Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Generering av multicue cellulära mikromiljöer genom UV-fotopatterning av tredimensionella cellodlingssubstrat

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63988
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Complex Molecular Systems, Eindhoven University of Technology

Summary

Traditionellt utförs cellodling på plana substrat som dåligt efterliknar cellernas naturliga miljö in vivo. Här beskriver vi en metod för att producera cellodlingssubstrat med fysiologiskt relevanta krökta geometrier och mikromönsterade extracellulära proteiner, vilket möjliggör systematiska undersökningar av cellulär avkänning av dessa extracellulära signaler.

Abstract

Den extracellulära matrisen är en viktig regulator för cellfunktionen. Miljösignaler som finns i den cellulära mikromiljön, såsom ligandfördelning och vävnadsgeometri, har alltmer visat sig spela kritiska roller för att styra cellfenotyp och beteende. Dessa miljösignaler och deras effekter på celler studeras dock ofta separat med hjälp av in vitro-plattformar som isolerar enskilda ledtrådar, en strategi som kraftigt förenklar den komplexa in vivo-situationen för flera ledtrådar. Tekniska tillvägagångssätt kan vara särskilt användbara för att överbrygga detta gap genom att utveckla experimentella inställningar som fångar komplexiteten hos in vivo-mikromiljön , men ändå behåller graden av precision och manipulerbarhet hos in vitro-system .

Denna studie belyser ett tillvägagångssätt som kombinerar ultraviolett (UV) -baserad proteinmönster och litografibaserad substratmikrofabrikation, som tillsammans möjliggör undersökning med hög genomströmning av cellbeteenden i multicue-miljöer. Med hjälp av masklös UV-fotomålning är det möjligt att skapa komplexa, självhäftande proteinfördelningar på tredimensionella (3D) cellodlingssubstrat på chips som innehåller en mängd väldefinierade geometriska ledtrådar. Den föreslagna tekniken kan användas för odlingssubstrat tillverkade av olika polymera material och kombineras med adhesiva mönstrade områden av ett brett spektrum av proteiner. Med detta tillvägagångssätt kan enskilda celler, såväl som monolager, utsättas för kombinationer av geometriska ledtrådar och kontaktvägledningssignaler som presenteras av de mönstrade substraten. Systematisk forskning med kombinationer av chipmaterial, proteinmönster och celltyper kan därmed ge grundläggande insikter i cellulära svar på multikuemiljöer.

Introduction

In vivo utsätts celler för en mängd olika miljösignaler som kan vara av mekanisk, fysisk och biokemisk natur som härrör från den extracellulära matrisen (ECM). Många miljösignaler har identifierats för att spela viktiga roller i regleringen av cellbeteende, såsom spridning, differentiering och migration 1,2,3,4,5. Ett av de mest undersökta fenomenen är kontaktvägledning, som beskriver vidhäftningsmedierad cellinriktning längs anisotropa biokemiska eller topografiska mönster som finns på det extracellulära substratet 6,7,8,9,10,11. Utöver att styra inriktningen av celler har kontaktvägledningssignaler också visat sig påverka andra cellegenskaper såsom cellmigration, organisering av intracellulära proteiner, cellform och cellöde 12,13,14,15. Dessutom har den geometriska arkitekturen i 3D-cellmiljön också erkänts för dess reglerande inflytande på cellbeteende16,17. I människokroppen utsätts celler för en rad krökta geometrier, allt från kollagenfibrer i mikroskala, kapillärer och glomeruli, upp till mesoskala alveoler och artärer18,19. Intressant nog har nyligen genomförda in vitro-studier visat att celler kan känna av och reagera på sådana fysiska signaler, från nano- tillmesoskalan 20,21,22,23.

Hittills har de flesta studier som undersöker cellsvar på miljösignaler till stor del utförts med hjälp av experimentella inställningar som isolerar enstaka ledtrådar. Även om detta tillvägagångssätt har möjliggjort enorma framsteg när det gäller att förstå de grundläggande mekanismerna bakom cellulär avkänning av miljösignaler, rekapitulerar det dåligt in vivo-miljön som samtidigt presenterar flera ledtrådar. För att överbrygga denna klyfta är det användbart att utveckla kulturplattformar där flera miljösignaler kan kontrolleras oberoende och samtidigt. Detta koncept har fått ökande dragkraft på senare tid24,25, med studier som kombinerar matrisstyvhet och liganddensitet 26,27,28,29, substratstyvhet och porositet30, substratstyvhet och 3D-mikronichevolym31, yttopografi och kontaktvägledningssignaler 32,33,34 och kontaktvägledningssignaler i nanoskala med vägledningssignaler för krökning i mesoskala23. Det är dock fortfarande utmanande att kombinera kontaktvägledningssignaler med en mängd olika 3D-geometrier på ett kontrollerat sätt med hög genomströmning.

Detta forskningsprotokoll behandlar denna utmaning och introducerar en metod för att skapa cellodlingssubstrat med en kontrollerad kombination av mönstrade limområden av ECM-proteiner (kontaktvägledningssignaler) och substratkrökning (geometriska ledtrådar). Detta tillvägagångssätt möjliggör dissektion av cellsvar i en biomimetisk multikumiljö på ett systematiskt och höggenomsläppt sätt. Den förvärvade kunskapen kan hjälpa till att ytterligare förstå cellbeteende i komplexa miljöer och kan användas för att designa lärorika material med egenskaper som styr cellsvar till ett önskat resultat.

3D-protein fotopatterning
Skapande av limområden av ECM-proteiner (kontaktvägledningssignaler) på cellodlingsmaterial kan åstadkommas med hjälp av en mängd olika tekniker, till exempel genom djup-ultraviolett (djup-UV) mönstring eller mikrokontaktutskrift35,36. Djup-UV-mönstring använder UV-ljus som projiceras genom en mask på ett polymert material för att bryta ner passiveringspolymerer på specifika platser på cellodlingssubstratet. Det mönstrade substratet inkuberas sedan med en ligand av intresse, vilket resulterar i limområden som stöder cellfästning och odling på fördefinierade platser 12,37,38. Ett alternativt sätt att införa proteinmönster är genom mikrokontakttryck, där elastomera frimärken som innehåller en önskad form beläggs med ett valfritt protein och pressas på ett cellodlingssubstrat och därigenom överför proteinbeläggningen till vilken celler kan fästa 35,37,39,40 . Tyvärr, eftersom båda teknikerna förlitar sig på maskberedning och mjuka litografimetoder, är experimenten tidskrävande och arbetsintensiva, samt begränsade när det gäller mönsterflexibilitet. Dessutom är både djup-UV-mönstring och mikrokontaktutskrift mest lämpade för plana material och är tekniskt svåra, om inte omöjliga, för mönstring av ligander i en 3D-miljö.

Kombinerade masklös litografi, kemisk ångavsättning och termoformning för att generera mikromönsterade 3D-polymera substrat41. Denna teknik bygger dock på användningen av termoformbara polymerfilmer och erbjuder låg proteinmönsterupplösning (7,5 μm), medan celler har rapporterats svara på geometriska proteinmönster så små som 0,1 μm 2,42. beskrev en annan lovande metod för nanomönster ECM-ligander på substrat som innehåller nano- och mikrometertopografier43. Med hjälp av mikrokontakttryck överfördes ECM-proteiner från polydimetylsiloxan (PDMS) -stämplar till ett termoresponsivt poly (N-isopropylacrylamid) (pNIPAM) substrat. Därefter tillät den termoresponsiva egenskapen hos pNIPAM-nätverket dem att överföra det tvådimensionella (2D) proteinmönstret till ett topografiskt PDMS-substrat (10-100 μm djupa spår) och därigenom kontrollera lokaliseringen av vidhäftningsställen på topografiska egenskaper. Alla möjliga mikrotopografier kan dock inte mönstras eftersom minskade vätbarhetsproblem gör det svårare att mönstra djupare topografiska substrat. Diken med ett bildförhållande mellan djup och bredd på 2,4 har rapporterats vara den ultimata gränsen för att framgångsrikt överföra mönstret till det topografiska substratet43. Dessutom är flexibiliteten hos olika mönster och upplösningen av de genererade mönstren dålig på grund av kravet på mikrokontaktutskrift.

Detta dokument beskriver en metod som övervinner de ovannämnda flaskhalsarna och erbjuder en flexibel metod med hög genomströmning för att skapa multicue-substrat som kan användas för cellodling (se figur 1). Fysiologiskt relevanta geometrier (cylindrar, kupoler, ellipser och sadelytor) med krökningar från ĸ = 1/2500 till ĸ = 1/125 μm-1 är fördesignade och mikrofabricerade i PDMS-chips . Därefter skapas kontaktvägledningssignaler ovanpå 3D-geometrierna med hjälp av en mängd olika digitala mönsterdesigner genom att använda en fotomålningsteknik med en upplösning så liten som 1,5 μm44. För detta ändamål passiveras PDMS-chipsen initialt för att förhindra att celler och proteiner fäster; detta passiveringsskikt kan sedan avlägsnas genom en kombination av fotoinitiatorn 4-bensoylbenszyl-trimetylammoniumklorid (PLPP) och UV-ljusexponering45. En digital mask är utformad för att specificera platserna för UV-exponering och därmed det område där passiveringsskiktet avlägsnas. Proteiner kan därefter fästa vid dessa områden, vilket möjliggör cellfästning. Eftersom mönstringen utförs med en digital (snarare än en fysisk) mask kan en mängd olika mönster skapas snabbt utan krångel och kostnad som är förknippade med att designa och tillverka ytterligare fotomasker. Dessutom kan ett varierat utbud av ECM-proteiner (t.ex. kollagen typ I, gelatin och fibronektin) mönstras på substratet. Även om detta protokoll utförs med användning av cellodlingschips gjorda av PDMS, kan principen tillämpas på något annat material av intresse46.

Protocol

I de studier som beskrivs i detta protokoll användes primära humana keratocyter. Denna forskning utfördes i enlighet med principerna i Helsingforsdeklarationen. Primära keratocyter isolerades från överblivna humana kadaveriska hornhinneceller från Descemet Membrane Endothelial Keratoplasty-kirurgi, som erhölls från Hornhinneavdelningen vid ETB-BISLIFE Multi-Tissue Center (Beverwijk, Nederländerna) efter att ha fått samtycke från de anhöriga till alla avlidna donatorer.

OBS: Se materialtabellen för detaljer om alla material, reagenser, utrustning och programvara som används i detta protokoll.

1. Tillverkning av 3D-cellodlingssubstrat

  1. Skapa en negativ glasform (#1) som innehåller alla funktioner av intresse, i det här fallet gjorda av glas med hjälp av en femtosekundlaser direktskrivningsteknik (se figur 2).
  2. Placera försiktigt den negativa glasformen (#1) på botten av en petriskål.
  3. Förbered en PDMS-prepolymer genom att placera ett tomt 50 ml koniskt rör på en skala, ta upp skalan och häll önskad mängd silikonelastomerbas i röret.
  4. Tillsätt härdningsmedel med en Pasteur-pipett så att det slutliga förhållandet mellan elastomerbas och härdningsmedel är 10:1 (w/w).
  5. Blanda komponenterna noggrant i det koniska röret med en spatel.
  6. Centrifugera vid 2 000 × g i 70 s för att avlägsna alla luftbubblor.
  7. Häll PDMS-prepolymeren ovanpå den negativa glasformen (#1) i petriskålen för att täcka den helt.
  8. Placera petriskålen med den negativa glasformen (#1) och PDMS-prepolymeren i vakuumdesickatorn och starta vakuumpumpen. När ett vakuum har uppnåtts, vänta i 5 minuter för att ta bort alla bubblor som finns vid gränssnittet mellan formytan och PDMS-prepolymeren.
  9. Ta bort vakuumet och ta petriskålen ur exsickatorn.
  10. Härda PDMS-prepolymeren över natten i ugnen vid 65 °C.
  11. Ta försiktigt bort det nyligen härdade positiva PDMS-chipet (#2) från den negativa glasformen (#1) genom att lyfta kanterna på PDMS med en spatel. Om det positiva PDMS-chipet (#2) tenderar att hålla fast vid den negativa glasformen (#1), tillsätt etanol eller vatten till kanterna på avtrycket medan du lyfter.
    OBS: Vätskan kommer att rinna in mellan de två skikten och underlätta separationen av den negativa glasformen (#1) och det positiva PDMS-chipet (#2).
  12. Skär av sidorna på det positiva PDMS-chipet (#2) med ett blad så att ett rektangulärt chip kvarstår.
  13. Placera det positiva PDMS-chipet (#2) i en exsickator bredvid en liten injektionsflaska med en droppe tridekafluor(1,1,2,2-tetrahydrooktyl)triklorsilan, ett silaniseringsmedel, och låt stå under vakuum över natten.
    OBS: Silanisering kommer att se till att avtrycket inte binder till andra PDMS-lager senare i protokollet. Andra silaniseringsmedel och /eller metoder kan också fungera för att säkerställa att ytorna på PDMS-chipsen inte fastnar på andra PDMS-lager.
    VARNING: Tridekafluor(1,1,2,2-tetrahydrooktyl)triklorsilan är brandfarligt (H226) och orsakar allvarliga hudbrännskador och ögonskador (H314). Använd personlig skyddsutrustning, arbeta i dragskåp och tvätta händerna noggrant efter hantering. Håll silaniseringsmedlet borta från värme, heta ytor, gnistor, öppna lågor och andra antändningskällor. Förvaras mellan 15 och 30 °C (P280, P210, P240, P403, P235, P310).
  14. Ta bort vakuumet och placera det positiva PDMS-chipet (#2) på botten av en petriskål. Häll PDMS-prepolymer (10: 1) ovanpå för att producera flera negativa PDMS-formar (# 3).
  15. Sätt petriskålen under vakuum i exsickatorn i 15 minuter för att ta bort alla bubblor.
  16. Härda PDMS-prepolymeren vid 65 °C över natten, varefter den negativa PDMS-formen (#3) kan skalas bort från det positiva PDMS-chipet (#2) med hjälp av en spatel.
  17. Silanisera den slutliga negativa PDMS-formen (#3) med silaniseringsmedel i en vakuumdessiccator över natten.
  18. Producera flera cellodlingschips (#4, se figur 2) med en tjocklek på cirka 5 mm genom att hälla PDMS-prepolymer i den negativa PDMS-formen (#3), avlägsna bubblor med exsickatorn och härda i 3 timmar vid 65 °C. Skär chipet med ett rakblad till den slutliga storleken som visualiseras i figur 2. Förvara chipsen i rumstemperatur.
    OBS: Ytjämnhet kan påverka cellresponsen. Vid behov kan ytterligare ett tunt lager PDMS användas som beläggning på det positiva PDMS-chipet (#2) för att jämna ut ytan. För att göra det, häll en liten droppe PDMS-prepolymer på chipet och sprid det över hela chipet med trycksatt luft. Härda det belagda spånet vid 65 °C i 3 timmar och fortsätt med steg 1.12.

2. Tillverkning av platta PDMS-prover (kontrollprover)

  1. Förbered PDMS-prepolymer (10:1) enligt steg 1.3-1.6.
  2. Placera ett glasöverdrag på den rundade vakuumstolpen i mitten av centrifugeringsbeläggningen.
  3. Slå på vakuumet för att fästa glasöverdragslipen på maskinen och pipettera en droppe PDMS i mitten av täckglaset med en Pasteur-pipett.
  4. Fördela PDMS-prepolymeren över glassubstratet med hjälp av följande protokoll för att få ett cirka 10 μm tjockt lager.
    1. Spincoat i 10 s vid 0,45 × g, acceleration: 0,2 × g/s.
    2. Spincoat i 50 s vid 44,8 × g, acceleration: 0,54 × g/s.
  5. Stäng av vakuumet, ta bort täckglaset från centrifugeringsbeläggningen med pincett och lägg det i en petriskål. Härda PDMS över natten i ugnen vid 65 °C och förvara i rumstemperatur efteråt.

3. Substrat passivering av 3D-cellodlingssubstrat

  1. Aktivera hydroxylgrupperna på ytan av PDMS-chipet (#4) medO2-plasma. Använd pincett och placera chipet i korgen på plasma asher.
  2. Kör en askcykel med en effekt på 20 W i 30 s. Ventilera askkammaren med N2.
  3. Ta ut chipet ur korgen och placera det i en liten PDMS-behållare (se figur 1).
  4. Tillsätt 500 μl Poly-L-lysin (PLL, 0,01%) på toppen av chipet med hjälp av en Pasteur-pipet så att hela ytan nedsänks i PLL-lösningen. Inkubera i 30 min vid rumstemperatur.
  5. Ta bort 450 μL av PLL från cellodlingschipet med en pipett och skölj chipytan tre gånger med 500 μL 0,1 M HEPES-buffert (8 < pH < 8,5). Lämna alltid en liten volym vätska på PDMS-chipet för att undvika uttorkning av provet, vilket minskar den slutliga mönsterkvaliteten.
  6. Gör 500 μL av ett 50 mg/ml metoxipolyetylenglykol-succinimidylvalerat (mPEG-SVA; MW 5 000 Da) lösning i 0,1 M HEPES-buffert (8 < pH < 8,5) per cellodlingschip och låt det inkubera på provet i 60 min. Eftersom mPEG-SVA har en halveringstid på 15 min, var noga med att förbereda den erforderliga mängden strax före användning.
    OBS: mPEG-SVA löses upp när lösningen är helt transparent.
  7. Ta bort 450 μL av mPEG-SVA-lösningen med en mikropipet och tvätta spånytan fem gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Se till att pipettera upp och ner flera gånger per tvätt för att säkerställa att all obunden mPEG-SVA tas bort. För att förhindra att provet torkar ut, minimera tiden mellan tvättstegen och se till att använda ett överskott (500 μL eller mer) PBS för tvätt.
  8. Lagra proverna genom att nedsänka dem i PBS eller fortsätt till protokollets mönstringssteg.
    OBS: Om så önskas kan passivering utföras under sterila förhållanden när man arbetar i ett kulturskåp och arbetar med sterila lösningar och utrustning.

4. Lagring av mönstrade cellodlingssubstrat

OBS: 3D-cellodlingssubstrat kan lagras under olika steg i processen.

  1. Förvara härdade PDMS-cellodlingschips under torra förhållanden vid rumstemperatur.
  2. Förvara de passiverade cellodlingschipsen på ett av dessa två sätt:
    1. Förvaras i PBS vid 4 °C i upp till 7 dagar.
    2. Förvaras under torra förhållanden i upp till flera månader. För att få torra prover, ta bort PBS och skölj flera gånger med dubbeldestillerat vatten (ddH2O). Föna med en kväve- eller luftpistol.

5. Design av digitala masker som används för fotomålning

OBS: Mönstring av 3D-substrat kan utföras med hjälp av ett enda eller flera fokalplan (se figur 3). Ett enda fokalplan kan användas på funktioner som inte är större än en digital spegelanordning (DMD, cirka 300 μm x 500 μm) och som inte är för höga (50-100 μm). Designa i så fall ett digitalt mönster med TIFF-läget. För funktioner som överskrider dimensionerna på en DMD och är relativt höga, dela upp substratets mönstring i flera steg. I det här fallet är flera mönster utformade med PDF-läget som alla individuellt fokuserar på enstaka fokalplan.

  1. Designa en digital mask med hjälp av designprogramvaruverktyg.
    1. Mönstring i TIFF-läge (pixlar): Skapa en helt svart rityta på 1 140 x 1 824 pixlar (den exakta storleken på 1 DMD, cirka 300 μm x 500 μm) och fyll ritytan med de former som är intressanta. Exportera ritytan som en 8-bitars TIFF-fil.
      OBS: Olika grånivåer i mönsterdesignen avgör hur mycket exponering som kommer att utföras på den platsen.
    2. Mönstring i PDF-läge (metriska enheter): Skapa en svart rityta av önskad storlek i mm och fyll ritytan med valfri form av intresse. Dela upp mönstret i flera filer om 3D-substratet behöver mönstras med flera fokalplan. Spara ritytan som en PDF-fil.
      OBS: Olika grånivåer i mönsterdesignen avgör hur mycket exponering som kommer att utföras på den platsen.

6. UV-fotomålning av 3D-cellodlingssubstrat

  1. Kalibrering
    OBS: Kalibrering av lasern görs för att få rätt fokus på materialet av intresse. Eftersom PDMS-cellodlingssubstraten är för tjocka för att mönstra igenom, använd en glasskiva på vilken chipet placeras upp och ner. Eftersom lasern möter glasskivan först, använd glas för att kalibrera lasern.
    1. Applicera fluorescerande highlighter på ett glasöverdrag och placera glasöverdragslip i lysrörsmikroskopets stadium. Se till att den markerade ytan är vänd uppåt.
    2. Slå på mikroskopet och PRIMO-utrustningen och öppna Micro-manager för att komma åt Leonardo-programvaran under "plugins".
    3. Välj Kalibrering i den första menyn, följt av att välja 20x-målet både i mikroskopet och i programvaran. Klicka på Nästa.
    4. Placera glasskivan med fluorescerande highlighter i mikroskopets optiska bana. Byt till fluorescerande läge och fokusera försiktigt på PRIMO-bilden som visas och se till att både logotypen och texten är i fokus. Klicka på Nästa för att avsluta kalibreringsproceduren.
    5. Skriv ner Z-platsen för scenen när du kalibrerar och använd den här platsen som referens senare i protokollet.
      OBS: Kalibreringsmaterialet ska matcha det material som används för mönstring senare i protokollet. Ovanstående steg beskriver den kalibrering som behövs för cellodlingssubstraten. För kalibrering av platta PDMS-kontrollprover, applicera fluorescerande överstrykningspenna ovanpå ytterligare ett platt PDMS-prov och kalibrera med hjälp av steg 6.1.2-6.1.5.
  2. Mönstra 3D-funktioner med ett enda fokalplan
    OBS: Mönstring med ett enda fokalplan görs på 3D-funktioner som inte överskrider måtten på en DMD (cirka 300 μm x 500 μm). Ett schema över fokalplanets inställning illustreras i figur 3.
    1. Ta bort kalibreringsglaset från scenen och placera en glasskiva som innehåller en droppe (~ 50 μL) fotoinitiator (PLPP) i scenen.
      VARNING: PLPP är irriterande för ögonen, andningsorganen och huden (R36-38). Använd personlig skyddsutrustning, håll den borta från explosiva material, tillsätt aldrig vatten till denna produkt, vidta försiktighetsåtgärder mot statiska urladdningar och undvik stötar och friktion (S26-36).
    2. Placera PDMS-cellodlingssubstratet upp och ner i droppen av fotoinitiator. Se till att 3D-funktionerna på ytan av cellodlingssubstratet vetter mot glasskivan och är helt nedsänkta i PLPP för att säkerställa korrekt mönstring.
    3. Välj Mönster i programvaran.
    4. Byt till brightfield-läge på mikroskopet och flytta scenen till funktionen av intresse.
    5. Fokusera på toppen eller botten av konvexa respektive konkava strukturer (figur 3).
    6. Välj PRIMO för att infoga ett valfritt mönster. Observera förhandsgranskningen av mönstret i orange ovanpå den levande brightfield-bilden.
    7. Justera mönstringsinställningarna efter funktion (plats, vinkel, repetitioner) och välj en dos på 1 000 mJ/mm2.
    8. Klicka på Lås och växla mikroskopet till fluorescerande läge.
    9. Klicka på Play-knappen längst ner till höger på skärmen för att starta mönstringen. När du är klar, observera mönstret som visas i grönt.
    10. När du är klar med alla funktioner på ett cellodlingschip, ta bort chipet från mönstringsglaset och förvara i PBS vid 4 ° C.
  3. Mönstra 3D-funktioner med flera fokalplan
    OBS: Mönstring med flera fokalplan görs på 3D-funktioner som är större än en DMD (cirka 300 μm x 500 μm) eller är relativt höga. I det här fallet måste 3D-funktionerna mönstras i flera steg, det vill säga mönsterdesignen ska anpassas enligt exemplet i figur 3.
    1. Ta bort kalibreringsglaset från scenen och placera en glasskiva som innehåller en droppe (~ 50 μL) fotoinitiator (PLPP) i scenen.
    2. Placera PDMS-cellodlingschipet upp och ner i droppen av fotoinitiator med pincett.
    3. Välj Mönster i programvaran. Byt till brightfield-läge på mikroskopet och flytta scenen till funktionen av intresse.
    4. Fokusera på chipets område på rätt plats. Eftersom mönstring utförs i ett enda fokalplan och funktionerna är större än en enda DMD, använd flera fokalplan och därmed flera omgångar av mönstring per 3D-substrat för att säkerställa tillräcklig mönsterupplösning längs funktionens fullständiga höjd och bredd (se figur 3). För en funktion med en höjd av 150 μm kan du till exempel mönstra funktionen i tre omgångar (± 1 fokalplan per 50 μm Z-resa), med fokus på cirka 25 μm, 75 μm och 125 μm från botten av funktionen. Kontrollera att funktionens undersida är runt det värde som skrevs ned i steg 6.1.5.
    5. Välj PRIMO för att infoga det valda mönstret. Observera förhandsgranskningen av mönstret som visas i orange ovanpå den levande brightfield-bilden.
    6. Justera mönstringsinställningarna efter funktion (plats, vinkel) och välj en dos på 1 000 mJ/mm2.
    7. Klicka på Lås och växla mikroskopet till fluorescerande läge.
    8. Klicka på Play-knappen längst ner till höger på skärmen för att starta mönstringen. När du är klar, observera mönstret som visas i grönt.
    9. Upprepa steg 6.3.4-6.3.8 om funktionen av intresse när flera fokalplan används.
    10. När du är klar med alla funktioner på ett cellodlingschip, ta bort chipet från mönstringsglaset och förvara det i PBS vid 4 ° C.
      OBS: Om så önskas, applicera UV-fotofärgningen under sterila förhållanden, använd petriskålar med glasbotten och förbered alla underlag i sterila odlingsskåp. Förvara de mönstrade proverna i PBS i upp till ett par veckor. Vid tvättning med ddH2Ooch torkat med tryckluft kan proverna förvaras upp till några månader vid 4 °C.

7. Proteininkubation

OBS: Det rekommenderas att använda nyligen proteininkuberade substrat för cellodling. Fortsätt bara till denna del av protokollet om cellsådden (steg 8) görs direkt efteråt.

  1. Överför det mönstrade cellodlingschipet till sterila PDMS-behållare i odlingsskåpet.
  2. Tvätta de mönstrade cellodlingschipsen 3x med ett överskott av steril PBS om mönstringen inte utfördes under sterila förhållanden.
  3. Förbered en ny proteinlösning i PBS.
    1. Fibronektin: tillsätt 2 ml PBS med hjälp av en mikropipet till en injektionsflaska med 20 μg rhodaminmärkt fibronektin för att erhålla en koncentration på 10 μg/ml. Pipettera försiktigt för att undvika bildandet av proteinklumpar och skydda mot ljus.
    2. Gelatin: tina en 200 μL alikvot upplöst gelatin-fluorescein. Skydda mot ljus.
  4. Tillsätt 200-500 μL av proteinlösningen till cellodlingschipet med användning av en mikropipet. Justera inkubationstiden och temperaturen beroende på vilket protein du väljer: Fibronektin: 5 min vid rumstemperatur, Gelatin: 15 min vid 37 °C. Se till att täcka provet (t.ex. med aluminiumfolie).
  5. Ta bort proteinlösningen och tvätta 5x med 500 μL steril PBS. Se till att pipettera PBS upp och ner flera gånger framför alla relevanta funktioner i cellodlingschipet för att ta bort obundet protein.
    OBS: Under tvättstegen är det viktigt att provet aldrig torkar ut. När du tar bort proteinlösningen eller PBS under tvätt, tillsätt omedelbart ny PBS för att förhindra att proteinklumpar bildas (se figur 4). Konvexa egenskaper är särskilt känsliga för uttorkning eftersom de är förhöjda över substratytan.
  6. Valfritt: granska proteinmönstren under ett fluorescensmikroskop. Håll proverna sterila och nedsänkta i PBS.

8. Cellsådd

OBS: Detta protokoll använder humana primära keratocyter och humana dermala fibroblaster. Keratocyterna skördades från human hornhinnevävnad från patienter, i linje med nederländska riktlinjer för sekundär användning av material, och karakteriserades tidigare som keratocyter47. Dessa celler odlas i DMEM kompletterat med 5% Fetal Bovine Serum (FBS), 1% penicillin / streptomycin (P / S) och 1 mM L-askorbinsyra 2-fosfat sesquimagnesium salthydrat (vitamin C) vid 37 ° C för högst fyra passager. Humana dermala fibroblaster köptes och odlades i DMEM kompletterat med 10% FBS och 1% P/S vid 37 °C för maximalt 15 passager. För sådd av både keratocyter och dermala fibroblaster på det fotomönsterade cellodlingschipet användes 20 000 celler per chip.

  1. Lösgör cellerna av intresse (t.ex. med trypsin) och förbered 1 ml av en cellsuspension på ± 10 000-50 000 celler / ml i odlingsmedium per chip. Justera det exakta antalet celler som läggs till per substrat beroende på cellstorlek och önskad avläsning.
  2. Ta bort PBS från cellodlingschipet och tillsätt 1 ml av cellsuspensionen.
  3. Transportera försiktigt cellodlingschipet med cellerna till inkubatorn och inkubera i 60 minuter vid 37 °C.
  4. Kontrollera vidhäftningen av cellerna på det mönstrade cellodlingschipet under ett ljusfältmikroskop. Leta efter långsträckta cellmorfologier när det gäller linjemönster (se figur 5). Om celler också har börjat fästa utanför det mönstrade området, ta bort dessa genom att pipettera medium upp och ner direkt ovanför cellerna på substratet.
    OBS: Celler som är fästa vid det mönstrade området kommer att förbli fästa, medan celler utanför de mönstrade områdena kommer att lossna.
  5. Ta bort cellodlingschipet från PDMS-behållaren och använd steril pincett för att lägga det i en 6-brunnsplatta fylld med ~ 5 ml odlingsmedium.
  6. Odla cellerna under önskad tid. Byt ut cellodlingsmediet var 2-3: e dag. För att säkerställa visualisering av proteinmönstret efter cellodling, minska mängden exponering av provet för ljus under odling.

9. Färgning, bildförvärv och analys

  1. Fixering och färgning
    1. Efter önskad kulturlängd, ta bort nästan allt medium och tvätta tre gånger med överskott av PBS. Inkubera sedan med 3,7% formalin i 15 minuter vid rumstemperatur följt av tre tvättsteg med PBS i 5 min per tvätt vid rumstemperatur. Låt aldrig provet torka ut.
      VARNING: Formalin är skadligt vid förtäring eller inandning (H302, H332), kan orsaka en allergisk hudreaktion (H317), misstänks orsaka genetiska defekter (H341) och kan orsaka cancer (H350). Använd personlig skyddsutrustning och arbeta i en dragskåp.
    2. Färga cellodlingssubstratet med önskade färgämnen eller antikroppar. För att minska volymerna av färgämnen, placera cellodlingsflisen upp och ner i en droppe färgningslösning som rörs på en glasskiva.
    3. Förvara proverna i PBS (kortvarigt) eller fäst vid ett täckglas med montering på medellång (lång sikt) vid 4 °C.
  2. Bildförvärv
    1. Placera det färgade provet upp och ner i en droppe PBS på en glasskiva. Sätt provet i scenen i ett konfokalmikroskop.
    2. Beroende på önskad detaljnivå, gör Z-stackar med ett lämpligt mål (10x, 20x eller 40x) och Z-avstånd för att säkerställa korrekt bildförvärv.
  3. Bildanalys och visualisering
    1. Öppna råbildfilerna i bildanalysprogramvaran och kontrollera att bildegenskaperna (t.ex. dimensioner, upplösning) är korrekta.
    2. Justera ljusstyrkan och kontrasten per kanal om det behövs.
    3. Beskär det intresseområde som innehåller mönstret och cellerna.
    4. Valfritt: utför ett dekonvolutionssteg om det behövs.
    5. Skapa en 3D-rendering av Z-stacken med hjälp av 3D-renderingsprogram.
    6. Optimera kontrast- och förstärkningsinställningarna för varje enskild kanal.
    7. Om du vill skapa en bild av 3D-renderingen skapar du en ögonblicksbild och exporterar som . TIFF-fil.
    8. Om du vill skapa en film med 3D-renderingen ställer du in startbildrutan och den slutliga bildrutan samt tidsramen innan du registrerar filmen. Exportera som .avi.

Representative Results

Med hjälp av det beskrivna protokollet kan 3D PDMS-cellodlingssubstrat UV-fotomönsteras för att skapa exakta och höggenomströmningshäftande områden som är lämpliga för cellfästning. På detta sätt utsätts celler för både relevanta substratgeometrier och adhesiva ligandmönster samtidigt. Cellegenskaper som orientering, cellarea och antal fokala vidhäftningar kan enkelt övervakas och användas för att bättre förstå cellbeteende i komplexa, in vivo-liknande miljöer.

För att verifiera mönstringshändelserna på 3D PDMS-substraten har atomära ytkompositioner av materialet i olika steg i protokollet mätts med hjälp av atomär röntgenfotoelektronspektroskopi (XPS)48. Sammanfattningsvis visade XPS-mätningarna närvaron av PEG-kedjor med en ökad kolsignal på passiverade prover, vilket reducerades efter fotomålning. Inkubation med fibronektin resulterade i en ökning av kolsignalen, vilket återigen indikerar framgångsrik proteinadhesion på ytan av cellodlingschipet. Därefter karakteriserades mönsterupplösning och inriktning på 3D-funktioner på en mängd olika cirkelmönstrade, konkava gropar (ĸ = 1/250 μm-1, ĸ = 1/1 000 μm-1 och ĸ = 1/3 750 μm-1, se figur 6). Från de maximala intensitetsprojektionerna kan man dra slutsatsen att proteinmönstret framgångsrikt mönstrades på alla tre 3D-funktionerna. Intensitetsprofilen i figur 6A visar hög mönsterupplösning med skarpa övergångar mellan mönstrade och icke-mönstrade områden. Dessutom erhölls konsekvent proteinintensitet över hela mönstret i gropen.

Den konkava gropen med ĸ = 1/250 μm-1 mönstrades med hjälp av metoden med ett enda fokalplan (ett mönster), medan groparna med ĸ = 1/1 000 μm-1 och ĸ = 1/3 750 μm-1 mönstrades med två respektive tre fokalplan (mönster). Som framgår av projektionerna med maximal intensitet i figur 6 resulterar båda metoderna i perfekt anpassning av mönstren ovanpå funktionerna. Inga feljusterade övergångar mellan de två olika fokalplanen och mönstren kan observeras.

Med hjälp av det beskrivna protokollet kan ett brett spektrum av proteinmönsterdesigner appliceras på en mängd olika geometrier (se figur 7 och video 1). För att illustrera mångsidigheten hos denna metod mönstrades semicylinders (konvexa och konkava), en sadelyta och grop med linjer och cirklar av olika bredder. De fotomönsterade materialen kan därefter användas för cellodling (se figur 7, figur 8, video 2, video 3 och video 4). Ett exempel på dermala fibroblaster odlade på en mönstrad (fibronektinlinjer, röd, 5 μm bred och 5 μm luckor) konkav semicylinder visas i figur 8, figur 9 och video 4. Under experimentet känner cellerna av och fäster vid multikue-cellodlingssubstratet och förblir livskraftiga över tiden. Som framgår av den immunofluorescerande färgningen i figur 8 bildar celler fokala vidhäftningar (vinculinkluster) huvudsakligen på fibronektinlinjerna.

En annan exempelstudie som använder dessa cellodlingsmaterial publicerades nyligen av vår grupp48. I denna studie utsattes humana myofibroblaster och endotelceller för kombinationen av kontaktvägledningssignaler och geometriska topografier. In vivo upplever båda typerna av celler kröknings- och kontaktvägledningssignaler i inhemska vävnader, såsom i den mänskliga vaskulaturen. Genom att utsätta cellerna in vitro för en miljö som kombinerar båda miljösignalerna kan in vivo-situationen rekapituleras, vilket ger en djupare förståelse för mikromiljöns roll för cellbeteende. Humana myofibroblaster visade sig anpassa sig till kontaktvägledningssignaler (parallella fibronektinlinjer) på konkava cylindriska substrat48. Men på konvexa strukturer med ökande krökningar åsidosatte de geometriska ledtrådarna de biokemiska ledtrådarna, vilket tyder på att myofibroblaster kan känna både graden och tecknet på krökning. Intressant nog kunde endotelceller bara fästa vid de konkava multikue-substraten och inte till de konvexa PDMS-substraten. På konkava, proteinmönstrade substrat är endotelcellerna orienterade i riktning mot kontaktvägledningssignalen. Denna grundläggande in vitro-kunskap har fysiologisk relevans inom vaskulär vävnadsteknik och kan så småningom hjälpa till med utformningen av smarta vävnadstekniska konstruktioner.

Figure 1
Figur 1: Den experimentella tidslinjen för att tillämpa kontaktvägledningssignaler på 3D-cellodlingssubstrat. Först produceras positiva cellodlingschips från en negativ PDMS-form som innehåller en rad geometrier. Ohärdat PDMS hälls i formen och härdas i 3 timmar vid 65 °C. Därefter behandlas PDMS medO2-plasma och inkuberas med PLL och mPEG-SVA (blå, märkt) för att passivera ytan på cellodlingssubstratet. Efter tvättning vänds substratet upp och ner i en droppe fotoinitiator (PLPP, grön, märkt) och UV-fotomönster med LIMAP-metoden. Här används en digital mask med ett användardefinierat mönster för att klyva passiveringsskiktet på definierade platser. Därefter kan en proteinlösning (röd, märkt) inkuberas och kommer bara att fästa vid de platser där passiveringsskiktet avlägsnas. Celler som sås på substratet utsätts för både geometri och proteinmönster, vilket möjliggör forskning om cellbeteende i komplexa, in vivo-härmande miljöer. Förkortningar: PDMS = polydimetylsiloxan; mPEG-SVA = metoxipolyetylenglykol-succinimidylvalerat; PLPP = 4-bensoylbensyl-trimetylammoniumklorid; LIMAP = Ljusinducerad molekylär adsorption av proteiner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Olika steg under produktion och passivering av 3D-cellodlingssubstratet. Den negativa glasformen (#1) är utformad med datorstödd designprogramvara och producerad med hjälp av en femtosekund-laser direktskrivningsteknik. Denna form används för att producera det mellanliggande positiva PDMS-chipet (# 2) och det negativa PDMS-formen (# 3), som därefter används för att producera det slutliga cellodlingschipet (# 4). Förkortning: PDMS = polydimetylsiloxan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Schematisk illustration av de två mönstringsmetoderna. Vänster: UV-fotomålning utförs på mindre funktioner (ungefär en DMD) med ett enda fokalplan och mönster. Som ett resultat är hela funktionen mönstrad på en gång. Höger: När större funktioner används (större än en DMD) delas mönstringen över flera fokalplan och mönster. Förkortning: DMD = digital spegelanordning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Ett typiskt exempel på ett normalt och uttorkat proteininkuberat substrat. Maximala intensitetsprojektioner (XY) och ortogonala vyer (XZ) av normala och uttorkade proteininkuberade substrat. När du tvättar ett mönstrat cellodlingssubstrat efter inkubation med en proteinlösning är det viktigt att alltid hålla provet vått. Även om mönstret är identiskt i alla bilder på funktionerna (ĸ = 1/1 000 μm-1), bildade gelatin-fluoresceinet (grönt) en stor klump när provet fick torka i några sekunder. Om provet alltid förblir vått kan korrekta proteinmönster observeras. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Bild 5: Brightfield-bilder efter sådd. Primära keratocyter (vänster) och dermala fibroblaster (höger) 4 h efter sådd på 3D geometriska egenskaper (konkav grop av ĸ = 1/1 000 μm-1 och semicylindrar av ĸ = 1/500, 1/375, 1/250, 1/175 och 1/125 μm-1). De övre vänstra insatserna representerar det linjemönster som används för mönstring av geometrierna. Vita pilar indikerar spridning av celler som redan visar justering. Skalstreck = 250 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Karakterisering av cirkulära mönster på konkava gropar. (A) Den maximala intensitetsprojektionen (XY) och ortogonala vyn (XZ) av akonkavegropen (ĸ = 1/250 μm-1) mönstrad med LIMAP (linjebredd: 20 μm, gapbredd: 20 μm) och inkuberad med gelatin-fluorescein (grön). Intensitetsprofilen längs den vita linjen ritas mot avståndet och visar en konsekvent mönsterkvalitet och upplösning. (B) Ytterligare mönstring utförd på konkava gropar med ĸ = 1/1 000 μm-1 och ĸ = 1/3750 μm-1, vilket visar flexibilitet när det gäller geometriska egenskaper som kan användas för mönstring. Återigen visualiseras både maximala intensitetsprojektioner (XY) och ortogonala vyer (XZ). Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: 3D-mikroskopidata för mönstrade strukturer. Typiska exempel på 3D-mönstrade cellodlingsmaterial efter fotomålning och cellodling, visualiserade med hjälp av 3D-renderingsprogramvara. (A) Konvex semicylinder mönstrad med 10 μm breda linjer (rhodamin-fibronektin, röd) och 10 μm breda luckor. Skalstreck = 5 μm. (B) Dermala fibroblaster färgade för F-aktin (grönt) odlade på konkav semicylinder mönstrad med 20 μm breda linjer (rhodamin-fibronektin, röd) och 20 μm breda luckor. Skalstång = 5 μm. (C) Sadelyta mönstrad med 20 μm breda linjer (rhodamin-fibronektin, röd) och 20 μm breda luckor. Skalstreck = 5 μm. (D) Konkav grop mönstrad med koncentriska cirklar med 20 μm breda linjer (gelatin-fluorescein, grön) och 20 μm breda luckor. F-aktincytoskeletten hos de humana keratocyterna färgas med användning av falloidin och visualiseras i rött. Skalstreck = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: Immunofluorescerande färgning av humana dermala fibroblaster på en fotomönsterad, konkav semicylinder. Cellerna är färgade för F-aktin (magenta), vinculin (grönt) och kärnor (blått). Skalstreck = 100 μm. (B) Inzoomning av en cell som ansluter till multicue-miljön. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 9
Figur 9: Brightfield timelapse-bilder av mänskliga dermala fibroblaster på en mönstrad, konkav cylinder. Den konkava semicylindern (ĸ = 1/250 μm-1) mönstrades med parallella linjer (5 μm breda och 5 μm luckor) och inkuberades med rhodamin-fibronektin före cellsådd. Timelapse-avbildning startas 1 h efter initial cellsådd (vänster, 0 min), när cellerna fortfarande är rundade och icke-vidhäftande (pilar). Efter cirka 24 timmar (mitten, 1 420 minuter) vidhäftade cellerna till multikue-substratet och visar ett inriktningssvar enligt kontaktvägledningsmönstret. Både anpassningssvaret och cellviabiliteten bibehålls under hela odlingstiden (höger, 3 180 min). Skalstreck = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Video 1: Mönsterexempel på ett 3D-cylindriskt substrat. 3D-representation av en konvex cylinder mönstrad med rhodamin-fibronektin (röd). Klicka här för att ladda ner den här videon.

Video 2: 3D-representation av dermala fibroblaster odlade på ett mönstrat, 3D-cylindriskt substrat (ĸ = 1/500 μm-1). Dermala fibroblaster odlade i 24 timmar på en mönstrad (fibronektinlinjer, röd, 10 μm bred och 10 μm luckor) konvex semicylinder. Cellerna är färgade för F-aktin (magenta), vinculin (grönt) och kärnor (blått). Klicka här för att ladda ner den här videon.

Video 3: 3D-representation av humana keratocyter odlade på en mönstrad 3D-grop (ĸ = 1/3 750 μm-1). 3D-representation av humana keratocyter odlade i 24 timmar i en konkav, mönstrad grop (gelatincirklar, grön, 20 μm bred och 20 μm luckor). Cellerna är färgade för F-aktin (röd). Klicka här för att ladda ner den här videon.

Video 4: Brightfield timelapse-avbildning av humana dermala fibroblaster på en mönstrad, konkav cylinder. Den konkava semicylindern (ĸ = 1/250 μm-1) mönstrades med parallella linjer (5 μm breda och 5 μm luckor) och inkuberades med rhodamin-fibronektin före cellsådd. Timelapse-avbildning startas 1 h efter initial cellsådd, när celler visar initial vidhäftning till multicue-miljön. Under hela timelapsen orienterar cellerna övervägande längs kontaktvägledningssignalerna, medan cellviabiliteten bibehålls. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Discussion

Numera studeras cellbeteende ofta på platta odlingssubstrat som saknar komplexiteten hos den inhemska cellmikromiljön. 3D-miljöer som byggnadsställningar och hydrogeler används som ett alternativ. Även om dessa cellodlingsmiljöer förbättrar in vivo-relevansen, är både systematiska studier av cellbeteende och genomförbarheten av avläsningsmetoder fortfarande utmanande. För att systematiskt undersöka cellbeteende på representativa odlingssubstrat behövs konsekventa multikue-substrat som möjliggör mikroskopisk avläsning. Därför beskriver vi i detta protokoll en metod för att skapa multikue cellodlingssubstrat med fysiologiskt relevanta geometrier och mönstrade ECM-proteiner. Den största utmaningen med att kombinera miljösignaler som vävnadsgeometri och kontaktvägledningssignaler på in vitro-plattformar är till stor del av teknisk natur. Konventionella metoder för att tillämpa kontaktvägledningssignaler (t.ex. mjuk litografi, djup-UV-mönstring och mikrokontaktutskrift35,36) på cellodlingsmaterial har optimerats för plana substrat. Behovet av 3D-cellodlingsmaterial i kombination med kontaktvägledningssignaler belyste flera tekniska utmaningar, såsom dålig mönsterjustering, upplösning och flexibilitet. För att övervinna dessa utmaningar kan en masklös, ljusbaserad mönstringsmetod med hög genomströmning användas45,49. Här möjliggör ett optiskt mikroskop exakt mönsterjustering och en upplösning i storleksordningen mikrometer (se figur 6). Vidare gör användningen av en digital mask det möjligt för forskare att studera cellbeteende på ett brett spektrum av mönster utan att behöva tillverka arbetsintensiva fysiska masker.

UV-fotomålningsmetoden kan användas i kombination med en mängd olika 3D-geometrier (t.ex. cylindrar, sadlar, kupoler, gropar) tillverkade av en rad olika material48. 3D-cellodlingssubstraten som används i denna studie är gjorda av PDMS; andra material kan dock också användas. Detta kan kräva olika steg för att producera det slutliga cellodlingssubstratet som innehåller de egenskaper som är av intresse. Eftersom celler har visat sig vara känsliga för ytjämnhet hos cellodlingsmaterial är det viktigt att skapa cellodlingschipsen med en slät yta så att de observerade cellernas svar helt kan hänföras till 3D-geometrin och kontaktvägledningssignalerna50,51. Mätmetoder som optisk profilometri, svepelektronmikroskopi eller atomkraftsmikroskopi kan användas för att mäta ytjämnhet. Efter tillverkning av cellodlingsmaterialet kan man välja en mönstringsmetod baserad på ett eller flera fokalplan beroende på de specifika dimensionerna för funktionen av intresse (se figur 3). Vanligtvis används ett enda fokalplan för att mönstra ett område inom ett Z-intervall på cirka 50 μm. Mönsterupplösningen visade sig vara konsekvent med hjälp av denna tumregel (se figur 6). En nackdel med denna metod är dock den ökade mönstringstiden med införandet av flera fokala plan och mönster. I vår hand, med hjälp av flera fokalplan, har 3D-geometriska funktioner upp till 16 mm x 16 mm x 0,17 mm (X x Y x Z) framgångsrikt mönstrats med hög mönsterkvalitet.

Dessutom är det viktigt att nämna att höjden (Z-axeln) på geometriska egenskaper som kan användas i kombination med detta protokoll är begränsad. Eftersom både UV-fotofärgningen och många cellulära avläsningar är beroende av en mikroskopiinställning, bestämmer målens arbetsavstånd den maximala höjden för en funktion. I vår hand kan geometrier som överstiger en höjd av 300 μm fortfarande UV-fotomönster, och avläsningar har utförts med hjälp av ett konfokalmikroskop med 40x mål. Således är mekanobiologisk forskning som sträcker sig från intracellulära till cellulära och vävnadsskalor möjlig med hjälp av det beskrivna protokollet.

En annan faktor som måste beaktas är risken för att prover torkar ut under eller efter UV-fotofärgningen49. Detta är särskilt relevant vid användning av 3D-geometrier, eftersom konvexiteter ofta exponeras utanför cellodlingsmaterial. Som visas i figur 4 kan detta resultera i ojämna mönster med proteinaggregat som bildas ovanpå funktionen av intresse. Tvättningen av cellodlingschipsen efter proteininkubation och under cellodling är avgörande för korrekt beläggning av 3D-geometrier. Därför rekommenderas det att alltid lämna små volymer av en arbetslösning (PBS, PLPP, proteinlösning, cellodlingsmedium) ovanpå cellodlingschipet.

Hittills har flera proteinbeläggningar (fibronektin, kollagen typ I och IV, gelatin, FNC) och celltyper (humana benmärgsstromaceller, humana myofibroblaster, humana endotelceller, humana keratocyter och dermala fibroblaster) använts i kombination med den beskrivna fotopatterningsmetoden på strukturerade cellodlingsmaterial. Som visats i en tidigare studie48 är optimeringen av proteininkubationsparametrar nyckeln till systematisk undersökning i nya celltyper. Innan du utför ett nytt experiment med nya proteiner eller celler rekommenderas det därför att testa en rad proteinkoncentrationer, inkubationstemperaturer och inkubationstider. Genom att jämföra cellmorfologi efter initial vidhäftning på homogena, mönstrade plana ytor med cellmorfologi under "normala" cellodlingsförhållanden kan en optimerad uppsättning experimentella parametrar erhållas. Dessutom kan varje celltyp kräva olika lång tid efter sådd för att visa en igenkännbar vidhäftningsmorfologi i en specifik multikuemiljö (se figur 5). För detta ändamål är det viktigt att optimera den tid som krävs per celltyp för att presentera kontakthändelser på det mönstrade området under tvätten i steg 8.4. Till exempel observerade vi att humana keratocyter på nätet visar långsträckta morfologier inom de första 30 minuterna efter sådd, medan endotelceller och dermala fibroblaster kräver flera timmar innan de visar en förändring i vidhäftningsmorfologi. De experimentella parametrar som krävs för proteininkubation (steg 7) och cellsådd (steg 8) kan således vara beroende av vilket protein och vilken celltyp som väljs.

Den presenterade metoden för att tillämpa kontaktvägledningssignaler på 3D-geometrier kan hjälpa till att skapa en djupare förståelse för cellbeteende i komplexa multicue-miljöer. Detta kan inkludera undersökningar av intracellulära komponenter, såsom fokala vidhäftningar och kärnor, och kan också involvera experiment utförda på en större cell- eller vävnadsskala med den föreslagna metoden. Så småningom förväntas den kunskap som erhållits kunna användas i utformningen av vävnadstekniska applikationer, där komplexa cellulära miljöer är utformade för att styra cellbeteende mot ett önskat resultat.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Dr. Nello Formisano (MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine) för att ha tillhandahållit humana primära keratocyter. Detta arbete har fått stöd av Chemelot InSciTe (projekt BM3.02); Europeiska forskningsrådet (anslag 851960). och ministeriet för utbildning, kultur och vetenskap för gravitationsprogrammet 024.003.013 "Materialdriven regenerering". Författarna vill tacka Alvéole för deras korrespondens, hjälp och felsökning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-vinculin antibody, mouse monoclonal IgG1 Sigma V9131 Dilution: 1/600
Bovine Serum albumin, Fraction V Roche 10735086001
DMEM, high glucose, pyruvate Gibco 41966029
DMEM/F-12 + GlutaMAX (1x) Gibco 10565018
DMi8 epifluorescent microscope Leica Microsystems
Ethanol Biosolve 0005250210BS
Fetal Bovine Serum Serana 758093
Fiji/ImageJ, version v1.53k www.imageJ.nih.gov
Fluorescent highlighter Stabilo 4006381333627
Fluorescin-labeled gelatin Invitrogen G13187 Concentration: 0.01%
Formaldehyde solution Merck F8775
Glass coverslips 24 x 60 mm, #1 VWR 631-1575
Glass coverslips, ø = 32 mm, #1 Menzel-Gläser
HCX PL fluotar L 20X/0.40na microscope objective Leica 11506242
HEPES Gibco 15630080
Human dermal fibroblasts Lonza CC-2511
Human primary keratocytes MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine
Illustrator, Version 26.0.1 Adobe
Laboratory oven Carbolite
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
Leica Application Suite X software, version 3.5.7.23225 Leica Microsystems
Leonardo software, version 4.16 Alvéole
Micro-manager, version 1.4.23 Open imaging
Mowiol 4-88 Sigma-Aldrich 81381 mounting medium
mPEG-succinimidyl valerate MW 5,000 Da Laysan Bio MPEG-SVA-5000 Concentration: 50 mg/mL
Negative glass mold FEMTOprint
NucBlue Live Readyprobes Reagent (Hoechst 33342) Invitrogen R37605 2 drops/mL
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140163
Petri dish (ø=100 mm) Greiner Bio-one 664160
Phalloidin Atto 647N Sigma 65906 Dilution: 1/250
Phosphate Buffered Saline Sigma P4417
Plasma asher Emitech K1050X
PLPP (photoinitiator) Alvéole
Poly-L-lysine, sterile-filtered Sigma-Aldrich P4707 Concentration: 0.01%
PRIMO Alvéole
Rhodamine-labeled fibronectin Cytoskeletn, Inc. FNR01 Concentration: 10 µg/mL
Secondary antibody with Alexa 488, Goat anti-mouse IgG1 (H) Molecular Probes A21121 Dilution: 1/300
Secondary antibody with Alexa 555, Goat anti-mouse IgG1 (H) Molecular Probes A21127 Dilution: 1/300
Spin coater Leurell Technologies Corporation model WS-650MZ-23NPPB
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW 1673921
TCS SP8X confocal microscope Leica Microsystems
tridecafluoro(1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane ABCR AB111444
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red Gibco 12604013
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Y., Wang, G., Luo, X., Qiu, J., Tang, C. Substrate stiffness regulates the proliferation, migration, and differentiation of epidermal cells. Burns. 38, 414-420 (2012).
  2. Viswanathan, P., et al. 3D surface topology guides stem cell adhesion and differentiation. Biomaterials. 52, 140-147 (2015).
  3. Peyton, S. R., et al. Marrow-derived stem cell motility in 3D synthetic scaffold is governed by geometry along with adhesivity and stiffness. Biotechnology and Bioengineering. 108 (5), 1181-1193 (2011).
  4. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 728-742 (2017).
  5. Chaudhuri, O., Cooper-White, J., Janmey, P. A., Mooney, D. J., Shenoy, V. B. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584, 535-546 (2020).
  6. Guido, S., Tranquillo, R. T. A methodology for the systematic and quantitative study of cell contact guidance in oriented collagen gels. Correlation of fibroblast orientation and gel birefringence. Journal of Cell Science. 105 (2), 317-331 (1993).
  7. Teixeira, A. I., Abrams, G. A., Bertics, P. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Epithelial contact guidance on well-defined micro- and nanostructured substrates. Journal of Cell Science. 116, 1881-1892 (2003).
  8. Driscoll, M. K., Sun, X., Guven, C., Fourkas, J. T., Losert, W. Cellular contact guidance through dynamic sensing of nanotopography. ACS Nano. 8 (4), 3546-3555 (2014).
  9. Buskermolen, A. B. C., et al. Cellular contact guidance emerges from gap avoidance. Cell Reports Physical Science. 1 (5), 100055 (2020).
  10. Thrivikraman, G., et al. Cell contact guidance via sensing anisotropy of network mechanical resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (29), 1-11 (2021).
  11. Buskermolen, A. B. C., et al. Entropic forces drive cellular contact guidance. Biophysical Journal. 116 (10), 1994-2008 (2019).
  12. Vignaud, T., et al. Reprogramming cell shape with laser nano-patterning. Journal of Cell Science. 125 (9), 2134-2140 (2012).
  13. Pouthas, F., et al. In migrating cells, the Golgi complex and the position of the centrosome depend on geometrical constraints of the substratum. Journal of Cell Science. 121 (14), 2406-2414 (2008).
  14. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  15. Théry, M., et al. Anisotropy of cell adhesive microenvironment governs cell internal organization and orientation of polarity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19771-19776 (2006).
  16. Huang, G., et al. Functional and biomimetic materials for engineering of the three-dimensional cell microenvironment. Chemical Reviews. 117 (20), 12764-12850 (2017).
  17. Callens, S. J. P., Uyttendaele, R. J. C., Fratila-Apachitei, L. E., Zadpoor, A. A. Substrate curvature as a cue to guide spatiotemporal cell and tissue organization. Biomaterials. 232, 119739 (2020).
  18. Yilmaz, C. O., Xu, Z. S., Gracias, D. H. Curved and Folded Micropatterns in 3D Cell Culture and Tissue Engineering. Methods in Cell Biology. 121, Elsevier Inc (2014).
  19. Silver, F. H., Freeman, J. W., Seehra, G. P. Collagen self-assembly and the development of tendon mechanical properties. Journal of Biomechanics. 36 (10), 1529-1553 (2003).
  20. Werner, M., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. Cellular geometry sensing at different length scales and its implications for scaffold design. Materials. 13 (4), 963 (2020).
  21. Di Cio, S., Bøggild, T. M. L., Connelly, J., Sutherland, D. S., Gautrot, J. E. Differential integrin expression regulates cell sensing of the matrix nanoscale geometry. Acta Biomaterialia. 50, 280-292 (2017).
  22. Fioretta, E. S., Simonet, M., Smits, A. I. P. M., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. Differential response of endothelial and endothelial colony forming cells on electrospun scaffolds with distinct microfiber diameters. Biomacromolecules. 15 (3), 821-829 (2014).
  23. Werner, M., Kurniawan, N. A., Korus, G., Bouten, C. V. C., Petersen, A. Mesoscale substrate curvature overrules nanoscale contact guidance to direct bone marrow stromal cell migration. Journal of The Royal Society Interface. 15 (145), 20180162 (2018).
  24. Ruprecht, V., et al. How cells respond to environmental cues - insights from bio-functionalized substrates. Journal of Cell Science. 130 (1), 51-61 (2017).
  25. Bao, M., Xie, J., Huck, W. T. S. Recent advances in engineering the stem cell microniche in 3D. Advanced Science. 5 (1800448), 1-16 (2018).
  26. Zhan, X. Effect of matrix stiffness and adhesion ligand density on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 108 (3), 675-683 (2020).
  27. Jiang, T., et al. Untangling the response of bone tumor cells and bone forming cells to matrix stiffness and adhesion ligand density by means of hydrogels. Biomaterials. 188, 130-143 (2019).
  28. Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33, 4460-4468 (2012).
  29. Rape, A. D., Zibinsky, M., Murthy, N., Kumar, S. A synthetic hydrogel for the high-throughput study of cell-ECM interactions. Nature Communications. 6 (8129), 1-9 (2015).
  30. Camarero-Espinosa, S., et al. 3D printed dual-porosity scaffolds: the combined effect of stiffness and porosity in the modulation of macrophage polarization. Advanced Healthcare Materials. 11 (2101415), 1-16 (2022).
  31. Bao, M., et al. Cellular volume and matrix stiffness direct stem cell behavior in a 3D microniche. ACS Applied Materials and Interfaces. 11 (2), 1754-1759 (2019).
  32. Charest, J. L., Eliason, M. T., García, A. J., King, W. P. Combined microscale mechanical topography and chemical patterns on polymer cell culture substrates. Biomaterials. 27, 2487-2494 (2006).
  33. Bilem, I., et al. Interplay of Geometric Cues and RGD/BMP-2 crosstalk in directing stem cell fate. ACS Biomaterials Science and Engineering. 3 (10), 2514-2523 (2017).
  34. Nam, K. -H., et al. Multiscale cues drive collective cell migration. Scientific Reports. 6, 29749 (2016).
  35. Alom Ruiz, S., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  36. Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein Micropatterns. A Direct Printing Protocol Using Deep UVs. Methods in Cell Biology. 97, Academic Press. (2010).
  37. Kane, R. S., Takayama, S., Ostuni, E., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Patterning proteins and cells using soft lithography. Biomaterials. 20 (23-24), 2363-2376 (1999).
  38. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9 (11), 1640 (2009).
  39. Offenhäusser, A., et al. Microcontact printing of proteins for neuronal cell guidance. Soft Matter. 3 (3), 290-298 (2007).
  40. Ricoult, S. G., Sanati Nezhad, A., Knapp-Mohammady, M., Kennedy, T. E., Juncker, D. Humidified microcontact printing of proteins: universal patterning of proteins on both low and high energy surfaces. Langmuir. 30 (40), 12002-12010 (2014).
  41. Waterkotte, B., et al. Biofunctional Micropatterning of Thermoformed 3D Substrates. Advanced Functional Materials. 24 (4), 442-450 (2014).
  42. Lehnert, D., et al. Cell behaviour on micropatterned substrata: Limits of extracellular matrix geometry for spreading and adhesion. Journal of Cell Science. 117 (1), 41-52 (2004).
  43. Sevcik, E. N., Szymanski, J. M., Jallerat, Q., Feinberg, A. W. Patterning on topography for generation of cell culture substrates with independent nanoscale control of chemical and topographical extracellular matrix cues. Current Protocols in Cell Biology. 75, 1-25 (2017).
  44. Micropatterning: Surface functionalization. Alvéole. , Available from: https://www.alveolelab.com/technology/micropatterning-surface-functionalization/ (2022).
  45. Strale, P. O., et al. Multiprotein printing by light-induced molecular adsorption. Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).
  46. van Gaal, R. C., Miltenburg, R. P. R. S., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C., Dankers, P. Y. W. Renal epithelial cell responses to supramolecular thermoplastic elastomeric concave and convex structures. Advanced Materials Interfaces. 8 (1), 2001490 (2021).
  47. Foster, J. W., Gouveia, R. M., Connon, C. J. Low-glucose enhances keratocyte-characteristic phenotype from corneal stromal cells in serum-free conditions. Scientific Reports. 5, 1-16 (2015).
  48. Van Der Putten, C., et al. Protein micropatterning in 2.5D: an approach to investigate cellular responses in multi-cue environments. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (22), 25589-25598 (2021).
  49. Melero, C., et al. Light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins. Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).
  50. Hou, Y., et al. Surface roughness gradients reveal topography-specific mechanosensitive responses in human mesenchymal stem cells. Small. 16 (10), 1905422 (2020).
  51. Bourkoula, A., et al. Roughness threshold for cell attachment and proliferation on plasma micro-nanotextured polymeric surfaces: The case of primary human skin fibroblasts and mouse immortalized 3T3 fibroblasts. Journal of Physics D: Applied Physics. 49 (30), 304002 (2016).

Tags

Bioteknik utgåva 184 PDMS-gjutning substratgeometri masklös UV-fotomålning kontaktvägledning krökning cellulär mikromiljö med flera signaler proteinbeläggning
Generering av multicue cellulära mikromiljöer genom UV-fotopatterning av tredimensionella cellodlingssubstrat
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van der Putten, C., D’Urso,… More

van der Putten, C., D’Urso, M., Bril, M., Woud, T. E., Bouten, C. V. C., Kurniawan, N. A. Generation of Multicue Cellular Microenvironments by UV-Photopatterning of Three-Dimensional Cell Culture Substrates. J. Vis. Exp. (184), e63988, doi:10.3791/63988 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter