Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Generering av multicue cellulære mikromiljøer ved UV-fotopatterning av tredimensjonale cellekultursubstrater

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63988
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Complex Molecular Systems, Eindhoven University of Technology

Summary

Tradisjonelt utføres cellekultur på plane substrater som dårlig etterligner det naturlige miljøet til celler in vivo. Her beskriver vi en metode for å produsere cellekultursubstrater med fysiologisk relevante buede geometrier og mikropatternerte ekstracellulære proteiner, noe som muliggjør systematiske undersøkelser av cellulær sensing av disse ekstracellulære signalene.

Abstract

Den ekstracellulære matrisen er en viktig regulator av cellefunksjon. Miljømessige signaler som eksisterer i det cellulære mikromiljøet, som ligandfordeling og vevsgeometri, har i økende grad vist seg å spille kritiske roller i styring av cellefenotype og oppførsel. Imidlertid studeres disse miljømessige signalene og deres effekter på celler ofte separat ved hjelp av in vitro-plattformer som isolerer individuelle signaler, en strategi som sterkt overforenkler den komplekse in vivo-situasjonen med flere signaler. Tekniske tilnærminger kan være spesielt nyttige for å bygge bro over dette gapet ved å utvikle eksperimentelle oppsett som fanger kompleksiteten til in vivo mikromiljøet, men beholder graden av presisjon og manipulerbarhet av in vitro-systemer .

Denne studien fremhever en tilnærming som kombinerer ultrafiolett (UV) -basert proteinmønster og litografibasert substratmikrofabrikasjon, som sammen muliggjør undersøkelse av celleadferd med høy gjennomstrømning i multicue-miljøer. Ved hjelp av maskeløs UV-fotopatterning er det mulig å lage komplekse, klebende proteinfordelinger på tredimensjonale (3D) cellekultursubstrater på sjetonger som inneholder en rekke veldefinerte geometriske signaler. Den foreslåtte teknikken kan brukes til kultursubstrater laget av forskjellige polymere materialer og kombinert med limmønstrede områder av et bredt spekter av proteiner. Med denne tilnærmingen kan enkeltceller, så vel som monolag, bli utsatt for kombinasjoner av geometriske signaler og kontaktveiledningssignaler presentert av de mønstrede substratene. Systematisk forskning ved hjelp av kombinasjoner av chipmaterialer, proteinmønstre og celletyper kan dermed gi grunnleggende innsikt i cellulære responser på multicue-miljøer.

Introduction

In vivo blir celler utsatt for et bredt spekter av miljømessige signaler som kan være av mekanisk, fysisk og biokjemisk natur som stammer fra den ekstracellulære matrisen (ECM). Tallrike miljømessige signaler har blitt identifisert for å spille viktige roller i reguleringen av celleadferd, som spredning, differensiering og migrasjon 1,2,3,4,5. Et av de mest undersøkte fenomenene er kontaktveiledning, som beskriver adhesjonsmediert cellejustering langs anisotrope biokjemiske eller topografiske mønstre tilstede på det ekstracellulære substratet 6,7,8,9,10,11. Utover å styre justeringen av celler, har kontaktveiledningssignaler også vist seg å påvirke andre celleegenskaper som cellemigrasjon, organisering av intracellulære proteiner, celleform og celle skjebne 12,13,14,15. I tillegg har den geometriske arkitekturen til det 3D-cellulære miljøet også blitt anerkjent for sin regulatoriske innflytelse på celleadferd 16,17. I menneskekroppen blir celler utsatt for en rekke buede geometrier, alt fra mikroskala kollagenfibre, kapillærer og glomeruli, opp til mesoskala alveoler og arterier18,19. Interessant nok har nyere in vitro-studier vist at celler kan fornemme og reagere på slike fysiske signaler, fra nano- til mesoskala 20,21,22,23.

Til dags dato har de fleste studier som undersøker cellerespons på miljøsignaler i stor grad blitt utført ved hjelp av eksperimentelle oppsett som isolerer enkeltsignaler. Selv om denne tilnærmingen har tillatt enorme fremskritt i å forstå de grunnleggende mekanismene bak cellulær sensing av miljømessige signaler, rekapitulerer den dårlig det in vivo miljøet som samtidig presenterer flere signaler. For å bygge bro over dette gapet er det nyttig å utvikle kulturplattformer der flere miljøsignaler kan kontrolleres uavhengig og samtidig. Dette konseptet har fått økende trekkraft i det siste24,25, med studier som kombinerer matrisestivhet og ligandtetthet 26,27,28,29, substratstivhet og porøsitet30, substratstivhet og 3D mikronichevolum 31, overflatetopografi ogkontaktveiledningssignaler 32,33,34 , og nanoskala kontaktveiledningssignaler med mesoskala krumningsveiledning23. Det er imidlertid fortsatt utfordrende å kombinere kontaktveiledningssignaler med en rekke 3D-geometrier på en kontrollert og høy gjennomstrømningsmåte.

Denne forskningsprotokollen adresserer denne utfordringen og introduserer en metode for å lage cellekultursubstrater med en kontrollert kombinasjon av mønstrede klebende områder av ECM-proteiner (kontaktveiledningssignaler) og substratkrumning (geometriske signaler). Denne tilnærmingen tillater disseksjon av cellerespons i et biomimetisk multicue-miljø på en systematisk og høy gjennomstrømnings måte. Kunnskapen som er oppnådd kan hjelpe til med videre forståelse av celleadferd i komplekse miljøer og kan brukes til å designe lærerike materialer med egenskaper som styrer celleresponser til et ønsket resultat.

Fotopatterning av 3D-proteiner
Opprettelse av klebende områder av ECM-proteiner (kontaktveiledningssignaler) på cellekulturmaterialer kan oppnås ved hjelp av en rekke teknikker, for eksempel ved dyp ultrafiolett (dyp UV) mønster eller mikrokontaktutskrift35,36. Deep-UV-mønster bruker UV-lys som projiseres gjennom en maske på et polymert materiale for å nedbryte passiveringspolymerer på bestemte steder på cellekultursubstratet. Det mønstrede substratet inkuberes deretter med en ligand av interesse, noe som resulterer i klebende områder som støtter cellefeste og kultur på forhåndsdefinerte steder 12,37,38. En alternativ måte å introdusere proteinmønstre på er ved hjelp av mikrokontakttrykk, hvor elastomere frimerker som inneholder ønsket form er belagt med et valgfritt protein og presses på et cellekultursubstrat, og overfører dermed proteinbelegget som celler kan feste seg til 35,37,39,40 . Dessverre, siden begge teknikkene er avhengige av maskeforberedelse og myke litografimetoder, er eksperimentene tidkrevende og arbeidskrevende, så vel som begrensede når det gjelder mønsterfleksibilitet. I tillegg er både dyp UV-mønster og mikrokontaktutskrift mest egnet for plane materialer og er teknisk vanskelig, om ikke umulig, for mønsterligander i et 3D-miljø.

For å forbedre disse konvensjonelle metodene kombinerte Waterkotte et al. maskeløs litografi, kjemisk dampavsetning og termoforming for å generere mikropatterned 3D polymere substrater41. Imidlertid er denne teknikken avhengig av bruk av termoformbare polymerfilmer og tilbyr lav proteinmønsteroppløsning (7,5 μm), mens celler har blitt rapportert å reagere på geometriske proteinmønstre så små som 0,1 μm 2,42. Sevcik og medarbeidere beskrev en annen lovende metode for nanopattern ECM-ligander på substrater som inneholder nano- og mikrometer-topografi43. Ved hjelp av mikrokontakttrykk ble ECM-proteiner overført fra polydimetylsiloksan (PDMS) frimerker til et termoresponsivt poly (N-isopropylacrylamid) (pNIPAM) substrat. Deretter tillot den termoresponsive egenskapen til pNIPAM-nettverket dem å overføre det todimensjonale (2D) proteinmønsteret til et topografisk PDMS-substrat (10-100 μm dype spor), og dermed kontrollere lokaliseringen av adhesjonssteder på topografiske egenskaper. Imidlertid kan ikke alle mulige mikrotopografier mønstres siden reduserte fuktbarhetsproblemer gjør det vanskeligere å mønstre dypere topografiske substrater. Grøfter med et dybde-til-bredde-sideforhold på 2,4 har blitt rapportert å være den ultimate grensen for vellykket overføring av mønsteret til det topografiske substratet43. I tillegg er fleksibiliteten til varierende mønstre og oppløsningen til de genererte mønstrene dårlig på grunn av kravet til mikrokontaktutskrift.

Denne artikkelen beskriver en metode som overvinner de ovennevnte flaskehalsene og tilbyr en fleksibel og høy gjennomstrømningsmetode for å lage multikusubstrater som kan brukes til cellekultur (se figur 1). Fysiologisk relevante geometrier (sylindere, kupler, ellipser og sadeloverflater) med krumninger fra ĸ = 1/2500 til ĸ = 1/125 μm-1 er forhåndsdesignet og mikrofabrikkert i PDMS-brikker. Deretter opprettes kontaktveiledningssignaler på toppen av 3D-geometriene ved hjelp av en rekke digitale mønsterdesign ved å bruke en fotopatteringsteknikk med en oppløsning så liten som 1,5 μm44. For dette formål blir PDMS-sjetongene i utgangspunktet passivert for å forhindre at celler og proteiner fester seg; dette passiveringslaget kan deretter fjernes ved kombinasjon av fotoinitiatoren 4-benzoylbenzyl-trimetylammoniumklorid (PLPP) og UV-lyseksponering45. En digital maske er designet for å spesifisere plasseringen av UV-eksponering, og dermed området der passiveringslaget fjernes. Proteiner kan deretter feste seg til disse områdene, noe som muliggjør cellefeste. Siden mønsteret utføres ved hjelp av en digital (i stedet for en fysisk) maske, kan en rekke mønstre opprettes raskt uten problemer og kostnader forbundet med å designe og produsere flere fotomasker. I tillegg kan et mangfoldig utvalg av ECM-proteiner (f.eks. Kollagen type I, gelatin og fibronektin) mønstres på substratet. Selv om denne protokollen utføres ved hjelp av cellekulturbrikker laget av PDMS, kan prinsippet brukes på ethvert annet materiale av interesse46.

Protocol

I studiene beskrevet i denne protokollen ble primære humane keratocytter brukt. Denne undersøkelsen ble utført i samsvar med prinsippene i Helsinkideklarasjonen. Primære keratocytter ble isolert fra rester av humant kadaverisk corneoskleralt vev fra Descemet Membrane Endothelial Keratoplasty kirurgi, som ble oppnådd fra Hornhinneavdelingen ved ETB-BISLIFE Multi-Tissue Center (Beverwijk, Nederland) etter å ha innhentet samtykke fra pårørende til alle avdøde givere.

MERK: Se materialtabellen for detaljer om alle materialer, reagenser, utstyr og programvare som brukes i denne protokollen.

1. Fabrikasjon av 3D-cellekultursubstrater

  1. Lag en negativ glassform (# 1) som inneholder alle funksjoner av interesse, i dette tilfellet laget av glass ved hjelp av en femtosekund-laser direkte skriveteknikk (se figur 2).
  2. Plasser forsiktig den negative glassformen (#1) på bunnen av en petriskål.
  3. Forbered en PDMS-prepolymer ved å plassere et tomt 50 ml konisk rør på en skala, tare skalaen og hell ønsket mengde silikonelastomerbase inn i røret.
  4. Tilsett herdemiddel ved hjelp av en Pasteur-pipet slik at det endelige forholdet mellom elastomerbase og herdemiddel er 10: 1 (w / w).
  5. Bland komponentene grundig i det koniske røret ved hjelp av en slikkepott.
  6. Sentrifuge ved 2000 × g i 70 s for å fjerne alle luftbobler.
  7. Hell PDMS-prepolymeren på toppen av den negative glassformen (#1) i petriskålen for å dekke den helt.
  8. Plasser petriskålen med den negative glassformen (#1) og PDMS-prepolymeren i vakuumtørkeren og start vakuumpumpen. Når et vakuum er nådd, vent i 5 minutter for å fjerne alle bobler som er tilstede i grensesnittet mellom formoverflaten og PDMS-prepolymeren.
  9. Fjern vakuumet og ta petriskålen ut av tørkevæsken.
  10. Herd PDMS-prepolymeren over natten i ovnen ved 65 °C.
  11. Fjern forsiktig den nylig herdede positive PDMS-brikken (# 2) fra den negative glassformen (# 1) ved å løfte kantene på PDMS ved hjelp av en slikkepott. Hvis den positive PDMS-brikken (# 2) har en tendens til å holde seg til den negative glassformen (# 1), tilsett etanol eller vann til kantene på avtrykket mens du løfter.
    MERK: Væsken vil løpe mellom de to lagene og lette separasjonen av den negative glassformen (# 1) og den positive PDMS-brikken (# 2).
  12. Bruk et blad til å kutte av sidene av den positive PDMS-brikken (#2) slik at en rektangulær brikke forblir.
  13. Plasser den positive PDMS-brikken (#2) i en tørkemaskin ved siden av et lite hetteglass med en dråpe tridekafluor (1,1,2,2-tetrahydrooctyl)triklorsilan, et silaniseringsmiddel, og la det stå under vakuum over natten.
    MERK: Silanisering vil sørge for at avtrykket ikke binder seg til andre PDMS-lag senere i protokollen. Andre silaniseringsmidler og/eller metoder kan også fungere for å sikre at overflatene på PDMS-brikkene ikke fester seg til andre PDMS-lag.
    FORSIKTIG: Tridekafluor(1,1,2,2-tetrahydrooctyl)triklorsilan er brannfarlig (H226) og forårsaker alvorlige hudforbrenninger og øyeskader (H314). Bruk personlig verneutstyr, arbeid i avtrekksvifte og vask hendene grundig etter håndtering. Hold silaniseringsmiddelet borte fra varme, varme overflater, gnister, åpen ild og andre tennkilder. Oppbevares mellom 15 og 30 °C (P280, P210, P240, P403, P235, P310).
  14. Fjern vakuumet og plasser den positive PDMS-brikken (#2) på bunnen av en petriskål. Hell PDMS-prepolymer (10:1) på toppen for å produsere flere negative PDMS-former (#3).
  15. Sett petriskålen under vakuum i tørkemaskinen i 15 minutter for å fjerne alle bobler.
  16. Herd PDMS-prepolymeren ved 65 °C over natten, hvoretter den negative PDMS-formen (#3) kan skrelles av fra den positive PDMS-brikken (#2) ved hjelp av en slikkepott.
  17. Silaniser den endelige negative PDMS-formen (# 3) ved hjelp av silaniseringsmiddel i en vakuumtørker over natten.
  18. Produser flere cellekulturbrikker (#4, se figur 2) med ca. 5 mm tykkelse ved å helle PDMS-prepolymer i den negative PDMS-formen (#3), fjerne bobler ved hjelp av tørkemiddelet og herde i 3 timer ved 65 °C. Med et barberblad, kutt brikken til den endelige størrelsen som visualisert i figur 2. Oppbevar sjetongene ved romtemperatur.
    MERK: Overflateruhet kan påvirke den cellulære responsen. Om nødvendig kan et ekstra tynt lag PDMS brukes som belegg på den positive PDMS-brikken (#2) for å jevne overflaten ut. For å gjøre det, hell en liten dråpe PDMS-prepolymer på brikken og spre den over hele brikken ved hjelp av trykkluft. Herd den belagte flisen ved 65 °C i 3 timer og fortsett med trinn 1.12.

2. Fremstilling av flate PDMS-prøver (kontrollprøver)

  1. Klargjør PDMS-prepolymer (10:1) i henhold til trinn 1.3–1.6.
  2. Plasser et glassdeksel på den avrundede vakuumstolpen i midten av spinnbeleggeren.
  3. Slå på vakuumet for å feste glassdekselet til maskinen og rør en dråpe PDMS i midten av dekslene ved hjelp av en Pasteur-rør.
  4. Fordel PDMS-prepolymeren over glassunderlaget ved hjelp av følgende protokoll for å få et omtrent 10 μm tykt lag.
    1. Spincoat for 10 s ved 0,45 × g, akselerasjon: 0,2 × g/s.
    2. Spincoat for 50 s ved 44,8 × g, akselerasjon: 0,54 × g/s.
  5. Slå av vakuumet, fjern dekslene fra spinnfrakken med pinsett, og legg den i en petriskål. Herd PDMS over natten i ovnen ved 65 °C og oppbevar den i romtemperatur etterpå.

3. Substrat passivering av 3D-cellekultursubstrater

  1. Aktiver hydroksylgruppene på overflaten av PDMS-brikken (# 4) ved hjelp av O2-plasma. Bruk pinsett til å plassere brikken i kurven til plasmaet.
  2. Kjør en askesyklus med en effekt på 20 W i 30 s. Luft askekammeret ved hjelp av N2.
  3. Ta brikken ut av kurven og legg den i en liten PDMS-beholder (se figur 1).
  4. Bruk en Pasteur-pipet til å tilsette 500 μL Poly-L-lysin (PLL, 0,01%) på toppen av brikken slik at hele overflaten blir nedsenket i PLL-løsningen. Rug i 30 minutter ved romtemperatur.
  5. Fjern 450 μL av PLL fra cellekulturbrikken med en pipet og skyll sponoverflaten tre ganger med 500 μL 0,1 M HEPES-buffer (8 < pH < 8,5). La alltid et lite volum væske ligge på PDMS-brikken for å unngå uttørking av prøven, noe som vil redusere den endelige mønsterkvaliteten.
  6. Lag 500 μL av et 50 mg / ml metoksypolyetylenglykol-succinimidylvalerat (mPEG-SVA; MW 5000 Da) løsning i 0,1 M HEPES buffer (8 < pH < 8,5) per cellekulturbrikke og la den ruge på prøven i 60 minutter. Siden mPEG-SVA har en halveringstid på 15 minutter, må du sørge for å forberede den nødvendige mengden like før bruk.
    MERK: mPEG-SVA oppløses når oppløsningen er helt gjennomsiktig.
  7. Fjern 450 μL av mPEG-SVA-løsningen ved hjelp av en mikropipet, og vask sponoverflaten fem ganger med fosfatbufret saltvann (PBS). Sørg for å røre opp og ned flere ganger per vask for å sikre at all ubundet mPEG-SVA fjernes. For å forhindre at prøven tørker ut, minimer tiden mellom vasketrinnene og sørg for å bruke et overskudd (500 μL eller mer) PBS til vask.
  8. Lagre prøvene ved å fordype dem i PBS eller fortsett til mønstertrinnet i protokollen.
    MERK: Om ønskelig kan passivering utføres under sterile forhold når du arbeider i et kulturskap og arbeider med sterile løsninger og utstyr.

4. Lagring av mønstrede cellekultursubstrater

MERK: 3D-cellekultursubstrater kan lagres under forskjellige trinn i prosessen.

  1. Oppbevar herdede PDMS-cellekulturflis under tørre forhold ved romtemperatur.
  2. Oppbevar passiverte cellekulturbrikker på en av disse to måtene:
    1. Oppbevares i PBS ved 4 °C i opptil 7 dager.
    2. Oppbevares under tørre forhold i opptil flere måneder. For å få tørre prøver, fjern PBS og skyll flere ganger med dobbeltdestillert vann (ddH2O). Blås-tørk ved hjelp av en nitrogen- eller luftpistol.

5. Design av digitale masker som brukes til fotopatterning

MERK: Mønster av 3D-substrater kan utføres ved hjelp av en enkelt eller flere fokalplan (se figur 3). Et enkelt fokalplan kan brukes på funksjoner som ikke er større enn en digital speilenhet (DMD, ca. 300 μm x 500 μm) og som ikke er for høye (50-100 μm). I så fall kan du designe et digitalt mønster ved hjelp av TIFF-modus. For funksjoner som overskrider dimensjonene til en DMD og er relativt høye, del mønsteret av substratet i flere trinn. I dette tilfellet er flere mønstre designet ved hjelp av PDF-modus som alle fokuserer individuelt på enkeltfokalplan.

  1. Design en digital maske ved hjelp av designprogramvareverktøy.
    1. Mønstre i TIFF-modus (piksler): Lag et helt svart tegnebrett på 1 140 x 1 824 piksler (den nøyaktige størrelsen på 1 DMD, omtrent 300 μm x 500 μm) og fyll tegnebrettet med interessante former. Eksporter tegnebrettet som en 8-biters TIFF-fil.
      MERK: Ulike grånivåer i mønsterdesignet bestemmer hvor mye eksponering som skal utføres på det stedet.
    2. Mønster i PDF-modus (metriske enheter): Lag et svart tegnebrett av ønsket størrelse i mm og fyll tegnebrettet med hvilken som helst form av interesse. Del mønsteret i flere filer hvis 3D-substratet må mønstres ved hjelp av flere fokalplan. Lagre tegnebrettet som en PDF-fil.
      MERK: Ulike grånivåer i mønsterdesignet bestemmer hvor mye eksponering som skal utføres på det stedet.

6. UV-fotopatterning av 3D-cellekultursubstrater

  1. Kalibrering
    MERK: Kalibrering av laseren er gjort for å få riktig fokus på materialet av interesse. Siden PDMS-cellekultursubstratene er for tykke til å mønster gjennom, bruk et glassglass som brikken er plassert opp-ned på. Siden laseren møter glassglasset først, bruk glass til å kalibrere laseren.
    1. Påfør fluorescerende highlighter på et glassdeksel og plasser glassdekselet i scenen i det fluorescerende mikroskopet. Forsikre deg om at den uthevede overflaten vender oppover.
    2. Slå på mikroskopet og PRIMO-utstyret og åpne Micro-manager for å få tilgang til Leonardo-programvare under 'plugins'.
    3. Velg Kalibrering i startmenyen, etterfulgt av å velge 20x-målet både på mikroskopet og i programvaren. Klikk på Neste.
    4. Plasser glassglasset med fluorescerende highlighter i mikroskopets optiske bane. Bytt til fluorescerende modus og fokuser nøye på PRIMO-bildet som vises, og sørg for at både logoen og teksten er i fokus. Klikk på Neste for å fullføre kalibreringsprosedyren.
    5. Skriv ned Z-plasseringen til scenen når du kalibrerer, og bruk denne plasseringen som referanse senere i protokollen.
      MERK: Kalibreringsmaterialet må samsvare med materialet som brukes til mønster senere i protokollen. Trinnene ovenfor beskriver kalibreringen som trengs for cellekultursubstratene. For kalibrering av flate PDMS-kontrollprøver, bruk fluorescerende highlighter på toppen av en ekstra flat PDMS-prøve og kalibrer med trinn 6.1.2-6.1.5.
  2. Mønstre 3D-funksjoner ved hjelp av et enkelt fokalplan
    MERK: Mønster ved hjelp av et enkelt fokalplan gjøres på 3D-funksjoner som ikke overskrider dimensjonene til en DMD (ca. 300 μm x 500 μm). Et skjema for fokalplanoppsettet er illustrert i figur 3.
    1. Fjern kalibreringslysbildet fra scenen og plasser et glassglass som inneholder en dråpe (~ 50 μL) fotoinitiator (PLPP) i trinnet.
      FORSIKTIG: PLPP er irriterende for øynene, luftveiene og huden (R36-38). Bruk personlig verneutstyr, hold det borte fra eksplosive materialer, tilsett aldri vann i dette produktet, ta forholdsregler mot statiske utladninger og unngå støt og friksjon (S26-36).
    2. Plasser PDMS-cellekultursubstratet opp-ned i dråpen til fotoinitiatoren. Forsikre deg om at 3D-funksjonene på overflaten av cellekultursubstratet vender mot glassglasset og er helt nedsenket i PLPP for å sikre riktig mønster.
    3. Velg Mønster i programvaren.
    4. Bytt til brightfield-modus på mikroskopet og flytt scenen til funksjonen av interesse.
    5. Fokuser på toppen eller bunnen av henholdsvis konvekse og konkave strukturer (figur 3).
    6. Velg PRIMO for å sette inn et mønster av valg. Vær oppmerksom på forhåndsvisningen av mønsteret i oransje på toppen av det levende brightfield-bildet.
    7. Juster mønsterinnstillingene i henhold til funksjonen (plassering, vinkel, repetisjoner) og velg en dose på 1000 mJ / mm2.
    8. Klikk på Lås og bytt mikroskopet til fluorescerende modus.
    9. Klikk på Play-knappen nederst til høyre på skjermen for å starte mønsteret. Når du er ferdig, observer mønsteret som vises i grønt.
    10. Når du er ferdig med alle funksjonene på en cellekulturbrikke, fjerner du brikken fra mønsterglasset og lagrer den i PBS ved 4 °C.
  3. Mønstre 3D-funksjoner ved hjelp av flere fokusplan
    MERK: Mønster ved hjelp av flere fokalplan gjøres på 3D-funksjoner som er større enn en DMD (ca. 300 μm x 500 μm) eller er relativt høye. I dette tilfellet må 3D-funksjonene mønstres i flere trinn, det vil si at mønsterdesignet skal tilpasses i henhold til eksemplet i figur 3.
    1. Fjern kalibreringslysbildet fra scenen og plasser et glassglass som inneholder en dråpe (~ 50 μL) fotoinitiator (PLPP) i trinnet.
    2. Plasser PDMS-cellekulturbrikken opp-ned i fotoinitiatorens dråpe ved hjelp av pinsett.
    3. Velg Mønster i programvaren. Bytt til brightfield-modus på mikroskopet og flytt scenen til funksjonen av interesse.
    4. Fokuser på området av brikken på riktig sted. Siden mønster utføres i et enkelt fokalplan og funksjonene er større enn en enkelt DMD, bruk flere fokalplan og dermed flere runder med mønster per 3D-substrat for å sikre tilstrekkelig mønsteroppløsning langs hele høyden og bredden på funksjonen (se figur 3). For eksempel, for en funksjon med en høyde på 150 μm, mønster funksjonen i tre runder (± 1 fokalplan per 50 μm Z-reise), med fokus rundt 25 μm, 75 μm og 125 μm fra bunnen av funksjonen. Kontroller at bunnen av funksjonen er rundt verdien som er skrevet ned i trinn 6.1.5.
    5. Velg PRIMO for å sette inn ønsket mønster. Vær oppmerksom på forhåndsvisningen av mønsteret som vises i oransje på toppen av det levende brightfield-bildet.
    6. Juster mønsterinnstillingene i henhold til funksjonen (plassering, vinkel) og velg en dose på 1000 mJ/mm2.
    7. Klikk på Lås og bytt mikroskopet til fluorescerende modus.
    8. Klikk på Play-knappen nederst til høyre på skjermen for å starte mønsteret. Når du er ferdig, observer mønsteret som vises i grønt.
    9. Gjenta trinn 6.3.4-6.3.8 på funksjonen av interesse når flere fokalplan brukes.
    10. Når du er ferdig med alle funksjonene på en cellekulturbrikke, fjerner du brikken fra mønsterglasset og lagrer den i PBS ved 4 °C.
      MERK: Hvis ønskelig, bruk UV-fotopatterning under sterile forhold, bruk petriskåler med glassbunn og tilbered alle underlag i sterile kulturskap. Oppbevar de mønstrede prøvene i PBS i opptil et par uker. Når prøvene vaskes med ddH2O og tørkes med trykkluft, kan prøvene oppbevares i opptil noen måneder ved 4 °C.

7. Protein inkubasjon

MERK: Det anbefales å bruke ferskt proteininkuberte substrater for cellekultur. Fortsett bare til denne delen av protokollen hvis cellesåingen (trinn 8) gjøres rett etterpå.

  1. Overfør den mønstrede cellekulturbrikken til sterile PDMS-beholdere i kulturskapet.
  2. Vask de mønstrede cellekulturbrikkene 3x med et overskudd av steril PBS hvis mønsteret ikke ble utført under sterile forhold.
  3. Forbered en frisk proteinløsning i PBS.
    1. Fibronektin: Tilsett 2 ml PBS ved hjelp av en mikropipet til et hetteglass med 20 μg rhodaminmerket fibronektin for å oppnå en konsentrasjon på 10 μg / ml. Pipet forsiktig for å unngå dannelse av proteinklumper og beskytte mot lys.
    2. Gelatin: Tine en 200 μL aliquot av oppløst gelatin-fluorescein. Beskytt mot lys.
  4. Tilsett 200-500 μL av proteinoppløsningen til cellekulturbrikken ved hjelp av en mikropipet. Juster inkubasjonstiden og temperaturen avhengig av det valgte proteinet: Fibronektin: 5 min ved romtemperatur, Gelatin: 15 min ved 37 °C. Sørg for å dekke prøven (f.eks. med aluminiumsfolie).
  5. Fjern proteinoppløsningen og vask 5x med 500 μL steril PBS. Sørg for å røre PBS opp og ned flere ganger over alle relevante funksjoner i cellekulturbrikken for å fjerne ubundet protein.
    MERK: Under vasketrinnene er det avgjørende at prøven aldri tørker ut. Når du fjerner proteinoppløsningen eller PBS under vask, tilsett ny PBS umiddelbart for å forhindre at proteinklumper dannes (se figur 4). Konvekse egenskaper er spesielt følsomme for uttørking da de er hevet over underlagsoverflaten.
  6. Valgfritt: gjennomgå proteinmønstrene under et fluorescensmikroskop. Hold prøvene sterile og nedsenket i PBS.

8. Cellesåing

MERK: Denne protokollen bruker humane primære keratocytter og humane dermale fibroblaster. Keratocytter ble høstet fra humant hornhinnevev fra pasienter, i tråd med nederlandske retningslinjer for sekundær bruk av materialer, og tidligere karakterisert som keratocytter47. Disse cellene dyrkes i DMEM supplert med 5% Fetal Bovine Serum (FBS), 1% penicillin / streptomycin (P / S) og 1 mM L-askorbinsyre 2-fosfat sesquimagnesium salthydrat (vitamin C) ved 37 ° C for maksimalt fire passasjer. Humane dermale fibroblaster ble kjøpt og dyrket i DMEM supplert med 10% FBS og 1% P / S ved 37 ° C for maksimalt 15 passasjer. For såing av både keratocytter og dermale fibroblaster på fotopatterned cellekulturbrikken ble det brukt 20.000 celler per chip.

  1. Løsne cellene av interesse (f.eks. ved bruk av trypsin) og klargjør 1 ml av en cellesuspensjon på ± 10.000-50.000 celler / ml i kulturmedium per chip. Juster det nøyaktige antallet celler som er tilsatt per substrat, avhengig av cellestørrelsen og ønsket avlesning.
  2. Fjern PBS fra cellekulturbrikken og tilsett 1 ml av cellesuspensjonen.
  3. Transporter cellekulturbrikken forsiktig med cellene til inkubatoren og inkuber i 60 minutter ved 37 °C.
  4. Kontroller adhesjonen av cellene på den mønstrede cellekulturbrikken under et lysfeltmikroskop. Se etter langstrakte cellemorfologier når det gjelder linjemønstre (se figur 5). Hvis cellene også har begynt å feste seg utenfor det mønstrede området, fjern disse ved å pipettere medium opp og ned rett over cellene på substratet.
    MERK: Celler festet til det mønstrede området vil forbli festet, mens celler utenfor de mønstrede områdene vil løsne.
  5. Fjern cellekulturbrikken fra PDMS-beholderen og bruk steril pinsett for å legge den i en 6-brønns plate fylt med ~ 5 ml kulturmedium.
  6. Dyrk cellene i ønsket tidsperiode. Bytt ut cellekulturmediet hver 2-3 dag. For å sikre visualisering av proteinmønsteret etter cellekultur, reduser mengden eksponering av prøven for lys under kultur.

9. Farging, bildeopptak og analyse

  1. Fiksering og farging
    1. Etter ønsket lengde på kulturen, fjern nesten alt mediet og vask tre ganger med overflødig PBS. Deretter inkuberes med 3,7% formalin i 15 minutter ved romtemperatur etterfulgt av tre vasketrinn med PBS i 5 minutter per vask ved romtemperatur. La aldri prøven tørke ut.
      FORSIKTIG: Formalin er skadelig ved svelging eller innånding (H302, H332), kan forårsake en allergisk hudreaksjon (H317), mistenkes for å forårsake genetiske defekter (H341) og kan forårsake kreft (H350). Bruk personlig verneutstyr og arbeid i en avtrekksvifte.
    2. Beis cellekultursubstratet med de ønskede fargestoffene eller antistoffene. For å redusere volumet av fargestoffer, plasser cellekulturflisene opp-ned i en dråpe fargeløsning rørt på et glassglass.
    3. Oppbevar prøvene i PBS (kortsiktig) eller festet til en deksler ved hjelp av monteringsmedium (langsiktig) ved 4 ° C.
  2. Bildeinnhenting
    1. Plasser fargeprøven opp ned i en dråpe PBS på et glassglass. Sett prøven i scenen av et konfokalt mikroskop.
    2. Avhengig av ønsket detaljnivå kan du lage Z-stabler med et passende mål (10x, 20x eller 40x) og Z-avstand for å sikre riktig bildeopptak.
  3. Bildeanalyse og visualisering
    1. Åpne RAW-bildefilene i bildeanalyseprogramvaren og kontroller at bildeegenskapene (f.eks. dimensjoner, oppløsning) er riktige.
    2. Juster lysstyrken og kontrasten per kanal om nødvendig.
    3. Beskjær interesseområdet som inneholder mønsteret og cellene.
    4. Valgfritt: Utfør et dekonvolusjonstrinn om nødvendig.
    5. Opprett en 3D-gjengivelse av Z-stakken ved hjelp av programvare for 3D-gjengivelse.
    6. Optimaliser kontrast- og forsterkningsinnstillingene for hver enkelt kanal.
    7. Hvis du vil lage et bilde av 3D-gjengivelsen, oppretter du et øyeblikksbilde og eksporterer som . TIFF-fil.
    8. Hvis du vil lage en film av 3D-gjengivelsen, angir du start- og sluttbildet samt tidsrammen før du registrerer filmen. Eksporter som .avi.

Representative Results

Ved hjelp av den beskrevne protokollen kan 3D PDMS-cellekultursubstrater UV-fotopatternes for å skape presise og høy gjennomstrømnings limområder som er egnet for cellefeste. På denne måten blir celler utsatt for både relevante substratgeometrier og klebende ligandmønstre samtidig. Celleegenskaper som orientering, celleareal og antall fokale adhesjoner kan enkelt overvåkes og brukes til å bedre forstå celleadferd i komplekse, in vivo-lignende miljøer.

For å verifisere mønsterhendelsene på 3D PDMS-substratene, har atomoverflatesammensetninger av materialet i forskjellige stadier av protokollen blitt målt ved hjelp av atomrøntgenfotoelektronspektroskopi (XPS)48. Oppsummert viste XPS-målingene tilstedeværelsen av PEG-kjeder med økt karbonsignal på passiverte prøver, som ble redusert etter fotopatterning. Inkubasjon med fibronektin resulterte i en økning av karbonsignal, noe som igjen indikerer vellykket proteinadhesjon på overflaten av cellekulturbrikken. Deretter ble mønsteroppløsning og justering på 3D-funksjoner karakterisert på en rekke sirkelmønstrede, konkave groper (ĸ = 1/250 μm-1, ĸ = 1/1,000 μm-1 og ĸ = 1/3,750 μm-1, se figur 6). Fra de maksimale intensitetsprojeksjonene kan det konkluderes med at proteinmønsteret ble vellykket mønstret på alle tre 3D-funksjonene. Intensitetsprofilen i figur 6A viser høy mønsteroppløsning med skarpe overganger mellom mønstrede og ikke-mønstrede områder. I tillegg ble det oppnådd konsistent proteinintensitet over hele mønsteret i gropen.

Den konkave gropen med ĸ = 1/250 μm-1 ble mønstret ved hjelp av enkeltfokalplanmetoden (ett mønster), mens gropene med ĸ = 1/1,000 μm-1 og ĸ = 1/3,750 μm-1 ble mønstret ved hjelp av henholdsvis to og tre fokalplan (mønstre). Som det fremgår av maksimalintensitetsprojeksjonene i figur 6, resulterer begge metodene i perfekt justering av mønstrene på toppen av funksjonene. Ingen feiljusterte overganger mellom de to forskjellige fokalplanene og mønstrene kan observeres.

Ved hjelp av den beskrevne protokollen kan et bredt spekter av proteinmønsterdesign brukes på en rekke geometrier (se figur 7 og video 1). For å illustrere allsidigheten til denne metoden ble halvsyklindere (konvekse og konkave), en sadeloverflate og grop mønstret ved hjelp av linjer og sirkler av forskjellige bredder. De fotopatternerte materialene kan senere brukes til cellekultur (se figur 7, figur 8, video 2, video 3 og video 4). Et eksempel på dermale fibroblaster dyrket på en mønstret (fibronektinlinjer, rød, 5 μm bred og 5 μm hull) konkav semicylinder er vist i figur 8, figur 9 og video 4. Under forsøket sanser og holder cellene seg til multikuecellekultursubstratet og forblir levedyktige over tid. Som det fremgår av den immunfluorescerende fargingen i figur 8, danner celler fokale adhesjoner (vinculinklynger) hovedsakelig på fibronektinlinjene.

En annen eksempelstudie som bruker disse cellekulturmaterialene ble nylig publisert av vår gruppe48. I denne studien ble humane myofibroblaster og endotelceller utsatt for kombinasjonen av kontaktveiledninger og geometriske topografier. In vivo opplever begge typer celler krumnings- og kontaktveiledningssignaler i innfødte vev som i den menneskelige vaskulaturen. Ved å utsette cellene in vitro for et miljø som kombinerer begge miljømessige signaler, kan in vivo-situasjonen rekapituleres, noe som gir en dypere forståelse av mikromiljøets rolle på celleadferd. Humane myofibroblaster ble vist å samsvare med kontaktveiledningssignaler (parallelle fibronektinlinjer) på konkave sylindriske substrater48. På konvekse strukturer med økende krumninger overstyrte imidlertid de geometriske signalene de biokjemiske signalene, noe som tyder på at myofibroblaster kan fornemme både grad og tegn på krumning. Interessant nok kunne endotelceller bare feste seg til de konkave multikusubstratene og ikke til de konvekse PDMS-substratene. På konkave, proteinmønstrede substrater er endotelcellene orientert i retning av kontaktveiledningssignalet. Denne grunnleggende in vitro-kunnskapen har fysiologisk relevans innen vaskulær vevsteknikk og kan til slutt hjelpe til med utformingen av smarte vevstekniske konstruksjoner.

