Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Extraktion extrazellulärer Vesikel aus dem peripheren Blut und festem Gewebe mit anschließender Profilierung von Oberflächenantigenen und Proteinladungen.
Abstract
Zirkulierende und geweberesidente extrazelluläre Vesikel (EVs) stellen vielversprechende Ziele als neuartige theranostische Biomarker dar und erweisen sich als wichtige Akteure bei der Aufrechterhaltung der organismischen Homöostase und dem Fortschreiten eines breiten Spektrums von Krankheiten. Während sich die aktuelle Forschung auf die Charakterisierung endogener Exosomen mit endosomalem Ursprung konzentriert, haben Mikrovesikel, die aus der Plasmamembran blähen, zunehmend an Aufmerksamkeit in den Bereichen Gesundheit und Krankheit gewonnen, die sich durch eine Fülle von Oberflächenmolekülen auszeichnen, die die Membransignatur von Elternzellen rekapitulieren. In dieser Arbeit wird ein reproduzierbares Verfahren vorgestellt, das auf der Differentialzentrifugation basiert, um EVs aus dem Plasma und festen Geweben, wie z.B. dem Knochen, zu extrahieren und zu charakterisieren. Das Protokoll beschreibt darüber hinaus die anschließende Profilierung von Oberflächenantigenen und Proteinladungen von EVs, die somit auf ihre Ableitungen zurückgeführt und mit Komponenten identifiziert werden können, die mit einer potenziellen Funktion in Verbindung stehen. Diese Methode wird für die korrelative, funktionelle und mechanistische Analyse von EVs in biologischen, physiologischen und pathologischen Studien nützlich sein.
Introduction
Extrazelluläre Vesikel (EVs) wurden vorgeschlagen, um zellfreigesetzte Lipiddoppelschicht-eingeschlossene extrazelluläre Strukturenzu definieren 1, die eine wichtige Rolle bei verschiedenen physiologischen und pathologischen Ereignissenspielen 2. EVs, die von gesunden Zellen freigesetzt werden, können grob in zwei Hauptkategorien unterteilt werden, nämlich Exosomen (oder kleine EVs), die durch einen intrazellulären endozytären Transportweg3 gebildet werden, und Mikrovesikel (oder große EVs), die durch die nach außen gerichtete Knospung der Plasmamembran der Zelle4 entstehen. Während sich viele Studien auf die Funktion von EVs konzentrieren, die aus kultivierten Zellen in vitro5 gewonnen wurden, sind EVs, die aus dem Kreislauf oder Gewebe stammen, komplexer und heterogener, was den Vorteil hat, dass sie den wahren Zustand des Organismus in vivo widerspiegeln 6. Darüber hinaus können fast alle Arten von Geweben EVs in vivo produzieren, und diese EVs können als Botenstoffe innerhalb des Gewebes fungieren oder von verschiedenen Körperflüssigkeiten, insbesondere dem peripheren Blut, übertragen werden, um die systemische Kommunikation zu erleichtern7. EVs im Kreislauf und im Gewebe sind auch Ziele für die Diagnose und Behandlung von Krankheiten8.
Während Exosomen in den letzten Jahren intensiv erforscht wurden, haben Mikrovesikel auch wichtige biologische Funktionen, die ohne Ultrazentrifugation leicht extrahiert werden können und so die Grundlagen- und klinische Forschung fördern9. Ein kritisches Problem in Bezug auf EVs, die aus dem Kreislauf und dem Gewebe isoliert wurden, besteht darin, dass sie von verschiedenen Zelltypen stammen10. Da Mikrovesikel von der Plasmamembran abgeblasen werden und durch eine Fülle von Zelloberflächenmolekülen9 gekennzeichnet sind, ist die Verwendung von Markern für die Mutterzellmembran zur Identifizierung des zellulären Ursprungs dieser EVs möglich. Insbesondere kann die Technik der Durchflusszytometrie (FC) zum Nachweis von Membranmarkern eingesetzt werden. Darüber hinaus können die Forscher die Elektrofahrzeuge isolieren und weitere Analysen auf der Grundlage der funktionalen Ladungen durchführen.
Das vorliegende Protokoll bietet ein gründliches Verfahren zur Extraktion und Charakterisierung von EVs aus in vivo Proben. Die EVs werden mittels Differentialzentrifugation isoliert, und die Charakterisierung der EVs umfasst die morphologische Identifizierung mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Herkunftsanalyse mittels FC und Proteinfrachtanalyse mittels Western Blot. Das Blutplasma und der Oberkieferknochen von Mäusen werden als Repräsentanten verwendet. Forscher können auf dieses Protokoll für Elektrofahrzeuge aus anderen Quellen zurückgreifen und entsprechende Änderungen vornehmen.
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Protocol
Die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Komitees für institutionelle Tierpflege und -nutzung der Vierten Militärmedizinischen Universität und den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt. Für die vorliegende Studie wurden 8 Wochen alte C57Bl/6-Mäuse (keine Präferenz für Weibchen oder Männchen) verwendet. Die Schritte zur Isolierung von Plasma- und Gewebe-EVs sind in Abbildung 1 dargestellt. Das Plasma wird als Repräsentant herangezogen, um das Verfahren zur Isolierung von EV aus Körperflüssigkeiten zu beschreiben. Der Oberkieferknochen wird als Repräsentant herangezogen, um das Verfahren der EV-Isolierung aus dem festen Gewebe zu erklären.
