Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Выделение и анализ прослеживаемых и функционализированных внеклеточных везикул из плазмы и твердых тканей

Published: October 17, 2022 doi: 10.3791/63990
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,2, 1,4, 1,5, 1, 2, 1,6, 1
1State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3Department of VIP Dental Care, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 4School of Basic Medicine, The Fourth Military Medical University, 5College of Life Science, Northwest University, 6Xi'an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine
* These authors contributed equally

Summary

В настоящем протоколе описан способ извлечения внеклеточных везикул из периферической крови и солидных тканей с последующим профилированием поверхностных антигенов и белковых грузов.

Abstract

Циркулирующие и резидентные в тканях внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой многообещающие мишени в качестве новых тераностических биомаркеров, и они становятся важными игроками в поддержании гомеостаза организма и прогрессировании широкого спектра заболеваний. В то время как текущие исследования сосредоточены на характеристике эндогенных экзосом эндосомального происхождения, микровезикулы, выделяющиеся из плазматической мембраны, привлекают все большее внимание к здоровью и болезням, которые характеризуются обилием поверхностных молекул, повторяющих мембранную сигнатуру родительских клеток. Здесь представлена воспроизводимая процедура, основанная на дифференциальном центрифугировании для извлечения и характеристики EV из плазмы и твердых тканей, таких как кость. Далее в протоколе описывается последующее профилирование поверхностных антигенов и белковых грузов EV, которые, таким образом, прослеживаются на предмет их происхождения и идентифицируются с компонентами, связанными с потенциальной функцией. Этот метод будет полезен для коррелятивного, функционального и механистического анализа ЭВ в биологических, физиологических и патологических исследованиях.

Introduction

Внеклеточные везикулы (ВВ) были предложены для определения высвобождаемых клетками липидных двухслойных внеклеточных структур1, которые играют важную роль в различных физиологических и патологических событиях2. ЭВ, высвобождаемые здоровыми клетками, можно разделить на две основные категории, а именно экзосомы (или малые ВВ), образующиеся через внутриклеточный эндоцитарный путьтрафика 3 , и микровезикулы (или большие ЭВ), развивающиеся в результате почкования плазматической мембраны клетки4 наружу. В то время как многие исследования сосредоточены на функции ЭВ, собранных из культивируемых клеток in vitro5, ВВ, полученные из кровообращения или тканей, являются более сложными и неоднородными, что имеет то преимущество, что отражает истинное состояние организма in vivo6. Кроме того, почти все виды тканей могут продуцировать ЭВ in vivo , и эти ЭВ могут действовать как мессенджеры внутри ткани или переноситься различными жидкостями организма, особенно периферической кровью, для облегчения системной коммуникации7. ВВ в кровообращении и тканях также являются мишенями для диагностики и лечения заболеваний8.

В то время как экзосомы интенсивно изучались в последние годы, микровезикулы также обладают важными биологическими функциями, которые могут быть легко извлечены без ультрацентрифугирования, что способствует фундаментальным и клиническим исследованиям9. Примечательно, что критическая проблема, касающаяся EV, выделенных из кровообращения и тканей, заключается в том, что они получены из разных типов клеток10. Поскольку микровезикулы выводятся из плазматической мембраны и характеризуются обилием молекулклеточной поверхности 9, возможно использование маркеров родительской клеточной мембраны для идентификации клеточного происхождения этих EV. В частности, метод проточной цитометрии (FC) может быть применен для обнаружения мембранных маркеров. Кроме того, исследователи могут изолировать электромобили и проводить дальнейший анализ на основе функциональных грузов.

Настоящий протокол предусматривает тщательную процедуру извлечения и определения характеристик электромобилей из образцов in vivo. EV выделяют с помощью дифференциального центрифугирования, а характеристика EV включает морфологическую идентификацию с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA) и просвечивающей электронной микроскопии (TEM), анализ происхождения с помощью FC и анализ белкового груза с помощью вестерн-блоттинга. В качестве представителей используется плазма крови и верхнечелюстная кость мышей. Исследователи могут ссылаться на этот протокол для электромобилей из других источников и вносить соответствующие изменения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством Комитета по уходу за животными и их использованию Четвертого военно-медицинского университета и руководящими принципами ARRIVE. Для настоящего исследования использовались 8-недельные мыши C57Bl / 6 (без предпочтения ни самок, ни самцов). Этапы, связанные с выделением плазменных и тканевых EV, проиллюстрированы на рисунке 1. Плазма взята в качестве репрезентативной для описания процедуры выделения EV из жидкостей организма. Верхнечелюстная кость берется в качестве репрезентативной для объяснения процедуры изоляции EV от твердых тканей.

