该协议描述了支持的脂质双层的形成以及细胞骨架丝和运动蛋白的添加,以使用荧光显微镜研究重组,膜系留细胞骨架网络的动力学。
活细胞的表面为许多细胞过程提供了一个多功能的活性平台,这些过程是由质膜与底层肌动蛋白皮层的相互作用引起的。在过去的几十年中,基于支持的脂质双层与肌动蛋白丝网络相结合的重组最小系统已被证明在揭示膜系链肌动蛋白网络的基本机制和后果以及研究单个膜相关蛋白的功能方面非常有帮助。在这里,我们描述了如何在 体外 重建这种活性复合系统,该系统由流体支持的脂质双层组成,通过膜相关的肌动蛋白结合蛋白偶联到动态肌动蛋白丝和肌球蛋白马达,可以通过全内反射荧光显微镜轻松观察到。开放式腔室设计允许人们逐步组装系统,并系统地控制许多参数,例如接头蛋白浓度、肌动蛋白浓度、肌动蛋白丝长、肌动蛋白/肌球蛋白比率以及 ATP 水平。最后,我们讨论了如何控制系统的质量,如何检测和排除常见问题,以及该系统与活细胞表面相比的一些局限性。
活体动物细胞的质膜不断与相邻的肌动蛋白细胞骨架相互作用,它们共同形成活性复合材料,实现多种细胞功能1,2。为了研究这种脂质膜-肌动蛋白界面的过程,在支持的脂质双层(SLB)之上重建细胞骨架网络已被证明是非常有帮助的。这种最小的系统方法可以精确控制细胞骨架网络成分和脂质组成。与巨型单层囊泡的独立式脂质膜相比,SLB的平面几何形状允许有效使用最先进的显微镜技术,例如超分辨率3,4,全内反射荧光(TIRF)5,6,7或干涉散射8 研究细胞骨架网络的空间组织和动力学。TIRF为荧光标记的组分提供了最高的对比度,因为溶液中未结合的标记分子对背景信号的贡献很小。
在这里,我们描述了一种基本协议,用于形成与支持的脂质双层相连的肌动球蛋白网络,该协议在该领域广泛用于研究活性准2D网络9,10,11的物理学及其对膜组织3,5,12,13,14,15,16的影响(图1).这种方法不仅限于基于肌动蛋白的网络,而且还可以很容易地适应于探索微管、中间丝或混合性质的复合网络,并使用表面敏感的显微镜方法研究脂质膜蛋白和细胞骨架成分之间的各种相互作用。
为了使该协议保持重点,我们排除了对肌动蛋白和肌球蛋白纯化和标记的详细描述,或有关如何调整和控制肌动球蛋白网络的收缩性和组织的详细信息。应该参考与JoVE方法集合,用于生物材料,生物物理学和活性物质研究的细胞骨架网络的体外重建17中发表的其他协议。
图1: 体外 肌动蛋白-膜活性复合体系示意图。 使用生物渲染创建。 请点击此处查看此图的大图。
该协议提供了一个多功能平台和设计实验以研究细胞的膜 – 皮层界面的起点。关键步骤是制备干净的载玻片,使用新鲜脂质进行有效的SUV形成(两者都会影响SLB的质量),以及使用新鲜回收的肌球蛋白II蛋白进行动态肌动蛋白丝重组。当长时间成像动力学时,结合除氧系统(例如,原儿茶酸和原儿茶酸3 4-双加氧酶5,31)非常重要。
开腔设计允许在不诱导脂质流动的情况下按顺序向现有系统添加组件。与常用的封闭室方法或使用脂质体36中的封装蛋白质相比,这可能是一个重要的优势。相反的影响,如蛋白质诱导的膜变形,不能用玻璃吸附的脂质双层来研究。
脂质双层可以用多种脂质组成形成。它首先将脂质囊泡吸附到亲水玻璃表面,然后是由于表面-囊泡和直接囊泡-囊泡相互作用引起的自发囊泡破裂,或者吸附的囊泡达到临界覆盖率,之后一小部分囊泡破裂,形成活性边缘,最终导致双层形成32.除玻璃外,各种基底可用于形成支撑的脂质双层,例如云母(例如,用于原子力显微镜),软基底(例如,聚二甲基硅氧烷),聚合物垫33,34,35,跨越电子显微镜网格的孔之间14。液滴界面双层是另一种创建稳定、独立的脂质双层的有趣方法36。将肌球蛋白网络包含在囊泡或乳液中是一种非常有效的方法,可以在细胞状几何中研究这种最小系统37,38,并在其他地方详细描述39。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了AXA研究基金和沃里克-惠康定量生物医学计划(Wellcome ISSF,RMRCB0058)的支持,用于DVK,NCBS-TIFR用于AB和ST,以及Wellcome-DBT Margdarshi奖学金(IA / M / 15 / 1 / 502018)用于SM。 DVK还要感谢生物物理学会启用虚拟网络活动“从分子到中尺度理解多组分细胞骨架网络的挑战”, 这有助于创建此协议集合。
1,2 dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- (lissamine rhodamine B sulfonyl) | Avanti Polar Lipids | 810158 | 16:0 RhoPE |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3- [(N-(5-amino-1 carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids | 790404 | DGS-NTA-Ni2+ |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375 | DOPC |