1. Aufbereitung des Plasmas und der Oberkieferknochenproben
- Bereiten Sie die Plasmaproben vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Bestimmen Sie das Körpergewicht der Maus mit einer Standard-Laborwaage.
- Geben Sie 20 μl, 2 mg/ml Heparin in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und verwenden Sie die Mischvorrichtung (siehe Materialtabelle), damit sich das Heparin an der Wand des Röhrchens festsetzen kann.
HINWEIS: Gerinnungsschutzröhrchen können auch direkt zur Blutentnahme verwendet werden. - Betäubung der Maus durch intraperitoneale Injektion von 50 mg/kg Pentobarbitalnatrium (siehe Materialtabelle). Fassen Sie den Hals der Maus mit Daumen und Zeigefinger, fixieren Sie dann den Schwanz und das linke Hinterbein mit dem kleinen Finger und injizieren Sie das Pentobarbital-Natrium mit einer 1-ml-Injektionsspritze, nachdem Sie den Bauch freigelegt haben.
- Vergewissern Sie sich, dass die Maus richtig betäubt ist, da beim Einklemmen des Fußballens keine Hornhautreflexe und keine Reaktion der Gliedmaßen vorhanden sind.
- Rasieren Sie die Haare im Gesicht und die Wimpern der Augen mit einer gebogenen Schere.
- Fassen Sie die Halshaut der Maus und drücken Sie die Haut um die Augen herum in den Nacken, so dass der Augapfel hervorsteht. Verwenden Sie eine Augenpinzette, um den Augapfel schnell einzuklemmen, und fangen Sie den Blutabfluss mit den in Schritt 1.1.2 vorbereiteten 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen auf. Opfern Sie die Maus, indem Sie den Halswirbel ausrenken.
ACHTUNG: Seien Sie vorsichtig mit den Härchen und Wimpern, da diese eine Hämolyse verursachen können. - Drehen Sie den Schlauch mehrmals vorsichtig auf den Kopf, um eine Blutgerinnung zu verhindern.
ACHTUNG: Drehen Sie den Schlauch so schnell wie möglich auf den Kopf. - Die Blutprobe wird für 15 min bei 1.200 x g bei 4 °C zentrifugiert.
- Übertragen Sie den Überstand vorsichtig in neue und saubere 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und verwenden Sie die Plasmaprobe sofort oder lagern Sie sie einige Stunden bei 4 °C.
- Den Überstand mit einem gleichen Volumen von 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnen und gut mischen.
HINWEIS: Das oben angegebene Protokoll zur Entnahme des Plasmas ist tödlich. Das Blut kann auch durch eine Venenpunktion11 entnommen werden, ohne dass die Maus geopfert wird.
- Bereiten Sie die Oberkieferknochenproben vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Isolieren Sie den Oberkieferknochen mit einer Augenpinzette und einer Schere und waschen Sie ihn mit PBS, um Weichteile mit einer Pinzette zu entfernen.
- Legen Sie den Oberkieferknochen in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und schneiden Sie den Knochen mit einer Schere in kleine Stücke (die Größe muss weniger als 1 mm Durchmesser haben). Fügen Sie eine bestimmte Menge Liberase (5 μg/ml, siehe Materialtabelle) hinzu, um das Gewebe zu bedecken (normalerweise 1 ml für Knochenproben einer 8 Wochen alten Maus) und inkubieren Sie dann 30 Minuten lang bei 37 °C.
- Zentrifugieren Sie die Probe bei 800 x g für 10 min bei 4 °C.
- Übertragen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette in neue und saubere 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
2. Extraktion von Elektrofahrzeugen
- Die in Schritt 1.1.10 und Schritt 1.2.4 vorbereiteten Proben werden 15 Minuten lang bei 2.500 x g (4 °C) zentrifugiert, um großzellige Trümmer und verbleibende Blutplättchen zu entfernen.
- Die Überstände vorsichtig in neue und saubere 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen überführen und 30 min bei 16.800 x g (4 °C) zentrifugieren.
Anmerkungen: Die Zentrifugationsgeschwindigkeit kann auf über 10.000 x g eingestellt werden, um EVs12 zu extrahieren. Je höher die Drehzahl der Zentrifuge, desto mehr EVs können gewonnen werden. Da die Geschwindigkeitsbegrenzung der von uns verwendeten Zentrifuge bei 16.800 x g liegt (siehe Materialtabelle), haben wir diese Drehzahl in diesem Protokoll gewählt. - Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets in jedem Röhrchen mit 1 ml PBS. 30 min bei 16.800 x g (4 °C) zentrifugieren.
- Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets in jedem Röhrchen mit 50 μl PBS. Lagern Sie diese Proben bei 4 °C nur für weniger als 24 h oder verwenden Sie sie vorzugsweise sofort für die folgenden Analysen (Schritte 3-5).
ACHTUNG: Eine Lagerung bei -80 °C ist nicht akzeptabel, da dies die Konzentration von EVs verringert und die Partikelgrößen von EVs13 erhöht, was die folgende Analyse von EVs beeinflusst.