1. Подготовка образцов плазмы и верхнечелюстной кости

  1. Подготовьте образцы плазмы, выполнив следующие действия.
    1. Определите массу тела мыши с помощью стандартных лабораторных весов.
    2. Добавьте 20 мкл, 2 мг/мл гепарина в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и используйте смесительное устройство (см. Таблицу материалов), чтобы гепарин прикрепился к стенке пробирки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Антикоагулянтные трубки также можно использовать непосредственно для сбора крови.
    3. Обезболивают мышей внутрибрюшинной инъекцией 50 мг/кг пентобарбитала натрия (см. Таблицу материалов). Возьмитесь за шею мыши большим и указательным пальцами, затем зафиксируйте мизинцем хвост и левую заднюю ногу и введите пентобарбитал натрия шприцем для инъекций объемом 1 мл после обнажения живота.
    4. Подтвердите, что мышь правильно обезболена, основываясь на отсутствии рефлекса роговицы и реакции конечностей при защемлении подушечки стопы.
    5. Сбрейте волосы на лице и ресницы глаз изогнутыми ножницами.
    6. Возьмитесь за кожу шеи мыши и прижмите кожу вокруг глаз к задней части шеи так, чтобы глазное яблоко выступало. Используйте офтальмологический пинцет, чтобы быстро зажать глазное яблоко, и соберите отток крови с помощью центрифужных пробирок объемом 1,5 мл, подготовленных на этапе 1.1.2. Пожертвуйте мышью, вывихнув шейный позвонок.
      ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны с волосами и ресницами, потому что они могут вызвать гемолиз.
    7. Аккуратно переверните трубку вверх дном несколько раз, чтобы предотвратить свертывание крови.
      ВНИМАНИЕ: Как можно скорее переверните трубку вверх дном.
    8. Центрифугируйте образец крови в течение 15 мин при 1 200 x g при 4 ° C.
    9. Осторожно перенесите надосадочную жидкость в новые и чистые центрифужные пробирки объемом 1,5 мл и немедленно используйте образец плазмы или храните его при температуре 4 ° C в течение нескольких часов.
    10. Разбавьте надосадочную жидкость равным объемом 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) и хорошо перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенный выше протокол для сбора плазмы приводит к летальному исходу. Кровь также может быть собрана через пункцию подключичной вены11 без ущерба для мыши.
  2. Подготовьте образцы верхнечелюстной кости, выполнив следующие действия.
    1. Изолируйте верхнечелюстную кость с помощью офтальмологического пинцета и ножниц и промойте их PBS, чтобы избавиться от мягких тканей пинцетом.
    2. Поместите верхнечелюстную кость в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл и разрежьте кость на мелкие кусочки (размер должен быть менее 1 мм в диаметре) ножницами. Добавьте определенное количество Libera (5 мкг / мл, см. Таблицу материалов), чтобы покрыть ткань (обычно 1 мл для образцов костей от 8-недельной мыши), а затем инкубируйте в течение 30 минут при 37 ° C.
    3. Центрифугируют образец при 800 x g в течение 10 мин при 4 °C.
    4. Осторожно перенесите надосадочную жидкость с помощью пипетки в новые и чистые центрифужные пробирки объемом 1,5 мл.

2. Извлечение электромобилей

  1. Центрифугируют образцы (приготовленные на этапах 1.1.10 и 1.2.4) в течение 15 мин при 2 500 x g (4 °C) для удаления крупного клеточного мусора и оставшихся тромбоцитов.
  2. Осторожно перенесите надосадочные жидкости в новые и чистые центрифужные пробирки объемом 1,5 мл и центрифугу в течение 30 мин при 16 800 x g (4 °C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость центрифугирования может быть установлена на более чем 10 000 x g для извлечения EV12. Чем выше скорость центрифуги, тем большее количество электромобилей можно получить. Поскольку предельная скорость центрифуги, которую мы использовали, составляет 16 800 x g (см. Таблицу материалов), мы выбрали эту скорость в этом протоколе.
  3. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулы в каждой пробирке с 1 мл PBS. Центрифуга в течение 30 мин при 16 800 x g (4 °C).
  4. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулы в каждой пробирке с 50 мкл PBS. Храните эти образцы при температуре 4 °C менее 24 часов или, предпочтительно, немедленно используйте для следующих анализов (этапы 3-5).
    ВНИМАНИЕ: Хранение при -80 °C недопустимо, так как это снизит концентрацию EV и увеличит размеры частиц EV13, тем самым влияя на последующий анализ EV.