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850355 | DPPC |
Amber glass vials | ThermoFisher | B7990-2A | |
ATP disodium salt | Sigma Aldrich | A26209 | |
Attofluor cell chamber | ThermoFisher | A7816 | |
Bath sonicator | GT Sonic | 1860QTS | |
beta-casein | Sigma Aldrich | C6905 | |
CaCl2 | ThermoFisher | 12135 | |
chloroform | Sigma Aldrich | 650471 | alternatively from Electron Microscopy Sciences, 50980296 |
Cover slips, #1, 25 mm diameter, Gold Seal | Harvard Apparatus | 64-0705B | |
Cover slips, #1, 40×22 mm, Gold Seal | ThermoFisher | 48404-031 | |
EDTA | ThermoFisher | G12635 | |
EGTA | Himedia | MB130 | |
Gas tight glass syringes, with removebla needle, blunt, volumes 10 µL, 100 µL, 500 µL | Hammilton | 1700 series | |
Hellmanex III | Hellma Analytics | Z805939 | cleaning solution |
HEPES | Himedia | RM380 | |
KaH2PO4 | ThermoFisher | G13405 | |
KCl | ThermoFisher | G13305 | |
KOH | ThermoFisher | G26708 | |
Lipid extruder | Avanti Polar Lipids | 61000-1EA | |
MgCl2 | ThermoFisher | G15535 | |
Microtip sonicator | Sonics | VC750 | 3 mm Tip diameter |
Na2CO3 | ThermoFisher | G15955 | |
NaCl | Himedia | GRM853 | |
NaH2PO4 | ThermoFisher | G15825 | |
NaOH | ThermoFisher | G27815 | |
Nikon Ti Eclipse TIRF microscope | Nikon | With a TIRF unit connected through a polarization-conserving optical fibre to an Agilent monolithic laser combiner MLC400 with multiple laser lines with a 100X, 1.45 NA Nikon Oil Objective with two 512 x 512-pixel EMCCD cameras (Photometrics Evolve 512) with a 100X, 1.45 NA Nikon Oil Objective with two 512 x 512-pixel EMCCD cameras (Photometrics Evolve 512) | |
NOA88 | Norland Products | 8801 | |
PTFE Coated Tweezer Style #2A | Structure Probe | 0S2AT-XD | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424R | |
Sucrose | ThermoFisher | G15925 | |
UV-illuminator | Novascan | PSD PRO-UV | needs vacuum and O2 supply |