3. Morphologische Identifizierung von EVs
- Führen Sie eine NTA-Analyse durch.
- Je nach Menge der EVs (grob nach der Größe der Pellets beurteilt, sind die Partikel des 50-μl-Plasmas das Minimum) werden 5-50 μl Resuspension übertragen (Schritt 2.4), in 10 ml Pufferlösung verdünnt (PBS mit 0,22-μm-Filter filtriert) und mit 1-ml-Mikropipettenspitzen ausreichend gemischt. Verwenden Sie diese letzte Suspension für die Partikelmessung.
- Verwenden Sie eine sterile 1-ml-Spritze, um mindestens 5 ml destilliertes Wasser mit einer moderaten und konstanten Geschwindigkeit zu injizieren, bis die Anzahl der auf der Detektionsschnittstelle angezeigten Partikel weniger als fünf beträgt.
Anmerkungen: Nach der Injektion von 1 ml destilliertem Wasser durch den gesamten Kanal wird die Anzahl der Partikel direkt auf der Detektionsschnittstelle angezeigt. Wenn die Zahl immer noch über fünf liegt, injizieren Sie weiterhin 1 ml destilliertes Wasser, bis die Kriterien erfüllt sind. - Rekonstituieren Sie 1 μl Kalibrierlösung in 1 ml destilliertem Wasser, um eine primäre Lösung zu erzeugen, und nehmen Sie dann 100 μl der primären Lösung auf 25 ml destilliertes Wasser, um eine Standard-Stammlösung (1:250.000) herzustellen. Lagern Sie dieses Arbeitsreagenz 1 Woche lang bei 4 °C.
- Kalibrieren Sie das NTA-Gerät mit der Standard-Stammlösung (Schritt 3.1.3). Injizieren Sie 1-5 ml der funktionierenden Kalibrierlösung mit einer sterilen 1-ml-Spritze, um den Maschinenkanal zu spülen, bis die auf der Detektionsschnittstelle angezeigte Anzahl der Partikel zwischen 50 und 400 (vorzugsweise etwa 300) liegt. Führen Sie das Kalibrierungsprogramm aus.
- Wiederholen Sie Schritt 3.1.2, um den Gerätekanal vor jeder Probenmessung zu spülen.
- Verwenden Sie eine sterile 1-ml-Spritze, um mindestens 2 ml Pufferlösung zu injizieren, um den Maschinenkanal mit konstanter Geschwindigkeit zu spülen, bis die auf der Detektionsschnittstelle angezeigte Anzahl der Partikel weniger als 10 beträgt.
- 1 ml der in Schritt 3.1.1 vorbereiteten EV-Probe wird mit einer moderaten und konstanten Geschwindigkeit injiziert (die empfohlene Geschwindigkeit beträgt 0,5-1 ml/s).
Anmerkungen: Die optimale Partikelkonzentration liegt darin, dass die Anzahl der auf der Detektionsschnittstelle angezeigten Partikel zwischen 50 und 400 liegt, vorzugsweise um die 300. Wenn die Anzahl der Partikel zu hoch ist, wiederholen Sie Schritt 3.1.2, um den Maschinenkanal sofort zu spülen, um ein Zurückhalten der Partikel an der Kanalwand zu vermeiden, und stellen Sie die Konzentration der EV-Probe mit Schritt 3.1.1 ein, und wiederholen Sie dann den Vorgang ab Schritt 3.1.5. - Führen Sie die Partikelanalyse durch und erstellen Sie die Analyseberichte gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
- Wenn es sich um eine kostbare Probe handelt, pumpen Sie die EV-Probe mit der 1-ml-Spritze zurück und sammeln Sie sie in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie Schritt 2.2, um die EVs zu extrahieren.
- Nachdem Sie alle Proben detektiert haben, injizieren Sie mindestens 2 ml Pufferlösung in den Maschinenkanal und injizieren Sie dann mindestens 5 ml destilliertes Wasser, bis die auf der Detektionsschnittstelle angezeigte Anzahl der Partikel weniger als fünf beträgt.
- Verwenden Sie eine sterile 5-ml-Spritze, um mindestens 10 ml Luft mit konstanter Geschwindigkeit zu injizieren (die empfohlene Geschwindigkeit beträgt 1 ml/s), um das Wasser aus dem Kanal zu entfernen.
- Führen Sie eine TEM-Analyse durch.
Anmerkungen: Führen Sie die folgenden Schritte mit neuen EV-Aufhängungen durch. Das mit Formvar-Kohlenstoff beschichtete Elektronenmikroskopgitter hat zwei Seiten, wobei die Arbeitsseite in den mittleren Gittern leuchtet. Das Mindestvolumen des Plasmas zur Extraktion der EVs für das folgende Verfahren beträgt 50 μl.- Die EV-Probe (Schritt 2.4) wird mit einem gleichen Volumen von 4 % Paraformaldehyd (PFA) gemischt. 4 μl der EVs auf einem Gitter deponieren und 15 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
- Geben Sie vier Tropfen PBS (ein Tropfen entspricht 50 μl) auf eine Folie Polyethylenfolie (siehe Materialtabelle). Übertragen Sie die Gitter mit einer sauberen mikroskopisch kleinen Pinzette und waschen Sie die Arbeitsseite des Gitters in PBS von einem Tropfen zum anderen.