3. Морфологическая идентификация ВВ

  1. Выполните NTA-анализ.
    1. В зависимости от количества EV (грубо судят по размеру гранул, частицы плазмы 50 мкл являются минимальными), перенесите 5-50 мкл ресуспендирования (этап 2.4), разбавьте в 10 мл буферного раствора (PBS отфильтровали фильтром 0,22 мкм) и достаточно смешайте с наконечниками микропипеток объемом 1 мл. Используйте эту окончательную суспензию для измерения частиц.
    2. Используйте стерильный шприц объемом 1 мл для введения не менее 5 мл дистиллированной воды с умеренной и постоянной скоростью до тех пор, пока количество частиц, отображаемых на интерфейсе обнаружения, не станет менее пяти.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После впрыска 1 мл дистиллированной воды по всему каналу количество частиц отображается непосредственно на интерфейсе обнаружения. Если число все еще превышает пять, продолжайте вводить 1 мл дистиллированной воды до тех пор, пока критерии не будут выполнены.
    3. Восстановите 1 мкл калибровочного раствора в 1 мл дистиллированной воды для получения первичного раствора, а затем возьмите 100 мкл первичного раствора на 25 мл дистиллированной воды для приготовления стандартного исходного раствора (1:250 000). Хранить этот рабочий реагент при температуре 4 °C в течение 1 недели.
    4. Откалибруйте прибор NTA с помощью стандартного исходного раствора (этап 3.1.3). Введите 1-5 мл рабочего калибровочного раствора стерильным шприцем объемом 1 мл для промывки канала машины до тех пор, пока количество частиц, отображаемых на интерфейсе обнаружения, не достигнет 50-400 (предпочтительно около 300). Запустите программу калибровки.
    5. Повторите шаг 3.1.2 для промывки канала машины перед каждым измерением образца.
    6. Используйте стерильный шприц объемом 1 мл для введения не менее 2 мл буферного раствора для промывки канала машины с постоянной скоростью до тех пор, пока количество частиц, отображаемых на интерфейсе обнаружения, не станет меньше 10.
    7. Введите 1 мл образца EV, приготовленного на этапе 3.1.1, с умеренной и постоянной скоростью (рекомендуемая скорость 0,5-1 мл / с).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальной концентрацией частиц является то, что количество частиц, отображаемых на границе раздела детектирования, составляет от 50 до 400, предпочтительно около 300. Если количество частиц слишком велико, повторите шаг 3.1.2, чтобы немедленно промыть канал машины, чтобы избежать задержки частиц на стенке канала, и отрегулируйте концентрацию образца EV с помощью шага 3.1.1, затем повторите с шага 3.1.5.
    8. Проведите анализ частиц и сформируйте отчеты об анализе в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
    9. Если образец ценный, откачайте образец EV с помощью шприца объемом 1 мл и соберите его в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Повторите шаг 2.2, чтобы извлечь электромобили.
    10. После обнаружения всех образцов введите не менее 2 мл буферного раствора в канал машины, а затем введите не менее 5 мл дистиллированной воды до тех пор, пока количество частиц, отображаемых на интерфейсе обнаружения, не станет менее пяти.
    11. Используйте стерильный шприц объемом 5 мл для введения не менее 10 мл воздуха с постоянной скоростью (рекомендуемая скорость составляет 1 мл / с) для удаления воды из канала.
  2. Проведите анализ ПЭМ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги со свежей ресуспендацией электромобиля. Сетка электронного микроскопа с формварно-углеродным покрытием имеет две стороны, причем рабочая сторона светится в центральных сетках. Минимальный объем плазмы для извлечения ЭВ для приведенной ниже процедуры составляет 50 мкл.
    1. Смешайте образец EV (этап 2.4) с равным объемом 4% параформальдегида (PFA). Поместите 4 мкл электромобилей на одну сетку и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре (RT).
    2. Четыре капли ПБС (одна капля равна 50 мкл) нанести на лист полиэтиленовой пленки (см. Таблицу материалов). Переложите сетки чистым микроскопическим пинцетом и промойте рабочую сторону сетки в ПБС от одной капли до другой.
    3. Используйте фильтровальную бумагу, чтобы удалить лишние PBS, оставшиеся в сетках.
    4. Инкубируйте рабочую сторону решетки в 1% фосфовольфрамовой кислоте (см. Таблицу материалов) в течение 2 мин, а затем повторите шаг 3.2.2.
      ВНИМАНИЕ: Поскольку фосфовольфрамовая кислота ядовита, эту процедуру необходимо выполнять в вытяжном шкафу, а избыточную фосфовольфрамовую кислоту необходимо специально перерабатывать, а не выбрасывать напрямую.
    5. Положите решетки лицевой стороной вверх в 10-сантиметровую посуду, застеленную фильтровальной бумагой. Сетки могут храниться при РТ в течение нескольких лет.
    6. Наблюдайте за сетками под электронным микроскопом, следуя инструкциям производителя (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить наблюдение за отдельными частицами, концентрация EV должна быть отрегулирована, а суспензия должна быть прозрачной без явной мутности. Перед каплей пробу следует хорошо перемешать. Репрезентативные анализы ТЕА и НТА показаны на рисунке 2.

4. Анализ происхождения электромобилей

ПРИМЕЧАНИЕ: Идентификация клеточного происхождения ЭВ требует применения антител к типичным маркерам клеточной мембраны. Минимальный объем плазмы для извлечения ЭВ для приведенной ниже процедуры составляет 300 мкл. Основываясь на липидных двухслойных структурах ВВ, для их маркировки можно использовать мембранный краситель. Для образцов плазмы крови для представления выбирается CD18 для лимфоцитов14 . Для образцов верхнечелюстной кости в качестве примера выбран остеокласт-ассоциированный рецептор (OSCAR) для остеокластов15 . Перед FC убедитесь, что проточный цитометр адаптирован к измерению EVs16, так как нижний предел размера в значительной степени отличается между различными проточными цитометрами.

  1. Ресуспендируют образцы (этап 2.4) 500 мкл PBS и переносят 50 мкл в новую и чистую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл в качестве заготовки (пробирка A) и еще 50 мкл в новую и чистую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл в качестве простой пробирки для окрашивания для FITC (пробирка B). Добавьте 0,5 мкл мембранного красителя в первичную пробирку для окрашивания мембраны. Инкубировать в течение 5 минут при РТ.
  2. Центрифугируйте первичную пробирку в течение 30 мин при 16 800 x g (4 °C). Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулы 200 мкл PBS.
  3. Разделите каждый образец объемом 50 мкл на четыре центрифужные пробирки по 1,5 мл для простого окрашивания пробирок для ПЭ (пробирка С), окрашивания поверхностными маркерами (пробирка D) и контроля только вторичных антител (пробирка E).
  4. Добавьте первичное антитело OSCAR в образцах EV кости, а также антитело CD18 в образцах EV в плазме (см. Таблицу материалов) в пробирку B (этап 4.1) и пробирку D (стадия 4.3) отдельно (разбавленную в соотношении 1:100). Инкубировать в течение 1 ч при 4 °C.
  5. Центрифугируйте пробирки в течение 30 мин при 16 800 x g (4 °C). Выбросьте надосадочную жидкость, ресуспендируйте гранулы с 500 мкл PBS, а затем снова центрифугу в течение 30 мин при 16 800 x g (4 ° C) для удаления лишних первичных антител.
  6. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулы 50 мкл PBS с последующим добавлением вторичных антител, конъюгированных с FITC (см. Таблицу материалов), соответственно (разбавленных в соотношении 1:200) (пробирка E). Добавьте одни и те же вторичные антитела в пробирку B (этап 4.1) и пробирку D (этап 4.3). Инкубировать все пробирки в течение 1 ч, при 4 °C в темноте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прямые флуоресцентно-конъюгированные меченые антитела также могут быть использованы для обработки обнаружения FC с надлежащим контролем изотипа.
  7. Разбавьте одну каплю суспензии шариков размером 0,2, 0,5 и 1 мкм (см. Таблицу материалов) соответственно в 1 мл PBS и сначала запустите шарики каждого размера, чтобы убедиться, что затвор выбран для электромобилей. Установите пороговое значение проточного цитометра для поиска шариков и популяции EV с помощью подходящего прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC).
    1. Установите конечное условие как расчет 100 000 частиц, окрашенных в мембрану. Проанализируйте образец с помощью проточного цитометра в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Репрезентативные результаты показаны на рисунке 3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оборудование NTA с флуоресцентными каналами также может использоваться для анализа происхождения, а подготовка образцов такая же, как и FC.

5. Анализ содержания белка в электромобилях

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ содержания белка в EV проводится с помощью вестерн-блоттинга. Например, плазменные и костные EV были отобраны для анализа 6-фосфоглюконатдегидрогеназы (ПГД) и пируваткиназы М2 (PKM2) на метаболический статус. Golgin84 (органелла Гольджи) использовали в качестве отрицательного контроля, а флотиллин (мембранный белок), кавеолин (интегральный белок кавеол) и β-актин (цитоскелет)17 использовались в качестве положительного контроля в EV по сравнению с образцами клеток. Митофилин и α-актинин-4 были выбраны в качестве больших маркеров EV, в то время как CD9 и CD81 были выбраны в качестве небольших маркеров EV для демонстрации субпопуляций EV18. Apoa1 был выбран в качестве маркералипопчастиц плазмы 19. Сведения о соответствующем реагенте см. в таблице материалов.

  1. Ресуспендируют гранулы (этап 2.4) в 50 мкл лизирующего буфера RIPA и инкубируют в течение 30 мин на льду.
  2. Количественно определите концентрацию белка во всех образцах в 96-луночной микропланшете с помощью анализа белка BCA в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
    1. Разбавьте 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) 0,9% физиологического раствора (NS) (содержащего 0,9% (мас./об.) хлорида натрия) до 0,5 мг/мл. Добавьте 0,5 мг/мл BSA и 0,9% NS в три дублированные лунки с определенными объемами, как показано в таблице 1.
    2. Опустите 2 мкл образцов (этап 5.1) и добавьте 18 мкл NS в три дублированные лунки отдельно.
    3. Приготовьте рабочий раствор, смешав реагент BCA A с реагентом B (50:1 Reagent A:B). Добавьте по 200 мкл рабочего раствора в каждую лунку и осторожно встряхните в течение 30 с.
    4. Инкубируйте 96-луночную микропланшет в течение 20-25 минут при 37 °C.
    5. Измерьте наружный диаметр на длине волны 596 нм с помощью спектрофотометра (см. Таблицу материалов).
    6. Экспортируйте данные.
    7. Нарисуйте стандартную кривую и рассчитайте концентрацию белка в образцах.
  3. Согласно результатам, разбавляют образцы до 1 мкг/мкл с 0,9% NS и 5-кратным загрузочным буфером SDS-PAGE (250 мМ Tris· HCl, pH 6,8, 10% SDS, 30% (об./об.) глицерина, 10 мМ DTT, 0,05% (мас./об.) бромфенольного синего, см. Таблицу материалов). Плотно закройте трубки пленкой и нагревайте в течение 5 минут при 100 °C.
  4. Загрузите образцы и белковую лестницу в градиентную концентрацию 4-20% геля Hepes-Tris (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите процентное содержание геля в соответствии с молекулярной массой интересующих белков.
  5. Запустите гель в проточном буфере при 80 В, пока белки не образуют линию, а затем переключитесь на 120 В в течение 1 ч, пока загрузочный краситель не окажется на дне геля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время работы может варьироваться в зависимости от используемого оборудования или типа и концентрации геля.
  6. Перенесите гель на мембрану из поливинилиденфторида (PVDF) (см. Таблицу материалов), предварительно инкубированную в метиловом спирте в течение 20 с. Используйте систему влажного переноса для переноса в течение 1 часа при 200 мА.
    ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что внутри системы переноса нет пузырьков, и держите мембрану PVDF влажной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время переноса может варьироваться в зависимости от молекулярной массы белка-мишени; 1 KD обычно требуется 1 мин.
  7. Приготовьте 5% буфер, блокирующий BSA, добавив 2,5 г BSA (см. Таблицу материалов) в 50 мл трис-буферного физиологического раствора-твина (TBST) (2 мл Tween добавляют в 2 л раствора PBS) в центрифужную пробирку объемом 50 мл. Взбалтывайте до тех пор, пока порошок не растворится. Блокируют мембраны в этом буфере на 2 ч при РТ при перемешивании.
  8. Инкубируют мембраны со специфическими первичными антителами, разбавленными TBST до надлежащей концентрации (митофилин, 1:1000; α-актинин-4, 1:1000; CD9, 1:1000; CD81, 1:1000; Апоа1, 1:1000; Гольгин84, 1:1000; Флотилин-1, 1:1000; Кавеолин-1, 1:1000; ПГД, 1:1000; ПКМ2, 1:1000; β-актин, 1:3000) на ночь при 4 °C.
  9. Промойте мембраны в моющем буфере (2 мл Tween, добавленного в 2 л раствора PBS) четыре раза (каждый раз по 15 мин) и инкубируйте мембраны с подходящими вторичными антителами в соотношении 1:4000 в течение 1 ч при RT с перемешиванием.
  10. Промойте мембраны в моющем буфере четыре раза (каждый раз по 15 минут) и сделайте снимок мембран с помощью набора для хемилюминесценции и системы визуализации геля (см. Таблицу материалов).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Согласно экспериментальному рабочему процессу, ЭВ могут быть извлечены из периферической крови и твердых тканей (рис. 1). Верхнечелюстная кость мыши в возрасте 8 недель составляет примерно 0,1 ± 0,05 г, и у мыши можно собрать около 300 мкл плазмы. Следуя этапам протокола, можно собрать 0,3 мг и 3 мкг EV соответственно. Как проанализировано TEM и NTA, типичными морфологическими характеристиками EV являются круглые чашеобразные мембранные везикулы диаметром от 50 до 300 нм (рис. 2). FC может обнаруживать ВВ, меченные мембранным красителем, при полезном контроле, а анализ ФК показывает процентное содержание специфических мембранных маркеров, экспрессируемых на ВВ, что подразумевает их происхождение из родительских клеток (рис. 3). Вестерн-блоттинг показывает экспрессию ПГД и ПКМ2 соответственно как представителя содержания белка в ВВ плазмы и ВВ костей, что указывает на метаболический статус (рис. 4). Отрицательная экспрессия Golgin84 в ВВ также обнаруживается с присутствием митофилина, α-актинина-4, флотиллина-1, кавеолина-1 и β-актина, который обычно обогащается большими ВВ (микровезикулами), полученными из плазматической мембраны. Маленький маркер EV CD9 также может быть обнаружен, в то время как экспрессия CD81 низкая или отсутствует, с отсутствием Apoa1 в плазменных EV (рис. 4).

Figure 1
Рисунок 1: Иллюстрация протокола извлечения EV . (A) Этапы извлечения EV плазмы периферической крови с помощью дифференциального центрифугирования. (B) Этапы извлечения тканевых EV с помощью дифференциального центрифугирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Морфологическая идентификация ЭВ. (A) Репрезентативное изображение просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ), отображающее морфологию ЭВ. Масштабная линейка = 200 нм. (B) Репрезентативные изображения анализа отслеживания наночастиц (NTA) и результаты количественного определения показывают распределение по размерам и количество частиц EV. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Анализ происхождения электромобилей . (A) Различные наборы трубок с различными элементами управления экспериментом. (B) Распределение шариков размером 1 мкм, 0,5 мкм и 0,2 мкм показано на графике. (C) Репрезентативные графики плотности, показывающие PBS (трубка A), простое окрашивание EV (трубка B), простое окрашивание мембранным красителем (трубка C) и двойное окрашивание образцов EV (трубка D). (D) Проточный цитометрический анализ процентного содержания CD18-положительных EV в EV плазмы крови красного цвета по сравнению с контролем вторичных антител только в черном цвете. (E) Проточный цитометрический анализ процентного содержания OSCAR-положительных EV из образцов костей красного цвета по сравнению с контролем вторичных антител только в черном цвете. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Анализ содержания белка в ЭВ. (A) Репрезентативное вестерн-блоттинг изображений EV плазмы, показывающее присутствие 6-фосфоглюконатдегидрогеназы (ПГД) и митофилина, α-актинина-4, CD9, флотиллина-1, кавеолина-1 и β-актина в плазменных EV и отрицательную экспрессию CD81, Golgin84 и Apoa1. (B) Репрезентативное вестерн-блоттинг изображений EV костей, показывающее присутствие пируваткиназы M2 (PKM2) и митофилина, α-актинина-4, CD9, CD81, флотиллина-1, кавеолина-1 и β-актина в костных EV и отрицательную экспрессию Golgin84. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Число 1 2 3 4 5 6 7 8
БСА (мкл) 0 1 2 4 8 12 16 20
NS (мкл) 20 19 18 16 12 8 4 0

Таблица 1: Стандартный рабочий раствор анализа BCA. Добавьте 0,5 мг/мл BSA и 0,9% NS в три дублированные лунки, как показано в таблице.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

При изучении особенностей, судьбы и функций электромобилей крайне важно изолировать электромобили с высокой производительностью и низким уровнем загрязнения. Существуют различные методы извлечения EV, такие как центрифугирование в градиенте плотности (DGC), эксклюзионная хроматография (SEC) и анализы иммунозахвата 4,20. Здесь был использован один из наиболее часто используемых методов - дифференциальное центрифугирование; Преимущества этого заключаются в том, что он не отнимает много времени, обеспечивает высокий выход электромобилей с легкой изоляцией от ограниченного количества образцов и возможностью модифицировать метод в зависимости от используемого источника образца. Для анализа функции циркулирующих ЭВ лучше выбирать плазму крови, которая может лучше отражать реальное состояние ЭВ in vivo, а не сыворотку. Это связано с тем, что многие ВВ, полученные из тромбоцитов, высвобождаются в процессе образования сгустка для сбора сыворотки21, в то время как тромбоциты удаляются с помощью центрифугирования перед выделением ЭВ из плазмы22. Следует отметить, что выбор антикоагулянтной терапии для выделения ЭВ в плазме до сих пор является спорным. Антикоагулянтный механизм гепарина более тесно связан с физиологией; изолированные таким образом электромобили могут больше отражать статус in vivo. Следует отметить, что гепарин вызывает ложноотрицательные показания ПЦР и блокирует поглощение EV клетками23,24. Другие антикоагулянтные реагенты, такие как ЭДТА или цитрат натрия, также имеют свои недостатки, включая биотоксичность, влияющую на химические свойства плазмы и тромбоцитов. В совокупности, учитывая приведенную выше информацию, гепарин выбран в этом исследовании. Для удаления тромбоцитов образцы центрифугировали со скоростью 2 500 x g до 16 800 x g, что может привести к удалению некоторых крупных EV. Кроме того, учитывая, что многие EV в вязкой плазме будут прикрепляться к тромбоцитам и удаляться, рекомендуется разбавлять плазму равным объемом PBS перед удалением тромбоцитов центрифугированием для улучшения выхода EV. Следует отметить, что лучше использовать градиент сахарозы с ультрацентрифугированием для очистки EV для удаления растворимых белковых загрязнений, таких как белковые полимеры21.

На сегодняшний день общие методы характеристики электромобилей включают, среди прочего, NTA, TEM, FC16 и вестерн-блоттинг25. Кроме того, из-за изменения морфологии и количества ВВ после восстановления в различных условиях13 мы предлагаем обработать обнаружение как можно скорее после извлечения ВВ. Кроме того, Görgens et al. рекомендовали использовать PBS с добавлением человеческого альбумина и трегалозы (PBS-HAT) для лучшей сохранности, чем чистый PBS26. Морфологическая идентификация ВВ с помощью НТА и ПЭМ должна быть выполнена сразу после процедуры экстракции, в противном случае форма ВВ может измениться27. Кроме того, Cryo-EM может быть использован28 для расширенного морфологического наблюдения EV, что имеет преимущества лучшего сохранения формы с более высоким разрешением. Помимо NTA, концентрация частиц также может быть количественно определена FC с помощью известного количества счетных шариков29, но этот метод не очень стабилен, и чувствительность к мелким частицам для FC низкая. Более того, из-за обнаружения роя мелких частиц с помощью FC30 лучше использовать NTA для определения размера. Точно так же происхождение электромобилей также может быть проанализировано NTA с флуоресцентными фильтрами. По сравнению с FC, NTA более чувствителен к более мелким частицам и имеет потенциальное преимущество, заключающееся в переработке образца для других экспериментов. Одним из преимуществ использования ФК является то, что конкретные подтипы ЭВ могут быть обогащены флуорохром-конъюгированными мембранными антителами28. Кроме того, функция специфических поверхностных антигенов может быть изучена с помощью экспериментов с потерей функции, таких как использование нейтрализующих антител28. В качестве альтернативы, 1% Triton X-100 может быть использован для разрушения липидного рафта мембраны EVs, таким образом, в качестве контроля для обнаружения мембранных сигналов31. Кроме того, исследователи могут использовать специфические характеристики мембраны для создания целевых носителей лекарств32.

Вестерн-блоттинг широко используется для анализа содержания белка в EV. Несколько маркеров, таких как митофилин, кавеолин и α-актинин-418 , были рекомендованы в качестве кандидатов для идентификации крупных электромобилей в недавних исследованиях; CD9 обогащен в небольших EV, а не в больших, а CD81, CD63 и Syntenin-1 широко распространены в небольших EV18. Что касается результатов вестерн-блоттинга, то такие маркеры, как митофилин и CD9, варьируются в разных условиях животных. Можно предположить, что изолированные электромобили представляют собой смешанную популяцию, в которой крупные электромобили являются одной основной субпопуляцией. Для проверки чистоты EV предлагается добавить обнаружение органелл / ядерных белков, таких как Lamin B или Golgin84, в качестве отрицательного контроля. Что касается плазменных EV, то, согласно нашим результатам, Apoa1, представляющий собой липопчастицы, не обогащен собранными EV. Одним из ограничений этого метода является то, что трудно отличить белки на поверхности от белков внутри везикулы. Таким образом, иммуноферментный анализ (ИФА) может быть применен для анализа мембранного белка в качестве дополнительных экспериментов. Кроме того, с развитием высокопроизводительного секвенирования исследователи могут воспользоваться преимуществами протеомного картирования33 для анализа белкового состава EV, при этом целевые белки также должны быть проверены вестерн-блоттингом.

