Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

יישום ספקטרוסקופיית ראמן קוהרנטית נגד סטוקס (CARS) להדמיית מיאלינציה בפרוסות מוח

Published: July 22, 2022 doi: 10.3791/64013
Automatic Translation
1, 2, 3, *3, *2
1Department of Integrative Biology, Oklahoma State University, 2Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz, 3Advanced Light Microscopy Core, University of Colorado Anschutz
* These authors contributed equally

Summary

הדמיה של מיאלינציה היא מטרה חשובה עבור חוקרים רבים החוקרים את מערכת העצבים. CARS היא טכניקה התואמת את האימונופלואורסצנציה שיכולה לדמות באופן טבעי שומנים בתוך רקמות כגון המוח המאיר מבנים מיוחדים כגון מיאלין.

Abstract

ספקטרוסקופיית ראמן קוהרנטית נגד סטוקס (CARS) היא טכניקה המשמשת באופן קלאסי על ידי כימאים ופיזיקאים כדי לייצר אות קוהרנטי של תנודות חתימה של מולקולות. עם זאת, חתימות רטט אלה אופייניות גם למולקולות בתוך רקמה אנטומית כמו המוח, מה שהופך אותו יותר ויותר שימושי וישים עבור יישומים במדעי המוח. לדוגמה, CARS יכולה למדוד שומנים על ידי קשרים כימיים מרגשים במיוחד בתוך מולקולות אלה, מה שמאפשר כימות של היבטים שונים של רקמות, כגון מיאלין המעורב בהעברה עצבית. בנוסף, בהשוואה לטכניקות אחרות המשמשות בדרך כלל לכימות מיאלין, ניתן גם להגדיר את CARS כך שיהיה תואם לטכניקות אימונופלואורסצנטיות, מה שמאפשר תיוג משותף עם סמנים אחרים כגון תעלות נתרן או רכיבים אחרים של העברה סינפטית. שינויים במיאלינציה הם מנגנון חשוב מטבעו במחלות דה-מיאלינציה כגון טרשת נפוצה או מצבים נוירולוגיים אחרים כגון תסמונת X שביר או הפרעות בספקטרום האוטיזם הוא תחום מחקר מתפתח. לסיכום, ניתן להשתמש ב-CARS בדרכים חדשניות כדי לענות על שאלות בוערות במדעי המוח ולספק ראיות למנגנונים בסיסיים הקשורים למצבים נוירולוגיים רבים ושונים.

Introduction

פוטנציאל פעולה הוא יחידת המידע הבסיסית במוח, ופוטנציאל פעולה המתפשט באמצעות אקסונים מהווה נדבך אחד של עיבוד מידע 1,2,3. תאי עצב בדרך כלל מקבלים קלטים ממספר תאי עצב אחרים ומשלבים את הקלטים האלה בחלון זמן צר נתון 4,5. לכן, מנגנוני הפעולה של התפשטות פוטנציאלית באקסונים קיבלו כמות משמעותית של תשומת לב מהחוקרים.

בעת התפשטות דרך אקסון, פוטנציאל פעולה מתחדש שוב ושוב לאורך האקסון כדי להבטיח התפשטות אמינה6. ברוב תאי העצב של בעלי חוליות לסתות (gnathostomes) אקסונים מוקפים בנדן של מיאלין, שהוא חומר עשיר בשומנים המיוצר על ידי אוליגודנדרוציטים סמוכים או תאי שוואן, שהם סוגים של תאי גליה (שנסקרוב-7,8). מעטפת המיאלין הזו מבודדת חשמלית את האקסון, מפחיתה את קיבוליותו ומאפשרת התפשטות פוטנציאלית של פעולה ביעילות, במהירות ובצריכת אנרגיה נמוכה יותר. המיאלין אינו מכסה את האקסון באופן אחיד, אך הוא עוטף את האקסון במקטעים שיש ביניהם רווחים קצרים, הנקראים הצמתים של Ranvier (נסקרב-9,10). הן עובי המיאלינציה, השולט ברמת הבידוד החשמלי של אקסון, והן הריווח של הצמתים של Ranvier, השולטים בתדירות שבה פוטנציאל הפעולה מתחדש לאורך אקסון, משפיעים על מהירות התפשטות פוטנציאל הפעולה (נבדק ב-11).

ישנה ספרות גדולה המציעה כי עובי המיאלינציה משפיע על מהירות ההתפשטות הפוטנציאלית של הפעולה באקסונים12,13,14. יתר על כן, שינויים במיאלינציה של האקסון יכולים לגרום למספר גירעונות CNS 15,16,17,18,19,20,21. לכן אין זה מפתיע שהתמקדות במאמצי מחקר רבים כרוכה במדידה ואפיון של אקסון מיאלינציה. מדידות של עובי המיאלין נעשו לרוב באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים, טכניקה הדורשת כמות משמעותית של הכנת רקמות ומאתגרת לשימוש בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה. עם זאת, יש גם טכניקה מהירה ופשוטה יותר למדידת מיאלינציה של אקסון המבוססת על ספקטרוסקופיית ראמן קוהרנטית נגד סטוקס (CARS). ניתן לכוונן לייזר CARS לתדרים שונים וכאשר מכוונים אותו לתדרים המתאימים לעורר שומנים, ניתן לדמות את המיאלין ללא צורך בתוויות נוספות22. ניתן לשלב את הדמיית השומנים עם אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית כך שניתן לדמות שומנים יחד עם מספר תעלות פלואורסצנטיות23. הדמיה של מיאלינציה עם CARS מהירה משמעותית ממיקרוסקופיית אלקטרונים ויש לה רזולוציה שהיא, אם כי נמוכה יותר מ- EM, מספיקה כדי לזהות אפילו הבדלים קטנים במיאלינציה באותו סוג של אקסונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים עמדו בכל החוקים החלים, הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות, ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קולורדו אנשוץ.

1. בעלי חיים

  1. השתמש בעכברי C57BL/6J (מלאי #000664) (Mus musculus ) שהתקבלו ממעבדת ג'קסון או גרבילים מונגולים (Meriones unguiculatus) שהתקבלו במקור מנהר צ'ארלס.

2. הכנת רקמות

  1. עבור זלוף שריר הלב, מנת יתר של מיני מכרסמים בעלי עניין עם פנטוברביטל (120 מ"ג/ק"ג משקל גוף) וטרנס-קרדית מחלחלים אליהם עם תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.76 mM KH 2 PO 4, 10 mM Na2HPO 4)ואחריה4% paraformaldehyde (PFA)24.
    1. באופן ספציפי, לפתוח את הבטן ואת כלוב הצלעות באמצעות מספריים להחזיק את כלוב הצלעות במקום עם מלקחיים hemostatic קלי כדי לחשוף את הלב.
    2. יש להחדיר מחט 23 GA המחוברת למשאבת זלוף לחדר השמאלי ולחתוך במהירות את האטריום הימני באמצעות מספריים עדינים.
    3. יש לתת PBS דרך משאבת הזלוף והמחט בלב למשך 10 דקות כדי לנקות את המוח והגוף מדם.
    4. החלף את משאבת הזלוף ל- 4% PFA למשך 10 דקות ובדוק את קשיחות הגפיים והזנב כדי לאשר זלוף מוצלח.
  2. לאחר הזילוף, ערפו את בעלי החיים והסירו את מוחם מהגולגולת. השאירו את המוחות למשך הלילה ב-4% PFA לפני המעבר ל-PBS. מטמיעים את גזעי המוח ב-4% אגרוז (ב-PBS) ופורסים באופן קורונלי באמצעות ויברטום בעובי של 200 מיקרומטר.