- Verwenden Sie Filterpapier, um überschüssiges PBS zu entfernen, das in den Gittern verblieben ist.
- Die Arbeitsseite des Gitters wird 2 Minuten lang in 1%ige Phosphowolframsäure (siehe Materialtabelle) inkubiert und dann Schritt 3.2.2 wiederholt.
ACHTUNG: Da Phosphowolframsäure giftig ist, muss dieses Verfahren im Abzug durchgeführt werden, und überflüssige Phosphowolframsäure muss gezielt recycelt und nicht direkt entsorgt werden. - Legen Sie die Roste mit der Vorderseite nach oben in eine 10 cm große Schüssel, die mit Filterpapier bedeckt ist. Die Gitter können mehrere Jahre bei RT gelagert werden.
- Betrachten Sie die Gitter unter dem Elektronenmikroskop gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
Anmerkungen: Um sicherzustellen, dass die einzelnen Partikel beobachtet werden, muss die Konzentration der EVs angepasst werden und die Suspension muss klar und ohne offensichtliche Trübung sein. Vor dem Abtropfen sollte die Probe gut durchmischt sein. Die repräsentativen TEM- und NTA-Analysen sind in Abbildung 2 dargestellt.
4. Herkunftsanalyse von Elektrofahrzeugen
HINWEIS: Die Identifizierung des zellulären Ursprungs von EVs erfordert die Anwendung von Antikörpern für typische Zellmembranmarker. Das minimale Plasmavolumen für die Extraktion der EVs für das folgende Verfahren beträgt 300 μl. Basierend auf den Lipiddoppelschichtstrukturen von EVs kann ein Membranfarbstoff verwendet werden, um sie zu markieren. Für Blutplasmaproben wird CD18 für Lymphozyten14 zur Repräsentation gewählt. Für Oberkieferknochenproben wird beispielhaft der Osteoklasten-assoziierte Rezeptor (OSCAR) für Osteoklasten15 ausgewählt. Stellen Sie vor dem FC sicher, dass das Durchflusszytometer für die Messung von EVs16 geeignet ist, da sich die untere Größengrenze zwischen verschiedenen Durchflusszytometern stark unterscheidet.
- Resuspendieren Sie die Proben (Schritt 2.4) mit 500 μl PBS und übertragen Sie 50 μl in ein neues und sauberes 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen als Leerkontrolle (Röhrchen A) und weitere 50 μl in ein neues und sauberes 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen als einfaches Färberöhrchen für FITC (Röhrchen B). Geben Sie 0,5 μl Membranfarbstoff in das Primärröhrchen für die Membranfärbung. 5 min bei RT inkubieren.
- Zentrifugieren Sie das Primärröhrchen 30 Minuten lang bei 16.800 x g (4 °C). Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets mit 200 μl PBS.
- Teilen Sie jede 50-μl-Probe in vier 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen auf, um einfache Färberöhrchen für PE (Röhrchen C), Oberflächenmarkerfärbung (Röhrchen D) und reine Sekundärantikörperkontrollen (Röhrchen E) zu erhalten.
- Der primäre Antikörper von OSCAR in Knochen-EV-Proben sowie der CD18-Antikörper in Plasma-EV-Proben (siehe Materialtabelle) werden separat in Röhrchen B (Schritt 4.1) und Röhrchen D (Schritt 4.3) gegeben (verdünnt im Verhältnis 1:100). 1 h bei 4 °C inkubieren.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei 16.800 x g (4 °C). Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Pellets mit 500 μl PBS und zentrifugieren Sie dann erneut 30 Minuten lang bei 16.800 x g (4 °C), um die zusätzlichen Primärantikörper zu entfernen.
- Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets mit 50 μl PBS, gefolgt von der Zugabe von FITC-konjugierten Sekundärantikörpern (siehe Materialtabelle) bzw. (verdünnt im Verhältnis 1:200) (Röhrchen E). Geben Sie die gleichen Sekundärantikörper in Röhrchen B (Schritt 4.1) und Röhrchen D (Schritt 4.3). Alle Röhrchen 1 h bei 4 °C im Dunkeln inkubieren.
HINWEIS: Direkte fluoreszenzkonjugierte Markierungsantikörper können auch verwendet werden, um die FC-Detektion mit geeigneten Isotypkontrollen zu verarbeiten. - Verdünnen Sie jeweils einen Tropfen der 0,2-, 0,5- und 1-μm-Beads-Suspension (siehe Materialtabelle) mit 1 ml PBS und lassen Sie zuerst jede Perlengröße laufen, um sicherzustellen, dass das für EVs gewählte Gate ausgewählt wurde. Legen Sie den Schwellenwert des Durchflusszytometers fest, um nach den Beads und der EV-Population zu suchen, indem Sie eine geeignete Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) verwenden.
- Legen Sie als Endbedingung die Berechnung von 100.000 membrangefärbten Partikeln fest. Analysieren Sie die Probe mit einem Durchflusszytometer gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Die repräsentativen Ergebnisse sind in Abbildung 3 dargestellt.
HINWEIS: NTA-Geräte mit Fluoreszenzkanälen können auch für die Ursprungsanalyse verwendet werden, und die Probenvorbereitung ist die gleiche wie bei FC.
- Legen Sie als Endbedingung die Berechnung von 100.000 membrangefärbten Partikeln fest. Analysieren Sie die Probe mit einem Durchflusszytometer gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Die repräsentativen Ergebnisse sind in Abbildung 3 dargestellt.
5. Analyse des Proteingehalts von EVs
HINWEIS: Die Analyse des Proteingehalts in EVs erfolgt mittels Western Blot. So wurden beispielsweise die Plasma- und Knochen-EVs ausgewählt, um den Stoffwechselstatus der 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (PID) und der Pyruvatkinase M2 (PKM2) zu analysieren. Golgin84 (das Golgi-Organell) wurde als Negativkontrolle verwendet, und Flotillin (Membranprotein), Caveolin (integrales Protein der Caveolae) und β-Aktin (das Zytoskelett)17 wurden als Positivkontrolle in EVs im Vergleich zu Zellproben verwendet. Mitofilin und α-Actinin-4 wurden als große EV-Marker ausgewählt, während CD9 und CD81 als kleine EV-Marker ausgewählt wurden, um die EV-Subpopulationen zu demonstrieren18. Apoa1 wurde als Plasma-Lipopartikel-Markerausgewählt 19. Details zu den jeweiligen Reagenzien finden Sie in der Materialtabelle.
- Die Pellets werden in 50 μl RIPA-Lysepuffer resuspendiert (Schritt 2.4) und 30 Minuten auf Eis inkubiert.
- Quantifizieren Sie die Proteinkonzentrationen aller Proben in der 96-Well-Mikrotiterplatte mit dem BCA-Proteinassay gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
- Verdünnen Sie die 2 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) mit 0,9 % normaler Kochsalzlösung (NS) (mit 0,9 % (w/v) Natriumchlorid) zu 0,5 mg/ml. Die 0,5 mg/ml BSA und 0,9 % NS werden in drei duplizierte Vertiefungen mit bestimmten Volumina gegeben, wie in Tabelle 1 dargestellt.
- Tropfen Sie 2 μl der Proben (Schritt 5.1) und geben Sie 18 μl NS separat in drei duplizierte Vertiefungen.
- Bereiten Sie eine Arbeitslösung vor, indem Sie BCA-Reagenz A mit Reagenz B (50:1 Reagenz A:B) mischen. Geben Sie 200 μl der Arbeitslösung in jede Vertiefung und schütteln Sie sie 30 s lang vorsichtig.
- Die 96-Well-Mikrotiterplatte wird für 20-25 min bei 37 °C inkubiert.
- Messen Sie den OD bei 596 nm mit dem Spektralphotometer (siehe Materialtabelle).
- Exportieren Sie die Daten.
- Zeichnen Sie eine Standardkurve und berechnen Sie die Proteinkonzentration der Proben.
- Den Ergebnissen zufolge werden die Proben mit 0,9 % NS und 5x SDS-PAGE-Ladepuffer (250 mM Tris· HCl, pH 6,8, 10 % SDS, 30 % (v/v) Glycerin, 10 mM DTT, 0,05 % (w/v) Bromphenolblau, siehe Materialtabelle). Die Röhrchen mit Folie fest verschließen und 5 min bei 100 °C erhitzen.
- Laden Sie die Proben und die Proteinleiter in eine Gradientenkonzentration von 4%-20% Hepes-Tris-Gel (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Wählen Sie den Gelprozentsatz entsprechend dem Molekulargewicht der zu untersuchenden Proteine. - Lassen Sie das Gel im Laufpuffer bei 80 V laufen, bis die Proteine eine Linie bilden, und schalten Sie dann für 1 Stunde auf 120 V um, bis sich der Ladefarbstoff am Boden des Gels befindet.
Anmerkungen: Die Laufzeit kann je nach verwendeter Ausrüstung oder Art und Konzentration des Gels variieren. - Übertragen Sie das Gel auf die Polyvinylidenfluorid-Membran (PVDF) (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie es 20 s lang in Methylalkohol. Verwenden Sie ein Nasstransfersystem, um 1 Stunde lang bei 200 mA zu übertragen.
VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen im Transfersystem befinden, und halten Sie die PVDF-Membran feucht.
HINWEIS: Die Übertragungszeit kann je nach Molekulargewicht des Zielproteins variieren. 1 KD benötigt in der Regel 1 min. - Bereiten Sie einen 5%igen BSA-Blockierungspuffer vor, indem Sie 2,5 g BSA (siehe Materialtabelle) in 50 ml Tris-gepuffertem Kochsalzlösung-Tween (TBST) (2 ml Tween in 2 l PBS-Lösung) in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen geben. Rühren, bis sich das Pulver aufgelöst hat. Blockieren Sie die Membranen in diesem Puffer für 2 h bei RT unter Rühren.
- Inkubieren Sie die Membranen mit spezifischen primären Antikörpern, die mit TBST verdünnt sind, in die richtige Konzentration (Mitofilin, 1:1000; α-Actinin-4, 1:1000; CD9, 1:1000; CD81, 1:1000; Apoa1, 1:1000; Golgin84, 1:1000; Flotillin-1, 1:1000; Caveolin-1, 1:1000; PID, 1:1000; PKM2, 1:1000; β-Aktin, 1:3000) über Nacht bei 4 °C.
- Waschen Sie die Membranen im Waschpuffer (2 mL Tween in 2 L PBS-Lösung) viermal (jeweils 15 min) und inkubieren Sie die Membranen mit den geeigneten Sekundärantikörpern bei 1:4000 für 1 h bei RT unter Rühren.
- Waschen Sie die Membranen viermal (jeweils 15 Minuten) im Waschpuffer und bilden Sie die Membranen mit dem Chemilumineszenz-Kit und einem Gel-Bildgebungssystem ab (siehe Materialtabelle).
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Representative Results
Entsprechend dem experimentellen Arbeitsablauf können EVs aus dem peripheren Blut und festen Geweben extrahiert werden (Abbildung 1). Der Oberkieferknochen einer Maus im Alter von 8 Wochen beträgt ca. 0,1 ± 0,05 g, und es können ca. 300 μl Plasma aus der Maus entnommen werden. Nach den Protokollschritten können 0,3 mg bzw. 3 μg EVs gesammelt werden. Wie mittels TEM und NTA analysiert, sind die typischen morphologischen Merkmale von EVs runde becherförmige Membranvesikel mit einem Durchmesser von 50-300 nm (Abbildung 2). FC kann die mit Membranfarbstoffen markierten EVs unter nützlichen Kontrollen nachweisen, und die FC-Analyse zeigt den prozentualen Anteil spezifischer Membranmarker, die auf EVs exprimiert werden, was auf ihre Herkunft aus Elternzellen hindeutet (Abbildung 3). Die Western-Blot-Analyse zeigt die Expression von PID bzw. PKM2 als repräsentativ für den Proteingehalt in Plasma-EVs und Knochen-EVs, was auf den metabolischen Status hinweist (Abbildung 4). Eine negative Expression von Golgin84 in EVs wird auch durch die Anwesenheit von Mitofilin, α-Actinin-4, Flotillin-1, Caveolin-1 und β-Aktin nachgewiesen, das häufig in großen EVs (Mikrovesikeln) angereichert ist, die von der Plasmamembran stammen. Der kleine EV-Marker CD9 kann ebenfalls nachgewiesen werden, während die CD81-Expression gering oder gar nicht vorhanden ist und Apoa1 in den Plasma-EVs nicht vorhanden ist (Abbildung 4).
Abbildung 1: Illustration des Protokolls zur Extraktion von EVs. (A) Die Schritte zur Extraktion von peripheren Blutplasma-EVs mit differentieller Zentrifugation. (B) Die Schritte zur Extraktion von Gewebe-EVs mit differentieller Zentrifugation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Morphologische Identifizierung von EVs . (A) Repräsentatives Transmissionselektronenmikroskop (TEM)-Bild, das die Morphologie von EVs zeigt. Maßstabsbalken = 200 nm. (B) Repräsentative Bilder der Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) und Quantifizierungsergebnisse zeigen die Größenverteilung und Partikelanzahl von EVs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Herkunftsanalyse von EVs . (A) Die verschiedenen Röhrensätze mit unterschiedlichen Kontrollen des Experiments. (B) Die Verteilung der Beads mit einer Größe von 1 μm, 0,5 μm und 0,2 μm, die im Scatted-Diagramm dargestellt ist. (C) Repräsentative Dichtediagramme, die PBS (Röhrchen A), die einfache Färbung von EVs (Röhrchen B), die einfache Färbung von Membranfarbstoff (Röhrchen C) und die Doppelfärbung der EV-Proben (Röhrchen D) zeigen. (D) Durchflusszytometrische Analyse des Prozentsatzes von CD18-positiven EVs in Blutplasma-EVs in Rot im Vergleich zur Sekundärantikörperkontrolle in Schwarz. (E) Durchflusszytometrische Analyse des Prozentsatzes der OSCAR-positiven EVs aus Knochenproben in Rot im Vergleich zur Sekundärantikörperkontrolle in Schwarz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Analyse des Proteingehalts von EVs. (A) Repräsentative Western-Blot von Plasma-EV-Bildern, die das Vorhandensein von 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (PID) und Mitofilin, α-Actinin-4, CD9, Flotillin-1, Caveolin-1 und β-Aktin in Plasma-EVs sowie die negative Expression von CD81, Golgin84 und Apoa1 zeigen. (B) Repräsentative Western Blot von Knochen-EV-Bildern, die das Vorhandensein von Pyruvatkinase M2 (PKM2) und Mitofilin, α-Actinin-4, CD9, CD81, Flotillin-1, Caveolin-1 und β-Aktin in Knochen-EVs und die negative Expression von Golgin84 zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Zahl | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| BSA (μL) | 0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 12 | 16 | 20 |
| NS (μL) | 20 | 19 | 18 | 16 | 12 | 8 | 4 | 0 |
Tabelle 1: Standardarbeitslösung des BCA-Assays. Fügen Sie die 0,5 mg/ml BSA und 0,9 % NS in drei duplizierte Vertiefungen hinzu, wie in der Tabelle gezeigt.
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Discussion
Bei der Untersuchung der Merkmale, des Verbleibs und der Funktion von Elektrofahrzeugen ist es von entscheidender Bedeutung, Elektrofahrzeuge mit hoher Ausbeute und geringer Kontamination zu isolieren. Es gibt verschiedene Methoden zur Extraktion von EVs, wie z. B. Dichtegradientenzentrifugation (DGC), Größenausschlusschromatographie (SEC) und Immunocapture-Assays 4,20. Hier kam eine der am häufigsten verwendeten Methoden, die Differentialzentrifugation, zum Einsatz; Dies hat den Vorteil, dass es nicht zeitaufwändig ist, eine hohe Ausbeute an EVs mit einfacher Isolierung von begrenzten Proben erzeugt und die Methode je nach verwendeter Probenquelle modifiziert werden kann. Für die Analyse der Funktion zirkulierender EVs ist es besser, das Blutplasma zu wählen, das den tatsächlichen Zustand der EVs in vivo besser widerspiegeln kann, als das Serum. Dies liegt daran, dass viele aus Blutplättchen gewonnene EVs während des Prozesses der Gerinnselbildung zur Gewinnung von Serum21 freigesetzt werden, während Thrombozyten durch Zentrifugation entfernt werden, bevor EVs aus dem Plasma22 isoliert werden. Es ist zu beachten, dass die Wahl der Antikoagulation für die Plasma-EV-Isolierung nach wie vor umstritten ist. Der gerinnungshemmende Mechanismus von Heparin ist enger mit der Physiologie verbunden; Die isolierten EVs spiegeln daher möglicherweise den In-vivo-Status besser wider. Es muss erwähnt werden, dass Heparin falsch negative PCR-Reads verursacht und die EV-Aufnahme durch die Zellenblockiert 23,24. Andere gerinnungshemmende Reagenzien wie EDTA oder Natriumcitrat haben ebenfalls ihre Mängel, einschließlich der Biotoxizität, die die chemischen Eigenschaften des Plasmas und der Blutplättchen beeinträchtigen. Unter Berücksichtigung der oben genannten Informationen wird in dieser Studie Heparin ausgewählt. Um die Blutplättchen zu entfernen, wurden die Proben mit einer Geschwindigkeit von 2.500 x g vor 16.800 x g zentrifugiert, wodurch einige große EVs entfernt werden können. In Anbetracht der Tatsache, dass sich viele EVs im viskosen Plasma an Blutplättchen anlagern und entfernt werden, wird außerdem empfohlen, das Plasma mit einem gleichen Volumen PBS zu verdünnen, bevor die Blutplättchen durch Zentrifugation entfernt werden, um die Ausbeute der EVs zu verbessern. Bemerkenswert ist, dass es besser ist, einen Saccharosegradienten mit Ultrazentrifugation zu verwenden, um die EVs zu reinigen, um die löslichen Proteinverunreinigungen, wie z. B. Proteinpolymere21, zu entfernen.
Zu den bisher gebräuchlichen Methoden zur Charakterisierung von EVs gehören unter anderem NTA, TEM, FC16 und WesternBlot 25. Darüber hinaus empfehlen wir, aufgrund der Veränderung der Morphologie und der Anzahl der EVs nach der Wiederherstellung unter verschiedenen Bedingungen13, die Detektion so bald wie möglich nach der Extraktion der EVs zu verarbeiten. Außerdem haben Görgens et al. empfohlen, PBS mit humanem Albumin und Trehalose (PBS-HAT) zu verwenden, um eine bessere Konservierung als reines PBS26 zu gewährleisten. Die morphologische Identifizierung von EVs mittels NTA und TEM muss unmittelbar nach dem Extraktionsverfahren durchgeführt werden, da sich sonst die Form der EVs verändern kann27. Darüber hinaus kann Cryo-EM28 für die erweiterte morphologische Beobachtung von EVs verwendet werden, was den Vorteil hat, dass die Form bei höherer Auflösung besser erhalten bleibt. Neben NTA kann die Konzentration von Partikeln auch durch FC mit Hilfe einer bekannten Menge von Zählkügelchen29 quantifiziert werden, aber diese Methode ist nicht sehr stabil, und die Empfindlichkeit gegenüber kleinen Partikeln ist für FC gering. Aufgrund der Schwarmdetektion kleiner Partikel mit FC30 ist es außerdem besser, NTA für die Größenbestimmung zu verwenden. In ähnlicher Weise kann die Herkunft von EVs auch von NTA mit Fluoreszenzfiltern analysiert werden. Im Vergleich zu FC ist NTA empfindlicher gegenüber kleineren Partikeln und hat den potenziellen Vorteil, dass die Probe für andere Experimente recycelt werden kann. Ein Vorteil der Verwendung von FC besteht darin, dass die spezifischen Subtypen von EVs mit Fluorochrom-konjugierten Membranantikörpern angereichert werden können28. Auch die Funktion spezifischer Oberflächenantigene kann durch Loss-of-Function-Experimente, wie z.B. mit neutralisierenden Antikörpern, untersucht werden28. Alternativ kann 1% Triton X-100 verwendet werden, um das Lipid Raft der EVs-Membran zu zerstören, also als Kontrolle zur Detektion von Membransignalen31. Darüber hinaus können Forscher die spezifischen Membraneigenschaften nutzen, um zielgerichtete Wirkstoffträger herzustellen32.
Western Blot wird häufig zur Analyse des Proteingehalts in EVs verwendet. Mehrere Marker wie Mitofilin, Caveolin und α-Actinin-418 wurden in neueren Studien als Kandidaten zur Identifizierung großer EVs empfohlen. CD9 ist in kleinen EVs eher angereichert als in großen EVs, und CD81, CD63 und Syntenin-1 sind in kleinen EVs reichlich vorhanden18. Was die Ergebnisse des Western-Blots betrifft, so sind Marker wie Mitofilin und CD9 bei verschiedenen Tierbedingungen unterschiedlich. Es ist davon auszugehen, dass es sich bei den isolierten EVs um eine gemischte Population handelt, in der große EVs eine große Subpopulation darstellen. Um die Reinheit von EVs zu verifizieren, wird vorgeschlagen, den Nachweis von Organellen-/Kernproteinen, wie z.B. Lamin B oder Golgin84, als Negativkontrolle hinzuzufügen. Was die Plasma-EVs betrifft, so ist Apoa1, das Lipopartikel repräsentiert, in den gesammelten EVs nicht angereichert. Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass es schwierig ist, die Proteine auf der Oberfläche von denen innerhalb des Vesikels zu unterscheiden. Daher kann der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) als ergänzende Experimente für die Membranproteinanalyse eingesetzt werden. Darüber hinaus können Forscher mit der Entwicklung der Hochdurchsatz-Sequenzierung die Vorteile des Proteom-Mappings33 nutzen, um die Proteinzusammensetzung von EVs zu analysieren, wobei die Zielproteine auch durch Western Blot verifiziert werden müssen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie ein praktikables Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung von Kreislauf- und Gewebe-EVs bietet, einschließlich einer Analyse ihrer Zellquellen und Proteininhalte, was dazu beiträgt, eine Grundlage für weitere funktionelle Experimente zu schaffen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (32000974, 81870796, 82170988 und 81930025) und der China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 und BX20190380) unterstützt. Wir sind dankbar für die Unterstützung des National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | Biosharp | 143174 | Transmission electron microscope |
| Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody | Yeason | 34306ES60 | Flow cytometry |
| Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | Flow cytometry |
| Anti-CD18 antibody | Abcam | ab131044 | Flow cytometry |
| Anti-CD81 antibody | Abcam | ab109201 | Western blot |
| anti-CD9 antibody | Huabio | ET1601-9 | Western blot |
| Anti-Mitofilin antibody | Abcam | ab110329 | Western blot |
| APOA1 Rabbit pAb | Abclone | A14211 | Western blot |
| BCA protein assay kit | TIANGEN | PA115 | Western blot |
| BLUeye Prestained Protein Ladder | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
| Bovine serum albumin | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
| Caveolin-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
| CellMask Orange plasma membrane stain | Invitrogen | C10045 | Flow cytometry |
| Chemiluminescence | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
| Curved operating scissor | JZ Surgical Instrument | J21040 | EV isolation |
| Electronic balance | Zhi Ke | ZK-DST | EV isolation |
| Epoch spectrophotometer | BioTek | N/A | Western blot |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 3810X | EV isolation |
| Flotillin-1 antibody | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
| Gel imaging system | Tanon | 4600 | Western blot |
| Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
| Grids - Formvar/Carbon Coated - Copper 200 mesh | Polysciences | 24915 | Transmission electron microscope |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | EV isolation |
| Liberase Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV isolation |
| Microscopic tweezer | JZ Surgical Instrument | JD1020 | EV isolation |
| NovoCyte flow cytometer | ACEA | N/A | Flow cytometry |
| Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells | Epizyme | LK206 | Western blot |
| OSCAR(D-19) antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | Flow cytometry |
| PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anesthetization |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
| Phosphotungstic acid | RHAWN | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| PKM2(d78a4) xp rabbit mab | Cell Signaling | 4053t | Western blot |
| Polyethylene (PE) film | Xiang yi | 200150055 | Transmission electron microscope |
| Polyvinylidene fluoride membranes | Roche | 3010040001 | Western blot |
| Protease inhibitors | Roche | 4693132001 | Western blot |
| Recombinant anti-PGD antibody | Abcam | ab129199 | Western blot |
| RIPA lysis buffer | Beyotime | P0013 | Western blot |
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
| Size beads | Invitrogen | F13839 | Flow cytometry |
| Tabletop High-Speed Micro Centrifuges | Hitachi | CT15E | EV isolation |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650 | Transmission electron microscope |
| Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
| Vortex Mixer Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV isolation |
| ZetaView BASIC NTA - Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 | Particle Metrix | N/A | Nanoparticle tracking analysis |
| α-Actinin-4 Rabbit mAb | Abclone | A3379 | Western blot |
| β-actin | Cwbio | CW0096M | Western blot |
References
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