Figure 1
Figur 1: Den eksperimentelle tidslinjen for bruk av kontaktveiledningssignaler på 3D-cellekultursubstrater. For det første produseres positive cellekulturbrikker fra en negativ PDMS-form som inneholder en rekke geometrier. Uherdet PDMS helles i formen og herdes i 3 timer ved 65 °C. Deretter behandles PDMS med O2-plasma og inkuberes med PLL og mPEG-SVA (blå, merket) for å passivere overflaten av cellekultursubstratet. Etter vask vendes underlaget opp-ned i en dråpe fotoinitiator (PLPP, grønn, merket) og UV-fotopatterned ved hjelp av LIMAP-tilnærmingen. Her brukes en digital maske med et brukerdefinert mønster for å spalte passivasjonslaget på definerte steder. Deretter kan en proteinløsning (rød, merket) inkuberes og vil bare feste seg til stedene der passivasjonslaget fjernes. Celler sådd på substratet blir utsatt for både geometri og proteinmønstre, noe som muliggjør forskning på celleadferd i komplekse, in vivo-etterlignende miljøer. Forkortelser: PDMS = polydimetylsiloksan; mPEG-SVA = metoksypolyetylenglykol-succinimidylvalerat; PLPP = 4-benzoylbenzyl-trimetylammoniumklorid; LIMAP = Lysindusert molekylær adsorpsjon av proteiner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Ulike stadier under produksjon og passivering av 3D-cellekultursubstratet. Den negative glassformen (# 1) er designet med datamaskinassistert designprogramvare og produsert ved hjelp av en femtosekund-laser direkte skriveteknikk. Denne formen brukes til å produsere den mellomliggende positive PDMS-brikken (# 2) og negativ PDMS-form (# 3), som senere brukes til å produsere den endelige cellekulturbrikken (# 4). Forkortelse: PDMS = polydimetylsiloksan. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Skjematisk illustrasjon av de to mønstermetodene. Venstre: UV-fotopatterning utføres på mindre funksjoner (omtrent en DMD) ved hjelp av et enkelt fokalplan og mønster. Som et resultat er den komplette funksjonen mønstret på en gang. Høyre: Når større funksjoner brukes (større enn én DMD), deles mønsteret over flere fokalplan og mønstre. Forkortelse: DMD = digital speilenhet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Et typisk eksempel på et normalt og uttørket proteininkubert substrat. Maksimal intensitetsprojeksjoner (XY) og ortogonale visninger (XZ) av normale og uttørkede proteininkuberte substrater. Når du vasker et mønstret cellekultursubstrat etter inkubering med en proteinløsning, er det avgjørende å alltid holde prøven våt. Selv om mønsteret er identisk i alle bilder på funksjonene (ĸ = 1/1,000 μm-1), ble gelatin-fluorescein (grønn) samlet og dannet en stor klump når prøven ble liggende å tørke i noen sekunder. Hvis prøven alltid forblir våt, kan korrekte proteinmønstre observeres. Skalafelt = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Brightfield-bilder etter seeding. Primære keratocytter (venstre) og dermale fibroblaster (høyre) 4 timer etter såing på 3D geometriske egenskaper (konkav grop av ĸ = 1/1,000 μm-1 og semicylindere av ĸ = 1/500, 1/375, 1/250, 1/175 og 1/125 μm-1). Innsatsene øverst til venstre representerer linjemønsteret som brukes til geometriens mønster. Hvite piler indikerer spredning av celler som allerede viser justering. Skalafelt = 250 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Karakterisering av sirkulære mønstre på konkave groper. (A) Maksimal intensitetsprojeksjon (XY) og ortogonal visning (XZ) av akoncave grop (ĸ = 1/250 μm-1) mønstret ved hjelp av LIMAP (linjebredde: 20 μm, gapbredde: 20 μm) og inkubert med gelatin-fluorescein (grønn). Intensitetsprofilen langs den hvite linjen er plottet mot avstanden, og viser en konsistent mønsterkvalitet og oppløsning. (B) Ytterligere mønster utført på konkave groper med ĸ = 1/1,000 μm-1 og ĸ = 1/3750 μm-1, som viser fleksibilitet når det gjelder geometriske egenskaper som kan brukes til mønster. Igjen visualiseres både maksimale intensitetsprojeksjoner (XY) og ortogonale visninger (XZ). Skalafelt = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: 3D-mikroskopidata av mønstrede strukturer. Typiske eksempler på 3D-mønstrede cellekulturmaterialer etter fotopatterning og cellekultur, visualisert ved hjelp av 3D-gjengivelsesprogramvare. (A) Konveks semicylinder mønstret med 10 μm brede linjer (rhodamin-fibronektin, rød) og 10 μm brede hull. Skala bar = 5 μm. (B) Dermal fibroblaster farget for F-aktin (grønn) dyrket på konkav semicylinder mønstret med 20 μm brede linjer (rhodamin-fibronektin, rød) og 20 μm brede hull. Skala bar = 5 μm. (C) Sadeloverflate mønstret med 20 μm brede linjer (rhodamin-fibronektin, rød) og 20 μm brede hull. Skalastang = 5 μm. (D) Konkav grop mønstret med konsentriske sirkler med 20 μm brede linjer (gelatin-fluorescein, grønn) og 20 μm brede hull. F-aktincytoskjelettet til de humane keratocytter farges ved hjelp av phalloidin og visualiseres i rødt. Skalalinje = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Immunfluorescerende farging av humane dermale fibroblaster på en fotopatterned, konkav semicylinder. (A) Maksimal intensitetsprojeksjon (XY) og ortogonale seksjoner (XZ og YZ) av humane dermale fibroblaster dyrket i 24 timer på en mønstret (fibronektinlinjer, rød, 5 μm bred og 5 μm hull) konkav semicylinder. Cellene er farget for F-aktin (magenta), vinculin (grønn) og kjerner (blå). Skala bar = 100 μm. (B) Zoom inn av en celle som fester seg til multicue-miljøet. Skalafelt = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Brightfield timelapse-bilder av humane dermale fibroblaster på en mønstret, konkav sylinder. Den konkave semicylinderen (ĸ = 1/250 μm-1) ble mønstret med parallelle linjer (5 μm brede og 5 μm hull) og inkubert med rhodamin-fibronektin før cellesåing. Timelapse-avbildningen startes 1 time etter første cellesåing (venstre, 0 min), når cellene fortsatt er avrundet og ikke-adherent (piler). Etter ca. 24 timer (midten, 1.420 min) festet cellene seg til multikuesubstratet og viser en justeringsrespons i henhold til kontaktveiledningsmønsteret. Både justeringsresponsen og cellens levedyktighet opprettholdes gjennom hele kulturvarigheten (høyre, 3,180 min). Skalafelt = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1: Mønstereksempel på et 3D sylindrisk substrat. 3D-representasjon av en konveks sylinder mønstret med rhodamin-fibronektin (rød). Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 2: 3D-representasjon av dermale fibroblaster dyrket på et mønstret, 3D sylindrisk substrat (ĸ = 1/500 μm-1). Dermale fibroblaster dyrket i 24 timer på en mønstret (fibronektinlinjer, rød, 10 μm bred og 10 μm hull) konveks semicylinder. Cellene er farget for F-aktin (magenta), vinculin (grønn) og kjerner (blå). Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 3: 3D-representasjon av humane keratocytter dyrket på en mønstret, 3D-grop (ĸ = 1/3,750 μm-1). 3D-representasjon av humane keratocytter dyrket i 24 timer i en konkav, mønstret grop (gelatinsirkler, grønn, 20 μm bred og 20 μm hull). Celler er farget for F-aktin (rød). Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 4: Brightfield timelapse avbildning av humane dermale fibroblaster på en mønstret, konkav sylinder. Den konkave semicylinderen (ĸ = 1/250 μm-1) ble mønstret med parallelle linjer (5 μm brede og 5 μm hull) og inkubert med rhodamin-fibronektin før cellesåing. Timelapse-avbildningen startes 1 time etter første cellesåing, når celler viser innledende overholdelse av multicue-miljøet. I løpet av den fullstendige timelapsen orienterer cellene seg hovedsakelig langs kontaktveiledningssignalene, mens cellens levedyktighet opprettholdes. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Discussion

I dag studeres celleadferd ofte på flatkultursubstrater som mangler kompleksiteten til det opprinnelige cellemikromiljøet. 3D-miljøer som stillaser og hydrogeler brukes som et alternativ. Selv om disse cellekulturmiljøene forbedrer in vivo-relevansen, er både systematiske studier av celleadferd og muligheten for avlesningsmetoder fortsatt utfordrende. For systematisk å undersøke celleadferd på representative kultursubstrater, er det nødvendig med konsistente multikusubstrater som muliggjør mikroskopisk avlesning. Derfor beskriver vi i denne protokollen en metode for å lage multikuecellekultursubstrater med fysiologisk relevante geometrier og mønstrede ECM-proteiner. Hovedutfordringen med å kombinere miljømessige signaler som vevsgeometri og kontaktveiledningssignaler på in vitro-plattformer er i stor grad av teknologisk karakter. Konvensjonelle metoder for å anvende kontaktveiledningssignaler (f.eks. myk litografi, dyp UV-mønster og mikrokontaktutskrift35,36) til cellekulturmaterialer er optimalisert for plane underlag. Behovet for 3D-cellekulturmaterialer kombinert med kontaktveiledningssignaler fremhevet flere teknologiske utfordringer, for eksempel dårlig mønsterjustering, oppløsning og fleksibilitet. For å overvinne disse utfordringene kan en høy gjennomstrømning, maskeløs, lysbasert mønstermetode brukes45,49. Her muliggjør et optisk mikroskop presis mønsterjustering og en oppløsning i størrelsesorden mikrometer (se figur 6). Videre gjør bruken av en digital maske det mulig for forskere å studere celleadferd på et bredt spekter av mønstre uten å måtte fremstille arbeidsintensive fysiske masker.

UV-fotopatterningsmetoden kan brukes i kombinasjon med en rekke 3D-geometrier (f.eks. sylindere, seter, kupler, groper) produsert av en rekke materialer48. 3D-cellekultursubstratene som ble brukt i denne studien er laget av PDMS; andre materialer kan imidlertid også brukes. Dette kan kreve forskjellige trinn for å produsere det endelige cellekultursubstratet som inneholder funksjonene av interesse. Siden celler har vist seg å være følsomme for overflateruhet av cellekulturmaterialer, er det viktig å lage cellekulturbrikkene med en jevn overflate slik at de observerte cellenes respons fullt ut kan tilskrives 3D-geometrien og kontaktveiledningssignalene50,51. Målemetoder som optisk profilometri, scanning elektronmikroskopi eller atomkraftmikroskopi kan brukes til å måle overflateruhet. Etter fabrikasjon av cellekulturmaterialet kan man velge en mønstermetode basert på ett eller flere fokalplan avhengig av de spesifikke dimensjonene til funksjonen av interesse (se figur 3). Vanligvis brukes et enkelt fokalplan til å mønstre et område innenfor et Z-område på omtrent 50 μm. Mønsteroppløsningen ble vist å være konsistent ved bruk av denne tommelfingerregelen (se figur 6). En ulempe med denne metoden er imidlertid den økte mønstertiden med innføring av flere fokale plan og mønstre. I vår hånd, ved hjelp av flere fokale plan, har 3D geometriske egenskaper opp til 16 mm x 16 mm x 0,17 mm (X x Y x Z) blitt vellykket mønstret med høy mønsterkvalitet.

I tillegg er det viktig å nevne at høyden (Z-aksen) av geometriske egenskaper som kan brukes i kombinasjon med denne protokollen er begrenset. Siden både UV-fotopatterning og mange cellulære avlesninger er avhengige av et mikroskopioppsett, bestemmer arbeidsavstanden til målene maksimal høyde på en funksjon. I vår hånd kan geometrier over en høyde på 300 μm fortsatt uv-fotopatterned, og avlesninger har blitt utført ved hjelp av et konfokalt mikroskop med 40x mål. Dermed er mekanobiologisk forskning som spenner fra intracellulære til cellulære og vevsskalaer mulig ved bruk av den beskrevne protokollen.

En annen faktor som må tas i betraktning er risikoen for at prøvene tørker ut under eller etter UV-fotopatterning49. Dette er spesielt relevant ved bruk av 3D-geometrier, da konveksiteter ofte eksponeres utenfor cellekulturmaterialer. Som vist i figur 4, kan dette føre til ujevne mønstre med proteinaggregater som dannes på toppen av funksjonen av interesse. Vaskingen av cellekulturbrikkene etter proteininkubasjon og under cellekultur er avgjørende for riktig belegg av 3D-geometrier. Derfor anbefales det å alltid legge små mengder av en arbeidsløsning (PBS, PLPP, proteinoppløsning, cellekulturmedium) på toppen av cellekulturbrikken.

Så langt har flere proteinbelegg (fibronektin, kollagen type I og IV, gelatin, FNC) og celletyper (humane benmargsstromalceller, humane myofibroblaster, humane endotelceller, humane keratocytter og dermale fibroblaster) blitt brukt i kombinasjon med den beskrevne fotopatterningsmetoden på strukturerte cellekulturmaterialer. Som vist i en tidligere studie48, er optimalisering av proteininkubasjonsparametere nøkkelen til systematisk undersøkelse i nye celletyper. Derfor, før du utfører et nytt eksperiment med nye proteiner eller celler, anbefales det å teste en rekke proteinkonsentrasjoner, inkubasjonstemperaturer og inkubasjonstider. Ved å sammenligne cellemorfologi etter første adhesjon på homogene, mønstrede flate områder med cellemorfologi under "normale" cellekulturforhold, kan et optimalisert sett med eksperimentelle parametere oppnås. I tillegg kan hver celletype kreve forskjellig tid etter såing for å vise en gjenkjennelig adhesjonsmorfologi på et bestemt multicue-miljø (se figur 5). For dette formål er det avgjørende å optimalisere tiden som kreves per celletype for å presentere kontakthendelser på det mønstrede området under vasken i trinn 8.4. For eksempel observerte vi at på linjemønstre viser humane keratocytter langstrakte morfologier innen de første 30 minuttene etter sådd, mens endotelceller og dermale fibroblaster krever flere timer før de viser en endring i adhesjonsmorfologi. De eksperimentelle parametrene som kreves for proteininkubasjon (trinn 7) og cellesåing (trinn 8) kan dermed være avhengig av hvilket protein og celletype som velges.

Den presenterte tilnærmingen til å bruke kontaktveiledningssignaler på 3D-geometrier kan hjelpe til med å skape en dypere forståelse av celleadferd i komplekse multicue-miljøer. Dette kan omfatte undersøkelser av intracellulære komponenter, som fokale adhesjoner og kjerner, og kan også involvere eksperimenter utført på større celle- eller vevsskala ved hjelp av den foreslåtte metoden. Til slutt forventes det at kunnskapen som er oppnådd, kan brukes i utformingen av vevstekniske applikasjoner, hvor komplekse cellulære miljøer er designet for å styre celleadferd mot et ønsket resultat.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Nello Formisano (MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine) for å gi humane primære keratocytter. Dette arbeidet har blitt støttet av Chemelot InSciTe (prosjekt BM3.02); Det europeiske forskningsrådet (stipend 851960); og Departementet for utdanning, kultur og vitenskap for gravitasjonsprogrammet 024.003.013 "Material Driven Regeneration". Forfatterne takker Alvéole for korrespondanse, hjelp og feilsøking.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-vinculin antibody, mouse monoclonal IgG1 Sigma V9131 Dilution: 1/600
Bovine Serum albumin, Fraction V Roche 10735086001
DMEM, high glucose, pyruvate Gibco 41966029
DMEM/F-12 + GlutaMAX (1x) Gibco 10565018
DMi8 epifluorescent microscope Leica Microsystems
Ethanol Biosolve 0005250210BS
Fetal Bovine Serum Serana 758093
Fiji/ImageJ, version v1.53k www.imageJ.nih.gov
Fluorescent highlighter Stabilo 4006381333627
Fluorescin-labeled gelatin Invitrogen G13187 Concentration: 0.01%
Formaldehyde solution Merck F8775
Glass coverslips 24 x 60 mm, #1 VWR 631-1575
Glass coverslips, ø = 32 mm, #1 Menzel-Gläser
HCX PL fluotar L 20X/0.40na microscope objective Leica 11506242
HEPES Gibco 15630080
Human dermal fibroblasts Lonza CC-2511
Human primary keratocytes MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine
Illustrator, Version 26.0.1 Adobe
Laboratory oven Carbolite
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
Leica Application Suite X software, version 3.5.7.23225 Leica Microsystems
Leonardo software, version 4.16 Alvéole
Micro-manager, version 1.4.23 Open imaging
Mowiol 4-88 Sigma-Aldrich 81381 mounting medium
mPEG-succinimidyl valerate MW 5,000 Da Laysan Bio MPEG-SVA-5000 Concentration: 50 mg/mL
Negative glass mold FEMTOprint
NucBlue Live Readyprobes Reagent (Hoechst 33342) Invitrogen R37605 2 drops/mL
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140163
Petri dish (ø=100 mm) Greiner Bio-one 664160
Phalloidin Atto 647N Sigma 65906 Dilution: 1/250
Phosphate Buffered Saline Sigma P4417
Plasma asher Emitech K1050X
PLPP (photoinitiator) Alvéole
Poly-L-lysine, sterile-filtered Sigma-Aldrich P4707 Concentration: 0.01%
PRIMO Alvéole
Rhodamine-labeled fibronectin Cytoskeletn, Inc. FNR01 Concentration: 10 µg/mL
Secondary antibody with Alexa 488, Goat anti-mouse IgG1 (H) Molecular Probes A21121 Dilution: 1/300
Secondary antibody with Alexa 555, Goat anti-mouse IgG1 (H) Molecular Probes A21127 Dilution: 1/300
Spin coater Leurell Technologies Corporation model WS-650MZ-23NPPB
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW 1673921
TCS SP8X confocal microscope Leica Microsystems
tridecafluoro(1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane ABCR AB111444
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red Gibco 12604013
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Y., Wang, G., Luo, X., Qiu, J., Tang, C. Substrate stiffness regulates the proliferation, migration, and differentiation of epidermal cells. Burns. 38, 414-420 (2012).
  2. Viswanathan, P., et al. 3D surface topology guides stem cell adhesion and differentiation. Biomaterials. 52, 140-147 (2015).
  3. Peyton, S. R., et al. Marrow-derived stem cell motility in 3D synthetic scaffold is governed by geometry along with adhesivity and stiffness. Biotechnology and Bioengineering. 108 (5), 1181-1193 (2011).
  4. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 728-742 (2017).
  5. Chaudhuri, O., Cooper-White, J., Janmey, P. A., Mooney, D. J., Shenoy, V. B. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584, 535-546 (2020).
  6. Guido, S., Tranquillo, R. T. A methodology for the systematic and quantitative study of cell contact guidance in oriented collagen gels. Correlation of fibroblast orientation and gel birefringence. Journal of Cell Science. 105 (2), 317-331 (1993).
  7. Teixeira, A. I., Abrams, G. A., Bertics, P. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Epithelial contact guidance on well-defined micro- and nanostructured substrates. Journal of Cell Science. 116, 1881-1892 (2003).
  8. Driscoll, M. K., Sun, X., Guven, C., Fourkas, J. T., Losert, W. Cellular contact guidance through dynamic sensing of nanotopography. ACS Nano. 8 (4), 3546-3555 (2014).
  9. Buskermolen, A. B. C., et al. Cellular contact guidance emerges from gap avoidance. Cell Reports Physical Science. 1 (5), 100055 (2020).
  10. Thrivikraman, G., et al. Cell contact guidance via sensing anisotropy of network mechanical resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (29), 1-11 (2021).
  11. Buskermolen, A. B. C., et al. Entropic forces drive cellular contact guidance. Biophysical Journal. 116 (10), 1994-2008 (2019).
  12. Vignaud, T., et al. Reprogramming cell shape with laser nano-patterning. Journal of Cell Science. 125 (9), 2134-2140 (2012).
  13. Pouthas, F., et al. In migrating cells, the Golgi complex and the position of the centrosome depend on geometrical constraints of the substratum. Journal of Cell Science. 121 (14), 2406-2414 (2008).
  14. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  15. Théry, M., et al. Anisotropy of cell adhesive microenvironment governs cell internal organization and orientation of polarity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19771-19776 (2006).
  16. Huang, G., et al. Functional and biomimetic materials for engineering of the three-dimensional cell microenvironment. Chemical Reviews. 117 (20), 12764-12850 (2017).
  17. Callens, S. J. P., Uyttendaele, R. J. C., Fratila-Apachitei, L. E., Zadpoor, A. A. Substrate curvature as a cue to guide spatiotemporal cell and tissue organization. Biomaterials. 232, 119739 (2020).
  18. Yilmaz, C. O., Xu, Z. S., Gracias, D. H. Curved and Folded Micropatterns in 3D Cell Culture and Tissue Engineering. Methods in Cell Biology. 121, Elsevier Inc (2014).
  19. Silver, F. H., Freeman, J. W., Seehra, G. P. Collagen self-assembly and the development of tendon mechanical properties. Journal of Biomechanics. 36 (10), 1529-1553 (2003).
  20. Werner, M., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. Cellular geometry sensing at different length scales and its implications for scaffold design. Materials. 13 (4), 963 (2020).
  21. Di Cio, S., Bøggild, T. M. L., Connelly, J., Sutherland, D. S., Gautrot, J. E. Differential integrin expression regulates cell sensing of the matrix nanoscale geometry. Acta Biomaterialia. 50, 280-292 (2017).
  22. Fioretta, E. S., Simonet, M., Smits, A. I. P. M., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. Differential response of endothelial and endothelial colony forming cells on electrospun scaffolds with distinct microfiber diameters. Biomacromolecules. 15 (3), 821-829 (2014).
  23. Werner, M., Kurniawan, N. A., Korus, G., Bouten, C. V. C., Petersen, A. Mesoscale substrate curvature overrules nanoscale contact guidance to direct bone marrow stromal cell migration. Journal of The Royal Society Interface. 15 (145), 20180162 (2018).
  24. Ruprecht, V., et al. How cells respond to environmental cues - insights from bio-functionalized substrates. Journal of Cell Science. 130 (1), 51-61 (2017).
  25. Bao, M., Xie, J., Huck, W. T. S. Recent advances in engineering the stem cell microniche in 3D. Advanced Science. 5 (1800448), 1-16 (2018).
  26. Zhan, X. Effect of matrix stiffness and adhesion ligand density on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 108 (3), 675-683 (2020).
  27. Jiang, T., et al. Untangling the response of bone tumor cells and bone forming cells to matrix stiffness and adhesion ligand density by means of hydrogels. Biomaterials. 188, 130-143 (2019).
  28. Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33, 4460-4468 (2012).
  29. Rape, A. D., Zibinsky, M., Murthy, N., Kumar, S. A synthetic hydrogel for the high-throughput study of cell-ECM interactions. Nature Communications. 6 (8129), 1-9 (2015).
  30. Camarero-Espinosa, S., et al. 3D printed dual-porosity scaffolds: the combined effect of stiffness and porosity in the modulation of macrophage polarization. Advanced Healthcare Materials. 11 (2101415), 1-16 (2022).
  31. Bao, M., et al. Cellular volume and matrix stiffness direct stem cell behavior in a 3D microniche. ACS Applied Materials and Interfaces. 11 (2), 1754-1759 (2019).
  32. Charest, J. L., Eliason, M. T., García, A. J., King, W. P. Combined microscale mechanical topography and chemical patterns on polymer cell culture substrates. Biomaterials. 27, 2487-2494 (2006).
  33. Bilem, I., et al. Interplay of Geometric Cues and RGD/BMP-2 crosstalk in directing stem cell fate. ACS Biomaterials Science and Engineering. 3 (10), 2514-2523 (2017).
  34. Nam, K. -H., et al. Multiscale cues drive collective cell migration. Scientific Reports. 6, 29749 (2016).
  35. Alom Ruiz, S., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  36. Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein Micropatterns. A Direct Printing Protocol Using Deep UVs. Methods in Cell Biology. 97, Academic Press. (2010).
  37. Kane, R. S., Takayama, S., Ostuni, E., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Patterning proteins and cells using soft lithography. Biomaterials. 20 (23-24), 2363-2376 (1999).
  38. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9 (11), 1640 (2009).
  39. Offenhäusser, A., et al. Microcontact printing of proteins for neuronal cell guidance. Soft Matter. 3 (3), 290-298 (2007).
  40. Ricoult, S. G., Sanati Nezhad, A., Knapp-Mohammady, M., Kennedy, T. E., Juncker, D. Humidified microcontact printing of proteins: universal patterning of proteins on both low and high energy surfaces. Langmuir. 30 (40), 12002-12010 (2014).
  41. Waterkotte, B., et al. Biofunctional Micropatterning of Thermoformed 3D Substrates. Advanced Functional Materials. 24 (4), 442-450 (2014).
  42. Lehnert, D., et al. Cell behaviour on micropatterned substrata: Limits of extracellular matrix geometry for spreading and adhesion. Journal of Cell Science. 117 (1), 41-52 (2004).
  43. Sevcik, E. N., Szymanski, J. M., Jallerat, Q., Feinberg, A. W. Patterning on topography for generation of cell culture substrates with independent nanoscale control of chemical and topographical extracellular matrix cues. Current Protocols in Cell Biology. 75, 1-25 (2017).
  44. Micropatterning: Surface functionalization. Alvéole. , Available from: https://www.alveolelab.com/technology/micropatterning-surface-functionalization/ (2022).
  45. Strale, P. O., et al. Multiprotein printing by light-induced molecular adsorption. Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).
  46. van Gaal, R. C., Miltenburg, R. P. R. S., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C., Dankers, P. Y. W. Renal epithelial cell responses to supramolecular thermoplastic elastomeric concave and convex structures. Advanced Materials Interfaces. 8 (1), 2001490 (2021).
  47. Foster, J. W., Gouveia, R. M., Connon, C. J. Low-glucose enhances keratocyte-characteristic phenotype from corneal stromal cells in serum-free conditions. Scientific Reports. 5, 1-16 (2015).
  48. Van Der Putten, C., et al. Protein micropatterning in 2.5D: an approach to investigate cellular responses in multi-cue environments. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (22), 25589-25598 (2021).
  49. Melero, C., et al. Light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins. Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).
  50. Hou, Y., et al. Surface roughness gradients reveal topography-specific mechanosensitive responses in human mesenchymal stem cells. Small. 16 (10), 1905422 (2020).
  51. Bourkoula, A., et al. Roughness threshold for cell attachment and proliferation on plasma micro-nanotextured polymeric surfaces: The case of primary human skin fibroblasts and mouse immortalized 3T3 fibroblasts. Journal of Physics D: Applied Physics. 49 (30), 304002 (2016).

Tags

Bioteknologi utgave 184 PDMS-støping substratgeometri maskeløs UV-fotopattering kontaktveiledning krumning multi-cue cellulært mikromiljø proteinbelegg
Generering av multicue cellulære mikromiljøer ved UV-fotopatterning av tredimensjonale cellekultursubstrater
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van der Putten, C., D’Urso,… More

van der Putten, C., D’Urso, M., Bril, M., Woud, T. E., Bouten, C. V. C., Kurniawan, N. A. Generation of Multicue Cellular Microenvironments by UV-Photopatterning of Three-Dimensional Cell Culture Substrates. J. Vis. Exp. (184), e63988, doi:10.3791/63988 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter