देगा।
    11. कवरलिप्स को बाहर निकालें और उन्हें आसुत पानी से भरकर रिसाव के लिए कक्षों का परीक्षण करें। प्रत्येक कक्ष ~ 150 μL नमूना तक पकड़ सकता है। लीक कक्षों को छोड़ दें।
      नोट: एक और महान और सुरक्षित सफाई विकल्प प्लाज्मा क्लीनर है। समय और पावर सेटिंग्स मॉडल पर निर्भर करती हैं, लेकिन सुनिश्चित करें कि प्लाज्मा के साथ ग्लास स्लाइड्स को ओवरट्रीट न करें क्योंकि इसके परिणामस्वरूप लिपिड गतिशीलता में कमी आएगी। सतह उपचार लिपिड27 की गतिशीलता को प्रभावित कर सकता है, जैसा कि सफाई समाधान (>45 मिनट) या एनएओएच (>30 मिनट) के साथ लंबे समय तक उपचार के साथ देखा गया है।
  2. समर्थित लिपिड बाइलेयर की तैयारी
    1. किसी भी सतह संदूषकों को हटाने के लिए प्रत्येक कक्ष को एसएलबी गठन बफर (या 1x PBS) के साथ धोएं, अंत में 100 μL बफर छोड़ दें। मात्रा में परिवर्तन को पुन: ट्रैक करने के लिए एक स्थायी मार्कर के साथ बफर के स्तर को 100 μL पर चिह्नित करें।
    2. कक्ष में 0.1 M CaCl2 का 2 μL जोड़ें। यह कांच की सतह पर पुटिकाओं के सोखने में सुधार करता है, अगले चरण में बाइलेयर गठन को बढ़ाता है। प्रत्येक कक्ष में एसयूवी समाधान (चरण 1.10 से) का 8 μL जोड़ें और 25 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: जोड़े जाने वाले एसयूवी मिश्रण की मात्रा का अनुमान लिपिड की कुल संख्या (0.72 एनएम2 के औसत क्षेत्र के साथ) की गणना करके लगाया जा सकता है जो दो लिपिड परतों के साथ कुएं के उजागर हाइड्रोफिलिक क्षेत्र को पूरी तरह से कवर करने के लिए आवश्यक हैं।
    3. अनबाउंड पुटिकाओं को एक्टिन गतिशीलता बफर (1x KMEH) के साथ धो लें। सबसे पहले, एसएलबी गठन बफर के 50 μL को हटा दें, नमूना कक्ष में केवल 50 μL छोड़ दें। दूसरा, कक्ष में 1x KMEH के 100 μL जोड़ें। धीरे से मिलाएं और फिर नीचे को छूने के बिना बफर के 100 μL को हटा दें।
      नोट: धोते समय कोमल होना महत्वपूर्ण है। सुनिश्चित करें कि पिपेट टिप कक्ष के निचले हिस्से को नहीं छूता है। पिपेट को कक्ष की दीवार पर बफर के प्रवाह को निर्देशित करने के लिए झुकाकर रखें और सीधे बाइलेयर पर नहीं, क्योंकि प्रत्यक्ष प्रवाह बाइलेयर को बाधित कर सकता है। पाइपिंग के दौरान किसी भी हवा के बुलबुले को पेश न करने के लिए सावधान रहें क्योंकि हवा लिपिड बाइलेयर तक पहुंच सकती है और इसमें दोष पैदा कर सकती है।
    4. 1x KMEH के 100 μL जोड़कर और 100 μL को हटाकर वॉश को 10x दोहराएं।
    5. बाईलेयर में 1 mg/mL β-कैसिइन का 10° L जोड़ें, धीरे से मिलाएं और 5-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। β-कैसिइन कवरस्लिप पर उन क्षेत्रों को अवरुद्ध करता है जहां बाइलेयर का निर्माण नहीं हुआ है। चरण 2.2.3 में वर्णित 1x KMEH के साथ β-कैसिइन 3x को धो लें। और बफर स्तर को 100 μL के निशान पर वापस लाएं।
  3. झिल्ली-एक्टिन लिंकर के अतिरिक्त
    1. β-कैसिइन इनक्यूबेशन (चरण 2.2.5.) के दौरान, -80 डिग्री सेल्सियस से झिल्ली-एक्टिन लिंकर प्रोटीन का एक एलिकोट निकालें, इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर जल्दी से पिघलाएं, और फिर इसे बर्फ पर रखें। प्रोटीन कमजोर पड़ने वाले बफर के साथ एलिकोट को 1 μM की एकाग्रता तक पतला करें।
    2. एक परिभाषित अंतिम एकाग्रता (आमतौर पर 5-20 एनएम) पर लिंकर प्रोटीन जोड़ें और धीरे से मिलाएं। कक्ष में प्रोटीन का तेजी से संतुलन सुनिश्चित करने के लिए, लिंकर प्रोटीन को 1x KMEH के साथ प्रीमिक्स करके 20 μL से बड़े वॉल्यूम जोड़ें।
    3. कमरे के तापमान पर 40 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। अनबाउंड एचएसई प्रोटीन को हटाने के लिए 1x KMEH बफर के साथ 3x धोएं (चरण 2.2.3 में)। प्रत्येक कक्ष में बफर स्तर को 100 μL चिह्न पर वापस लाएं। नमूना अब इमेजिंग के लिए तैयार है।
  4. लिपिड बाइलेयर की गुणवत्ता का आकलन
    नोट: यह एक वैकल्पिक कदम है जिसे हर बार निष्पादित करने की आवश्यकता नहीं है। हम अनुशंसा करते हैं कि यह मूल्यांकन हर बार फ्रोजन एमएलवी स्टॉक से ताजा एसयूवी बनाने पर किया जाए।
    1. माइक्रोस्कोप, उत्तेजना लेजर और डिटेक्शन कैमरों को चालू करें। सुनिश्चित करें कि लेजर संरेखित है, उद्देश्य साफ किया गया है, और सॉफ्टवेयर छवियों को प्राप्त करने के लिए तैयार है।
    2. 100x उद्देश्य पर तेल डालें, माइक्रोस्कोप चरण पर नमूना माउंट करें, और बाईलेयर पर उद्देश्य पर ध्यान केंद्रित करें। सुनिश्चित करें कि लेजर की स्थिति ऐसी है कि यह नमूने पर कुल आंतरिक प्रतिबिंब से गुजरता है। बाइलेयर-बाउंड 10xHis-YFP-EzrinABD के प्रतिदीप्ति तीव्रता वितरण की जांच करने के लिए 488 एनएम उत्तेजना लेजर का उपयोग करें।
      नोट: अच्छी गुणवत्ता वाले बाइलेयर प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक बड़े पैमाने पर, समान वितरण दिखाते हैं। खराब बाइलेयर तीव्र और पैची फ्लोरोसेंट धब्बे दिखाते हैं।
    3. बाइलेयर की अखंडता निर्धारित करने के लिए, एक एफआरएपी परख करें।
      1. बाईलेयर पर रुचि के क्षेत्र का चयन करें और इमेजिंग स्थितियों का उपयोग करके दृश्य के क्षेत्र की कुछ छवियों को रिकॉर्ड करें जो 5: 1 या उससे अधिक का सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्रदान करते हैं। रिकॉर्डिंग को रोकें और टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप के क्षेत्र डायाफ्राम को बंद करें ताकि फ्लोरोफोरे को स्थानीय रूप से ब्लीच करने के लिए बाईलेयर के एक छोटे से गोलाकार क्षेत्र पर एक केंद्रित लेजर बीम पर ध्यान केंद्रित किया जा सके।
      2. 3-10 सेकंड के लिए छोटे क्षेत्र को फोटोब्लीच करने के लिए लेजर को अपने अधिकतम आउटपुट पर चालू करें और फिर लेजर को बंद करें। क्षेत्र डायाफ्राम को उसके मूल त्रिज्या में फिर से खोलें, इमेजिंग स्थिति को वापस (पूर्व-ब्लीच) सेटिंग्स में बदलें, और तुरंत दृश्य के क्षेत्र में फ्लोरोसेंट सिग्नल की वसूली को रिकॉर्ड करने के लिए फिर से शुरू करें।
    4. जांचें कि क्या बाइलेयर तरल पदार्थ है। सामान्य पार्श्व प्रसार के साथ अच्छे बाइलेयर तेजी से ठीक हो जाते हैं, जबकि खराब बाइलेयर धीरे-धीरे ठीक हो जाते हैं या बिल्कुल ठीक नहीं होते हैं (चित्रा 3)। यदि बाइलेयर पुनर्प्राप्त नहीं हो रहा है, तो समस्या निवारण अनुभाग की जाँच करें और पुनरारंभ करें। छवियों को 16-बिट TIFF फ़ाइलों के रूप में सहेजें। प्रसार गुणांक के मात्रात्मक आकलन के लिए, चरण 3 की जांच करें। नीचे।
  5. फ्लोरोसेंट एक्टिन का पोलीमराइजेशन
    नोट: समय बचाने के लिए, बाइलेयर (चरण 2.3.) के लिए एचएसई प्रोटीन बाइंडिंग के इनक्यूबेशन समय के दौरान या बाईलेयर (चरण 2.4.) के गुणवत्ता मूल्यांकन के दौरान एक्टिन को पॉलीमराइज करना शुरू करें।
    1. 10: 1 मोलर अनुपात में अनलेबल और फ्लोरोसेंटली लेबल वाले जी-एक्टिन को मिलाएं और इसे जी-बफर के साथ ऊपर उठाएं ताकि जी-एक्टिन की एकाग्रता 20 μM हो। जिस एकाग्रता पर एक्टिन को अंततः बहुलक बनाया जाता है, वह इस मूल्य का 1/4 होगा। 1x घोल के लिए मिश्रण में 10x ME बफर का 1/10 जोड़ें और 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। यह चरण जी-एक्टिन से बंधे सीए2 + आयनों को एमजी2 + आयनों के साथ प्रतिस्थापित करता है। सुनिश्चित करें कि अंतिम मात्रा 10 μL के गुणकों में है।
    2. निम्नानुसार कैपिंग प्रोटीन की वांछित मात्रा जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर जल्दी से प्रोटीन स्टॉक को कैप करने की शीशी को पिघलाएं और फिर इसे बर्फ पर रखें। जी-बफर के साथ पतला करें जैसे कि कैपिंग प्रोटीन की एकाग्रता अब पोलीमराइजेशन मिश्रण में वांछित अंतिम एकाग्रता से दोगुनी है। चरण 2.5.1 से एक्टिन मिश्रण में पतला कैपिंग प्रोटीन समाधान की एक समान मात्रा जोड़ें।
    3. अंत में, प्रतिक्रिया मिश्रण में ताजा 2x लक्ष्य बफर की एक समान मात्रा जोड़ें। चरण 2.5.2 के अंत में समाधान का अंतिम आयतन एक्टिन मिश्रण की मात्रा का चार गुना होना चाहिए। सुनिश्चित करें कि KMEH की अंतिम सांद्रता 1x है, एटीपी की 1 mM है, बीएसए की 1 mg/ mL है, और G-actin की 5 μM है।
      पोलीमराइजेशन की अनुमति देने के लिए 45-60 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
      नोट: इसे लक्ष्य बफर रणनीति कहा जाता है, जिसमें Mg2 + G-actin (चरण 2.5.1.) की एक मात्रा को कैपिंग प्रोटीन मिश्रण (चरण 2.5.2.) की एक मात्रा और 2x लक्ष्य बफर (चरण 2.5.3.) के दो संस्करणों के साथ मिलाया जाता है। इससे एक्टिन की मात्रा को ऊपर या नीचे करना और कैपिंग प्रोटीन (या किसी अन्य एक्टिन मॉड्यूलेटर) की सापेक्ष एकाग्रता को बदलना आसान हो जाता है; चित्र 4)।
  6. फ्लोरोसेंट एक्टिन फिलामेंट्स के अलावा
    1. कुछ 200 μL युक्तियों को तेज ब्लेड या कैंची से काटें ताकि उन्हें कुंद किया जा सके। धीरे से 5 μM पॉलीमराइज्ड एक्टिन (चरण 2.5.3 से) की आवश्यक मात्रा को एक कुंद-एंडेड पिपेट टिप (एक्टिन फिलामेंट्स की कतरन को रोकने के लिए) के साथ निकालें और इसे एक साफ ऑटोक्लेव पीसीआर ट्यूब में जोड़ें।
    2. मात्रा >20 μL बनाने के लिए ट्यूब में 1x KMEH जोड़ें और F-actin की कतरन से बचने के लिए धीरे से मिलाएं। माउंटेड नमूना कक्ष से, बफर की एक समान मात्रा को हटा दें।
    3. कक्ष में पॉलीमराइज्ड एक्टिन समाधान जोड़ें और नीचे बाईलेयर को छूने के बिना धीरे से 3x ऊपर और नीचे पिपेट करें। यह एक्टिन फिलामेंट्स को बाइलेयर पर समान रूप से वितरित करने की अनुमति देता है। टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप पर नमूना माउंट करें (चरण 2.4.1 और चरण 2.4.2 देखें)।
    4. कोई भी बाइलेयर के लिए एफ-एक्टिन बाइंडिंग की प्रक्रिया को रिकॉर्ड कर सकता है। 20-30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। एफ-एक्टिन अतिरिक्त स्थिर स्थिति में पहुंचने के बाद दृश्य के विभिन्न क्षेत्रों से कुछ छवियों को रिकॉर्ड करें। (सजातीय) से पहले और बाद में 10xHis-YFP-EzrinABD के स्थानिक संगठन में परिवर्तन का निरीक्षण करें।
      नोट: एचवाईई एक्टिन की अनुपस्थिति में लिपिड बाइलेयर पर समान रूप से वितरित किया जाता है। एक्टिन फिलामेंट्स के अलावा, एचवाईई एफ-एक्टिन के साथ मिलकर काम करता है। कोलोकलाइजेशन की सीमा लिंकर प्रोटीन के एक्टिन-बाध्यकारी संबंध पर निर्भर करती है; आत्मीयता जितनी मजबूत होगी, कोलोकलाइजेशन उतना ही अधिक होगा और लिंकर प्रोटीन की पार्श्व गतिशीलता उतनी ही धीमी होगी (चित्रा 5)।
  7. मायोसिन II के अतिरिक्त
    1. एक्टिन इनक्यूबेशन के 30 मिनट के बाद, नमूने को माइक्रोस्कोप पर वापस माउंट करें (यदि यह अनमाउंट किया गया था)। लिंकर प्रोटीन और एफ-एक्टिन चैनलों में सिग्नल की जांच करें। यदि आवश्यक हो तो इमेजिंग स्थितियों को समायोजित करें।
    2. एक समान लिंकर प्रोटीन सिग्नल और समान रूप से बिखरे हुए एक्टिन फिलामेंट्स के साथ एक अच्छे क्षेत्र का चयन करें और लंबे समय तक चूक रिकॉर्डिंग के लिए कोई कलाकृतियां नहीं हैं। मायोसिन जोड़ने से पहले 0.1-0.2 हर्ट्ज पर 10-15 फ्रेम रिकॉर्ड करें और रिकॉर्डिंग को रोकें। पिपेल स्टॉक शीशी से पुनर्नवीनीकरण मांसपेशी मायोसिन -2 की आवश्यक मात्रा को कुंद-अंत पिपेट टिप (मायोसिन फिलामेंट्स की कतरन को रोकने के लिए) के साथ बाहर निकालें और एक साफ ऑटोक्लेव पीसीआर ट्यूब में जोड़ें।
    3. वॉल्यूम >20 μL बनाने के लिए तुरंत ट्यूब में 1x KMEH जोड़ें और धीरे से मिलाएं। कोई एटीपी, एटीपी रिजेनरेटिंग मिक्स, फोटो-स्टेबलाइजिंग एजेंट आदि भी जोड़ सकता है। इस चरण के दौरान। इसे परेशान किए बिना माउंटेड नमूना कक्ष से बफर की एक समान मात्रा को सावधानीपूर्वक हटा दें।
    4. धीरे से नमूना कक्ष में मायोसिन समाधान जोड़ें। ऊपर और नीचे पिपेट न करें क्योंकि यह सतह से बंधे फिलामेंट्स को परेशान करेगा। तुरंत टाइम-लैप्स रिकॉर्डिंग को फिर से शुरू करें और सिस्टम का निरीक्षण करें क्योंकि यह प्री-मायोसिन अवस्था से एटीपी-ईंधन वाले सिकुड़ा हुआ एक्टो-मायोसिन प्रवाह और एस्टर गठन से एटीपी-क्षीण जाम अवस्था में विकसित होता है (प्रतिनिधि परिणाम देखें)।
    5. केवल बफर नमूने का उपयोग करके सभी चैनलों के लिए पृष्ठभूमि छवियां लें। सभी छवियों को 16-बिट .tiff फ़ाइलों के रूप में सहेजें। सामान्य समस्याओं को हल करने के लिए युक्तियों के लिए तालिका 2 देखें।

Figure 3
चित्रा 3: त्वरित एफआरएपी परख के साथ बाइलेयर का गुणवत्ता मूल्यांकन। डीओपीसी और नी-एनटीए लिपिड (98: 2 मोल) से तैयार समर्थित लिपिड बाइलेयर (एसएलबी) को एचवाईई (10xHis-YFP-टैग झिल्ली-एक्टिन लिंकर) के साथ लेपित किया जाता है। अनबाउंड प्रोटीन को धोने के बाद, फ्लोरोसेंट बाइलेयर को टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप के तहत चित्रित किया जाता है। बाइलेयर पर एक छोटा सा क्षेत्र उच्च लेजर शक्ति के साथ फोटोब्लीच किया जाता है, और प्रतिदीप्ति की वसूली दर्ज की जाती है। (ए) एक अच्छा बाइलेयर हमेशा तेजी से ठीक हो जाता है, इस मामले में उपयोग की जाने वाली लिपिड संरचना के लिए 1-1.5 μm2/s के अपेक्षित प्रसार गुणांक के साथ। (बी) खराब बाइलेयर बहुत धीरे-धीरे ठीक हो जाते हैं या बिल्कुल ठीक नहीं होते हैं। (सी) खराब बाइलेयर की प्रतिनिधि छवियां: (सी-i) छेद के साथ एक बाइलेयर, (सी-ii) बड़े, स्थिर लिपिड पैच के साथ एक बाईलेयर, और (सी-iii) छोटे, स्थिर डॉट्स के साथ एक बाइलेयर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: योजनाबद्ध दिखा रहा है कि लक्ष्य बफर विधि का उपयोग करके एक्टिन को पॉलीमराइज़ कैसे किया जाए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: एफ-एक्टिन से जुड़ने पर एचवाईई का स्थानिक संगठन। टीआईआरएफ स्नैपशॉट एक्टिन फिलामेंट्स (एट्टो -635 मैलिमाइड के साथ लेबल) को जोड़ने से पहले और बाद में एचवाईई के स्थानिक संगठन को दर्शाते हैं। एचवाईई संगठन एफ-एक्टिन को जोड़ने से पहले समरूप है और एक्टिन फिलामेंट्स के साथ कोलोकाइज्ड और कोलाइज्ड हो जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. डेटा विश्लेषण

  1. फिजी सॉफ्टवेयर (https://imagej.net) का उपयोग करके, लिंकर प्रोटीन छवियों (चरण 2.4 से) से पृष्ठभूमि को घटाएं। प्रक्षालित स्थान और एक संदर्भ क्षेत्र से औसत तीव्रता मूल्यों को मापें।
  2. प्रक्षालित स्थान और संदर्भ क्षेत्र से समय के निशान को उनके संबंधित पूर्व-ब्लीच तीव्रता मूल्यों की तीव्रता के लिए सामान्य करें। सामान्यीकृत संदर्भ क्षेत्र समय ट्रेस में संबंधित समय बिंदुओं द्वारा सामान्यीकृत प्रक्षालित क्षेत्र मानों में प्रत्येक समय बिंदु को विभाजित करें। पृष्ठभूमि के लिए परिणामी सामान्यीकृत समय ट्रेस को सही करें और अधिग्रहण के दौरान तीव्रता में किसी भी व्यवस्थित उतार-चढ़ाव (वैश्विक फोटोब्लीचिंग, जेड-ड्रिफ्ट, आदि)।
    1. बाइलेयर टेथर्ड प्रोटीन के प्रसार गुणांक का अनुमान लगाने के लिए एक फिटिंग-मुक्त, मैनुअल विधि28 का उपयोग करें। संक्षेप में, पुनर्प्राप्ति प्रोफ़ाइल के आधे समय,1/2, की गणना उस समय को देखकर की जा सकती है जब सामान्यीकृत पुनर्प्राप्ति प्रोफ़ाइल अपनी स्थिर स्थिति के आधे हिस्से तक पहुंच जाती है:
      Equation 1
      यहां, एफ0 फोटोब्लीचिंग के बाद पहले फ्रेम में प्रक्षालित क्षेत्र में औसत तीव्रता है, और एफ∞ बाइलेयर की वसूली का दीर्घकालिक स्थिर राज्य मूल्य है।
    2. प्रभावी ब्लीच त्रिज्या का अनुमान लगाएं, आरई, एक पैरामीटर जो फोटोब्लीचिंग के दौरान प्रसार के लिए सही करता है, पोस्ट ब्लीच स्पॉट प्रोफाइल29 के लाइन स्कैन से। ब्लीच स्पॉट के केंद्र से गुजरने वाले इस लाइन-स्कैन की आधी चौड़ाई, आर1/2, निम्नानुसार आरई से संबंधित है:
      Equation 2
      चरण 2.8.3 में गणना की गई 1/2, चरण 2.8.4 में गणना की गई आरई, और मूल रूप से सेट ब्लीच त्रिज्या, आरएन, का उपयोग निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके प्रसार गुणांक (डी) की गणना करने के लिए किया जाता है:
      Equation 3
  3. एक्टोमायोसिन एस्टर्स का छवि विश्लेषण
    1. फिजी का उपयोग करके, सभी चैनलों में सभी रिकॉर्ड की गई छवियों से पृष्ठभूमि को घटाएं। फ्लैट-फील्ड सुधार का उपयोग करके किसी भी गैर-समान रोशनी या हस्तक्षेप पैटर्न के लिए छवियों को सही करें।
      नोट: कोई रंगीन प्लास्टिक स्लाइड का उपयोग कर सकता है, जो इस तरह के सुधार करने के लिए अच्छे फ्लैट नमूने हैं। एक प्लानर बाइलेयर पर लिंकर प्रोटीन और एक्टिन फिलामेंट्स के लिए, चैनल-विशिष्ट रोशनी सुधार मानचित्र बनाने के लिए कई पूर्व-मायोसिन छवियों के औसत प्रक्षेपण का भी उपयोग किया जा सकता है।
      1. यहां दिखाए गए एचवाईई चैनल के लिए, कई एचवाईई छवियों का औसत तीव्रता प्रक्षेपण लें (मायोसिन जोड़ने से पहले लिपिड बाइलेयर के विभिन्न क्षेत्रों से दर्ज किया गया)। औसत प्रक्षेपण (पूर्व-मायोसिन छवियों या किसी भी मानक फ्लैट नमूने से) के लिए एक उपयुक्त गॉसियन फ़िल्टर (σ = 50 पिक्सेल से 80 पिक्सेल) लागू करें।
      2. फ़िल्टर की गई छवि को 32-बिट छवि में कनवर्ट करें। सभी पिक्सेल मानों को पूरी छवि के माध्य से विभाजित करें। यह एचवाईई चैनल के लिए एक सामान्यीकृत सुधार मानचित्र देगा। फ्लैट-फील्ड सुधार के लिए इस नक्शे के साथ एचवाईई चैनल में सभी छवियों को विभाजित करें। एक ही रणनीति का उपयोग करके अन्य चैनलों के लिए सुधार मानचित्र बनाएं।
    2. फिजी में घातीय या सरल अनुपात विधि (तीव्रता क्षय प्रोफ़ाइल के आधार पर) का उपयोग करके फोटोब्लीचिंग के लिए सही है।
      1. किसी भी अस्थायी x-y गलत संरेखण (ट्रांसलेशनल आंदोलन) को सही करने के लिए, सभी फोटोब्लीच-सही चैनलों को एक हाइपरस्टैक में विलय करें। फिजी में हाइपरस्टैक-रेग प्लगइन का उपयोग करके, एक कठोर शरीर या अनुवाद परिवर्तन लागू करें।
      2. अंत में, संरेखित हाइपरस्टैक को अलग-अलग चैनलों में विभाजित करें और आगे के विश्लेषण के लिए उन्हें 16-बिट टीआईएफएफ स्टैक के रूप में अलग से सहेजें।

Representative Results

प्रतिनिधित्व के लिए, यहां फोटोब्लीचिंग के बाद पहली छवि से एक विशिष्ट पोस्टब्लीच प्रोफ़ाइल ( चित्रा 3 ए में टी = 0 एस पर छवि) और निम्नलिखित फ़ंक्शन28 ( चित्रा 6 ए देखें) के लिए इसका फिट दिखाया गया है:

Equation 4

इस वक्र के फिट द्वारा गणना की गई re (23.94 μm) का मान चरण 2.8.4 में गणना किए गए re के समान है। (23.24 μm)। यहां, के एक ब्लीच गहराई पैरामीटर है जिसे सीधे एफ0 से अनुमानित किया जा सकता है (चरण 2.8.4 में वर्णित)। इसी तरह, चित्रा 6 बी रिकवरी प्रोफाइल और निम्नलिखित फ़ंक्शन28 के लिए फिट दिखाता है:

Equation 5

हम प्रसार गुणांक का फिट किया गया मान 1.34 μm2/s पाते हैं, एक मान जो 1.39 μm 2/s के मान के साथ निकटता से सहमत है जिसकी गणना चरण 2.8.4 में सूत्र द्वारा की जाती है। यहां, एमएफ लिपिड बाइलेयर के मोबाइल अंश के लिए खड़ा है जो प्रक्षालित आबादी के अंश का प्रतिनिधित्व करता है जो वापस ठीक हो जाता है। लिपिड-लंगर वाले अणुओं की गतिशीलता, निश्चित रूप से, लिपिड संरचना और इसकी भौतिक स्थिति (तरल या जेल चरण) पर निर्भर करती है। डीओपीसी-आधारित लिपिड झिल्ली का उपयोग करने वाले हमारे प्रयोगों के लिए, गतिशीलता >1 μm2/s होनी चाहिए, और एक अच्छे लिपिड बाइलेयर को इंगित करने के लिए मोबाइल अंश 0.9 से कम नहीं होना चाहिए। हम बाइलेयर की गुणवत्ता और गतिशीलता के त्वरित परीक्षण के लिए मैनुअल फिटिंग-मुक्त विधि के उपयोग की सलाह देते हैं। कई एफआरएपी वक्रों के लिए विश्लेषण को स्वचालित करते समय फिटिंग विधि उपयोगी हो सकती है। इसके अलावा, यदि कोई सिस्टम में प्रसार को व्यवस्थित रूप से चिह्नित करने के लिए अधिक परिष्कृत एफआरएपी प्रयोग करना चाहता है, तो हम प्रयोगात्मक डिजाइन में फिटिंग मॉडल और संभावित नुकसान पर अधिक विवरण के लिए लोरेन एट अल .30 से इस समीक्षा के लिए पाठक की सलाह देते हैं।

Figure 6
चित्रा 6: लिपिड बाइलेयर के प्रसार गुणांक की मात्रा। (ए) फोटोब्लीचिंग के बाद पहली छवि की लाइन प्रोफाइल ( चित्रा 3 ए में टी = 0 एस) और प्रभावी ब्लीच त्रिज्या की गणना करने के लिए समीकरण 4 में फिट है। (बी) प्रसार गुणांक और मोबाइल अंश की गणना करने के लिए प्रक्षालित क्षेत्र की वसूली प्रोफ़ाइल और समीकरण 5 में फिट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ऊपर वर्णित प्रयोगों का एक विशिष्ट परिणाम जो टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित एक समर्थित लिपिड बाइलेयर पर जुड़े एक एक्टो-मायोसिन नेटवर्क की गतिशील असेंबली और संगठन को दर्शाता है, चित्रा 7 और पूरक वीडियो एस 1 में दर्शाया गया है।

चित्रा 7 लिंकर प्रोटीन, एफ-एक्टिन और मायोसिन -II का एक छवि मोंटेज दिखाता है।

Figure 7
चित्रा 7: सिकुड़ा हुआ एक्टोमायोसिन प्रवाह झिल्ली-एक्टिन लिंकर प्रोटीन एचवाईई के स्थानीय क्लस्टरिंग को चलाता है। एचवाईई (वाईएफपी-टैग्ड), एक्टिन फिलामेंट्स (एट्टो -635 मैलिमाइड के साथ लेबल), और मायोसिन II फिलामेंट्स (एट्टो -565 मेलिमाइड के साथ लेबल) के टीआईआरएफ स्नैपशॉट एचवाईई और एफ-एक्टिन युक्त एसएलबी में मायोसिन II को जोड़ने पर। शीर्ष पर समय इंगित किया गया है: टीआईआरएफ क्षेत्र में फ्लोरोसेंट मायोफिलामेंट्स दिखाई देने से ठीक पहले 0 मिनट है। एचवाईई और एफ-एक्टिन को मायोसिन जोड़ने (0 मिनट) से पहले लिपिड बाइलेयर पर सजातीय रूप से वितरित किया जाता है। मायोसिन गतिविधि सिकुड़ा हुआ एक्टोमायोसिन प्रवाह को प्रेरित करती है, जो स्थिर अवस्था (15 मिनट) में एस्टर जैसी संरचनाओं में उभरती है, जो युग्मित झिल्ली घटक (एचवाईई) के स्थानीय क्लस्टरिंग को चलाती है। सबसे निचली पंक्ति एक्टिन (पीला) और मायोसिन II (मैजेंटा) छवियों का एक विलय है जो अलग-अलग समय बिंदुओं पर एक्टिन और मायोसिन के संगठन को दर्शाती है। इन मोंटाज को बनाने में उपयोग की जाने वाली छवियों को फिजी में पृष्ठभूमि संकेत, गैर-समान तीव्रता पैटर्न और ट्रांसलेशनल आंदोलन के लिए ठीक किया गया था। स्केल बार = 10 μm. विवरण के लिए, पूरक वीडियो एस 1 देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

बफर का नाम संयोजन
लिपिड पुनर्जलीकरण बफर 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5% सुक्रोज, pH 7.5
एसएलबी गठन बफर 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 5-6
एसएलबी स्टोरेज बफर 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.2
प्रोटीन तनुकरण बफर 20 mM HEPES, 100 mM KCl, 1mM TCEP या DTT, pH 7.2
1X ME या एक्टिन आयन-विनिमय बफर 50 mM MgCl2, 0.2 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7.2 (स्टोर 4 °C पर)
1X KMEH या एक्टिन पोलीमराइजेशन बफर 50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 50 mM HEPES, pH 7.2
100 mM ATP स्टॉक 100 mM ATP disodium नमक, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 2 mM EGTA, pH 7.5 (स्टोर -20 °C पर)
2x लक्ष्य बफर 2x KMEH, 2 mg/ml BSA, 2mM ATP, 5mM TCEP (4°C पर संग्रहीत)
जी-बफर 2 mM Tris, 0.1 mM CaCl2, 0.2 mM ATP, 0.5 mM TCEP, 0.04 % NaN3, pH 8 (4 °C पर स्टोर)
मायोसिन II बफर 500 mM KCl, 1 mM EDTA, 10-20 mM Hepes, pH 7.0
जेल-निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी बफर 50 mM Tris-HCl, 150-300 mM NaCl, 5 mM TCEP, 0.1% ट्वीन -20, pH 7.5
कैपिंग प्रोटीन स्टोरेज बफर 10 mM Tris · Cl, 50 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7.5, 20% ग्लिसरॉल

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली बफर रचनाओं की सूची।

सामान्य समस्याएं और उनकी परेशानी शूटिंग समस्या कारण संभावित समाधान
1 लिपिड बाइलेयर कोई प्रसार नहीं दिखाता है इस समस्या का सबसे संभावित कारण गंदा कवरग्लास है जो तब हो सकता है जब सफाई समाधान वृद्ध हो जाता है या स्नान सोनिकेशन के दौरान हीटिंग नहीं होती है। इन बाइलेयर में एक 'वेसिकुलर' उपस्थिति होती है क्योंकि फटे हुए पुटिका कवरग्लास से चिपक जाते हैं लेकिन एक दूसरे के साथ फ्यूज नहीं होते हैं। 6 सप्ताह से अधिक पुराने एमएलवी या 6 दिनों से अधिक पुराने एसयूवी का उपयोग करना, या एसयूवी की कम मात्रा जोड़ने से वेसिकुलर बाइलेयर गठन भी हो सकता है। ताजा सफाई समाधान का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि हीटर चालू है और तापमान 45-65 डिग्री सेल्सियस के बीच है। ताजा लिपिड मिश्रण का उपयोग करें। (फ्लोरोसेंट लिपिड जांच बनाम फ्लोरोसेंट प्रोटीन जांच का उपयोग करना कभी-कभी अलग-अलग प्रकट हो सकता है। उदाहरण के लिए, यदि बाइलेयर में उप-विवर्तन दोष हैं और सतह निष्क्रिय चरण को छोड़ दिया जाता है (या काम नहीं करता है), तो लिपिड जांच एक समान तीव्रता वितरण दिखाएगी लेकिन फ्लोरोसेंट प्रोटीन जांच उज्ज्वल फ्लोरोसेंट स्पॉट प्रदर्शित कर सकती है।
2 लिपिड बाइलेयर में चमकीले पैच होते हैं बाईलेयर गठन के लिए एसयूवी की लंबी इनक्यूबेशन एक लिपिड बाइलेयर बना सकती है जो कुल मिलाकर अलग-थलग है लेकिन कभी-कभी उज्ज्वल पैच के साथ। ये पैच बहु-स्तरीय बाइलेयर हो सकते हैं जो बड़ी मात्रा में फ्लोरोसेंट जांच को आकर्षित कर सकते हैं। एसयूवी के साथ 15-20 मिनट इनक्यूबेशन पर्याप्त है। सुनिश्चित करें कि जांच एकत्र नहीं हो रही है: लिंकर प्रोटीन का एक त्वरित कठोर स्पिन (4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 300 x g) समुच्चय को हटा सकता है
3 लिपिड बाइलेयर में गहरे छेद होते हैं यह तब होता है जब बाईलेयर को पुरानी एसयूवी से बनाया जाता है और लंबे समय तक चित्रित किया जाता है (गठन के > 4 घंटे बाद), या लंबे समय तक इमेजिंग के कारण समाधान का पीएच काफी बदल जाता है (उदाहरण के लिए, उच्च एटीपी अवस्था में और कुछ ऑक्सीजन स्कैवेंजर्स की उपस्थिति में), या जब सतह बीटा-कैसिइन के साथ अति-निष्क्रिय हो जाती है (10-15 मिनट से अधिक समय तक बहुत अधिक बीटा-कैसिइन जोड़ना और या इसे धोना नहीं)। ताजा लिपिड का उपयोग करें। इमेजिंग फ्रेम दर या प्रभावी लेजर रोशनी समय को कम करें। उच्च बफरिंग क्षमता वाले बफर का उपयोग करें।
4 लिपिड बाइलेयर धीमी गति से प्रसार दिखाता है कोलेस्ट्रॉल के उच्च प्रतिशत वाले लिपिड बाइलेयर, लंबे संतृप्त लिपिड या चार्ज किए गए लिपिड धीमी गति से फैलते हैं। ऐसे मामलों में, उच्च तापमान पर अपना नमूना तैयार करें। कोई जटिल और अप्रमाणित लिपिड रचनाओं के साथ एक नियंत्रण के रूप में एक सरल, परीक्षण की गई लिपिड संरचना का भी उपयोग कर सकता है। सुनिश्चित करें कि गिलास साफ है।
5 एक्टिन पॉलीमराइज्ड नहीं करता है लक्ष्य बफर पुराना है, जी-एक्टिन स्टॉक बहुत पुराना है, पुराने और नए जी-एक्टिन को सह-बहुलक बनाया गया था। सुनिश्चित करेंकि पोलीमराइजेशन (एमई बफर का उपयोग करके) से पहले सीए2 + को एमजी 2 + द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है। ताजा एटीपी-एमजी2+ स्टॉक का उपयोग करें। ताजा पुनर्नवीनीकरण जी-एक्टिन का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि बाईलेयर में जोड़े गए एफ-एक्टिन (जी-एक्टिन के संदर्भ में) की एकाग्रता 0.2 μM से अधिक है। कम सांद्रता के लिए, फेलोइडिन स्थिर एफ-एक्टिन का उपयोग करें।
6 एक्टिन बाइलेयर से नहीं जुड़ता है मेम्ब्रेन-एक्टिन लिंकर को बहुत कम सांद्रता पर जोड़ा या जोड़ा नहीं जाता है- यह लिंकर प्रोटीन की प्रतिदीप्ति के रूप में अनुमान लगाया जा सकता है। यदि प्रतिदीप्ति सभ्य है, तो झिल्ली-एक्टिन लिंकर ने एक्टिन-बाध्यकारी क्षमता खो दी है। इसके अलावा, यदि लिंकर प्रोटीन गैर-विशेष रूप से कांच की सतह से बंधा हुआ है (जब बाइलेयर खराब होता है), तो यह एक्टिन फिलामेंट्स की भर्ती नहीं कर सकता है। सुनिश्चित करें कि बाइलेयर अलग हो रहा है। ताजा लिंकर प्रोटीन का उपयोग करें
7 फ्लोरोसेंट एफ-एक्टिन सिग्नल कमजोर है लेबल से डार्क एक्टिन का अनुपात बहुत कम है। या तो लेबल किए गए एक्टिन या बिना लेबल वाले एक्टिन बहुत पुराने हैं और वे एक-दूसरे के साथ मेल नहीं खा रहे हैं। एक्टिन को फिर से रीसायकल करें, और ताजा पुनर्नवीनीकरण एक्टिन के साथ प्लॉयमराइजेशन का पुन: प्रयास करें। फोटोडैमेज एफ-एक्टिन को नष्ट या डीपोलीमराइज कर सकता है; यदि संभव हो, तो एक्टिन (और मायोसिन) के लिए लाल या दूर-लाल रंगों का उपयोग करें।
8 मायोसिन सिकुड़न नहीं दिखाता है यह देखा जा सकता है कि मायोसिन-संक्रमित प्रणाली में एटीपी जोड़ने के बाद, एक्टो-मायोसिन की कोई सिकुड़न नहीं होती है। जांचें कि क्या मायोसिन एकाग्रता या शुद्धता का स्तर अच्छा है। ताजा पुनर्नवीनीकरण मायोसिन का उपयोग करें (रीसाइक्लिंग के बाद 6 सप्ताह के भीतर उपयोग करें)। मायोसिन मिश्रण में ताजा एटीपी जोड़ने से मदद मिल सकती है। डी-गैसिंग बफर और ऑक्सीजन स्कैवेंजर्स आदि का उपयोग करना। मोटर्स की फोटोडैमिंग को कम कर सकता है।  अधिक जानकारी प्लास्टिनो एट अल या स्टैम एट अल द्वारा समान विधियों के संग्रह के प्रोटोकॉल में पाई जा सकती है
9 कवरग्लास हाइड्रोफिलिक नहीं है कवरग्लास को ठीक से साफ नहीं किया जाता है। लिपिड बाइलेयर गठन के लिए स्वच्छ हाइड्रोफिलिक कवरग्लास महत्वपूर्ण है। सफाई प्रोटोकॉल के बाद कवरग्लास की हाइड्रोफिलिसिटी का एक उपयोगी, दृश्य रीडआउट पानी द्वारा ग्लास के गीलेपन का निरीक्षण करना है। एक सपाट-लेटे कवरस्लिप में पानी की एक छोटी मात्रा जोड़ें। अगर कवरस्लिप को ठीक से साफ नहीं किया जाता है तो पानी एक गोल बूंद के आकार में रहेगा। हालांकि, पानी की एक ही मात्रा फैल जाएगी और एक उपचारित हाइड्रोफिलिक कवरग्लास पर एक पतली परत बनाएगी। कवर ग्लास की सतह पर पानी के इस गीले व्यवहार का उपयोग यह पता लगाने के लिए किया जा सकता है कि सफाई समाधान / एनएओएच के साथ सफाई के कदम काम करते हैं या नहीं।

तालिका 2: समस्या निवारण मार्गदर्शिका सामान्य समस्याओं और संबंधित समाधानों को सारांशित करती है।

पूरक वीडियो एस 1: सिकुड़ा हुआ एक्टोमायोसिन प्रवाह झिल्ली-एक्टिन लिंकर प्रोटीन एचवाईई के स्थानीय क्लस्टरिंग को चलाता है। एचवाईई और एफ-एक्टिन युक्त एसएलबी में मायोसिन II को जोड़ने पर एचवाईई (वाईएफपी-टैग्ड), एक्टिन फिलामेंट्स (एट्टो -635 मैलिमाइड के साथ लेबल), और मायोसिन II फिलामेंट्स (एट्टो -565 मैलिमाइड के साथ लेबल) का टीआईआरएफ टाइमलैप्स। शीर्ष पर समय इंगित किया गया है: टीआईआरएफ क्षेत्र में फ्लोरोसेंट मायोफिलामेंट्स दिखाई देने से ठीक पहले 0 मिनट है। स्केल पट्टी = 10 μm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह प्रोटोकॉल कोशिकाओं के झिल्ली-कॉर्टेक्स इंटरफ़ेस का अध्ययन करने के लिए प्रयोगों को डिजाइन करने के लिए एक बहुमुखी मंच और एक प्रारंभिक बिंदु प्रस्तुत करता है। महत्वपूर्ण कदम स्वच्छ ग्लास स्लाइड की तैयारी, कुशल एसयूवी गठन (दोनों एसएलबी की गुणवत्ता को प्रभावित करने वाले) के लिए ताजा लिपिड का उपयोग करना, और गतिशील एक्टिन फिलामेंट पुनर्गठन के लिए ताजा पुनर्नवीनीकरण मायोसिन II प्रोटीन का उपयोग करना है। जब लंबे समय तक इमेजिंग गतिशीलता होती है, तो ऑक्सीजन स्कैवेंजर सिस्टम (जैसे, प्रोटोकेटच्यूइक एसिड और प्रोटोकेटच्यूट 3 4-डाइऑक्सीजिनेज 5,31) को शामिल करना बहुत महत्वपूर्ण है।

ओपन-चैंबर डिज़ाइन लिपिड प्रवाह को प्रेरित किए बिना मौजूदा प्रणाली में घटकों के अनुक्रमिक जोड़ की अनुमति देता है। यह आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले, बंद-कक्ष दृष्टिकोण या लिपोसोम 36 के भीतर एनकैप्सुलेटेड प्रोटीन का उपयोग करके काम करने पर एक महत्वपूर्ण लाभ होसकता है। प्रोटीन-प्रेरित झिल्ली विरूपण जैसे विपरीत प्रभावों का अध्ययन ग्लास-अधिशोषित लिपिड बाइलेयर के साथ नहीं किया जा सकता है।

लिपिड बाइलेयर लिपिड रचनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ बनाया जा सकता है। यह हाइड्रोफिलिक ग्लास की सतह पर लिपिड पुटिकाओं के सोखने के साथ शुरू होता है, इसके बाद या तो सतह-पुटिका और प्रत्यक्ष पुटिका-पुटिका इंटरैक्शन के कारण सहज पुटिका टूट जाती है या अधिशोषित पुटिकाएं एक महत्वपूर्ण कवरेज तक पहुंच जाती हैं, जिसके बाद पुटिकाओं का एक छोटा सा अंश टूट जाता है, जिससे सक्रिय किनारे बनते हैं, जो अंततः बाईलेयर गठन की ओर जाता है। . ग्लास के अलावा, विभिन्न सब्सट्रेट्स का उपयोग समर्थित लिपिड बाइलेयर बनाने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि माइका (जैसे, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी के लिए), नरम सब्सट्रेट्स (जैसे, पॉली-डी-मिथाइल-सिलोक्सेन), बहुलक कुशन 33,34,35, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड14 के छेद के बीच फैले हुए। ड्रॉपलेट इंटरफ़ेस बाइलेयर स्थिर, फ्री-स्टैंडिंग लिपिड बाइलेयर बनाने के लिए एक और दिलचस्प तरीकाहै। पुटिकाओं या इमल्शन में एक्टो-मायोसिन नेटवर्क का समावेश सेल जैसी ज्यामिति37,38 में इस न्यूनतम प्रणाली का अध्ययन करने के लिए एक बहुत ही शक्तिशाली तरीका है, औरजिसे कहीं और विस्तार से वर्णित किया गया है।

Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को एएक्सए रिसर्च फंड और डीवीके के लिए वारविक-वेलकम क्वांटिटेटिव बायोमेडिसिन प्रोग्राम (वेलकम आईएसएसएफ, आरएमआरसीबी0058), एबी और एसटी के लिए एनसीबीएस-टीआईएफआर और एसएम के लिए वेलकम-डीबीटी मार्गदर्शी फैलोशिप (आईए /एम /15/1/502018) द्वारा समर्थित किया गया था। जिसने इस प्रोटोकॉल संग्रह के निर्माण में योगदान दिया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2 dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- (lissamine rhodamine B sulfonyl) Avanti Polar Lipids 810158 16:0 RhoPE
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3- [(N-(5-amino-1 carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids 790404 DGS-NTA-Ni2+
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850375 DOPC
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850355 DPPC
Amber glass vials ThermoFisher B7990-2A
ATP disodium salt Sigma Aldrich A26209
Attofluor cell chamber ThermoFisher A7816
Bath sonicator GT Sonic 1860QTS
beta-casein Sigma Aldrich C6905
CaCl2 ThermoFisher 12135
chloroform Sigma Aldrich 650471 alternatively from Electron Microscopy Sciences, 50980296
Cover slips, #1, 25 mm diameter, Gold Seal Harvard Apparatus 64-0705B
Cover slips, #1, 40x22 mm, Gold Seal ThermoFisher 48404-031
EDTA ThermoFisher G12635
EGTA Himedia MB130
Gas tight glass syringes, with removebla needle, blunt, volumes 10 µL, 100 µL, 500 µL Hammilton 1700 series
Hellmanex III Hellma Analytics Z805939 cleaning solution
HEPES Himedia RM380
KaH2PO4 ThermoFisher G13405
KCl ThermoFisher G13305
KOH ThermoFisher G26708
Lipid extruder Avanti Polar Lipids 61000-1EA
MgCl2 ThermoFisher G15535
Microtip sonicator Sonics VC750 3 mm Tip diameter
Na2CO3 ThermoFisher G15955
NaCl Himedia GRM853
NaH2PO4 ThermoFisher G15825
NaOH ThermoFisher G27815
Nikon Ti Eclipse TIRF microscope Nikon With a TIRF unit connected through a polarization-conserving optical fibre to an Agilent monolithic laser combiner MLC400 with multiple laser lines with a 100X, 1.45 NA Nikon Oil Objective with two 512 x 512-pixel EMCCD cameras (Photometrics Evolve 512) with a 100X, 1.45 NA Nikon Oil Objective with two 512 x 512-pixel EMCCD cameras (Photometrics Evolve 512)
NOA88 Norland Products 8801
PTFE Coated Tweezer Style #2A Structure Probe 0S2AT-XD
Refrigerated microcentrifuge Eppendorf 5424R
Sucrose ThermoFisher G15925
UV-illuminator Novascan PSD PRO-UV needs vacuum and O2 supply

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References

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जीव विज्ञान अंक 185
समर्थित लिपिड बाइलेयर पर मेम्ब्रेन-टेथर्ड मिनिमल एक्टिन कॉर्टिक्स का पुनर्गठन
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Köster, D. V., Bhat, A.,… More

Köster, D. V., Bhat, A., Talluri, S., Mayor, S. Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers. J. Vis. Exp. (185), e63968, doi:10.3791/63968 (2022).

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