Таким образом, это исследование предоставляет возможный протокол для выделения и характеристики циркуляторных и тканевых EV, включая анализ их клеточных источников и содержания белка, что помогает создать основу для дальнейших функциональных экспериментов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (32000974, 81870796, 82170988 и 81930025) и Китайского фонда постдокторантуры (2019M663986 и BX20190380). Мы благодарны за помощь Национальному экспериментально-учебному демонстрационному центру фундаментальной медицины (АМФУ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% paraformaldehyde  Biosharp 143174 Transmission electron microscope
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody Yeason 34306ES60 Flow cytometry
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody Invitrogen A11008 Flow cytometry
Anti-CD18 antibody Abcam ab131044 Flow cytometry
Anti-CD81 antibody Abcam ab109201 Western blot
anti-CD9 antibody Huabio ET1601-9 Western blot
Anti-Mitofilin antibody Abcam ab110329 Western blot
APOA1 Rabbit pAb Abclone A14211 Western blot
BCA protein assay kit TIANGEN PA115 Western blot
BLUeye Prestained Protein Ladder Sigma-Aldrich 94964-500UL Western blot
Bovine serum albumin MP Biomedical 218072801 Western blot
Caveolin-1 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-53564 Western blot
CellMask Orange plasma membrane stain Invitrogen C10045 Flow cytometry
Chemiluminescence Amersham Biosciences N/A Western blot
Curved operating scissor JZ Surgical Instrument J21040 EV isolation
Electronic balance Zhi Ke ZK-DST EV isolation
Epoch spectrophotometer BioTek N/A Western blot
Eppendorf tubes Eppendorf 3810X EV isolation
Flotillin-1 antibody PTM BIO PTM-5369 Western blot
Gel imaging system Tanon 4600 Western blot
Golgin84 Novus nbp1-83352 Western blot
Grids - Formvar/Carbon Coated - Copper 200 mesh Polysciences 24915 Transmission electron microscope
Heparin Solution StemCell  7980 EV isolation
Liberase Research Grade Sigma-Aldrich 5401127001 EV isolation
Microscopic tweezer JZ Surgical Instrument JD1020 EV isolation
NovoCyte flow cytometer ACEA N/A Flow cytometry
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells Epizyme LK206 Western blot
OSCAR(D-19) antibody Santa Cruz Biotechnology SC-34235 Flow cytometry
PBS (2x) ZHHC PW013 Western blot
Pentobarbital sodium Sigma-Aldrich 57-33-0 Anesthetization
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jacson 115-035-003 Western blot
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jacson 111-035-003 Western blot
Phosphotungstic acid RHAWN 12501-23-4 Transmission electron microscope
PKM2(d78a4) xp rabbit  mab  Cell Signaling 4053t Western blot
Polyethylene (PE) film Xiang yi 200150055 Transmission electron microscope
Polyvinylidene fluoride membranes  Roche 3010040001 Western blot
Protease inhibitors Roche 4693132001 Western blot
Recombinant anti-PGD antibody Abcam ab129199 Western blot
RIPA lysis buffer Beyotime P0013 Western blot
SDS-PAGE loading buffer (5x) Cwbio CW0027S Western blot
Size beads Invitrogen F13839 Flow cytometry
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges Hitachi CT15E EV isolation
Transmission electron microscope HITACHI H-7650 Transmission electron microscope
Tween-20 MP Biomedicals 19472 Western blot
Vortex Mixer Genie Scientific Industries SI0425 EV isolation
ZetaView BASIC NTA - Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 Particle Metrix N/A Nanoparticle tracking analysis
α-Actinin-4 Rabbit mAb Abclone A3379 Western blot
β-actin Cwbio CW0096M Western blot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).
  2. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  3. Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  4. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
  5. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 63 (2018).
  6. Thietart, S., Rautou, P. E. Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view. Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).
  7. Xia, W., et al. Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors. Nature Communications. 12 (1), 6043 (2021).
  8. In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T. Tumor-educated pletelets. Blood. 133 (22), 2359-2364 (2019).
  9. Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation. Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).
  10. Brahmer, A., et al. endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820 (2019).
  11. Yang, H., et al. Blood collection through subclavian vein puncture in mice. Journal of Visualized Experiments. (147), e59556 (2019).
  12. Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales. Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).
  13. Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
  14. Forsyth, C. B., Mathews, H. L. Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans. Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).
  15. Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685 (2020).
  16. Welsh, J. A., et al. MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526 (2020).
  17. Durcin, M., et al. Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677 (2017).
  18. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
  19. Noren Hooten, N., et al. Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality. Scientific Reports. 9 (1), 17582 (2019).
  20. Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
  21. Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).
  22. Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  23. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  24. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
  25. Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  26. Görgens, A., et al. Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238 (2020).
  27. Maroto, R., et al. Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478 (2017).
  28. Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).
  29. Liu, D., et al. Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors. Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).
  30. Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).
  31. Dawson, G. Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes). Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).
  32. Zhang, G., et al. Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030 (2020).
  33. Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).

Tags

Биология выпуск 188
Выделение и анализ прослеживаемых и функционализированных внеклеточных везикул из плазмы и твердых тканей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cao, Y., Qiu, J. Y., Chen, D., Li,… More

Cao, Y., Qiu, J. Y., Chen, D., Li, C. Y., Xing, S. J., Zheng, C. X., Liu, X., Jin, Y., Sui, B. D. Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues. J. Vis. Exp. (188), e63990, doi:10.3791/63990 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter