Summary
Detta protokoll beskriver bildandet av stödda lipid-dubbelskikt och tillsatsen av cytoskelettfilament och motorproteiner för att studera dynamiken i rekonstituerade, membranbundna cytoskelettnätverk med hjälp av fluorescensmikroskopi.
Abstract
Ytan på en levande cell ger en mångsidig aktiv plattform för många cellulära processer, som härrör från samspelet mellan plasmamembranet och den underliggande aktinbarken. Under de senaste decennierna har rekonstituerade, minimala system baserade på stödda lipid-dubbelskikt i kombination med aktinfilamentnätverk visat sig vara mycket avgörande för att avslöja grundläggande mekanismer och konsekvenser av membranbundna aktinnätverk, liksom för att studera funktionerna hos enskilda membranassocierade proteiner. Här beskriver vi hur man rekonstituerar sådana aktiva kompositsystem in vitro som består av vätskestödda lipid-dubbelskikt kopplade via membranassocierade aktinbindande proteiner till dynamiska aktinfilament och myosinmotorer som lätt kan observeras via total intern reflektionsfluorescensmikroskopi. En öppen kammardesign gör att man kan montera systemet steg för steg och systematiskt kontrollera många parametrar såsom länkproteinkoncentration, aktinkoncentration, aktinfilamentlängd, aktin / myosinförhållande, samt ATP-nivåer. Slutligen diskuterar vi hur man kontrollerar systemets kvalitet, hur man upptäcker och felsöker vanligt förekommande problem och några begränsningar av detta system i jämförelse med den levande cellytan.
Introduction
Plasmamembranet i en levande djurcell interagerar ständigt med den intilliggande aktincytoskeletten, och tillsammans bildar de ett aktivt kompositmaterial som uppfyller en mängd cellulära funktioner 1,2. För att studera processer vid detta lipidmembran-aktingränssnitt har rekonstitueringen av cytoskelettala nätverk ovanpå stödda lipid-dubbelskikt (SLB) visat sig vara till stor hjälp. Denna minimala systemmetod möjliggör exakt kontroll av cytoskelettnätverkskomponenter och lipidkomposition. Jämfört med de fristående lipidmembranen hos gigantiska unilamellära vesiklar möjliggör SLB: s plana geometri effektiv användning av toppmoderna mikroskopitekniker såsom superupplösning3,4, total intern reflektionsfluorescens (TIRF) 5,6,7 eller interferometrisk spridning 8 att studera den rumsliga organisationen och dynamiken i cytoskelettala nätverk. TIRF ger den högsta kontrasten för fluorescerande märkta komponenter, eftersom signalen från obundna märkta molekyler i lösningen som bidrar till bakgrundssignalen är minimal.
Här beskriver vi ett grundläggande protokoll för bildandet av aktomyosinnätverk bundna till stödda lipid-dubbelskikt, som används i stor utsträckning inom området för att studera fysiken hos aktiva, kvasi-2D-nätverk 9,10,11 och deras effekt på membranorganisation 3,5,12,13,14,15,16 (Figur 1 ). Detta tillvägagångssätt är inte begränsat till aktinbaserade nätverk utan kan också enkelt anpassas för att utforska mikrotubuli, mellanliggande filament eller sammansatta nätverk av blandad natur och för att studera en mängd olika interaktioner mellan lipidmembranproteiner och cytoskelettkomponenter med hjälp av ytkänsliga mikroskopimetoder.
För att hålla detta protokoll fokuserat har vi uteslutit en detaljerad beskrivning av rening och märkning av aktin- och myosinproteiner eller detaljer om hur man ställer in och kontrollerar kontraktiliteten och organisationen av aktomyosinnätverk. Man bör hänvisa till andra protokoll som publiceras tillsammans med detta i JoVE Methods Collection, In Vitro Reconstitution of Cytoskeleton Networks for Biomaterials, Biophysics and Active Matter Research17.
Figur 1: Schematisk för det aktiva kompositsystemet in vitro-aktinmembran . Skapad med Biorender. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Protocol
1. Reagenser och utrustning
- Förbered färska buffertar enligt tabell 1. Använd ultrarent, avjoniserat vatten med en resistivitet på 18,2 MΩ·cm vid 25 °C. Sterilisera alla buffertar genom att leda dem genom 0,22 μm filter under vakuum. Degas de buffertar som används för kolonnkromatografi.
- Rena skelettmuskelaktin som beskrivits tidigare18,19. Tillsätt 20% glycerol till den slutliga renade G-aktinlösningen och gör alikvoter på 500 μl (för märkning eller bulkexperiment) och 10 μl (för enskilda experiment) volym. Snabbfrys alikvoterna genom att doppa rören i flytande kväve i 30 s och förvara dem sedan vid −80 °C i upp till 18 månader.
OBS: Alternativt kan renat aktin eller acetonpulver köpas kommersiellt. - Märk renad skelettmuskel G-aktin med alla fluorescerande maleimidfärger som beskrivits tidigare5. Bestäm koncentrationen och graden av märkning av proteinet med spektrofotometri med hjälp av korrigerad A 290nm för aktin (εaktin =26 600 M-1 cm-1) och Aλmax av färgämnet. Gör alikvoter på 10 μl och blixtfrys genom att doppa rören i flytande kväve i 30 s och förvara vid −80 °C i upp till 18 månader.
OBS: Märkning med lysinkonjugerande NHS-estrar kommer att skapa icke-funktionellt aktin och bör undvikas. - Rena skelettmuskelmyosin II genom att följa protokoll20. Kör SDS-PAGE med 10% polyakrylamidgel följt av Coomassie-färgning för att bestämma renhetsnivån för proteinet21. Förvara renad skelettmuskel myosin-II vid −20 °C i flytande form i myosin II-buffert med 50% glycerol.
OBS: Det lagrade myosin II kan användas i upp till 2 år. - Märk renat myosin-II med alla fluorescerande maleimidfärgämnen som beskrivits tidigare5. Undvik att märka myosinmotorer med NHS-estrar färgämnen. Bestäm koncentrationen och graden av märkning med spektrofotometri med korrigerad A280nm myosin II och Aλmax av färgämnet. Förvara det återvunna myosin II (mörkt eller märkt) vid 4 °C och använd det inom 6 veckor.
- Rening av kapslingsprotein
- Skaffa murin capping protein genom att följa ett tidigare protokoll22. Kör SDS-PAGE med 10% polyakrylamidgel följt av Coomassie-färgning för att bestämma proteinets renhetsnivå. Mät koncentrationen med hjälp av280 nm täckprotein (εCP = 99 530 M-1 cm-1).
- Tillsätt 20% glycerol till proteinlösningen och gör 5 μL alikvoter i 200 μL PCR-rör. Doppa rören i flytande kväve och förvara dem vid −80 °C i upp till 2 år.
OBS: Capping-proteinaktiviteten kontrolleras genom polymerisering av fasta mängder fluorescerande G-aktin i närvaro av olika kapslingsproteinmängder. Filamenten avbildas sedan under ett mikroskop och deras längdfördelning kvantifieras. Ju högre relativ koncentration av kapsylprotein, desto kortare är aktinfilamentfördelningarna. Se Köster m.fl.5.
- Uttryck ett fluorescerande membran-aktinlänkprotein, t.ex. för detta protokoll använd 10xHis-YFP-EzrinABD (HYE), uttryck det i Bl21DE3 * Escherichia Coli och rena som beskrivits tidigare23. Bestäm koncentrationen av proteinet genom spektrofotometri.
- Förvara proteinet i små alikvoter i gelfiltreringskromatografibuffert (eller annan lämplig buffert) med 20% glycerol vid −80 °C. Under dessa förhållanden är proteinet stabilt i över 2 år.
OBS: Valet av aktinmembranlänkprotein och fluorescerande markör beror på vilken typ av fråga man tar upp. Ett brett spektrum av lipidlänkande strategier har utvecklats under de senaste åren inklusive histidinmärkta proteiner24, biotin-streptavidin 25 och enkelsträngat DNA26. - Beredning av multilamellära vesiklar (MLV)
Arbetsflödet från MLV till lipid-dubbelskikt som stöds visas i figur 2.- Placera 5-10 bärnstensfärgade glasflaskor i en 200 ml glasbägare. Fyll bägaren med 2% rengöringslösning, precis tillräckligt för att sänka ner glasflaskorna. Sonicate dem i ett vattenbad i 30 min vid full puls och 65 ° C.
- Ta ut injektionsflaskorna från lösningen och skölj dem noggrant med destillerat vatten. Placera injektionsflaskorna i en glasbägare som innehåller 2 N NaOH och sonikat i 20 minuter. Ingen uppvärmning krävs under detta steg.
- Ta ut injektionsflaskorna från NaOH-lösningen och skölj noggrant med destillerat vatten. Torka injektionsflaskorna i en varmluftsugn som är inställd på 65 °C i 2 timmar eller längre.
- Förvara de rengjorda injektionsflaskorna i en ren bägare förseglad med transparent film i upp till 6 veckor.
VARNING: Utför följande steg inuti en kemisk dragskåp. Hantera kloroform och lipidlösningarna med gastäta Hamilton-glassprutor för att undvika kontaminering av plast. - Skölj Hamilton-sprutorna och några bärnstensfärgade glasflaskor flera gånger med ren kloroform. Ta lipidpulvret som lagras i glasampuller från −20 °C frysen och tillsätt tillräckliga volymer kloroform för att lösa upp lipidpulverna till koncentrationer på 10-25 mg/ml.
- Överför lösningen från ampullen till en nyrengjord bärnstensfärgad glasflaska och märk den på lämpligt sätt. Utför detta steg på is för att minska avdunstningen av kloroform.
- Gör en DOPC-stamlösning med en koncentration på 10-25 mg / ml och DGS-NTA-Ni2+ med en koncentration på 1-10 mg / ml.
- För att göra en fungerande lipidblandning, ta en ren glasflaska och skölj den 2x med kloroform. Tillsätt 300 μl ren kloroform till injektionsflaskan för att fungera som bas för bättre blandning av komponenterna. Detta kommer inte att påverka de slutliga koncentrationerna av lipiderna eftersom all kloroform kommer att torkas ut i nästa steg.
- Tillsätt uppmätta volymer av stamlipidlösningar till injektionsflaskan för att göra önskade fungerande lipidblandningar. Mållipidkoncentrationen i lipidrehydreringsbufferten är 4 mM. Torka lipidblandningen under en långsam ström avN2-gas inuti den kemiska huven vid rumstemperatur. Detta steg kan ta upp till 30 minuter för varje injektionsflaska.
- När allt lösningsmedel har torkat ut, vakuumtorka lipidfilmen i >2 timmar vid rumstemperatur för att avlägsna eventuella spår av kloroform kvar. Återsuspendera den uttorkade lipidblandningen i lipidrehydreringsbuffert för en slutlig lipidkoncentration på 4 mM.
- Inkubera i 5-10 min för att möjliggöra rehydrering av lipiderna. Vortex lipidlösningen i cirka 30 s för att bilda MLV.
- Gör 0,5-1 ml alikvoter av MLV: erna i 1,5 ml mikrocentrifugrör. Doppa rören i flytande kväve, försegla med en transparent film och förvara vid −20 °C (i upp till 6 veckor).
OBS: Lipidlagerkoncentrationer väljs för att möjliggöra tillräckligt stora volymer som möjliggör tillförlitlig pipettering med Hamilton-sprutorna. Om de volymer som krävs för att göra beståndet är för stora för att lösa upp det torkade lipidpulvret, gör flera utspädningar av beståndet för att säkerställa reproducerbar blandning av olika lipider.
- Beredning av små unilamellära vesiklar (SUV)
- Ta ut en alikvot av MLV från −20 °C lagring och tina den vid rumstemperatur. Blixtfrys blåsorna genom att kasta mikrocentrifugröret i flytande kväve i 15-30 s och lägg det omedelbart i ett vattenbad vid 45 ° C tills lösningen har tinat helt (1-2 min). Upprepa ovanstående frys-tina cykel 10x-15x tills lösningen ser mindre grumlig ut.
OBS: Ställ in vattenbadets temperatur högre än övergångstemperaturen för lipidblandningen som tinas för att möjliggöra enhetlig lipidblandning. - Balansera en sprutbaserad miniextruder utrustad med ett polykarbonatfiltermembran med 80 nm porstorlek med SUV-rehydreringsbuffert. Se till att det inte finns läckage eller bubblor i systemet. Medan extruderingsmetoden ger monodisperse SUV: er med minimal lipidskada, kan lipidblandningar med negativ laddning hålla fast vid polykarbonatmembranet.
- För försiktigt den tinade lipidlösningen genom den förbalanserade extrudern från ena sidan till den andra och sedan tillbaka. Upprepa cykeln 5x-10x tills lipidlösningen blir synligt klar, vilket indikerar bildandet av SUV: er med ~ 100 nm diameter.
- Centrifugera den extruderade suspensionen (eller spetssonika lösningen; se anmärkning nedan) vid 15 000 x g i 60 minuter vid 4 °C för att pelletera ner lipidskräpet. Samla de översta 80% av lösningen utan att störa pelleten och utan att skapa bubblor. Överför supernatanten som innehåller SUV: erna till ett nytt mikrocentrifugrör och förvara på is i upp till 6 dagar.
OBS: Ett alternativ till centrifugering är spets ultraljudsbehandling utförs enligt följande. Slå på en microtip sonicator och ställ in följande inställningar: Amplitud = 30% av det maximala, PÅ tid = 10 s, AV-tid = 60 s. Rengör spetsen på mikro-sonicator med avjoniserat vatten följt av 2 N NaOH, kloroform och igen avjoniserat vatten. Doppa sonicator spetsen i var och en av dessa lösningar och sonicate för 1-2 cykler med hjälp av ovanstående inställningar. Doppa den rena spetsen i den frystinade vesikellösningen och sonika i 3-6 cykler på is tills lösningen blir klar. - Efter centrifugering, kontrollera om det finns tecken på hög lipidnedbrytning eller en misslyckad lipidsträngsprutning som bildandet av en tunn vitaktig film och / eller en tydligt synlig pellet. I dessa fall, fortsätt inte och upprepa SUV-förberedelsestegen igen.
OBS: Hållbarheten för stadsjeepar kan skilja sig åt för olika lipidblandningar. SUV: er tillverkade av DOPC: DGS-NTA-Ni2+ är stabila i upp till 6 dagar för dessa experiment. Tips för att lösa vanliga problem finns i tabell 2.
- Ta ut en alikvot av MLV från −20 °C lagring och tina den vid rumstemperatur. Blixtfrys blåsorna genom att kasta mikrocentrifugröret i flytande kväve i 15-30 s och lägg det omedelbart i ett vattenbad vid 45 ° C tills lösningen har tinat helt (1-2 min). Upprepa ovanstående frys-tina cykel 10x-15x tills lösningen ser mindre grumlig ut.
Figur 2: Schematisk som visar arbetsflödet från beredning av multilamellära vesiklar och små unilamellära vesiklar till bildandet av lipid-dubbelskikt som stöds. Skapad med Biorender. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Rekonstituering av membranbundna aktinnät
- Beredning av provkammare
- Ta 3-5 rektangulära glasöverdrag och placera dem i en Coplin-burk. Slå på badljudsmedjan och ställ in temperaturen på 65 °C. Fyll Coplin-burken med 2% rengöringslösning för att helt sänka ner täckglasen och placera den i sonicator i 30 minuter i full pulsläge.
- Använd trubbiga PTFE-belagda pincett för att ta bort täckglasen en efter en från burken. Skölj dem noggrant med destillerat vatten och lägg dem i en annan Coplin-burk fylld med 2 N NaOH.
- Sonicate täckglasen i 20 min i full pulsläge. Ta bort täckglasen en efter en, skölj noggrant med destillerat vatten och lägg i en annan Coplin-burk fylld med destillerat vatten.
OBS: Eventuellt sonikera täckglasen i destillerat vatten i 20 minuter och skölj dem sedan igen med destillerat vatten. - Omedelbart innan du börjar experimentet, ta burken som innehåller täckglasen i en kemisk huva försedd med en N2-gasförsörjning .
- Optimera lufttrycket för N 2-gasströmmen genom försök och fel så att det bara räcker för att förskjuta vatten från täckytan utan att bryta den. Rikta in flödet avN2-gas parallellt med täckglasplanet för att minska risken för att täcka glid.
- Använd handskar och pincett för att ta bort täckglasen en efter en från burken för att torka dem under N2-strömmen . Torka båda sidorna av varje täckglas och placera dem på ett rent plastgaller med lock. Placera lådan med täckglasen i en exsickator för att undvika kontakt med dammpartiklar i luften.
OBS: De N 2-torkade täckglasen kan förvaras i en exsickator där de kan förbli hydrofila i upp till2 dagar. Den här strategin kan vara användbar när många dubbelskikt krävs för experimentet eller om experimentet tar längre tid än 8 timmar. - Ta autoklaverade PCR-rör och skär ut locken och nedre koniska halvorna med ett skarpt kirurgiskt blad. Ta de cylindriska halvskurna rören en efter en, applicera UV-härdbart lim på den släta kanten på varje skuren rör och placera den inverterad på en nyrengjord täckglas så att fälgen sitter platt på täckglaset.
- Flytta inte cylindern i sidled när den är placerad på täckglaset för att säkerställa att limet inte spills ut i kammarens centrala utrymme. Rektangulära täckglas kan bekvämt rymma upp till tre reaktionskamrar, och de runda rymmer endast en i mitten (figur 1).
- Placera de kammarbärande täckglasen inuti en UV-ozonrengörare med enO2-tillförsel och vakuum (eller använd en UV-belysning). Slå på UV-ljuset och tänd i 3-5 minuter så att limet kan polymeriseras. Utför längre belysning (10-15 min) för att förbättra täckglasets hydrofilicitet och därmed kvaliteten på lipid-dubbelskiktet.
- Förvara de torra UV-belysta provkamrarna i upp till 8 timmar i små plastlådor (t.ex. tomma rektangulära täckglaslådor) inslagna i transparent film för att minska kontakten med dammpartiklar i luften.
OBS: En stadig ström avO2 i närvaro av UV-ljus bildar ozon och syreradikaler som kan avlägsna organiska föroreningar från ytan av täckglaset. Ett vakuum förhindrar läckage av giftigt ozon som bildas under processen. - Ta ut täckglasen och testa kamrarna för läckage genom att fylla dem med destillerat vatten. Varje kammare rymmer upp till ~150 μL prov. Kassera de läckande kamrarna.
OBS: Ett annat bra och säkert rengöringsalternativ är plasmarengöraren. Tids- och effektinställningarna beror på modellen, men se till att inte överbehandla glasskivorna med plasma eftersom detta kommer att resultera i en minskning av lipidrörligheten. Ytbehandlingen kan påverka rörligheten hos lipider27, vilket har observerats vid långvarig behandling med rengöringslösningen (>45 min) eller NaOH (>30 min).
- Framställning av stödda lipid-dubbelskikt
- Tvätta varje kammare med SLB-bildningsbuffert (eller 1x PBS) för att avlägsna eventuella ytföroreningar och lämna 100 μL buffert i slutet. Markera buffertnivån vid 100 μl med en permanent markör för att reproducerbart spåra förändringar i volymen.
- Tillsätt 2 μL 0,1 M CaCl2till kammaren . Detta förbättrar adsorptionen av vesiklarna till glasytan, vilket förbättrar dubbelskiktsbildningen i nästa steg. Tillsätt 8 μl av SUV-lösningen (från steg 1.10.) till varje kammare och inkubera i 15 minuter vid 25 °C.
OBS: Volymen av SUV-blandningen som ska tillsättas kan uppskattas genom att beräkna det totala antalet lipider (med en genomsnittlig yta på 0,72 nm2) som behövs för att helt täcka det exponerade hydrofila området i brunnen med två lipidskikt. - Tvätta av de obundna vesiklarna med aktinmotilitetsbuffert (1x KMEH). Ta först bort 50 μL av SLB-bildningsbufferten och lämna endast 50 μL i provkammaren. För det andra, tillsätt 100 μL 1x KMEH till kammaren. Blanda försiktigt och ta sedan bort 100 μl av bufferten utan att vidröra botten.
OBS: Det är viktigt att vara försiktig när du tvättar. Se till att pipettspetsen inte vidrör kammarens botten. Håll pipetten lutad för att rikta buffertflödet till kammarens vägg och inte direkt vid dubbelskiktet, eftersom ett direkt flöde kan störa dubbelskiktet. Var försiktig så att du inte introducerar några luftbubblor när du pipetterar eftersom luft kan nå lipid-dubbelskiktet och orsaka defekter i det. - Upprepa tvättarna 10x genom att tillsätta 100 μL 1x KMEH och ta bort 100 μL.
- Tillsätt 10 μl 1 mg/ml β-kasein till dubbelskiktet, blanda försiktigt och inkubera i 5-10 min. β-kasein blockerar regionerna på täckglaset där dubbelskiktet inte har bildats. Tvätta av β-kasein 3x med 1x KMEH enligt beskrivningen i steg 2.2.3. och återföra buffertnivån till 100 μl-märket.
- Tillsats av membran-aktinlänkare
- Under inkubationen β-kasein (steg 2.2.5) tar du ut en alikvot membranaktinlänkerprotein från −80 °C, tinar det snabbt vid 37 °C och förvarar det sedan på is. Späd alikvoten med proteinutspädningsbuffert till en koncentration av 1 μM.
- Tillsätt linkerproteinet i en definierad slutlig koncentration (vanligtvis 5-20 nM) och blanda försiktigt. För att säkerställa en snabb jämvikt av proteinet i kammaren, tillsätt volymer som är större än 20 μL genom att förblanda linkerproteinet med 1x KMEH.
- Inkubera i 40 minuter vid rumstemperatur. Tvätta 3x med 1x KMEH-buffert för att ta bort det obundna HSE-proteinet (som i steg 2.2.3.). För tillbaka buffertnivån i varje kammare till 100 μl-märket. Provet är nu klart för avbildning.
- Kvalitetsbedömning av lipid-dubbelskiktet
OBS: Detta är ett valfritt steg som inte behöver utföras varje gång. Vi rekommenderar att denna bedömning utförs varje gång färska stadsjeepar tillverkas av frysta MLV-lager.- Slå på mikroskopet, excitationslasrarna och detekteringskamerorna. Se till att lasern är inriktad, målet rengörs och programvaran är redo att skaffa bilder.
- Sätt olja på 100x-målet, montera provet på mikroskopsteget och fokusera målet på dubbelskiktet. Se till att laserpositionen är sådan att den genomgår total intern reflektion på provet. Använd en 488 nm excitationslaser för att kontrollera fluorescensintensitetsfördelningen för den dubbelskiktsbundna 10xHis-YFP-EzrinABD.
OBS: Bilayers av god kvalitet visar en storskalig, enhetlig fördelning av fluorescensintensiteten. Dåliga dubbelskikt visar intensiva och fläckiga fluorescerande fläckar. - För att bestämma dubbelskiktets integritet, utför en FRAP-analys.
- Välj ett område av intresse på dubbelskiktet och spela in några bilder av synfältet med hjälp av bildförhållanden som ger ett signal-brusförhållande på 5: 1 eller högre. Pausa inspelningen och stäng TIRF-mikroskopets fältmembran för att fokusera en koncentrerad laserstråle på ett litet cirkulärt område i dubbelskiktet för att lokalt bleka fluoroforerna.
- Slå på lasern till dess maximala utgång för att fotobleka det lilla området i 3-10 s och stäng sedan av lasern. Öppna fältmembranet igen till dess ursprungliga radie, justera avbildningstillståndet tillbaka till (förblekning) inställningar och fortsätt omedelbart att registrera återhämtningen av fluorescerande signal i synfältet.
- Kontrollera om dubbelskiktet är flytande. Bra dubbelskikt med normal lateral diffusion återhämtar sig snabbt, medan dåliga dubbelskikt återhämtar sig långsamt eller inte återhämtar sig alls (figur 3). Om dubbelskiktet inte återställs, kontrollera felsökningsavsnittet och starta om. Spara bilderna som 16-bitars TIFF-filer. För en kvantitativ uppskattning av diffusionskoefficienten, kontrollera steg 3. under.
- Polymerisation av fluorescerande aktin
OBS: För att spara tid, börja polymerisera aktin under inkubationstiden för HSE-proteinbindningen till dubbelskiktet (steg 2.3.) eller under kvalitetsbedömningen av dubbelskiktet (steg 2.4.).- Blanda omärkt och fluorescerande märkt G-aktin i ett 10: 1 molförhållande och fyll på det med G-buffert så att koncentrationen av G-aktin är 20 μM. Koncentrationen vid vilken aktin slutligen polymeriseras kommer att vara 1/4 av detta värde. Tillsätt 1/10 av 10x ME-bufferten till blandningen för en 1x-lösning och inkubera i 2 minuter. Detta steg ersätter Ca 2+ joner bundna till G-aktin med Mg2+ joner. Se till att den slutliga volymen är i multiplar på 10 μl.
- Tillsätt önskad mängd kapslingsprotein enligt följande. Tina en injektionsflaska med täckproteinbuljong snabbt vid 37 °C och förvara den sedan på is. Späd med G-buffert så att koncentrationen av kapsyleringsprotein nu är dubbelt så hög som den önskade slutliga koncentrationen i polymerisationsblandningen. Tillsätt en lika stor volym av den utspädda täckproteinlösningen till aktinblandningen från steg 2.5.1.
- Slutligen tillsätt en lika stor volym färsk 2x målbuffert till reaktionsblandningen. Den slutliga volymen av lösningen bör vara fyra gånger volymen av aktinblandningen i slutet av steg 2.5.2. Se till att den slutliga koncentrationen av KMEH är 1x, av ATP är 1 mM, av BSA är 1 mg / ml och av G-aktin är 5 μM.
Inkubera i mörker vid 25 °C i 45–60 minuter så att polymerisation kan ske.
OBS: Detta kallas målbuffertstrategin, där en volym Mg2+ G-aktin (steg 2.5.1.) blandas med en volym capping-proteinblandning (steg 2.5.2.) och två volymer 2x målbuffert (steg 2.5.3.). Detta gör det lättare att skala upp eller ner mängden aktin och att ändra den relativa koncentrationen av kapslingsprotein (eller någon annan aktinmodulator; Figur 4).
- Tillsats av fluorescerande aktinfilament
- Skär några 200 μL spetsar med ett vasst blad eller sax för att göra dem trubbiga. Pipettera försiktigt ut den erforderliga volymen av 5 μM polymeriserat aktin (från steg 2.5.3) med en trubbig pipettspets (för att förhindra skjuvning av aktinfilament) och tillsätt den i ett rent autoklaverat PCR-rör.
- Tillsätt 1x KMEH i röret för att göra volymen >20 μL och blanda försiktigt för att undvika skjuvning av F-aktin. Ta bort en lika stor volym av bufferten från den monterade provkammaren.
- Tillsätt den polymeriserade aktinlösningen i kammaren och pipettera försiktigt upp och ner 3x utan att vidröra dubbelskiktet längst ner. Detta gör att aktinfilament kan fördelas jämnt på dubbelskiktet. Montera provet på TIRF-mikroskopet (se steg 2.4.1 och steg 2.4.2).
- Man kan spela in processen med F-aktinbindning till dubbelskiktet. Inkubera i 20-30 min. Spela in några bilder från olika synfält efter att F-actin dessutom har nått ett stabilt tillstånd. Observera förändring i den rumsliga organisationen av 10xHis-YFP-EzrinABD före (homogen) och efter aktinorganisation.
OBS: HYE fördelas jämnt över lipid-dubbelskiktet i frånvaro av aktin. Vid tillsats av aktinfilament samlokaliseras HYE med F-aktin. Omfattningen av samlokalisering beror på den aktinbindande affiniteten hos linkerproteinet; ju starkare affinitet, desto högre samlokalisering och desto långsammare är länkproteinets laterala rörlighet (figur 5).
- Tillsats av myosin II
- Efter 30 minuters aktinkubation, montera provet tillbaka på mikroskopet (om det var avmonterat). Kontrollera signalen i länkprotein- och F-aktinkanalerna. Justera bildförhållandena om det behövs.
- Välj ett bra område med enhetlig länkproteinsignal och jämnt spridda aktinfilament och inga artefakter för en lång tidsfördröjningsregistrering. Spela in 10-15 bilder vid 0,1-0,2 Hz före myosintillägg och pausa inspelningen. Pipettera ut den erforderliga volymen av återvunnen muskelmyosin-II från lagerflaskan med en trubbig pipettspets (för att förhindra skjuvning av myosinfilament) och lägg till ett rent autoklaverat PCR-rör.
- Tillsätt omedelbart 1x KMEH i röret för att göra volymen >20 μL och blanda försiktigt. Man kan också lägga till ATP, ATP-regenererande blandning, fotostabiliserande medel etc. under detta steg. Ta försiktigt bort en lika stor volym av bufferten från den monterade provkammaren utan att störa den.
- Tillsätt försiktigt myosinlösningen i provkammaren. Pipettera inte upp och ner eftersom det kommer att störa de ytbundna filamenten. Återuppta omedelbart time-lapse-inspelningen och observera systemet när det utvecklas från pre-myosintillståndet till ATP-drivna kontraktila akto-myosinflöden och asterbildning till ett ATP-utarmat fastnat tillstånd (se representativa resultat).
- Ta bakgrundsbilder för alla kanaler med hjälp av ett buffertprov. Spara alla bilder som 16-bitars .tiff filer. Se tabell 2 för tips för att lösa vanliga problem.
Figur 3: Kvalitetsbedömning av dubbelskikten med snabb FRAP-analys. Lipid-dubbelskikt (SLB) framställda av DOPC- och Ni-NTA-lipider (98: 2 mol%) är belagda med HYE (10xHis-YFP-taggad membran-aktinlänkare). Efter att det obundna proteinet har tvättats ut avbildas det fluorescerande dubbelskiktet under ett TIRF-mikroskop. En liten region på dubbelskiktet fotobleks med hög laserkraft och återvinningen av fluorescens registreras. (A) Ett bra dubbelskikt återhämtar sig alltid snabbt, med en förväntad diffusionskoefficient på 1-1,5 μm2/s för lipidkompositionen som används i detta fall. (B) Dåliga dubbelskikt återhämtar sig mycket långsamt eller återhämtar sig inte alls. (C) Representativa bilder av dåliga dubbelskikt: (C-i) ett dubbelskikt med hål, (C-ii) ett dubbelskikt med stora, orörliga lipidfläckar och (C-iii) ett dubbelskikt med små, orörliga prickar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Schematisk som visar hur man polymeriserar aktin med målbuffertmetoden. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Rumslig organisation av HYE vid bindning till F-aktin. TIRF-ögonblicksbilder som visar den rumsliga organisationen av HYE före och efter tillsats av aktinfilament (märkt med Atto-635 maleimid). HYE-organisationen är homogen före tillsatsen av F-aktin och blir samlokaliserad och samjusterad längs aktinfilament. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Analys av data
- Använd Fiji-programvaran (https://imagej.net) och subtrahera bakgrunden från länkproteinbilderna (från steg 2.4.). Mät medelvärdena från den blekta fläcken och ett referensområde.
- Normalisera tidsspåren från den blekta fläcken och referensregionen till intensiteten hos deras respektive intensitetsvärden före blekmedel. Dela varje tidpunkt i de normaliserade blekta regionvärdena med respektive tidpunkter i den normaliserade tidsspårningen för referensregionen. Korrigera det resulterande normaliserade tidsspåret för bakgrund och för eventuella systematiska fluktuationer i intensitet under förvärvet (global fotoblekning, z-drift, etc.).
- Använd en monteringsfri, manuell metod28 för att uppskatta diffusionskoefficienten för de tvåskiktiga bundna proteinerna. I korthet kan halvtiden för återställningsprofilen, τ1/2, beräknas genom att titta på den tidpunkt då den normaliserade återhämtningsprofilen når hälften av sitt stabila tillstånd:
Här är F 0 medelintensiteten i det blekta området i den första ramen efter fotoblekning, och F∞ är det långsiktiga steady state-värdet för återvinning av dubbelskiktet. - Uppskatta den effektiva blekningsradien, re, en parameter som korrigerar för diffusion under fotoblekning, från en linjeskanning av fläckprofilen för blekmedel29. Halvbredden vid halva minimum av denna linjeskanning som passerar genom blekpunktens mittpunkt, r 1/2, avser re enligt följande:
Τ1/2 beräknat i steg 2.8.3, r e beräknat i steg 2.8.4 och den ursprungligen inställda blekmedelsradien, rn, används för att beräkna diffusionskoefficienten (D) med hjälp av följande formel:
- Använd en monteringsfri, manuell metod28 för att uppskatta diffusionskoefficienten för de tvåskiktiga bundna proteinerna. I korthet kan halvtiden för återställningsprofilen, τ1/2, beräknas genom att titta på den tidpunkt då den normaliserade återhämtningsprofilen når hälften av sitt stabila tillstånd:
- Bildanalys av aktomyosin asters
- Använd Fiji och subtrahera bakgrunden från alla inspelade bilder i alla kanaler. Korrigera bilderna för eventuella ojämna belysnings- eller störningsmönster med hjälp av plattfältskorrigering.
OBS: Man kan använda färgade plastglas, som är bra platta prover för att göra sådana korrigeringar. För linkerproteinet och aktinfilamenten på ett plant dubbelskikt kan man också använda den genomsnittliga projektionen av flera pre-myosinbilder för att skapa kanalspecifika belysningskorrigeringskartor.- För HYE-kanalen, som visas här, ta en genomsnittlig intensitetsprojektion av flera HYE-bilder (inspelade från olika regioner i lipid-dubbelskiktet före myosintillägg). Använd ett lämpligt Gaussiskt filter (σ = 50 pixlar till 80 pixlar) på den genomsnittliga projektionen (från pre-myosinbilder eller något vanligt platt prov).
- Konvertera den filtrerade bilden till en 32-bitarsbild. Dela alla pixelvärden med medelvärdet av hela bilden. Detta ger en normaliserad korrigeringskarta för HYE-kanalen. Dela upp alla bilder i HYE-kanalen med den här kartan för korrigering av platta fält. Skapa korrigeringskartor för andra kanaler med samma strategi.
- Korrigera för fotoblekning med en exponentiell eller enkel förhållandemetod (beroende på intensitetsförfallsprofilen) i Fiji.
- För att korrigera för eventuell tidsmässig x-y-feljustering (translationell rörelse), slå samman alla fotoblekningskorrigerade kanaler till en enda Hyperstack. Använd Hyperstack-Reg-plugin i Fiji, använd en stel kropp eller översättningstransformation.
- Slutligen dela upp den justerade Hyperstacken i enskilda kanaler och spara dem separat som 16-bitars TIFF-stackar för vidare analys.
- Använd Fiji och subtrahera bakgrunden från alla inspelade bilder i alla kanaler. Korrigera bilderna för eventuella ojämna belysnings- eller störningsmönster med hjälp av plattfältskorrigering.
Representative Results
För representation visas här en typisk postbleachprofil från den 1: a bilden efter fotoblekning (bild vid t = 0 s i figur 3A) och dess passform till följande funktion28 (se figur 6A):
Värdet på re (23,94 μm) beräknat genom anpassning till denna kurva är mycket likt det r e som beräknades i steg 2.8.4. (23,24 μm). Här är K en blekdjupsparameter som kan uppskattas direkt från F0 (beskrivs i steg 2.8.4.). På samma sätt visar figur 6B återställningsprofilen och dess anpassning till följande funktion28:
Vi finner att det anpassade värdet för diffusionskoefficienten är 1,34 μm 2 / s, ett värde som nära överensstämmer med värdet 1,39 μm 2 / s som beräknas med formeln i steg2.8.4. Här står MF för den mobila fraktionen av lipid-dubbelskiktet som representerar den bråkdel av den blekta populationen som återhämtar sig. Rörligheten hos lipidförankrade molekyler beror naturligtvis på lipidkompositionen och dess fysiska tillstånd (vätske- eller gelfas). För våra experiment med DOPC-baserade lipidmembran bör rörligheten vara >1 μm2/s, och den mobila fraktionen bör inte vara mindre än 0,9 för att indikera ett bra lipid-dubbelskikt. Vi rekommenderar att du använder den manuella monteringsfria metoden för ett snabbt test av dubbelskiktets kvalitet och rörlighet. Anpassningsmetoden kan vara användbar när du automatiserar analysen för många FRAP-kurvor. Vidare, om man vill utföra ett mer sofistikerat FRAP-experiment för att systematiskt karakterisera diffusion i systemet, rekommenderar vi läsaren till denna recension från Lorén et al.30 för mer detaljer om passande modeller och potentiella fallgropar i experimentell design.
Figur 6: Kvantifiering av diffusionskoefficienten för lipid-dubbelskikt. (A) Linjeprofil för den första bilden efter fotoblekning (t = 0 s i figur 3A) och dess anpassning till ekvation 4 för att beräkna den effektiva blekningsradien. (B) Det blekta områdets återhämtningsprofil och dess anpassning till ekvation 5 för att beräkna diffusionskoefficienten och den rörliga fraktionen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Ett typiskt resultat av de ovan beskrivna experimenten som visar den dynamiska sammansättningen och organisationen av ett akto-myosinnätverk kopplat på ett lipid-dubbelskikt som stöds av TIRF-mikroskopi visas i figur 7 och kompletterande video S1.
Figur 7 visar ett bildmontage av linkerproteinet, F-aktin och myosin-II.
Figur 7: Kontraktila aktomyosinflöden driver lokal klustring av membran-aktinlänkproteinet HYE. TIRF-ögonblicksbilder av HYE (YFP-märkta), aktinfilament (märkta med Atto-635 maleimid) och myosin II-filament (märkta med Atto-565 maleimid) vid tillsats av myosin II till en SLB innehållande HYE och F-aktin. Tiden anges på toppen: 0 min är omedelbart innan fluorescerande myofilament började dyka upp i TIRF-fältet. HYE och F-aktin fördelas homogent över lipid-dubbelskiktet före myosintillsats (0 min). Myosinaktivitet inducerar kontraktila aktomyosinflöden, som dyker upp i asterliknande strukturer vid steady state (15 min), vilket driver lokal klustring av den kopplade membrankomponenten (HYE). Den lägsta raden är en sammanslagning av aktin (gul) och myosin II (magenta) bilder som visar organisationen av aktin och myosin vid olika tidpunkter. Bilderna som användes för att göra dessa montage korrigerades i Fiji för bakgrundssignal, ojämna intensitetsmönster och translationell rörelse. Skalstreck = 10 μm. Mer information finns i Kompletterande video S1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Buffertens namn | Sammansättning | |
| Lipid Rehydrering buffert | 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5% sackaros, pH 7,5 | |
| SLB-bildningsbuffert | 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 5-6 | |
| SLB-lagringsbuffert | 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,2 | |
| Buffert för proteinutspädning | 20 mM HEPES, 100 mM KCl, 1mM TCEP eller DTT, pH 7,2 | |
| 1X ME eller Actin jonbytesbuffert | 50 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7,2 (förvaras vid 4°C) | |
| 1X KMEH eller aktinpolymerisationsbuffert | 50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 50 mM HEPES, pH 7,2 | |
| 100 mM ATP-lager | 100 mM ATP dinatriumsalt, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 2 mM EGTA, pH 7,5 (förvaras vid -20°C) | |
| 2x målbuffert | 2x KMEH, 2 mg/ml BSA, 2mM ATP, 5mM TCEP (förvaras vid 4°C) | |
| G-buffert | 2 mM Tris, 0,1 mM CaCl2, 0,2 mM ATP, 0,5 mM TCEP, 0,04 % NaN3, pH 8 (förvaras vid 4°C) | |
| Myosin II-buffert | 500 mM KCl, 1 mM EDTA, 10-20 mM Hepes, pH 7,0 | |
| Gelfiltreringskromatografi buffert | 50 mM Tris-HCl, 150-300 mM NaCl, 5 mM TCEP, 0,1% Tween-20, pH 7,5 | |
| Lagringsbuffert för tak för protein | 10 mM Tris· Cl, 50 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7,5, 20% glycerol | |
Tabell 1: Förteckning över buffertkompositioner som används i detta protokoll.
| Vanliga problem och deras felsökning | Problem | Orsak | Möjliga lösningar | ||||||
| 1 | Lipid dubbelskikt visar ingen diffusion | Den mest troliga orsaken till detta problem är smutsigt täckglas som kan hända när rengöringslösningen är åldrad eller uppvärmningen inte ägde rum under bad ultraljudsbehandling. Dessa dubbelskikt har ett "vesikulärt" utseende eftersom de sprängda vesiklarna fastnar på täckglaset men inte smälter samman med varandra. Att använda MLV som är äldre än 6 veckor eller stadsjeepar äldre än 6 dagar, eller lägga till låga mängder stadsjeepar kan också leda till vesikulär dubbelskiktsbildning. | Använd färsk rengöringslösning. Se till att värmaren är påslagen och att temperaturen är mellan 45-65 °C. Använd färska lipidblandningar. (Att använda en fluorescerande lipidsond kontra en fluorescerande proteinsond kan ibland manifestera sig annorlunda. T.ex. om dubbelskiktet har subdiffraktionsdefekter och ytpassiveringssteget hoppas över (eller inte fungerar), kommer lipidsonden att visa en enhetlig intensitetsfördelning men den fluorescerande proteinsonden kan visa ljusa fluorescerande fläckar.) | ||||||
| 2 | Lipid dubbelskikt har ljusa fläckar | Lång inkubation av stadsjeepar för dubbelskiktsbildning kan skapa ett lipid-dubbelskikt som är övergripande diffunderande men med enstaka ljusa fläckar. Dessa fläckar kan vara flerskiktiga dubbelskikt som kan locka till sig stora mängder fluorescerande sond. | 15-20 min inkubation med SUV räcker. Se till att sonden inte aggregeras: en snabb hård snurrning av linkerproteinet (300 x g i 15 minuter vid 4 ° C) kan ta bort aggregaten | ||||||
| 3 | Lipid dubbelskikt har mörka hål | Detta händer när dubbelskiktet är tillverkat av gamla SUV: er och avbildat under längre timmar (> 4 timmar efter bildning), eller lösningens pH förändras drastiskt på grund av långvarig avbildning (t.ex. i högt ATP-tillstånd och i närvaro av vissa syreavskiljare), eller när ytan är över-passiverad med beta-kasein (tillsätter för mycket beta-kasein i mer än 10-15 minuter och eller inte tvättar ut det). | Använd färska lipider. Minska bildfrekvensen eller den effektiva laserbelysningstiden. Använd buffertar med högre buffringskapacitet. | ||||||
| 4 | Lipid dubbelskikt visar långsam diffusion | Lipid dubbelskikt med hög andel kolesterol, långa mättade lipider eller laddade lipider diffunderar långsammare. | Förbered i sådana fall ditt prov vid hög temperatur. Man kan också använda en enkel, testad lipidkomposition som en kontroll tillsammans med komplexa och otestade lipidkompositioner. Se till att glaset är rent. | ||||||
| 5 | Aktin polymeriserar inte | Målbufferten är gammal, G-aktinlagret är för gammalt, gammalt och nytt G-aktin sampolymeriserades. | Se till att Ca 2+ ersätts med Mg2+ före polymerisation (med ME-buffert). Använd färsk ATP-Mg2+ lager. Använd nyåtervunnet G-aktin. Se till att koncentrationen av F-aktin (i termer av G-aktin) som tillsätts till dubbelskiktet är högre än 0,2 μM. För lägre koncentrationer, använd falloidinstabiliserat F-aktin. | ||||||
| 6 | Aktin binder inte till dubbelskiktet | Membran-aktinlänkare tillsätts eller tillsätts inte vid mycket låg koncentration - detta kan härledas från fluorescensen hos linkerproteinet. Om fluorescensen är anständig har membran-aktinlänkaren förlorat aktinbindande kapacitet. Om länkproteinet är icke-specifikt bundet till glasytan (när dubbelskiktet är dåligt) kanske det inte rekryterar aktinfilament. | Se till att dubbelskiktet sprider sig. Använd färskt linkerprotein | ||||||
| 7 | Fluorescerande F-aktinsignal är svag | Förhållandet mellan märkt och mörkt aktin är för lågt. Antingen det märkta aktinet eller det omärkta aktinet är för gammalt och de sampolymeriseras inte med varandra. | Återvinn aktin igen och försök igen med nyåtervunnet aktin. Fotoskador kan förstöra eller depolymerisera F-aktin; Använd om möjligt röda eller fjärrröda färgämnen för aktin (och myosin). | ||||||
| 8 | Myosin visar inte kontraktilitet | Det kan observeras att efter tillsats av ATP till det myosininfunderade systemet finns det ingen kontraktilitet hos akto-myosinet. | Kontrollera om myosinkoncentrationen eller renhetsnivån är bra. Använd nyåtervunnet myosin (använd inom 6 veckor efter återvinning). Att lägga till färsk ATP till myosinblandningen kan hjälpa till. Avgasningsbuffertar och användning av syreavskiljare etc. kan minska fotoskador på motorerna. Ytterligare information kan hittas i protokollen av Plastino et al. eller Stam et al. av samma metodsamling | ||||||
| 9 | Coverglass är inte hydrofilt | Coverglass rengörs inte ordentligt. | Rent hydrofillliskt täckglas är avgörande för lipid-dubbelskiktsbildningen. En användbar, visuell avläsning av täckglasets hydrofilicitet efter rengöringsprotokollet är att observera vätningen av glaset med vatten. Tillsätt en liten volym vatten till en platt liggande täckglas. Vattnet kommer att förbli i form av en rund droppe om täckglaset inte rengörs ordentligt. Samma volym vatten kommer emellertid att spridas ut och bilda ett tunt skikt på ett behandlat hydrofilt täckglas. Detta vätningsbeteende hos vattnet på täckglasytan kan användas för att fastställa om rengöringsstegen med rengöringslösningen/NaOH har fungerat. | ||||||
Tabell 2: Felsökningsguide som sammanfattar vanliga problem och motsvarande lösningar.
Kompletterande video S1: Kontraktila aktomyosinflöden driver lokal klustring av membran-aktinlänkproteinet HYE. TIRF-timelapse av HYE (YFP-märkt), aktinfilament (märkt med Atto-635 maleimid) och myosin II-filament (märkta med Atto-565 maleimid) vid tillsats av myosin II till en SLB innehållande HYE och F-aktin. Tiden anges på toppen: 0 min är omedelbart innan fluorescerande myofilament började dyka upp i TIRF-fältet. Skalstreck = 10 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Detta protokoll presenterar en mångsidig plattform och en utgångspunkt för att designa experiment för att studera membran-cortex-gränssnittet mellan celler. Kritiska steg är beredningen av rena glasskivor, med användning av färska lipider för effektiv SUV-bildning (båda påverkar kvaliteten på SLB) och användningen av nyåtervunna myosin II-proteiner för dynamisk omorganisation av aktinfilament. Vid avbildningsdynamik under lång tid är det mycket viktigt att införliva ett syreavskiljningssystem (t.ex. protocatechuic syra och protocatechuate 3 4-dioxygenas 5,31).
Den öppna kammarens design möjliggör sekventiell tillsats av komponenter till ett befintligt system utan att inducera lipidflöden. Detta kan vara en viktig fördel jämfört med vanliga metoder med slutna kammare eller arbete med inkapslade proteiner inom liposomer36. Motsatta effekter såsom proteininducerad membrandeformation kan inte studeras med glasadsorberade lipid-dubbelskikt.
Lipid-dubbelskikten kan bildas med ett brett spektrum av lipidkompositioner. Det börjar med adsorption av lipidblåsorna till den hydrofila glasytan, följt av antingen spontan vesikelbrott på grund av yt-vesikel och direkta vesikel-vesikelinteraktioner eller de adsorberade vesiklarna som når en kritisk täckning varefter en liten del av vesiklarna brister och bildar aktiva kanter, vilket så småningom leder till dubbelskiktsbildningen32 . Förutom glas kan olika substrat användas för att bilda stödda lipid-dubbelskikt, såsom glimmer (t.ex. för atomkraftsmikroskopi), mjuka substrat (t.ex. poly-di-metyl-siloxan), polymerkuddar33,34,35, som sträcker sig mellan hål i elektronmikroskopigaller 14. Droplet interface bilayers är en annan intressant metod för att skapa stabila, fristående lipid-dubbelskikt36. Införandet av akto-myosinnätverk i vesiklar eller emulsioner är en mycket kraftfull metod för att studera detta minimala system i en cellliknande geometri37,38, och som beskrivs i detalj någon annanstans 39.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av AXA-forskningsfonden och Warwick-Wellcome Quantitative Biomedicine Programme (Wellcome ISSF, RMRCB0058) för DVK, NCBS-TIFR för AB och ST, och Wellcome-DBT Margdarshi-stipendiet (IA / M / 15/1 / 502018) för SM. DVK vill också tacka Biophysical Society för att ha möjliggjort det virtuella nätverksevenemanget "Utmaningar för att förstå flerkomponents cytoskelettala nätverk från molekylär till meso-skala", som bidrog till skapandet av denna protokollsamling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2 dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- (lissamine rhodamine B sulfonyl) | Avanti Polar Lipids | 810158 | 16:0 RhoPE |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3- [(N-(5-amino-1 carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids | 790404 | DGS-NTA-Ni2+ |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375 | DOPC |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850355 | DPPC |
| Amber glass vials | ThermoFisher | B7990-2A | |
| ATP disodium salt | Sigma Aldrich | A26209 | |
| Attofluor cell chamber | ThermoFisher | A7816 | |
| Bath sonicator | GT Sonic | 1860QTS | |
| beta-casein | Sigma Aldrich | C6905 | |
| CaCl2 | ThermoFisher | 12135 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 650471 | alternatively from Electron Microscopy Sciences, 50980296 |
| Cover slips, #1, 25 mm diameter, Gold Seal | Harvard Apparatus | 64-0705B | |
| Cover slips, #1, 40x22 mm, Gold Seal | ThermoFisher | 48404-031 | |
| EDTA | ThermoFisher | G12635 | |
| EGTA | Himedia | MB130 | |
| Gas tight glass syringes, with removebla needle, blunt, volumes 10 µL, 100 µL, 500 µL | Hammilton | 1700 series | |
| Hellmanex III | Hellma Analytics | Z805939 | cleaning solution |
| HEPES | Himedia | RM380 | |
| KaH2PO4 | ThermoFisher | G13405 | |
| KCl | ThermoFisher | G13305 | |
| KOH | ThermoFisher | G26708 | |
| Lipid extruder | Avanti Polar Lipids | 61000-1EA | |
| MgCl2 | ThermoFisher | G15535 | |
| Microtip sonicator | Sonics | VC750 | 3 mm Tip diameter |
| Na2CO3 | ThermoFisher | G15955 | |
| NaCl | Himedia | GRM853 | |
| NaH2PO4 | ThermoFisher | G15825 | |
| NaOH | ThermoFisher | G27815 | |
| Nikon Ti Eclipse TIRF microscope | Nikon | With a TIRF unit connected through a polarization-conserving optical fibre to an Agilent monolithic laser combiner MLC400 with multiple laser lines with a 100X, 1.45 NA Nikon Oil Objective with two 512 x 512-pixel EMCCD cameras (Photometrics Evolve 512) with a 100X, 1.45 NA Nikon Oil Objective with two 512 x 512-pixel EMCCD cameras (Photometrics Evolve 512) | |
| NOA88 | Norland Products | 8801 | |
| PTFE Coated Tweezer Style #2A | Structure Probe | 0S2AT-XD | |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Sucrose | ThermoFisher | G15925 | |
| UV-illuminator | Novascan | PSD PRO-UV | needs vacuum and O2 supply |
References
- Köster, D. V., Mayor, S. Cortical actin and the plasma membrane: Inextricably intertwined. Current Opinion in Cell Biology. 38, 81-89 (2016).
- Rao, M., Mayor, S. Active organization of membrane constituents in living cells. Current Opinion in Cell Biology. 29, 126-132 (2014).
- Honigmann, A., et al. A lipid bound actin meshwork organizes liquid phase separation in model membranes. eLife. 3, 01671 (2014).
- Das, A., et al. Stratification relieves constraints from steric hindrance in the generation of compact actomyosin asters at the membrane cortex. Science Advances. 6 (11), (2020).
- Köster, D. V., et al. Actomyosin dynamics drive local membrane component organization in an in vitro active composite layer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (12), 1645-1654 (2016).
- Vogel, S. K., Heinemann, F., Chwastek, G., Schwille, P. The design of MACs (minimal actin cortices). Cytoskeleton. 70 (11), 706-717 (2013).
- Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M.
- Mosby, L. S., et al. Myosin II filament dynamics in actin networks revealed with interferometric scattering microscopy. Biophysical Journal. 118 (8), 1946-1957 (2020).
- Seara, D. S., et al. Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin. Nature Communications. 9 (1), 4948 (2018).
- Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7, 12615 (2016).
- Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments. eLife. 2, 00116 (2013).
- Ditlev, J. A., et al. A composition-dependent molecular clutch between T cell signaling condensates and actin. eLife. 8, 42695 (2019).
- Banjade, S., Rosen, M. K. Phase transitions of multivalent proteins can promote clustering of membrane receptors. eLife. 3, 04123 (2014).
- Heinemann, F., Vogel, S. K., Schwille, P. Lateral membrane diffusion modulated by a minimal actin cortex. Biophysical Journal. 104 (7), 1465-1475 (2013).
- Vogel, S. K., Greiss, F., Khmelinskaia, A., Schwille, P. Control of lipid domain organization by a biomimetic contractile actomyosin cortex. eLife. 6, 24350 (2017).
- Block, S. Brownian motion at lipid membranes: A comparison of hydrodynamic models describing and experiments quantifying diffusion within lipid bilayers. Biomolecules. 8 (2), 30 (2018).
- JoVE, JoVE. JoVE Methods Collection. In vitro reconstitution of cytoskeleton networks for biomaterials, biophysics and active matter research. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).
- Pardee, J. D., Spudich, J. A.
- Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
- Pollard, T. D.
- JoVE Science Education Database.
- Bieling, P., et al. WH2 and proline-rich domains of WASP-family proteins collaborate to accelerate actin filament elongation. The EMBO Journal. 37 (1), 102-121 (2018).
- Shrivastava, R., Köster, D., Kalme, S., Mayor, S., Neerathilingam, M. Tailor-made ezrin actin binding domain to probe its interaction with actin in-vitro. PLoS One. 10 (4), 0123428 (2015).
- Nye, J. A., Groves, J. T. Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers. Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).
- Honigmann, A., et al. Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells. Nature Communications. 5, 5412 (2014).
- Selden, N. S., et al. Chemically programmed cell adhesion with membrane-anchored oligonucleotides. Journal of the American Chemical Society. 134 (2), 765-768 (2012).
- Seu, K. J., et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).
- Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K., DiBenedetto, E. Simplified equation to extract diffusion coefficients from confocal FRAP data. Traffic. 13 (12), 1589-1600 (2012).
- Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K. A novel computational framework for D(t) from Fluorescence Recovery after Photobleaching data reveals various anomalous diffusion types in live cell membranes. Traffic. 20 (11), 867-880 (2019).
- Lorén, N., et al. Fluorescence recovery after photobleaching in material and life sciences: Putting theory into practice. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (3), 323-387 (2015).
- Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (7), 1-7 (2013).
- Andrecka, J., Spillane, K. M., Ortega-Arroyo, J., Kukura, P. Direct observation and control of Supported lipid bilayer formation with interferometric scattering microscopy. ACS Nano. 7 (12), 10662-10670 (2013).
- Lin, W. -C., et al. Supported membrane formation, characterization, functionalization, and patterning for application in biological science and technology. Current Protocols in Chemical Biology. 2 (4), 235-269 (2010).
- Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
- Sapuri-Butti, A. R., Butti, R. C., Parikh, A. N. Characterization of supported membranes on topographically patterned polymeric elastomers and their applications to microcontact printing. Langmuir. 23 (25), 12645-12654 (2007).
- Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
- Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. iScience. 25 (5), 104236 (2022).
- Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments. (177), e63332 (2021).
- Murrell, M., Chen, S., Sun, Z. G. In vitro reconstitution of actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
