Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering og analyse av sporbare og funksjonaliserte ekstracellulære vesikler fra plasma og fast vev

Published: October 17, 2022 doi: 10.3791/63990
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,2, 1,4, 1,5, 1, 2, 1,6, 1
1State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3Department of VIP Dental Care, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 4School of Basic Medicine, The Fourth Military Medical University, 5College of Life Science, Northwest University, 6Xi'an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver en metode for å ekstrahere ekstracellulære vesikler fra perifert blod og fast vev med påfølgende profilering av overflateantigener og proteinlaster.

Abstract

Sirkulerende og vevsresidente ekstracellulære vesikler (EV) representerer lovende mål som nye teranostiske biomarkører, og de fremstår som viktige aktører i opprettholdelsen av organisatorisk homeostase og utviklingen av et bredt spekter av sykdommer. Mens den nåværende forskningen fokuserer på karakterisering av endogene eksosomer med endosomal opprinnelse, har mikrovesikler som blebber fra plasmamembranen fått økende oppmerksomhet i helse og sykdom, som er preget av en overflod av overflatemolekyler som rekapitulerer membransignaturen til foreldreceller. Her presenteres en reproduserbar prosedyre basert på differensiell sentrifugering for ekstrahering og karakterisering av EV fra plasma og fast vev, slik som beinet. Protokollen beskriver videre etterfølgende profilering av overflateantigener og proteinlaster av elbiler, som dermed er sporbare for deres derivasjoner og identifisert med komponenter relatert til potensiell funksjon. Denne metoden vil være nyttig for korrelativ, funksjonell og mekanistisk analyse av elbiler i biologiske, fysiologiske og patologiske studier.

Introduction

Ekstracellulære vesikler (EV) har blitt foreslått for å definere cellefrigjorte lipid-dobbeltlags lukkede ekstracellulære strukturer1, som spiller viktige roller i ulike fysiologiske og patologiske hendelser2. EV frigjort av friske celler kan grovt deles inn i to hovedkategorier, nemlig eksosomer (eller små EV) dannet gjennom en intracellulær endocytisk trafikkvei3 og mikrovesikler (eller store EV) utviklet av den utadvendte spiringen av plasmamembranen til cellen4. Mens mange studier fokuserer på funksjonen til EV samlet fra dyrkede celler in vitro5, er EV avledet fra sirkulasjonen eller vevet mer komplekse og heterogene, som har fordelen av å reflektere den sanne tilstanden til organismen in vivo6. Videre kan nesten alle typer vev produsere EV in vivo , og disse EVene kan fungere som budbringere i vevet eller overføres av forskjellige kroppsvæsker, spesielt perifert blod, for å lette systemisk kommunikasjon7. Elbiler i sirkulasjon og vev er også mål for sykdomsdiagnose og behandling8.

Mens eksosomer har blitt intensivt studert de siste årene, har mikrovesikler også viktige biologiske funksjoner, som lett kan ekstraheres uten ultrasentrifugering, og dermed fremme grunnleggende og klinisk forskning9. Spesielt er et kritisk problem med elbiler isolert fra sirkulasjon og vev at de er avledet fra forskjellige celletyper10. Siden mikrovesikler blåses fra plasmamembranen og kjennetegnes av en overflod av celleoverflatemolekyler9, er det mulig å bruke foreldrecellemembranmarkører for å identifisere den cellulære opprinnelsen til disse EVene. Spesielt kan flowcytometri (FC) -teknikken brukes til å oppdage membranmarkører. Dessuten kan forskerne isolere elbilene og gjøre ytterligere analyser basert på de funksjonelle lastene.

Den nåværende protokollen gir en grundig prosedyre for å trekke ut og karakterisere elbiler fra in vivo-prøver. Elbilene er isolert via differensialsentrifugering, og karakteriseringen av elbiler inkluderer morfologisk identifikasjon via nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) og transmisjonselektronmikroskopi (TEM), opprinnelsesanalyse via FC og proteinfraktanalyse via western blot. Blodplasmaet og maksillærbenet av mus brukes som representanter. Forskere kan referere til denne protokollen for elbiler fra andre kilder og gjøre tilsvarende modifikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyreforsøkene ble utført i samsvar med retningslinjene for institusjonell dyrepleie- og brukskomité ved det fjerde militære medisinske universitetet og ARRIVE-retningslinjene. For denne studien ble 8 uker gamle C57Bl / 6 mus (ingen preferanse for verken kvinner eller menn) brukt. Trinnene som er involvert i å isolere plasma- og vevs-EVer er illustrert i figur 1. Plasmaet er tatt som en representant for å beskrive EV-isolasjonsprosedyren fra kroppsvæsker. Det maksillære beinet er tatt som en representant for å forklare EV-isolasjonsprosedyren fra det faste vevet.