3. מכתים

  1. חלקים צפים נטולי כתמים עבור Nissl, כדי לדמיין גופי תאים (1:100), במדיית נוגדנים (מדיה AB: 0.1 M חיץ פוספט (PB: 50 mM KH 2 PO 4,150 mM Na2HPO4), 150 mM NaCl, 3 mM Triton-X, 1% אלבומין בסרום בקר (BSA)) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר מעבדה סטנדרטי25.
    1. יש להגן על חלקים מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום ו/או כיסוי. אורכי גל של 550 ננומטר ומטה תואמים להדמיית CARS (איור 1).
      הערה: בעוד שאיננו מצפים של-Triton-X או לריאגנטים אחרים תהיה השפעה על הדמיית שומנים ב-CAS, ייתכן שיהיה צורך בבקרות נוספות עם מדיית נוגדנים ספציפית.
  2. נקודת השהיה: אחסן חלקים צפים חופשיים (כאשר הם מוגנים מפני אור) ב- PBS עד להדמיה. לאחר הניתוח, התמונה מקטעי מוח תוך שבועיים.

Figure 1
איור 1: ניתן לשלב הדמיית CARS עם הדמיה אימונופלואורסצנטית. הגרפים מראים כי הדמיית CARS מתרחשת בספקטרום אות אדום 660/640 ננומטר26. אורך גל זה רחוק מספיק מתחום הירוק, הכחול או ה-UV, מה שמאפשר שילוב של אות ה-CARS עם אימונופלואורסצנציה בטווחים אלה. באופן ספציפי, הגרף מציין גם את העירור והפליטה עבור ניסל המתויג עם פלואורופור כחול, אשר שולב עם CARS במהלך איסוף התוצאות הייצוגיות עבור פרסום זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

4. הדמיה

הערה: מערך הלייזר של CARS מכיל לייזר סיבים המספק את השעון של 80 MHz, ולייזר OPO (מתנד פרמטרי אופטי) עם טווח כוונון של 770-990 ננומטר כאשר קרן סטוקס קבועה ב- 1031 ננומטר, הדרושים לאיסוף אות ה- CARS. יש צמצם אחד לשתי הקורות.

  1. לפני הבאת דגימות למיקרוסקופ, הפעל וחמם את לייזר CARS למשך שעה אחת לפחות, יישר את לייזר ה- CARS, ואת Koehler את אופטיקת המעבה ואת הסרעפת של המיקרוסקופ להדמיית CARS קדימה.
    הערה: שלב זה הוא קריטי לתפקוד תקין של מיקרוסקופיה של CARS.
    1. ליישור מרחבי של שתי קרני הלייזר (משאבה וסטוקים), גש לשני קובצי ה-PSD הפנימיים (גלאים רגישים למיקום) באמצעות ממשק המשתמש הגרפי של לייזר CARS.
    2. השג יישור זמני באמצעות פונקציית ההשהיה בממשק המשתמש הגרפי של לייזר CARS, שיכולה לעזור לחפוף את הפולסים של שני הלייזרים (משאבה וסטוקס) בעלי פיזור שונה בגלל אורכי הגל השונים שלהם. לכן, הן החפיפה הטמפורלית והן החפיפה המרחבית של קורות המשאבה והסטוקים נעשות עם קלט המשתמש דרך ממשק המשתמש הגרפי.
    3. כוונן את הפריסקופ החיצוני (שתי המראות האחרונות של המערך) כדי למרכז את שני הלייזרים החופפים מרחבית על מראות ראש הסריקה של המיקרוסקופ.
    4. לזיהוי הטוב ביותר של CARS ללא עיבוי, ודא שהמעבה הוא Koehler-ed (כלומר המעבה ממורכז וממוקד בסרעפת כדי להשיג תאורה אחידה)
  2. עבור דימות קונפוקלי אימונופלואורסצנטי והדמיית CARS, התאימו את לייזר ה-CARS, עם גלאים קדמיים ואפי-CARS שאינם מרוסנים (NDDs), על-ידי שילוב מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בלייזרים גלויים להדמיית פלואורסצנציה (איור 2).
  3. הניחו חלקים בצלחת תרבית עם כיסוי (למיקרוסקופיה הפוכה), PBS כדי למנוע את התייבשות הרקמה, ומשקל זכוכית כדי לשמור על הרקמה ליד הכיסוי.
  4. צלם z-stacks או תמונות בודדות עם מטרת מים מתוקנת אינפרא-אדום 60X, 1.2 NA, המשמשת לאיסוף אות CARS בכיוון האפי ודרך מעבה 0.55 NA בכיוון קדימה להדמיית אזורים במוח כגון הגרעין המדיאלי של גוף הטרפז (MNTB).
    1. צלם את תמונות ה-CARS במשאבה/בדיקה של כ-600 mW ובסטוקס של 300 mW, באמצעות ממשק המשתמש הגרפי של לייזר CARS. ערכי הספק לייזר אלה נמדדים באופן פנימי על ידי המערכת. כוחות שני הלייזרים במיקום הדגימה הם פחות מ-25 mW ובטוחים לדגימת הרקמה.
    2. חופפים את המשאבה ואת קורות סטוקס באופן מרחבי וזמני. כוונן את ה-OPO ל-797.2 ננומטר. זה מניב אורך גל של CARS של 650 ננומטר. בגלל רמת האנרגיה הגבוהה יותר, החזרה המתקבלת למצב הקרקע היא אנטי-סטוקס (כחול מועבר) לעירור.
    3. לכוד את אות ה-CARS בגלאים אפיים או קדמיים שאינם משומרים באמצעות מסנני פס (640-680 ננומטר) ולאחר מכן זיהוי רציף של תווית האימונופלואורסצנציה (במקרה זה מסומן באופן פלואורסצנטי Nissl).
      הערה: סמן הסומא העצבי של Nissl אינו נתפס במסנן CARS 640-680 ננומטר, מה שמאפשר שילוב של פלואורסצנציה והדמיית CARS בתמונות המוצגות להלן.
    4. ה-CARS והפלואורסצנציה אינן חולקות PMTs. השתמש בהגדרות אלה לאות שומנים אופטימלי כדי לדמות באופן סלקטיבי את המיאלינציה באזור המוח.
      התראה: הגן על המשתמש מפני קרן הלייזר
  5. שמור את התמונות כקבצי .oib, שאותם ניתן לייבא לתוכנית ניתוח תמונות לכימות נוסף (איור 3).

Figure 2
איור 2: דיאגרמת מכשירים של CARS המציגה לייזרים של CARS (חיצים אדומים) וזיהוי קדימה שאינם מסולפים (NDD) המשולבים בקונפוקל סריקת לייזר. ב-NDD קדימה אנו רוכשים CARS עבור אג"ח C-H (חיצים אדומים כהים) ו-SHG (ג'נרטואין הרמוני שני) ב-515 ננומטר (חץ כתום). באפי NDD, אנו רוכשים CARS עבור קשרי C-H (חיצים אדומים כהים) ו-2PE (פליטת שני פוטונים) אוטופלואורסצנטיות (חץ כחול בהיר). ברצף, ניתן לרכוש תמונות קונפוקליות פלואורסצנטיות (חיצים ירוקים ללייזר גלוי, חצים כחולים לזיהוי קונפוקלי). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: מכוניות יכולות להאיר מיאלין (מגנטה) ברקמת המוח (גזע המוח) תוך הדמיה של סימוני ניסל (ציאן) או פלואורסצנטיים. שני הפאנלים מראים תוצאות מייצגות מגרביל מונגולי (תמונה בודדת M. unguiculatus, איור 3A,C,E) ועכבר (z-stack max projection M. musculus, איור 2B,D,F), מה שמצביע על כך שניתן להשתמש בטכניקה זו בין מינים שונים. איור 3A,B המציג את Nissl בציאן, C,D מראים את אות ה-CARS במגנטה, E,F משלבים את אותות ניסל ו-CARS עם כל פאנל עבור גרביל או עכבר, בהתאמה. שתי קבוצות התמונות מציגות מקטע של הגרעין המדיאלי של גוף הטרפז (MNTB) בגזע המוח. נוירונים ב-MNTB מקבלים קלטים מאקסונים בעלי מיאלינציה כבדה, המסתיימים בקליקס של הולד, סוג של סינפסה ענקית27. סרגל קנה המידה הוא 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אחד היתרונות הגדולים ביותר של מיקרוסקופיית CARS על פני טכניקות אחרות הוא התאימות עם הדמיה פלואורסצנטית23. איור 1 מראה את ספקטרום ה-CARS בהשוואה ל-Nissl המתויג עם סמן אימונופלואורסצנטי המציג חפיפה מועטה/ללא חפיפה בספקטרה. איור 2 ממחיש את מערך הלייזר עבור מכוניות בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית. איור 3 מדגים שתי תמונות מייצגות, אחת כערימה בודדת ואחת כהקרנה מקסימלית של z-stack מגרביל ועכבר שניתן לקבל באמצעות הדמיית CARS המציגה את שני גופי התאים (ציאן) ואת אות המיאלין (מגנטה).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

גוף הולך וגדל של ספרות מדגיש את תפקידו של המיאלין בתפקוד המוח 13,16,21,28. יתר על כן, אנו יודעים כי עובי המיאלינציה ודפוס המיאלינציה יכולים להשתנות במספר מצבים נוירולוגיים כגון טרשת נפוצה (נבדק ב -29), הזדקנות (נבדק ב -30), אוטיזם20,31, ורבים אחרים. לכן אין זה מפתיע שיותר ויותר חוקרים צריכים להעריך את המיאלינציה ברקמות מוח ובמודלים של בעלי חיים, בכמה מצבים רפואיים ובמספר גדל והולך של מצבי ניסוי. שיטות מסורתיות לדימוי מיאלינציה ברקמת המוח כוללות תיוג נוגדנים ואחריו מיקרוסקופיית אור, ומיקרוסקופיית אלקטרונים (EM). שתי הטכניקות גוזלות זמן רב ודורשות פרוטוקולי הכנת רקמות רב-שלביים, הקשורים לשגיאות אפשריות ולשינויים בהרכב הרקמות. הדגמנו שיטה חלופית שיכולה להניב תוצאות דומות הרבה יותר מהר בזכות היכולת לדמות מיאלין הרבה יותר מהר, ושניתן לשלב אותה עם מיקרוסקופיית אור פלואורסצנטית נוספת. חשוב לציין כי ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לדמות שומנים ברקמת המוח ללא צורך בסמנים או תוויות נוספות. טכניקה זו לא רק מאפשרת הדמיה של המיאלין לאורך אקסונים שלמים, אלא היא מאפשרת הדמיה של תוצרי פירוק מיאלין כגון פלאקים או טיפות נוזליות32, אשר הוכחו, למשל, בטרשת נפוצה33.

התדירות שאליה כוון לייזר ה-CARS התאימה להטות את התמונה בכבדות לטובת שומנים, וכתוצאה מכך תמונות באיכות גבוהה של מיאלינציה, שכן המיאלין הוא ללא ספק החומר העשיר ביותר בשומנים במוח. העיקרון של טכניקה זו הוא כי לייזר CARS, אשר ניתן לכוון לתדרים שונים, הוא מכוון 792.2 ננומטר, שהוא תדר מתאים לעורר CH2 אג"ח. אלה נמצאים בשפע בליפידים, המכילים שרשראות ארוכות של קבוצות CH2 המקושרות על ידי קשרי פחמן-פחמן עם קבוצת חומצה קרבוקסילית סופנית אחת בסוף. ליפידים מרגשים עם תדר זה יצרו אות שניתן היה לדמות באמצעות טכנולוגיית זיהוי סטנדרטית של מיקרוסקופ קונפוקלי. איכות התמונות המתקבלות תומכת בניתוחים כמותיים שיכולים להיעשות על ידי צופה אנושי או אלגוריתמים אוטומטיים34. עם זאת, שיטה זו אינה מתייגת באופן בלעדי את המיאלין מכיוון שקשרי CH2 אינם בלעדיים למיאלין, ולכן CARS הוא פחות ספציפי מאשר נוגדן יהיה. כתוצאה מכך, התמונות מציגות תווית כלשהי, שאינה קשורה למיאלין. חשוב לציין שתווית רקע זו אינה פוגעת באיכות המדידות או ביכולת הניתוחים הכמותיים.

הרזולוציה של הדמיית CARS מוגבלת עקיפה ודומה למיקרוסקופיה של שני פוטונים (~250 ננומטר) ולכן נמוכה מזו של EM. לכן, חוקרים שמטרתם להעריך הבדלים קטנים מאוד בעובי המיאלינציה כפי שהיא מתרחשת, למשל, במצבים רפואיים מסוימים, צריכים להיות מודעים למגבלה זו. בקרות EM נוספות במדגם קטן יכולות לאשר שהרזולוציה מספיקה למטרת המחקר שלהם.

אחד היתרונות הגדולים של CARS להדמיית מיאלין, מלבד המהירות והקלות, הוא היכולת לשלב את הדמיית השומנים ללא תוויות עם מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית. בהתאם למיקרוסקופ המשמש ל-CARS, ניתן לדמות שתיים או אפילו שלוש תעלות נוספות כך שניתן לשלב הדמיית מיאלין עם תיוג נוגדנים, כתם ניסל, קווי עכבר מהונדסים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים, או דומה. מגבלות אפשריות בשימוש בפלואורופור באורך גל ארוך יותר נובעות בעיקר מכך שאות ה-CARS נצפה דרך מסנני פס של 640-680 ננומטר שיכולים לתפוס את הפליטה של פלואורופורים ירוקים ו/או אדומים. עם זאת, ללייזר פיקו-שניות המשמש לעירור CARS יש אנרגיית שיא של פולס של ~10 פחות מלייזר פמטו-שניות סטנדרטי המשמש לעירור של שני פוטונים, המתורגם ל~100 פחות פלואורסצנציה. יתר על כן, לייזר פיקו-שניות פולס של 797.2 ננומטר המשמש לעירור CARS רחוק מבחינה ספקטרלית משיא בליעת החתך הדו-פוטוני של הפלואורופורים הנראים לעין. לכן, לייזר פיקו-שניות CARS אינו יעיל מאוד לעירור דו-פוטוני של פלואורופורים נראים לעין, מה שהופך את האות הפלואורסצנטי זניח לחצייה לזיהוי CARS. עם זאת, יש לבדוק זאת על ידי הדמיה של דגימת בקרה שלילית שאין לה תוויות פלואורסצנטיות בהשוואה לדגימה עם סמנים פלואורסצנטיים.

לסיכום, הדמיית CARS היא טכניקה מתאימה להדמיית מיאלין ברקמת המוח. בעוד שהרזולוציה דומה למיקרוסקופיית אור סטנדרטית ולכן נמוכה יותר מ- EM, המהירות וקלות השימוש הופכות טכניקה זו לחלופה אטרקטיבית לשיטות הקיימות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

Acknowledgments

נתמך על ידי NIH R01 DC 17924, R01 DC 18401 (קלוג), ו- NIH 1R15HD105231-01, T32DC012280 ו- FRAXA (מק'קולה). הדמיית CARS בוצעה בחלק הליבה של מיקרוסקופיית האור המתקדמת של המרכז לנוירוטכנולוגיה בקמפוס הרפואי של אוניברסיטת קולורדו אנשוץ, הנתמך בחלקו על ידי NIH P30 NS048154 ו-NIH P30 DK116073.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetic:
1 mL disposable syringe with needle 27 GA x 0.5" Exel int 260040
Fatal + Vortech
Surgery:
Spring Scissors - 8mm Cutting Edge Fine Science Tools 15024-10
Standard tweezers Fine Science Tools 11027-12
Perfusion:
4% Paraformaldehyde Fisher Chemical SF994 (CS)
Fine Scissors - Sharp Fine Science Tools 14063-11
Kelly hemostats Fine Science Tools 13019-14
Millipore H2O
Needle tip, 23 GA x 1" BD precision glide 305193
Phosphate buffered saline (PBS):
Potassium chloride Sigma P9333
Potassium phosphate monobase Sigma P5655
pump with variable flow or equivalent
Sodium chloride Fisher Chemical s271-1
Sodiumphosphate dibasic Sigma S7907
Dissection:
50 mL vial with 4% PFA
Bochem Chemical Spoon 180mm Bochem 230331000
Fine Scissors - Sharp Fine Science Tools 14063-11
Noyes Spring Scissors Fine Science Tools 15011-12
Pair of fine (Graefe) tweezers Fine Science Tools 11050-10
Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10"
Standard tweezers Fine Science Tools 11027-12
Surgical Scissors - Blunt Fine Science Tools 14000-20
Slicing:
Agar, plant RPI 9002-18-0
Vibratome Leica VT1000s
well plate Alkali Sci. TPN1048-NT
Staining:
AB Media: 1n 1,000 mL of Millipore H2O
Phosphate buffered (PB):
Potassium Phosphate Monobase Sigma P5655
Sodium Phosohate Dibasic Sigma S7907
BSA (Bovine serum albumin) Sigma life science A2153-100g
Sodium Chloride Fisher Chemical s271-1
Triton X-100 Sigma - Aldrich x100-500ml
Nissl 435/455 Invitrogen N21479
CARS:
APE picoemerald laser Angewandte Physik & Elektronik GmbH
bandpass filter (420-520 nm) Chroma Technology HQ470/100m-2P
bandpass filter (500-530 nm) Chroma Technology HQ515/30m-2P
bandpass filters (640-680 nm) Chroma Technology HQ660/40m-2P
Confocal microscope Olympus FV1000
Cut Transfer pipet Fisher 13-711-7M
dichroic longpass 565 nm Chroma Technology 565dcxr
dichroic longpass 585 nm Chroma Technology 585dcxr
dichroic shortpass 750 nm Chroma Technology T750spxrxt
glass bottom culture dish MatTek P35G-0-10-C
glass weight (10 mm x 10 mm boro rod) Allen Scientific Glass Inc
multiphoton shortpass emission filter 680 nm Chroma Technology ET680sp-2p8
PBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cole, K., Curtis, H. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
  2. Cole, K. S., Curtis, H. J. Membrane potential of the squid giant axon during current flow. Journal of General Physiology. 24 (4), 551-563 (1941).
  3. Alcami, P., El Hady, A. Axonal computations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 413 (2019).
  4. Neumann, E., Nachmansohn, D. Nerve excitability-Toward an integrating concept. Aharon Katzir Memorial Volume. , 99-166 (1975).
  5. Waxman, S. G. Integrative properties and design principles of axons. International Review of Neurobiology. 18, 1-40 (1975).
  6. Fitzhugh, R. Computation of impulse initiation and saltatory conduction in a myelinated nerve fiber. Biophysical Journal. 2 (1), 11-21 (1962).
  7. Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 275-281 (2006).
  8. Salzer, J. L., Zalc, B. Myelination. Current Biology. 26 (20), 971-975 (2016).
  9. Boullerne, A. I. The history of myelin. Experimental Neurology. 283, 431-445 (2016).
  10. Kuhn, S., Gritti, L., Crooks, D., Dombrowski, Y. Oligodendrocytes in development, myelin generation and beyond. Cells. 8 (11), 1424 (2019).
  11. Saab, A. S., Nave, K. -A. Myelin dynamics: protecting and shaping neuronal functions. Current Opinion in Neurobiology. 47, 104-112 (2017).
  12. Chomiak, T., Hu, B. What is the optimal value of the g-Ratio for myelinated fibers in the rat CNS? A theoretical approach. PLOS ONE. 4 (11), 7754 (2009).
  13. Ford, M. C., et al. Tuning of Ranvier node and internode properties in myelinated axons to adjust action potential timing. Nature Communications. 6, 8073 (2015).
  14. Stange-Marten, A., et al. Input timing for spatial processing is precisely tuned via constant synaptic delays and myelination patterns in the auditory brainstem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), 4851-4858 (2017).
  15. Bu, J., Banki, A., Wu, Q., Nishiyama, A. Increased NG2+ glial cell proliferation and oligodendrocyte generation in the hypomyelinating mutant shiverer. Glia. 48 (1), 51-63 (2004).
  16. Pacey, L. K. K., et al. Delayed myelination in a mouse model of fragile X syndrome. Human Molecular Genetics. 22 (19), 3920-3930 (2013).
  17. Green, A. J., et al. Clemastine fumarate as a remyelinating therapy for multiple sclerosis (ReBUILD): a randomised, controlled, double-blind, crossover trial. Lancet. 390 (10111), London, England. 2481-2489 (2017).
  18. Jeon, S. J., Ryu, J. H., Bahn, G. H. Altered translational control of fragile X mental retardation protein on myelin proteins in neuropsychiatric disorders. Biomolecules & Therapeutics. 25 (3), 231-238 (2017).
  19. Barak, B., et al. Neuronal deletion of Gtf2i, associated with Williams syndrome, causes behavioral and myelin alterations rescuable by a remyelinating drug. Nature Neuroscience. 22 (5), 700-708 (2019).
  20. Phan, B. N., et al. A myelin-related transcriptomic profile is shared by Pitt-Hopkins syndrome models and human autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 23 (3), 375-385 (2020).
  21. Lucas, A., Poleg, S., Klug, A., McCullagh, E. A. Myelination deficits in the auditory brainstem of a mouse model of fragile X syndrome. Frontiers in Neuroscience. 15, 1536 (2021).
  22. Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. -X. Coherent anti-stokes raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal ttissues. Biophysical Journal. 89 (1), 581-591 (2005).
  23. Kim, S. -H., et al. Multiplex coherent anti-stokes raman spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids. Circulation Research. 106 (8), 1332-1341 (2010).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  25. Tu, L., et al. Free-floating Immunostaining of Mouse Brains. Journal of Visualized Experiments. (176), e62876 (2021).
  26. Fluorescence SpectraViewer. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer (2022).
  27. Held, H. Die centrale gehörleitung. Arch Anat Physiol Anat Abt. 17, 201-248 (1893).
  28. Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
  29. Gruchot, J., et al. The molecular basis for remyelination failure in multiple sclerosis. Cells. 8 (8), 825 (2019).
  30. Rivera, A. D., et al. Epidermal growth factor pathway in the age-related decline of oligodendrocyte regeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 838007 (2022).
  31. Kútna, V., O'Leary, V. B., Hoschl, C., Ovsepian, S. V. Cerebellar demyelination and neurodegeneration associated with mTORC1 hyperactivity may contribute to the developmental onset of autism-like neurobehavioral phenotype in a rat model. Autism Research: Official Journal of the International Society for Autism Research. 15 (5), 791-805 (2022).
  32. Ozsvár, A., et al. Quantitative analysis of lipid debris accumulation caused by cuprizone induced myelin degradation in different CNS areas. Brain Research Bulletin. 137, 277-284 (2018).
  33. Prineas, J. W., Graham, J. S. Multiple sclerosis: capping of surface immunoglobulin G on macrophages engaged in myelin breakdown. Annals of Neurology. 10 (2), 149-158 (1981).
  34. Bégin, S., et al. Automated method for the segmentation and morphometry of nerve fibers in large-scale CARS images of spinal cord tissue. Biomedical Optics Express. 5 (12), 4145-4161 (2014).

Tags

מדעי המוח גיליון 185
יישום ספקטרוסקופיית ראמן קוהרנטית נגד סטוקס (CARS) להדמיית מיאלינציה בפרוסות מוח
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCullagh, E. A., Poleg, S., Stich,… More

McCullagh, E. A., Poleg, S., Stich, D., Moldovan, R., Klug, A. Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices. J. Vis. Exp. (185), e64013, doi:10.3791/64013 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter