Summary
Le présent protocole décrit une méthode pour extraire les vésicules extracellulaires du sang périphérique et des tissus solides avec profilage ultérieur des antigènes de surface et des cargaisons de protéines.
Abstract
Les vésicules extracellulaires (VE) circulantes et résidentes dans les tissus représentent des cibles prometteuses en tant que nouveaux biomarqueurs théranostiques, et elles apparaissent comme des acteurs importants dans le maintien de l’homéostasie de l’organisme et la progression d’un large éventail de maladies. Alors que les recherches actuelles se concentrent sur la caractérisation des exosomes endogènes d’origine endosomale, les microvésicules qui s’échappent de la membrane plasmique ont attiré de plus en plus d’attention dans les domaines de la santé et de la maladie, qui se caractérisent par une abondance de molécules de surface récapitulant la signature membranaire des cellules mères. Ici, une procédure reproductible est présentée basée sur la centrifugation différentielle pour extraire et caractériser les VE du plasma et des tissus solides, tels que l’os. Le protocole décrit en outre le profilage ultérieur des antigènes de surface et des cargaisons protéiques des véhicules électriques, qui sont donc traçables pour leurs dérivations et identifiés avec des composants liés à la fonction potentielle. Cette méthode sera utile pour l’analyse corrélative, fonctionnelle et mécaniste des VE dans les études biologiques, physiologiques et pathologiques.
Introduction
Des vésicules extracellulaires (VE) ont été proposées pour définir les structures extracellulaires enfermées dans la bicouche lipidiquelibérée par les cellules 1, qui jouent un rôle important dans divers événements physiologiques et pathologiques2. Les VE libérés par les cellules saines peuvent être divisés en deux catégories principales, à savoir les exosomes (ou petits VE) formés par une voie de trafic endocytaire intracellulaire3 et les microvésicules (ou gros VE) développées par le bourgeonnement vers l’extérieur de la membrane plasmique de la cellule4. Alors que de nombreuses études portent sur la fonction des VE prélevés in vitrosur des cellules cultivées 5, les VE issus de la circulation ou des tissus sont plus complexes et hétérogènes, ce qui a l’avantage de refléter l’état réel de l’organisme in vivo6. En outre, presque tous les types de tissus peuvent produire des VE in vivo , et ces VE peuvent agir comme messagers dans le tissu ou être transférés par divers fluides corporels, en particulier le sang périphérique, pour faciliter la communication systémique7. Les VE dans la circulation et les tissus sont également des cibles pour le diagnostic et le traitement des maladies8.
Alors que les exosomes ont été intensivement étudiés ces dernières années, les microvésicules ont également des fonctions biologiques importantes, qui peuvent être facilement extraites sans ultracentrifugation, favorisant ainsi la recherche fondamentale et clinique9. Notamment, un problème critique concernant les VE isolés de la circulation et des tissus est qu’ils sont dérivés de différents types de cellules10. Étant donné que les microvésicules sont soufflées à partir de la membrane plasmique et caractérisées par une abondance de molécules de surface cellulaire9, il est possible d’utiliser des marqueurs membranaires cellulaires parents pour identifier l’origine cellulaire de ces VE. Plus précisément, la technique de cytométrie en flux (FC) peut être appliquée pour détecter les marqueurs membranaires. De plus, les chercheurs peuvent isoler les véhicules électriques et effectuer d’autres analyses en fonction des cargaisons fonctionnelles.
Le présent protocole prévoit une procédure rigoureuse pour extraire et caractériser les VE à partir d’échantillons in vivo. Les VE sont isolés par centrifugation différentielle, et la caractérisation des VE comprend l’identification morphologique par analyse de suivi des nanoparticules (NTA) et la microscopie électronique à transmission (MET), l’analyse d’origine par FC et l’analyse de la cargaison de protéines par transfert Western. Le plasma sanguin et l’os maxillaire des souris sont utilisés comme représentants. Les chercheurs peuvent se référer à ce protocole pour les VE provenant d’autres sources et apporter les modifications correspondantes.
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Protocol
Les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément aux lignes directrices du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la quatrième Université médicale militaire et aux directives ARRIVE. Pour la présente étude, des souris C57Bl/6 âgées de 8 semaines (aucune préférence pour les femelles ou les mâles) ont été utilisées. Les étapes de l’isolement des VE plasmatiques et tissulaires sont illustrées à la figure 1. Le plasma est pris comme représentant pour décrire la procédure d’isolation EV des fluides corporels. L’os maxillaire est pris comme représentant pour expliquer la procédure d’isolement EV des tissus solides.
1. Préparation des échantillons de plasma et d’os maxillaire
- Préparez les échantillons de plasma en suivant les étapes ci-dessous.
- Déterminez le poids corporel de la souris à l’aide d’une balance de laboratoire standard.
- Ajouter 20 μL, 2 mg/mL d’héparine dans un tube à centrifuger de 1,5 mL et utiliser le mélangeur (voir le tableau des matières) pour laisser l’héparine se fixer à la paroi du tube.
REMARQUE: Les tubes anticoagulants peuvent également être utilisés directement pour recueillir le sang. - Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale de 50 mg/kg de pentobarbital sodique (voir le tableau des matières). Saisissez le cou de la souris avec le pouce et l’index, puis fixez la queue et la patte arrière gauche avec le petit doigt et injectez le pentobarbital sodique avec une seringue d’injection de 1 ml après avoir exposé le ventre.
- Confirmer que la souris est correctement anesthésiée en fonction de l’absence de réflexe cornéen et de réaction des membres lorsque le coussinet plantaire est pincé.
- Rasez les cheveux sur le visage et les cils des yeux avec des ciseaux incurvés.
- Saisissez la peau du cou de la souris et appuyez la peau autour des yeux à l’arrière du cou pour que le globe oculaire dépasse. Utilisez une pince à épiler ophtalmique pour serrer rapidement le globe oculaire et recueillir l’écoulement du sang à l’aide des tubes centrifugeux de 1,5 mL préparés à l’étape 1.1.2. Sacrifiez la souris en disloquant la vertèbre cervicale.
ATTENTION : Faites attention aux poils et aux cils, car ils peuvent provoquer une hémolyse. - Retournez doucement le tube plusieurs fois pour éviter la coagulation du sang.
ATTENTION : Retournez le tube dès que possible. - Centrifuger l’échantillon de sang pendant 15 min à 1 200 x g à 4 °C.
- Transférer soigneusement le surnageant dans des tubes centrifugeux neufs et propres de 1,5 mL et utiliser immédiatement l’échantillon de plasma ou le conserver à 4 °C pendant quelques heures.
- Diluer le surnageant avec un volume égal de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et bien mélanger.
REMARQUE: Le protocole fourni ci-dessus pour recueillir le plasma est fatal. Le sang peut également être recueilli par ponction veineusesous-clavière 11 sans sacrifier la souris.
- Préparez les échantillons d’os maxillaire en suivant les étapes ci-dessous.
- Isolez l’os maxillaire avec une pince à épiler et des ciseaux ophtalmiques et lavez-les avec du PBS pour vous débarrasser des tissus mous avec une pince à épiler.
- Mettez l’os maxillaire dans des tubes centrifugés de 1,5 ml et coupez l’os en petits morceaux (la taille doit être inférieure à 1 mm de diamètre) avec des ciseaux. Ajouter une certaine quantité de Liberase (5 μg/mL, voir le tableau des matières) pour couvrir le tissu (habituellement 1 mL pour les échantillons d’os d’une souris âgée de 8 semaines), puis incuber pendant 30 min à 37 °C.
- Centrifuger l’échantillon à 800 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Transférer délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette dans des tubes à centrifuger neufs et propres de 1,5 mL.
2. Extraction de véhicules électriques
- Centrifuger les échantillons (préparés aux étapes 1.1.10 et 1.2.4) pendant 15 min à 2 500 x g (4 °C) pour éliminer les débris de grosses cellules et les plaquettes restantes.
- Transférer délicatement les surnageants dans des tubes à centrifuger neufs et propres de 1,5 mL et la centrifuger pendant 30 minutes à 16 800 x g (4 °C).
REMARQUE: La vitesse de centrifugation peut être réglée sur plus de 10 000 x g pour extraire les VE12. Plus la vitesse de la centrifugeuse est élevée, plus la quantité de véhicules électriques peut être obtenue. Étant donné que la limite de vitesse de la centrifugeuse que nous avons utilisée est de 16 800 x g (voir le tableau des matériaux), nous avons choisi cette vitesse dans ce protocole. - Jeter le surnageant et remettre en suspension les pastilles dans chaque tube avec 1 mL de PBS. Centrifuger pendant 30 min à 16 800 x g (4 °C).
- Jeter le surnageant et remettre en suspension les pastilles dans chaque tube avec 50 μL de PBS. Conserver ces échantillons à 4 °C seulement pendant moins de 24 h ou, de préférence, les utiliser immédiatement pour les analyses suivantes (étapes 3 à 5).
ATTENTION : Le stockage à -80 °C est inacceptable, car cela réduira la concentration des VE et augmentera la taille des particules des VE13, influençant ainsi l’analyse suivante des VE.
3. Identification morphologique des VE
- Effectuez une analyse NTA.
- Selon la quantité de VE (grossièrement jugée par la taille des pastilles, les particules de plasma de 50 μL sont le minimum), transférer 5-50 μL de remise en suspension (étape 2.4), diluer dans 10 mL de solution tampon (PBS filtré avec un filtre de 0,22 μm) et mélanger suffisamment avec 1 mL de micro pointes de pipetière. Utilisez cette suspension finale pour la mesure des particules.
- Utilisez une seringue stérile de 1 mL pour injecter au moins 5 mL d’eau distillée à une vitesse modérée et constante jusqu’à ce que le nombre de particules affichées sur l’interface de détection soit inférieur à cinq.
REMARQUE: Après injection de 1 mL d’eau distillée à travers tout le canal, le nombre de particules est directement indiqué sur l’interface de détection. Si le nombre est toujours supérieur à cinq, continuez à injecter 1 mL d’eau distillée jusqu’à ce que les critères soient satisfaits. - Reconstituer 1 μL de solution d’étalonnage dans 1 mL d’eau distillée pour générer une solution primaire, puis prendre 100 μL de la solution primaire pour 25 mL d’eau distillée pour préparer une solution mère étalon (1:250 000). Conservez ce réactif fonctionnel à 4 °C pendant 1 semaine.
- Calibrer l’instrument NTA avec la solution mère étalon (étape 3.1.3). Injecter 1 à 5 mL de la solution d’étalonnage de travail avec une seringue stérile de 1 mL pour rincer le canal de la machine jusqu’à ce que le nombre de particules affiché sur l’interface de détection soit compris entre 50 et 400 (de préférence autour de 300). Exécutez le programme d’étalonnage.
- Répétez l’étape 3.1.2 pour rincer le canal de la machine avant chaque mesure d’échantillon.
- Utiliser une seringue stérile de 1 mL pour injecter au moins 2 mL de solution tampon afin de rincer le canal de la machine à vitesse constante jusqu’à ce que le nombre de particules affiché sur l’interface de détection soit inférieur à 10.
- Injecter 1 mL de l’échantillon EV préparé à l’étape 3.1.1 à une vitesse modérée et constante (la vitesse recommandée est de 0,5-1 mL/s).
REMARQUE: La concentration optimale de particules fait que le nombre de particules affichées sur l’interface de détection varie de 50 à 400, de préférence autour de 300. Si le nombre de particules est trop élevé, répéter l’étape 3.1.2 pour rincer immédiatement le canal de la machine afin d’éviter la rétention de particules à la paroi du canal et ajuster la concentration de l’échantillon EV à l’étape 3.1.1, puis répéter à partir de l’étape 3.1.5. - Effectuer l’analyse des particules et générer les rapports d’analyse conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
- Si l’échantillon est précieux, pompez l’échantillon de VE avec la seringue de 1 mL et recueillez-les dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL. Répétez l’étape 2.2 pour extraire les véhicules électriques.
- Après avoir détecté tous les échantillons, injecter au moins 2 mL de solution tampon dans le canal de la machine, puis injecter au moins 5 mL d’eau distillée jusqu’à ce que le nombre de particules affiché sur l’interface de détection soit inférieur à cinq.
- Utilisez une seringue stérile de 5 mL pour injecter au moins 10 mL d’air à vitesse constante (la vitesse recommandée est de 1 mL/s) afin d’éliminer l’eau dans le canal.
- Effectuer une analyse TEM.
REMARQUE: Effectuez les étapes suivantes avec de nouvelles suspensions EV. La grille du microscope électronique revêtu de carbone formvar a deux côtés, le côté de travail étant lumineux dans les grilles centrales. Le volume minimum de plasma pour extraire les VE pour la procédure ci-dessous est de 50 μL.- Mélanger l’échantillon de VE (étape 2.4) avec un volume égal de paraformaldéhyde (PFA) à 4 %. Déposer 4 μL des VE sur une grille et incuber pendant 15 min à température ambiante (RT).
- Mettez quatre gouttes de PBS (une goutte équivaut à 50 μL) sur une feuille de film de polyéthylène (voir le tableau des matériaux). Transférez les grilles avec une pince microscopique propre et lavez le côté fonctionnel de la grille dans PBS d’une goutte à l’autre.
- Utilisez des papiers filtres pour enlever le PBS supplémentaire qui est resté dans les grilles.
- Incuber le côté fonctionnel de la grille dans de l’acide phosphotungstique à 1 % (voir le tableau des matières) pendant 2 minutes, puis répéter l’étape 3.2.2.
ATTENTION: Puisque l’acide phosphotungstique est toxique, cette procédure doit être utilisée dans la hotte, et l’acide phosphotungstique redondant doit être spécifiquement recyclé plutôt que jeté directement. - Placez les grilles face vers le haut dans un plat de 10 cm recouvert de papiers filtres. Les grilles peuvent être stockées chez RT pendant plusieurs années.
- Observez les grilles au microscope électronique en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
REMARQUE: Pour s’assurer que les particules individuelles sont observées, la concentration des VE doit être ajustée et la suspension doit être claire sans turbidité évidente. Avant de tomber, l’échantillon doit être bien mélangé. Les analyses représentatives de la TEM et de la NTA sont présentées à la figure 2.
4. Analyse de l’origine des véhicules électriques
REMARQUE: L’identification de l’origine cellulaire des VE nécessite l’application d’anticorps pour les marqueurs membranaires cellulaires typiques. Le volume plasmatique minimum pour extraire les VE pour la procédure ci-dessous est de 300 μL. Sur la base des structures bicouches lipidiques des VE, un colorant membranaire peut être utilisé pour les marquer. Pour les échantillons de plasma sanguin, CD18 pour les lymphocytes14 est choisi pour la représentation. Pour les échantillons d’os maxillaire, le récepteur associé aux ostéoclastes (OSCAR) pour les ostéoclastes15 est choisi à titre d’exemple. Avant le FC, assurez-vous que le cytomètre en flux est adapté à la mesure des VE16, car la limite inférieure de taille est très différente entre les cytomètres de flux distincts.
- Resuspendre les échantillons (étape 2.4) avec 500 μL de PBS et transférer 50 μL dans un tube à centrifuger neuf et propre de 1,5 mL comme témoin blanc (tube A) et un autre 50 μL dans un nouveau tube à centrifuger propre de 1,5 mL comme simple tube de coloration pour FITC (tube B). Ajouter 0,5 μL de colorant membranaire au tube primaire pour la coloration de la membrane. Incuber pendant 5 min à TA.
- Centrifuger le tube primaire pendant 30 min à 16 800 x g (4 °C). Jeter le surnageant et remettre les pastilles en suspension avec 200 μL de PBS.
- Diviser chaque échantillon de 50 μL en quatre tubes centrifugeuses de 1,5 mL pour les tubes de coloration simples pour l’EP (tube C), la coloration des marqueurs de surface (tube D) et les témoins d’anticorps secondaires seulement (tube E).
- Ajouter l’anticorps primaire d’OSCAR dans les échantillons d’EV osseuse ainsi que l’anticorps CD18 dans les échantillons plasmatiques de VE (voir le tableau des matériaux) dans le tube B (étape 4.1) et le tube D (étape 4.3) séparément (dilué à 1:100). Incuber pendant 1 h à 4 °C.
- Centrifuger les tubes pendant 30 min à 16 800 x g (4 °C). Jeter le surnageant, remettre les pastilles en suspension avec 500 μL de PBS, puis centrifuger à nouveau pendant 30 minutes à 16 800 x g (4 °C) pour éliminer les anticorps primaires supplémentaires.
- Jeter le surnageant et remettre les pastilles en suspension avec 50 μL de PBS, puis ajouter des anticorps secondaires conjugués FITC (voir le tableau des matériaux), respectivement (dilué à 1:200) (tube E). Ajouter les mêmes anticorps secondaires au tube B (étape 4.1) et au tube D (étape 4.3). Incuber tous les tubes pendant 1 h, à 4 °C dans l’obscurité.
REMARQUE: Les anticorps de marquage conjugués à fluorescence directe peuvent également être utilisés pour traiter la détection de FC avec des contrôles d’isotype appropriés. - Diluer une goutte de suspension de billes de 0,2, 0,5 et 1 μm (voir le tableau des matériaux) respectivement dans 1 mL de PBS, et faire passer d’abord chaque taille de billes pour s’assurer de la barrière choisie pour les véhicules électriques. Réglez le seuil du cytomètre en flux pour rechercher les billes et la population EV en utilisant une diffusion vers l’avant (FSC) et une diffusion latérale (SSC) appropriées.
- Définissez l’état terminal sur le calcul de 100 000 particules teintées à la membrane. Analysez l’échantillon à l’aide d’un cytomètre en flux selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Les résultats représentatifs sont présentés à la figure 3.
REMARQUE: L’équipement NTA avec canaux de fluorescence peut également être utilisé pour l’analyse d’origine, et la préparation de l’échantillon est la même que FC.
- Définissez l’état terminal sur le calcul de 100 000 particules teintées à la membrane. Analysez l’échantillon à l’aide d’un cytomètre en flux selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Les résultats représentatifs sont présentés à la figure 3.
5. Analyse de la teneur en protéines des VE
REMARQUE: L’analyse de la teneur en protéines dans les VE est effectuée par transfert Western. Par exemple, les VE plasmatiques et osseux ont été sélectionnés pour analyser l’état métabolique de la 6-phosphogluconate déshydrogénase (DPI) et de la pyruvate kinase M2 (PKM2). Golgin84 (l’organite de Golgi) a été utilisé comme témoin négatif, et la flottilline (protéine membranaire), la caveolin (protéine intégrale des cavéoles) et la β-actine (le cytosquelette)17 ont été utilisées comme témoin positif dans les VE par rapport aux échantillons cellulaires. La mitofilline et la α-actinine-4 ont été choisies comme grands marqueurs EV, tandis que CD9 et CD81 ont été choisis comme petits marqueurs EV pour illustrer les sous-populations EV18. Apoa1 a été sélectionné comme marqueur de lipoparticules plasmatiques19. Pour les détails respectifs sur les réactifs, voir le tableau des matériaux.
- Remettez les pastilles en suspension (étape 2.4) dans 50 μL de tampon de lyse RIPA et incuber pendant 30 min sur glace.
- Quantifier les concentrations de protéines de tous les échantillons de la microplaque à 96 puits au moyen du dosage des protéines BCA en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
- Diluer les 2 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) avec 0,9 % de solution saline normale (NS) (contenant 0,9 % (p/v) de chlorure de sodium) dans 0,5 mg/mL. Ajouter les 0,5 mg/mL de BSA et 0,9 % de NS dans trois puits dupliqués avec certains volumes, comme le montre le tableau 1.
- Déposer 2 μL des échantillons (étape 5.1) et ajouter 18 μL de NS dans trois puits dupliqués séparément.
- Préparer une solution de travail en mélangeant le réactif BCA A avec le réactif B (50:1 Réactif A:B). Ajouter 200 μL de la solution de travail dans chaque puits et agiter doucement pendant 30 s.
- Incuber la microplaque de 96 puits pendant 20-25 min à 37 °C.
- Mesurer la DO à 596 nm à l’aide du spectrophotomètre (voir le tableau des matériaux).
- Exportez les données.
- Tracez une courbe standard et calculez la concentration en protéines des échantillons.
- Selon les résultats, diluer les échantillons à 1 μg/μL avec 0,9% de NS et 5x tampon de chargement SDS-PAGE (250 mM Tris· HCl, pH 6,8, 10 % SDS, 30 % (v/v) glycérol, 10 mM de DTT, 0,05 % (p/v) de bleu de bromophénol, voir le tableau des matières). Sceller hermétiquement les tubes avec un film et chauffer pendant 5 min à 100 °C.
- Charger les échantillons et l’échelle protéique dans un gradient de concentration de 4% à 20% Hepes-Tris gel (voir Tableau des matériaux).
NOTE: Choisissez le pourcentage de gel en fonction du poids moléculaire des protéines d’intérêt. - Faites passer le gel dans le tampon courant à 80 V jusqu’à ce que les protéines forment une ligne, puis passez à 120 V pendant 1 h jusqu’à ce que le colorant de chargement soit au fond du gel.
NOTE: La durée de fonctionnement peut varier en fonction de l’équipement utilisé ou du type et de la concentration du gel. - Transférer le gel sur la membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) (voir le tableau des matières), pré-incubé dans de l’alcool méthylique pendant 20 s. Utilisez un système de transfert humide pour transférer pendant 1 h à 200 mA.
ATTENTION : Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulle à l’intérieur du système de transfert et gardez la membrane PVDF humide.
NOTE: Le temps de transfert peut varier en fonction du poids moléculaire de la protéine cible; 1 KD a généralement besoin de 1 min. - Préparer un tampon bloquant le BSA à 5 % en ajoutant 2,5 g de BSA (voir le tableau des matières) dans 50 mL de solution saline tamponnée Tris (TBST) (2 mL de Tween ajoutés dans 2 L de solution PBS) dans un tube centrifuge de 50 mL. Agiter jusqu’à dissolution de la poudre. Bloquer les membranes dans ce tampon pendant 2 h à TA avec agitation.
- Incuber les membranes avec des anticorps primaires spécifiques dilués avec TBST à une concentration appropriée (Mitofilin, 1:1000; α-Actinin-4, 1:1000; CD9, 1:1000; CD81, 1:1000; Apoa1, 1:1000 ; Golgin84, 1:1000; Flottilline-1, 1:1000; Caveolin-1, 1:1000; DPI, 1:1000; PKM2, 1:1000; β-actine, 1:3000) pendant une nuit à 4 °C.
- Laver les membranes dans le tampon de lavage (2 mL de Tween ajoutés dans 2 L de solution PBS) quatre fois (15 min à chaque fois), et incuber les membranes avec les anticorps secondaires appropriés à 1:4000 pendant 1 h à TA avec agitation.
- Lavez les membranes dans le tampon de lavage quatre fois (15 minutes à chaque fois) et imagez les membranes à l’aide du kit de chimiluminescence et d’un système d’imagerie sur gel (voir le tableau des matériaux).
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Representative Results
Selon le flux de travail expérimental, les VE peuvent être extraits du sang périphérique et des tissus solides (Figure 1). L’os maxillaire d’une souris âgée de 8 semaines est d’environ 0,1 ± 0,05 g, et environ 300 μL de plasma peuvent être prélevés sur la souris. En suivant les étapes du protocole, 0,3 mg et 3 μg de VE peuvent être collectés, respectivement. Comme analysé par TEM et NTA, les caractéristiques morphologiques typiques des VE sont des vésicules membranaires rondes en forme de coupe d’un diamètre allant de 50 à 300 nm (Figure 2). FC peut détecter les VE marqués par colorant membranaire sous des contrôles utiles, et l’analyse FC montre les pourcentages de marqueurs membranaires spécifiques exprimés sur les VE qui impliquent leur origine à partir des cellules mères (Figure 3). L’analyse par transfert Western montre l’expression du DPI et de la PKM2, respectivement, en tant que représentant de la teneur en protéines dans les VE plasmatiques et les VE osseuses, indiquant le statut métabolique (Figure 4). L’expression négative de Golgin84 dans les VE est également détectée avec la présence de Mitofilin, de α-Actinin-4, de Flotillin-1, de Caveolin-1 et de β-actine, qui est généralement enrichie en gros VE (microvésicules) dérivés de la membrane plasmique. Le petit marqueur EV CD9 peut également être détecté, tandis que l’expression de CD81 est faible ou absente, avec un manque d’existence d’Apoa1 dans les VE plasmatiques (Figure 4).
Figure 1 : Illustration du protocole d’extraction des VE. (A) Les étapes pour extraire les VE plasmatiques du sang périphérique par centrifugation différentielle. (B) Les étapes pour extraire les VE tissulaires par centrifugation différentielle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Identification morphologique des VE. (A) Image représentative au microscope électronique à transmission (MET) montrant la morphologie des VE. Barre d’échelle = 200 nm. (B) Des images représentatives de l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) et les résultats de quantification montrent la distribution de taille et le nombre de particules des VE. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Analyse de l’origine des VE. (A) Les différents ensembles de tubes avec différentes commandes de l’expérience. (B) La distribution des billes de taille de 1 μm, 0,5 μm et 0,2 μm est indiquée dans le graphique diffusé. (C) Graphiques de densité représentatifs montrant le PBS (tube A), la coloration simple des VE (tube B), la coloration simple du colorant membranaire (tube C) et la double coloration des échantillons de VE (tube D). (D) Analyse cytométrique en flux du pourcentage de VE CD18 positifs dans les VE plasmatiques sanguins en rouge par rapport au contrôle d’anticorps secondaire seul en noir. (E) Analyse cytométrique en flux du pourcentage de VE OSCAR positifs à partir d’échantillons osseux en rouge par rapport au contrôle d’anticorps secondaires uniquement en noir. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse de la teneur en protéines des VE. (A) Images représentatives de la véhiculaire Western du plasma montrant la présence de 6-phosphogluconate déshydrogénase (DPI) et de mitofiline, de α-actinine-4, CD9, de flottilline-1, de cavéoline-1 et de β-actine dans les VE plasmatiques et l’expression négative de CD81, Golgin84 et Apoa1. (B) Images représentatives de Western Blot de l’EV osseux montrant la présence de pyruvate kinase M2 (PKM2) et de Mitofilin, de α-actinine-4, CD9, CD81, Flotillin-1, Caveolin-1 et β-actine dans les VE osseux et l’expression négative de Golgin84. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Nombre | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| BSA (μL) | 0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 12 | 16 | 20 |
| NS (μL) | 20 | 19 | 18 | 16 | 12 | 8 | 4 | 0 |
Tableau 1 : Solution de travail standard du dosage BCA. Ajouter les 0,5 mg/mL de BSA et 0,9 % de NS dans trois puits dupliqués, comme le montre le tableau.
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Discussion
Lors de l’étude des caractéristiques, du devenir et de la fonction des véhicules électriques, il est crucial d’isoler les véhicules électriques à haut rendement et à faible contamination. Diverses méthodes existent pour extraire les VE, telles que la centrifugation par gradient de densité (DGC), la chromatographie d’exclusion de taille (SEC) et les tests d’immunocapture 4,20. Ici, l’une des méthodes les plus couramment utilisées, la centrifugation différentielle, a été utilisée; les avantages de ceci sont que cela ne prend pas de temps, cela génère un rendement élevé de VE avec une isolation facile à partir d’échantillons limités, et la possibilité de modifier la méthode en fonction de la source d’échantillon utilisée. Pour analyser la fonction des VE circulants, il est préférable de choisir le plasma sanguin, qui peut mieux refléter l’état réel des VE in vivo, plutôt que le sérum. En effet, de nombreux VE dérivés des plaquettes seront libérés au cours du processus de formation de caillots pour la collecte du sérum21, tandis que les plaquettes sont éliminées par centrifugation avant l’isolement des VE du plasma22. Il faut noter que le choix de l’anticoagulation pour l’isolement plasmatique EV est encore controversé. Le mécanisme anticoagulant de l’héparine est plus étroitement lié à la physiologie; les VE isolés pourraient ainsi refléter davantage l’état in vivo. Il faut mentionner que l’héparine provoquera des lectures PCR faussement négatives et bloquera l’absorption de l’EV par les cellules23,24. D’autres réactifs anticoagulants, tels que l’EDTA ou le citrate de sodium, ont également leurs pénuries, y compris la biotoxicité, affectant les propriétés chimiques du plasma et des plaquettes. Collectivement, compte tenu des informations ci-dessus, l’héparine est sélectionnée dans cette étude. Pour éliminer les plaquettes, les échantillons ont été centrifugés à la vitesse de 2 500 x g avant 16 800 x g, ce qui peut éliminer certains gros VE. De plus, étant donné que de nombreux VE dans le plasma visqueux se fixent aux plaquettes et sont éliminés, il est suggéré de diluer le plasma avec un volume égal de PBS avant d’éliminer les plaquettes par centrifugation pour améliorer le rendement des VE. Il est à noter qu’il est préférable d’utiliser un gradient de saccharose avec ultracentrifugation pour purifier les VE afin d’éliminer les contaminations de protéines solubles, telles que les polymères protéiques21.
À ce jour, les méthodes courantes de caractérisation des véhicules électriques comprennent NTA, TEM, FC16 et Western blot, entre autres25. De plus, en raison de l’altération de la morphologie et de la quantité de VE après avoir été restaurés dans différentes conditions13, nous suggérons de traiter la détection dès que possible après l’extraction des VE. En outre, Görgens et al. ont recommandé d’utiliser du PBS complété par de l’albumine humaine et du tréhalose (PBS-HAT) pour une meilleure conservation que le PBS26 pur. L’identification morphologique des VE via NTA et TEM doit être effectuée immédiatement après la procédure d’extraction, sinon la forme des VE peut changer27. De plus, Cryo-EM peut être utilisé28 pour l’observation morphologique avancée des véhicules électriques, ce qui présente l’avantage de mieux préserver la forme avec une résolution plus élevée. Outre le NTA, la concentration de particules peut également être quantifiée par FC à l’aide d’une quantité connue de billes de comptage29, mais cette méthode n’est pas très stable et la sensibilité aux petites particules est faible pour FC. De plus, en raison de la détection en essaim de petites particules avec FC30, il est préférable d’utiliser NTA pour les déterminations de taille. De même, l’origine des VE peut également être analysée par NTA avec des filtres à fluorescence. Comparé au FC, le NTA est plus sensible aux particules plus petites et présente l’avantage potentiel de recycler l’échantillon pour d’autres expériences. L’un des avantages de l’utilisation de FC est que les sous-types spécifiques de VE peuvent être enrichis d’anticorps membranaires conjugués au fluorochrome28. En outre, la fonction d’antigènes de surface spécifiques peut être étudiée par des expériences de perte de fonction, telles que l’utilisation d’anticorps neutralisants28. Alternativement, 1% Triton X-100 peut être utilisé pour détruire le radeau lipidique de la membrane EVs, donc comme contrôle pour détecter les signaux membranaires31. De plus, les chercheurs peuvent utiliser les caractéristiques spécifiques de la membrane pour créer des vecteurs de médicaments ciblés32.
Le transfert Western est largement utilisé pour analyser la teneur en protéines des véhicules électriques. Plusieurs marqueurs tels que la mitofilline, la cavéoline et la α-actinine-418 ont été recommandés comme candidats pour identifier les gros véhicules électriques dans des études récentes; CD9 est enrichi dans les petits VE plutôt que dans les gros VE, et CD81, CD63 et Syntenin-1 sont largement abondants dans les petits VE18. En ce qui concerne les résultats du transfert Western, des marqueurs tels que la mitofilline et CD9 sont variables dans différentes conditions animales. On peut supposer que les VE isolés représentent une population mixte, dans laquelle les grands VE constituent une sous-population majeure. Pour vérifier la pureté des VE, il est suggéré d’ajouter la détection des protéines organites/nucléaires, telles que Lamin B ou Golgin84, comme témoin négatif. Comme pour les EV plasmatiques, selon nos résultats, l’Apoa1 représentant les lipoparticules n’est pas enrichi dans les EV collectés. Une limitation de cette méthode est qu’il est difficile de distinguer les protéines à la surface de celles à l’intérieur de la vésicule. Par conséquent, le test immuno-enzymatique (ELISA) peut être appliqué à l’analyse des protéines membranaires en tant qu’expériences supplémentaires. De plus, avec le développement du séquençage à haut débit, les chercheurs peuvent tirer parti de la cartographie protéomique33 pour analyser la composition protéique des VE, les protéines cibles devant également être vérifiées par transfert Western.
En résumé, cette étude fournit un protocole réalisable pour isoler et caractériser les VE circulatoires et tissulaires, y compris une analyse de leurs sources cellulaires et de leur teneur en protéines, ce qui aide à établir une base pour d’autres expériences fonctionnelles.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32000974, 81870796, 82170988 et 81930025) et de la China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 et BX20190380). Nous sommes reconnaissants de l’aide du Centre national expérimental de démonstration de l’enseignement de la médecine de base (AMFU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | Biosharp | 143174 | Transmission electron microscope |
| Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody | Yeason | 34306ES60 | Flow cytometry |
| Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | Flow cytometry |
| Anti-CD18 antibody | Abcam | ab131044 | Flow cytometry |
| Anti-CD81 antibody | Abcam | ab109201 | Western blot |
| anti-CD9 antibody | Huabio | ET1601-9 | Western blot |
| Anti-Mitofilin antibody | Abcam | ab110329 | Western blot |
| APOA1 Rabbit pAb | Abclone | A14211 | Western blot |
| BCA protein assay kit | TIANGEN | PA115 | Western blot |
| BLUeye Prestained Protein Ladder | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
| Bovine serum albumin | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
| Caveolin-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
| CellMask Orange plasma membrane stain | Invitrogen | C10045 | Flow cytometry |
| Chemiluminescence | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
| Curved operating scissor | JZ Surgical Instrument | J21040 | EV isolation |
| Electronic balance | Zhi Ke | ZK-DST | EV isolation |
| Epoch spectrophotometer | BioTek | N/A | Western blot |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 3810X | EV isolation |
| Flotillin-1 antibody | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
| Gel imaging system | Tanon | 4600 | Western blot |
| Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
| Grids - Formvar/Carbon Coated - Copper 200 mesh | Polysciences | 24915 | Transmission electron microscope |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | EV isolation |
| Liberase Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV isolation |
| Microscopic tweezer | JZ Surgical Instrument | JD1020 | EV isolation |
| NovoCyte flow cytometer | ACEA | N/A | Flow cytometry |
| Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells | Epizyme | LK206 | Western blot |
| OSCAR(D-19) antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | Flow cytometry |
| PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anesthetization |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
| Phosphotungstic acid | RHAWN | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| PKM2(d78a4) xp rabbit mab | Cell Signaling | 4053t | Western blot |
| Polyethylene (PE) film | Xiang yi | 200150055 | Transmission electron microscope |
| Polyvinylidene fluoride membranes | Roche | 3010040001 | Western blot |
| Protease inhibitors | Roche | 4693132001 | Western blot |
| Recombinant anti-PGD antibody | Abcam | ab129199 | Western blot |
| RIPA lysis buffer | Beyotime | P0013 | Western blot |
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
| Size beads | Invitrogen | F13839 | Flow cytometry |
| Tabletop High-Speed Micro Centrifuges | Hitachi | CT15E | EV isolation |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650 | Transmission electron microscope |
| Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
| Vortex Mixer Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV isolation |
| ZetaView BASIC NTA - Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 | Particle Metrix | N/A | Nanoparticle tracking analysis |
| α-Actinin-4 Rabbit mAb | Abclone | A3379 | Western blot |
| β-actin | Cwbio | CW0096M | Western blot |
References
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