1. Fremstilling av plasma og maksillære beinprøver

  1. Forbered plasmaprøvene ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Bestem musens kroppsvekt ved hjelp av en standard laboratoriebalanse.
    2. Tilsett 20 μL, 2 mg/ml heparin til et 1,5 ml sentrifugerør og bruk mikserenheten (se materialfortegnelse) for å la heparinet feste seg til rørveggen.
      MERK: Antikoagulasjonsrør kan også brukes direkte til å samle blodet.
    3. Bedøv musen ved intraperitoneal injeksjon av 50 mg/kg pentobarbitalnatrium (se Materialfortegnelse). Ta tak i musehalsen med tommelen og pekefingeren, fest deretter halen og venstre bakben med lillefingeren og injiser pentobarbitalnatriumet med en 1 ml injeksjonssprøyte etter å ha eksponert magen.
    4. Bekreft at musen er riktig bedøvet basert på fravær av hornhinnerefleks og lemreaksjon når fotputen er klemt.
    5. Barber håret på ansiktet og øyenvipper i øynene med buet saks.
    6. Ta tak i musens nakkehud og trykk huden rundt øynene til baksiden av nakken slik at øyebollet stikker ut. Bruk oftalmisk pinsett for raskt å klemme øyeeplet, og samle utstrømningen av blod med 1,5 ml sentrifugerør utarbeidet i trinn 1.1.2. Ofre musen ved å forskyve livmorhalsen.
      FORSIKTIG: Vær forsiktig med hår og øyevipper fordi de kan forårsake hemolyse.
    7. Skru forsiktig røret opp ned flere ganger for å forhindre blodpropp.
      FORSIKTIG: Snu røret opp ned så snart som mulig.
    8. Sentrifuger blodprøven i 15 min ved 1 200 x g ved 4 °C.
    9. Overfør supernatanten forsiktig til nye og rene 1,5 ml sentrifugerør, og bruk plasmaprøven umiddelbart eller oppbevar den ved 4 °C i noen timer.
    10. Fortynn supernatanten med et likt volum på 1x fosfatbufret saltvann (PBS) og bland godt.
      MERK: Protokollen ovenfor for å samle plasma er dødelig. Blodet kan også samles gjennom subclavia vene punktering11 uten å ofre musen.
  2. Forbered de maksillære beinprøvene ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Isoler det maksillære beinet med oftalmisk pinsett og saks og vask dem med PBS for å kvitte seg med bløtvev med pinsett.
    2. Sett det maksillære beinet i 1,5 ml sentrifugerør og kutt beinet i små biter (størrelsen må være mindre enn 1 mm i diameter) med saks. Tilsett en viss mengde liberase (5 μg/ml, se materialfortegnelse) for å dekke vevet (vanligvis 1 ml for benprøver fra en 8 uker gammel mus), og rug deretter i 30 minutter ved 37 °C.
    3. Sentrifuger prøven ved 800 x g i 10 minutter ved 4 °C.
    4. Overfør supernatanten forsiktig med en pipette til nye og rene 1,5 ml sentrifugerør.

2. Utvinning av elbiler

  1. Sentrifuger prøvene (fremstilt i trinn 1.1.10 og trinn 1.2.4) i 15 minutter ved 2 500 x g (4 °C) for å fjerne storcellerester og gjenværende blodplater.
  2. Overfør supernatantene forsiktig til nye og rene 1,5 ml sentrifugerør og sentrifuge i 30 minutter ved 16 800 x g (4 °C).
    MERK: Sentrifugeringshastigheten kan settes til over 10.000 x g for å trekke ut elbiler12. Jo høyere sentrifugehastigheten er, desto flere elbiler kan oppnås. Fordi fartsgrensen for sentrifugen vi brukte er 16 800 x g (se materialfortegnelse), valgte vi denne hastigheten i denne protokollen.
  3. Kast supernatanten og resuspender pelletsene i hver slange med 1 ml PBS. Sentrifuge i 30 minutter ved 16 800 x g (4 °C).
  4. Kast supernatanten og resuspender pelletsene i hver slange med 50 mikrol PBS. Oppbevar disse prøvene ved 4 °C i mindre enn 24 timer, eller bruk helst umiddelbart til følgende analyser (trinn 3-5).
    FORSIKTIG: Lagring ved -80 °C er uakseptabelt, da dette vil redusere konsentrasjonen av elbiler og øke partikkelstørrelsen til elbiler13, og dermed påvirke den følgende analysen av elbiler.

3. Morfologisk identifisering av elbiler

  1. Utfør NTA-analyse.
    1. I henhold til mengden EV (grovt bedømt av størrelsen på pellets, er partiklene på 50 μL plasma minimum), overfør 5-50 μL resuspensjon (trinn 2,4), fortynn i 10 ml bufferløsning (PBS filtrert med 0,22 μm filter), og bland med 1 ml mikropipettorspisser tilstrekkelig. Bruk denne siste suspensjonen til partikkelmåling.
    2. Bruk en steril 1 ml sprøyte til å injisere minst 5 ml destillert vann med moderat og konstant hastighet til antall partikler som vises på deteksjonsgrensesnittet er mindre enn fem.
      MERK: Etter injeksjon av 1 ml destillert vann gjennom hele kanalen, vises antall partikler direkte på deteksjonsgrensesnittet. Hvis antallet fortsatt er over fem, fortsett å injisere 1 ml destillert vann til kriteriene er oppfylt.
    3. Rekonstituer 1 μL kalibreringsløsning i 1 ml destillert vann for å generere en primærløsning, og ta deretter 100 μL av primærløsningen til 25 ml destillert vann for å fremstille en standard stamløsning (1:250 000). Oppbevar dette arbeidsreagenset ved 4 °C i 1 uke.
    4. Kalibrer NTA-instrumentet med standard lagerløsning (trinn 3.1.3). Injiser 1-5 ml av arbeidskalibreringsløsningen med en 1 ml steril sprøyte for å skylle maskinkanalen til antall partikler som vises på deteksjonsgrensesnittet er mellom 50-400 (helst rundt 300). Kjør kalibreringsprogrammet.
    5. Gjenta trinn 3.1.2 for å skylle maskinkanalen før hver prøvemåling.
    6. Bruk en steril 1 ml sprøyte til å injisere minst 2 ml bufferløsning for å skylle maskinkanalen med konstant hastighet til antall partikler som vises på deteksjonsgrensesnittet er mindre enn 10.
    7. Injiser 1 ml av EV-prøven fremstilt i trinn 3.1.1 med moderat og konstant hastighet (anbefalt hastighet er 0,5-1 ml/s).
      MERK: Den optimale partikkelkonsentrasjonen gjør antall partikler som vises på deteksjonsgrensesnittet fra 50-400, helst rundt 300. Hvis antallet partikler er for høyt, gjenta trinn 3.1.2 for å skylle maskinkanalen umiddelbart for å unngå partikkelretensjon ved kanalveggen og juster konsentrasjonen av EV-prøven med trinn 3.1.1, og gjenta deretter fra trinn 3.1.5.
    8. Utfør partikkelanalysen og generer analyserapportene i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelse).
    9. Hvis prøven er dyrebar, pump tilbake EV-prøven med 1 ml sprøyten og samle dem i 1,5 ml sentrifugerør. Gjenta trinn 2.2 for å trekke ut elbilene.
    10. Etter å ha oppdaget alle prøvene, injiser minst 2 ml bufferløsning til maskinkanalen og injiser deretter minst 5 ml destillert vann til antall partikler som vises på deteksjonsgrensesnittet er mindre enn fem.
    11. Bruk en steril 5 ml sprøyte til å injisere minst 10 ml luft med konstant hastighet (anbefalt hastighet er 1 ml/s) for å fjerne vannet i kanalen.
  2. Utfør TEM-analyse.
    MERK: Utfør følgende trinn med nye EV-fjæringer. Det formvar-karbonbelagte elektronmikroskopgitteret har to sider, hvor arbeidssiden er lysende i sentergitterene. Minimumsvolumet av plasma for å trekke ut elbilene for prosedyren nedenfor er 50 μL.
    1. Bland EV-prøven (trinn 2.4) med et likt volum på 4% paraformaldehyd (PFA). Sett 4 μL av elbilene på ett rutenett og rug i 15 minutter ved romtemperatur (RT).
    2. Sett fire dråper PBS (en dråpe er lik 50 μL) på et ark med polyetylenfilm (se materialtabell). Overfør ristene med ren mikroskopisk pinsett og vask arbeidssiden av risten i PBS fra en dråpe til en annen.
    3. Bruk filterpapir for å fjerne ekstra PBS som ble igjen i rutenettene.
    4. Inkuber arbeidssiden av rutenettet i 1 % fosfotungstisk syre (se materialfortegnelse) i 2 minutter, og gjenta deretter trinn 3.2.2.
      FORSIKTIG: Siden fosfotungstikksyre er giftig, må denne prosedyren brukes i avtrekkshetten, og overflødig fosfotungstisk syre må resirkuleres spesifikt i stedet for å kastes direkte.
    5. Sett ristene med forsiden opp i en 10 cm tallerken dekket med filterpapir. Nettene kan lagres på RT i flere år.
    6. Observer ristene under et elektronmikroskop i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelse).
      MERK: For å sikre at enkeltpartiklene observeres, må konsentrasjonen av elbilene justeres, og fjæringen må være klar uten åpenbar turbiditet. Før du slipper, bør prøven blandes godt. De representative TEM- og NTA-analysene er vist i figur 2.

4. Opprinnelsesanalyse av elbiler

MERK: Identifiseringen av den cellulære opprinnelsen til EV krever påføring av antistoffer for typiske cellemembranmarkører. Minste plasmavolum for å trekke ut elbilene for prosedyren nedenfor er 300 μL. Basert på lipid-dobbeltlagsstrukturene til elbiler, kan membranfargestoff brukes til å merke dem. For blodplasmaprøver velges CD18 for lymfocytter14 for representasjon. For maksillære beinprøver er osteoklasassosiert reseptor (OSCAR) for osteoklaster15 valgt som eksempel. Før FC, sørg for at strømningscytometeret er tilpasset måling av EV16, da den nedre størrelsesgrensen i stor grad er forskjellig mellom forskjellige strømningscytometre.

  1. Resuspender prøver (trinn 2.4) med 500 μL PBS og overfør 50 μL til et nytt og rent 1,5 ml sentrifugerør som en blank kontroll (rør A) og ytterligere 50 μL til et nytt og rent 1,5 ml sentrifugerør som et enkelt fargerør for FITC (tube B). Tilsett 0,5 μL membranfargestoff til primærrøret for membranfarging. Inkuber i 5 min ved RT.
  2. Sentrifuger primærrøret i 30 minutter ved 16 800 x g (4 °C). Kast supernatanten og resuspender pelletsene med 200 mikrol PBS.
  3. Del hver 50 μL-prøve i fire 1,5 ml sentrifugerør for enkle fargerør for PE (rør C), overflatemarkørfarging (rør D) og sekundære antistoffkontroller (rør E).
  4. Legg til det primære antistoffet av OSCAR i ben-EV-prøver samt CD18-antistoff i plasma EV-prøver (se materialtabellen) til rør B (trinn 4.1) og rør D (trinn 4.3) separat (fortynnet ved 1:100). Inkuber i 1 time ved 4 °C.
  5. Sentrifuger rørene i 30 minutter ved 16 800 x g (4 °C). Kast supernatanten, resuspender pelletsene med 500 μl PBS, og sentrifuge deretter igjen i 30 minutter ved 16 800 x g (4 °C) for å fjerne de ekstra primære antistoffene.
  6. Kast supernatanten og resuspender pelletsene med 50 μL PBS, etterfulgt av tilsetning av FITC-konjugerte sekundære antistoffer (se henholdsvis materialtabell (fortynnet ved 1:200) (tube E). Legg de samme sekundære antistoffene til tube B (trinn 4.1) og tube D (trinn 4.3). Inkuber alle rørene i 1 time, ved 4 °C i mørket.
    MERK: Direkte fluorescenskonjugerte merkingsantistoffer kan også brukes til å behandle FC-deteksjon med riktige isotypekontroller.
  7. Fortynn en dråpe perler på 0,2, 0,5 og 1 μm (se materialfortegnelse) suspensjon henholdsvis i 1 ml PBS, og kjør hver størrelse perler først for å sikre at porten er valgt for elbiler. Sett terskelen til strømningscytometeret for å søke etter perlene og EV-populasjonen ved å bruke en passende fremoverspredning (FSC) og sidespredning (SSC).
    1. Sett terminalbetingelsen som beregning av 100 000 membranfargede partikler. Analyser prøven via et flowcytometer i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelse). De representative resultatene er vist i figur 3.
      MERK: NTA-utstyr med fluorescenskanaler kan også brukes til opprinnelsesanalyse, og prøveprepareringen er den samme som FC.

5. Analyse av proteininnhold i elbiler

MERK: Analysen av proteininnholdet i elbiler utføres via western blot. For eksempel ble plasma- og bein-EVene valgt for å analysere 6-fosfoglukonatdehydrogenase (PGD) og pyruvatkinase M2 (PKM2) for metabolsk status. Golgin84 (Golgi organelle) ble brukt som en negativ kontroll, og Flotillin (membranprotein), Caveolin (integrert protein av caveolae) og β-aktin (cytoskjelettet)17 ble brukt som en positiv kontroll i EV sammenlignet med celleprøver. Mitofilin og α-Actinin-4 ble valgt som store EV-markører, mens CD9 og CD81 ble valgt som små EV-markører for å demonstrere EV-underpopulasjonene18. Apoa1 ble valgt som plasma lipopartikkelmarkør19. For de respektive reagensdetaljene, se Materialfortegnelse.

  1. Resuspender pelletsene (trinn 2,4) i 50 μL RIPA lysebuffer, og inkuber i 30 minutter på is.
  2. Kvantifiser proteinkonsentrasjonene av alle prøver i 96-brønns mikroplaten ved hjelp av BCA-proteinanalysen i henhold til produsentens instruksjoner (se materialtabellen).
    1. Fortynn 2 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) med 0,9 % normal saltvann (NS) (inneholdende 0,9 % (w/v) natriumklorid) til 0,5 mg/ml. Legg til 0,5 mg/ml BSA og 0,9 % NS i tre dupliserte brønner med visse volumer, som vist i tabell 1.
    2. Slipp 2 μL av prøvene (trinn 5.1) og tilsett 18 μL NS i tre dupliserte brønner separat.
    3. Forbered en arbeidsløsning ved å blande BCA-reagens A med reagens B (50: 1 Reagens A: B). Tilsett 200 μL av arbeidsløsningen til hver brønn og rist forsiktig i 30 s.
    4. Inkuber 96-brønns mikroplaten i 20-25 minutter ved 37 °C.
    5. Mål OD ved 596 nm med spektrofotometeret (se materialfortegnelse).
    6. Eksporter dataene.
    7. Tegn en standardkurve og beregne proteinkonsentrasjonen i prøvene.
  3. Ifølge resultatene, fortynn prøvene til 1 μg / μL med 0,9% NS og 5x SDS-PAGE lastebuffer (250 mM Tris · HCl, pH 6,8, 10 % SDS, 30 % (v/v) glyserol, 10 mM DTT, 0,05 % (w/v) bromofenolblått, se materialfortegnelse). Forsegle tubene tett med film og varm opp i 5 minutter ved 100 °C.
  4. Legg prøvene og proteinstigen i en gradientkonsentrasjon på 4% -20% Hepes-Tris gel (se materialtabell).
    MERK: Velg gelprosenten i henhold til molekylvekten til proteinene av interesse.
  5. Kjør gelen i løpebufferen ved 80 V til proteinene danner en linje, og bytt deretter til 120 V i 1 time til lastevæsken er i bunnen av gelen.
    MERK: Driftstiden kan variere i henhold til utstyret som brukes eller typen og konsentrasjonen av gelen.
  6. Overfør gelen til membranen av polyvinylidenfluorid (PVDF) (se materialfortegnelse), pre-inkubert i metylalkohol i 20 s. Bruk et våtoverføringssystem for å overføre i 1 time ved 200 mA.
    FORSIKTIG: Forsikre deg om at det ikke er noen boble inne i overføringssystemet og hold PVDF-membranen våt.
    MERK: Overføringstiden kan variere i henhold til molekylvekten til målproteinet; 1 KD trenger vanligvis 1 min.
  7. Forbered 5% BSA-blokkeringsbuffer ved å tilsette 2,5 g BSA (se materialfortegnelse) i 50 ml Tris-bufret saltvann-Tween (TBST) (2 ml Tween tilsatt i 2 liter PBS-løsning) i et 50 ml sentrifugerør. Agiter til pulveret er oppløst. Blokker membranene i denne bufferen i 2 timer ved RT med omrøring.
  8. Inkuber membranene med spesifikke primære antistoffer fortynnet med TBST i riktig konsentrasjon (Mitofilin, 1:1000; α-Actinin-4, 1:1000; CD9, 1:1000; CD81, 1:1000; Apoa1, 1:1000; Golgin84, 1:1000; Flotillin-1, 1:1000; Caveolin-1, 1:1000; PGD, 1:1000; PKM2, 1:1000; β-aktin, 1:3000) over natten ved 4 °C.
  9. Vask membranene i vaskebufferen (2 ml Tween tilsatt i 2 liter PBS-oppløsning) fire ganger (15 min hver gang), og inkuber membranene med passende sekundære antistoffer ved 1:4000 i 1 time ved RT med omrøring.
  10. Vask membranene i vaskebufferen fire ganger (15 min hver gang), og avbilde membranene ved hjelp av kjemiluminescenssettet og et gelavbildningssystem (se materialfortegnelse).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ifølge den eksperimentelle arbeidsflyten kan elbiler ekstraheres fra perifert blod og fast vev (figur 1). Det maksillære beinet til en mus i alderen 8 uker er ca. 0,1 ± 0,05 g, og ca. 300 μl plasma kan samles fra musen. Etter protokolltrinnene kan henholdsvis 0,3 mg og 3 μg elbiler samles inn. Som analysert av TEM og NTA, er de typiske morfologiske egenskapene til EV runde koppformede membranvesikler med en diameter fra 50-300 nm (figur 2). FC kan detektere membranfargemerkede elbiler under nyttige kontroller, og FC-analyse viser prosentandelen av spesifikke membranmarkører uttrykt på EV som antyder deres opprinnelse fra foreldreceller (figur 3). Western blot-analyse viser uttrykket av henholdsvis PGD og PKM2 som en representant for proteininnholdet i plasma-EV og ben-EV, noe som indikerer metabolsk status (figur 4). Negativt uttrykk av Golgin84 i EV oppdages også med tilstedeværelse av Mitofilin, α-Actinin-4, Flotillin-1, Caveolin-1 og β-aktin, som vanligvis er anriket i plasmamembranavledede store EV (mikrovesikler). Den lille EV-markøren CD9 kan også detekteres, mens CD81-ekspresjon er lav eller fraværende, med manglende Apoa1-eksistens i plasma-elbilene (figur 4).

Figure 1
Figur 1: Illustrasjon av protokollen for å trekke ut elbiler. (A) Trinnene for å trekke ut perifere blodplasma-EVer med differensiell sentrifugering. (B) Trinnene for å trekke ut vev EV med differensiell sentrifugering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Morfologisk identifisering av elbiler. (A) Representativt transmisjonselektronmikroskop (TEM) bilde som viser morfologien til EV. Skala bar = 200 nm. (B) Representative nanopartikkelsporingsanalyser (NTA) bilder og kvantifiseringsresultater viser størrelsesfordelingen og partikkelantallet til EV. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Opprinnelsesanalyse av elbiler . (A) De forskjellige settene med rør med forskjellige kontroller av eksperimentet. (B) Fordelingen av perler av størrelsen 1 μm, 0,5 μm og 0,2 μm viste i den skatede grafen. (C) Representative tetthetsgrafer som viser PBS (rør A), enkel farging av EV (rør B), enkel farging av membranfarge (rør C) og dobbeltfarging av EV-prøvene (rør D). (D) Flowcytometrisk analyse av prosentandelen av CD18-positive EV i blodplasma-EV i rødt sammenlignet med sekundært antistoffkontroll i svart. (E) Flowcytometrisk analyse av prosentandelen av OSCAR-positive EVs fra benprøver i rødt sammenlignet med det sekundære antistoffkontrollen i svart. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Analyse av proteininnhold i elbiler. (A) Representative vestlige flekk av plasma EV-bilder som viser tilstedeværelsen av 6-fosfoglukonatdehydrogenase (PGD) og Mitofilin, α-Actinin-4, CD9, Flotillin-1, Caveolin-1 og β-aktin i plasma-EV og det negative uttrykket av CD81, Golgin84 og Apoa1. (B) Representative vestlige flekk av bein EV-bilder som viser tilstedeværelsen av pyruvatkinase M2 (PKM2) og Mitofilin, α-Actinin-4, CD9, CD81, Flotillin-1, Caveolin-1 og β-aktin i bein-EV og det negative uttrykket av Golgin84. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Nummer 1 2 3 4 5 6 7 8
BSA (μL) 0 1 2 4 8 12 16 20
NS (μL) 20 19 18 16 12 8 4 0

Tabell 1: Standard arbeidsløsning for BCA-analyse. Legg til 0,5 mg/ml BSA og 0,9 % NS i tre dupliserte brønner, som vist i tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Når man studerer funksjonene, skjebnen og funksjonen til elbiler, er det avgjørende å isolere elbiler med høy avkastning og lav forurensning. Det finnes ulike metoder for å trekke ut EV, for eksempel tetthetsgradientsentrifugering (DGC), størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) og immunfangstanalyser 4,20. Her ble en av de mest brukte metodene, differensialsentrifugering, brukt; Fordelene med dette er at det ikke er tidkrevende, det genererer et høyt utbytte av elbiler med enkel isolering fra begrensede prøver, og muligheten til å endre metoden basert på prøvekilden som brukes. For å analysere funksjonen til sirkulerende elbiler, er det bedre å velge blodplasmaet, som bedre kan reflektere den virkelige tilstanden til elbiler in vivo, i stedet for serumet. Dette skyldes at mange blodplateavledede EVer vil bli frigjort under prosessen med koagulasjonsdannelse for oppsamling av serum21, mens blodplater fjernes via sentrifugering før isolering av EV fra plasma22. Det må bemerkes at valget av antikoagulasjon for plasma EV-isolasjon fortsatt er kontroversielt. Den antikoagulerende mekanismen for heparin er nærmere knyttet til fysiologi; Elbilene isolert kan dermed være mer reflekterende for in vivo-statusen. Det må nevnes at heparin vil forårsake falske negative PCR-avlesninger og blokkere EV-opptak av celler23,24. Andre antikoagulasjonsreagenser, som EDTA eller natriumcitrat, har også sine mangler, inkludert biotoksisitet, som påvirker de kjemiske egenskapene til plasma og blodplater. Samlet, gitt ovennevnte informasjon, er heparin valgt i denne studien. For å fjerne blodplatene ble prøvene sentrifugert med en hastighet på 2.500 x g før 16.800 x g, noe som kan fjerne noen store elbiler. I tillegg, med tanke på at mange EVer i det viskøse plasmaet vil feste seg til blodplater og bli fjernet, foreslås det å fortynne plasmaet med et likt volum PBS før du fjerner blodplater gjennom sentrifugering for å forbedre utbyttet av EV. Merk at det er bedre å bruke en sukrosegradient med ultrasentrifugering for å rense elbilene for å fjerne løselige proteinforurensninger, for eksempel proteinpolymerer21.

Til dags dato inkluderer de vanlige metodene for å karakterisere elbiler NTA, TEM, FC16 og Western blot, blant annet25. I tillegg, på grunn av endringen av morfologi og mengde elbiler etter å ha blitt restaurert under forskjellige forhold13, foreslår vi å behandle deteksjonen så snart som mulig etter utvinning av elbilene. Dessuten har Görgens et al. anbefalt å bruke PBS supplert med humant albumin og trehalose (PBS-HAT) for bedre bevaring enn ren PBS26. Morfologisk identifisering av elbiler via NTA og TEM må utføres umiddelbart etter ekstraksjonsprosedyren, ellers kan formen på elbiler endreseg 27. Videre kan Cryo-EM brukes28 for avansert morfologisk observasjon av elbiler, noe som har fordelene ved å bevare formen bedre med høyere oppløsning. Foruten NTA kan konsentrasjonen av partikler også kvantifiseres av FC ved hjelp av en kjent mengde tellekuler29, men denne metoden er ikke veldig stabil, og sensitiviteten for små partikler er lav for FC. Videre, på grunn av svermedeteksjon av små partikler med FC30, er det bedre å bruke NTA for størrelsesbestemmelser. På samme måte kan opprinnelsen til elbiler også analyseres av NTA med fluorescensfiltre. Sammenlignet med FC er NTA mer følsom for mindre partikler og har den potensielle fordelen av å resirkulere prøven for andre eksperimenter. En fordel med å bruke FC er at de spesifikke subtypene av elbiler kan berikes med fluorokromkonjugerte membranantistoffer28. Funksjonen til spesifikke overflateantigener kan også studeres via funksjonstapseksperimenter, for eksempel ved bruk av nøytraliserende antistoffer28. Alternativt kan 1% Triton X-100 brukes til å ødelegge lipidflåten til EVs membran, og dermed som en kontroll for å oppdage membransignaler31. Videre kan forskere bruke de spesifikke membranegenskapene til å lage målrettede legemiddelbærere32.

Western blot brukes mye til å analysere proteininnholdet i elbiler. Flere markører som Mitofilin, caveolin og α-Actinin-418 har blitt anbefalt som kandidater for å identifisere store elbiler i nyere studier; CD9 er beriket i små elbiler i stedet for i store elbiler, og CD81, CD63 og Syntenin-1 er det rikelig med i små elbiler18. Når det gjelder resultatene av Western blot, er markører som Mitofilin og CD9 variable i forskjellige dyreforhold. Det kan antas at de isolerte elbilene representerer en blandet befolkning, der store elbiler er en stor underpopulasjon. For å verifisere renheten til EV, foreslås det at deteksjon av organelle / nukleære proteiner, som Lamin B eller Golgin84, legges til som den negative kontrollen. Når det gjelder plasma-EV-er, er Apoa1 som representerer poppartikler ifølge våre resultater ikke beriket i de innsamlede elbilene. En begrensning av denne metoden er at det er vanskelig å skille proteinene på overflaten fra de i vesiklet. Derfor kan enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) brukes til membranproteinanalyse som supplerende eksperimenter. Videre, med utviklingen av høykapasitetssekvensering, kan forskere dra nytte av proteomisk kartlegging33 for å analysere proteinsammensetningen til EV, med målproteinene som også må verifiseres av western blot.

Oppsummert gir denne studien en gjennomførbar protokoll for å isolere og karakterisere sirkulasjons- og vevs-EV, inkludert en analyse av deres cellekilder og proteininnhold, noe som bidrar til å etablere grunnlag for videre funksjonelle eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (32000974, 81870796, 82170988 og 81930025) og China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 og BX20190380). Vi er takknemlige for hjelpen fra National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% paraformaldehyde  Biosharp 143174 Transmission electron microscope
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody Yeason 34306ES60 Flow cytometry
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody Invitrogen A11008 Flow cytometry
Anti-CD18 antibody Abcam ab131044 Flow cytometry
Anti-CD81 antibody Abcam ab109201 Western blot
anti-CD9 antibody Huabio ET1601-9 Western blot
Anti-Mitofilin antibody Abcam ab110329 Western blot
APOA1 Rabbit pAb Abclone A14211 Western blot
BCA protein assay kit TIANGEN PA115 Western blot
BLUeye Prestained Protein Ladder Sigma-Aldrich 94964-500UL Western blot
Bovine serum albumin MP Biomedical 218072801 Western blot
Caveolin-1 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-53564 Western blot
CellMask Orange plasma membrane stain Invitrogen C10045 Flow cytometry
Chemiluminescence Amersham Biosciences N/A Western blot
Curved operating scissor JZ Surgical Instrument J21040 EV isolation
Electronic balance Zhi Ke ZK-DST EV isolation
Epoch spectrophotometer BioTek N/A Western blot
Eppendorf tubes Eppendorf 3810X EV isolation
Flotillin-1 antibody PTM BIO PTM-5369 Western blot
Gel imaging system Tanon 4600 Western blot
Golgin84 Novus nbp1-83352 Western blot
Grids - Formvar/Carbon Coated - Copper 200 mesh Polysciences 24915 Transmission electron microscope
Heparin Solution StemCell  7980 EV isolation
Liberase Research Grade Sigma-Aldrich 5401127001 EV isolation
Microscopic tweezer JZ Surgical Instrument JD1020 EV isolation
NovoCyte flow cytometer ACEA N/A Flow cytometry
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells Epizyme LK206 Western blot
OSCAR(D-19) antibody Santa Cruz Biotechnology SC-34235 Flow cytometry
PBS (2x) ZHHC PW013 Western blot
Pentobarbital sodium Sigma-Aldrich 57-33-0 Anesthetization
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jacson 115-035-003 Western blot
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jacson 111-035-003 Western blot
Phosphotungstic acid RHAWN 12501-23-4 Transmission electron microscope
PKM2(d78a4) xp rabbit  mab  Cell Signaling 4053t Western blot
Polyethylene (PE) film Xiang yi 200150055 Transmission electron microscope
Polyvinylidene fluoride membranes  Roche 3010040001 Western blot
Protease inhibitors Roche 4693132001 Western blot
Recombinant anti-PGD antibody Abcam ab129199 Western blot
RIPA lysis buffer Beyotime P0013 Western blot
SDS-PAGE loading buffer (5x) Cwbio CW0027S Western blot
Size beads Invitrogen F13839 Flow cytometry
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges Hitachi CT15E EV isolation
Transmission electron microscope HITACHI H-7650 Transmission electron microscope
Tween-20 MP Biomedicals 19472 Western blot
Vortex Mixer Genie Scientific Industries SI0425 EV isolation
ZetaView BASIC NTA - Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 Particle Metrix N/A Nanoparticle tracking analysis
α-Actinin-4 Rabbit mAb Abclone A3379 Western blot
β-actin Cwbio CW0096M Western blot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).
  2. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  3. Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  4. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
  5. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 63 (2018).
  6. Thietart, S., Rautou, P. E. Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view. Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).
  7. Xia, W., et al. Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors. Nature Communications. 12 (1), 6043 (2021).
  8. In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T. Tumor-educated pletelets. Blood. 133 (22), 2359-2364 (2019).
  9. Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation. Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).
  10. Brahmer, A., et al. endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820 (2019).
  11. Yang, H., et al. Blood collection through subclavian vein puncture in mice. Journal of Visualized Experiments. (147), e59556 (2019).
  12. Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales. Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).
  13. Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
  14. Forsyth, C. B., Mathews, H. L. Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans. Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).
  15. Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685 (2020).
  16. Welsh, J. A., et al. MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526 (2020).
  17. Durcin, M., et al. Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677 (2017).
  18. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
  19. Noren Hooten, N., et al. Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality. Scientific Reports. 9 (1), 17582 (2019).
  20. Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
  21. Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).
  22. Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  23. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  24. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
  25. Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  26. Görgens, A., et al. Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238 (2020).
  27. Maroto, R., et al. Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478 (2017).
  28. Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).
  29. Liu, D., et al. Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors. Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).
  30. Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).
  31. Dawson, G. Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes). Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).
  32. Zhang, G., et al. Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030 (2020).
  33. Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).

Tags

Biologi utgave 188
Isolering og analyse av sporbare og funksjonaliserte ekstracellulære vesikler fra plasma og fast vev
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cao, Y., Qiu, J. Y., Chen, D., Li,… More

Cao, Y., Qiu, J. Y., Chen, D., Li, C. Y., Xing, S. J., Zheng, C. X., Liu, X., Jin, Y., Sui, B. D. Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues. J. Vis. Exp. (188), e63990, doi:10.3791/63990 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter