Summary
तंत्रिका तंत्र का अध्ययन करने वाले कई शोधकर्ताओं के लिए माइलिनेशन की कल्पना करना एक महत्वपूर्ण लक्ष्य है। CARS एक ऐसी तकनीक है जो इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ संगत है जो मस्तिष्क जैसे ऊतक के भीतर लिपिड को मूल रूप से छवि बना सकती है जो माइलिन जैसी विशेष संरचनाओं को रोशन करती है।
Abstract
सुसंगत स्टोक्स विरोधी रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी (CARS) एक तकनीक है जो रसायनज्ञों और भौतिकविदों द्वारा अणुओं के हस्ताक्षर कंपन के सुसंगत संकेत का उत्पादन करने के लिए शास्त्रीय रूप से नियोजित की जाती है। हालांकि, ये कंपन हस्ताक्षर मस्तिष्क जैसे शारीरिक ऊतक के भीतर अणुओं की विशेषता भी हैं, जिससे यह तंत्रिका विज्ञान अनुप्रयोगों के लिए तेजी से उपयोगी और लागू होता है। उदाहरण के लिए, CARS इन अणुओं के भीतर विशेष रूप से रोमांचक रासायनिक बंधों द्वारा लिपिड को माप सकता है, जिससे ऊतक के विभिन्न पहलुओं की मात्रा का ठहराव हो सकता है, जैसे कि न्यूरोट्रांसमिशन में शामिल माइलिन। इसके अलावा, आमतौर पर माइलिन की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोग की जाने वाली अन्य तकनीकों की तुलना में, CARS को इम्यूनोफ्लोरोसेंट तकनीकों के साथ संगत होने के लिए भी स्थापित किया जा सकता है, जिससे सोडियम चैनल या सिनैप्टिक ट्रांसमिशन के अन्य घटकों जैसे अन्य मार्करों के साथ सह-लेबलिंग की अनुमति मिलती है। माइलिनेशन परिवर्तन मल्टीपल स्केलेरोसिस या अन्य न्यूरोलॉजिकल स्थितियों जैसे फ्रेजाइल एक्स सिंड्रोम या ऑटिज़्म स्पेक्ट्रम विकारजैसी बीमारियों को कम करने में एक स्वाभाविक रूप से महत्वपूर्ण तंत्र है जो अनुसंधान का एक उभरता हुआ क्षेत्र है। निष्कर्ष में, CARS का उपयोग न्यूरोसाइंस में दबाव वाले सवालों के जवाब देने और कई अलग-अलग न्यूरोलॉजिकल स्थितियों से संबंधित अंतर्निहित तंत्र के लिए सबूत प्रदान करने के लिए अभिनव तरीकों से किया जा सकता है।
Introduction
एक्शन पोटेंशिअल मस्तिष्क में सूचना की मूल इकाई है, और अक्षतंतु के माध्यम से कार्रवाई संभावित प्रसार सूचना प्रसंस्करण 1,2,3 का एक स्तंभ बनाता है। न्यूरॉन्स आमतौर पर कई अन्य न्यूरॉन्स से अभिवाही इनपुट प्राप्त करते हैं और इन इनपुट को किसी दिए गए संकीर्ण समय विंडो 4,5 के भीतर एकीकृत करते हैं। इसलिए, अक्षतंतु में कार्रवाई संभावित प्रसार के तंत्र को जांचकर्ताओं से महत्वपूर्ण मात्रा में ध्यान मिला है।
अक्षतंतु के माध्यम से प्रचार करते समय, विश्वसनीय प्रसार सुनिश्चित करने के लिए अक्षतंतु के साथ एक क्रिया क्षमता को बार-बार पुनर्जीवितकिया जाता है। जबड़े वाले कशेरुकी (ग्नाथोस्टोम) के अधिकांश न्यूरॉन्स में अक्षतंतु माइलिन के एक आवरण से घिरे होते हैं, जो पास के ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स या श्वान कोशिकाओं द्वारा निर्मित एक लिपिड युक्त पदार्थ है, जो ग्लियल कोशिकाओं के प्रकार हैं (7,8 में समीक्षा की गई)। यह माइलिन म्यान विद्युत रूप से अक्षतंतु को इन्सुलेट करता है, इसकी धारिता को कम करता है और कार्रवाई संभावित प्रसार को कुशलतापूर्वक, जल्दी से और कम ऊर्जा खपत के साथ अनुमति देता है। माइलिन अक्षतंतु को समान रूप से कवर नहीं करता है, लेकिन यह अक्षतंतु को उन खंडों में ढक देता है जिनके बीच छोटे अंतराल होते हैं, जिन्हें रैनवियर के नोड्स कहा जाता है (9,10 में समीक्षा की गई)। माइलिनेशन मोटाई, जो एक अक्षतंतु के विद्युत इन्सुलेशन के स्तर को नियंत्रित करती है, और रैनवियर के नोड्स की रिक्ति, जो उस आवृत्ति को नियंत्रित करती है जिसके साथ एक अक्षतंतु के साथ कार्रवाई क्षमता पुनर्जीवित होती है, कार्रवाई संभावित प्रसार की गति को प्रभावित करती है (11 में समीक्षा की गई)।
साहित्य का एक बड़ा निकाय यह सुझाव देता है कि माइलिनेशन मोटाई अक्षतंतु 12,13,14 में कार्रवाई संभावित प्रसार की गति को प्रभावित करती है। इसके अलावा, एक्सॉन माइलिनेशन में परिवर्तन के परिणामस्वरूप कई सीएनएस घाटे 15,16,17,18,19,20,21 हो सकते हैं। इसलिए यह आश्चर्य की बात नहीं है कि कई शोध प्रयासों के फोकस में एक्सॉन माइलिनेशन का माप और लक्षण वर्णन शामिल है। माइलिन मोटाई का माप आमतौर पर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ किया गया है, एक ऐसी तकनीक जिसके लिए ऊतक तैयारी की एक महत्वपूर्ण मात्रा की आवश्यकता होती है और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ संयोजन में उपयोग करना चुनौतीपूर्ण है। हालांकि, एक्सॉन माइलिनेशन को मापने के लिए एक तेज और सरल तकनीक भी है जो सुसंगत एंटी-स्टोक्स रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी (CARS) पर आधारित है। एक कार्स लेजर को विभिन्न आवृत्तियों के लिए ट्यून किया जा सकता है और जब लिपिड को उत्तेजित करने के लिए उपयुक्त आवृत्तियों के लिए ट्यून किया जाता है, तो माइलिन को किसी भी अतिरिक्त लेबल22 की आवश्यकता के बिना चित्रित किया जा सकता है। लिपिड इमेजिंग को मानक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ जोड़ा जा सकता है जैसे कि लिपिड को कई फ्लोरोसेंट चैनलों के साथ चित्रित किया जा सकताहै। CARS के साथ इमेजिंग माइलिनेशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की तुलना में काफी तेज है और इसमें एक रिज़ॉल्यूशन है, हालांकि ईएम से कम है, एक ही प्रकार के अक्षतंतु में माइलिनेशन में छोटे अंतर का पता लगाने के लिए भी पर्याप्त है।
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Protocol
सभी प्रयोगों ने सभी लागू कानूनों, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के दिशानिर्देशों का अनुपालन किया, और कोलोराडो विश्वविद्यालय एंशुट्ज़ संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।
1. जानवर
- C57BL/6J (स्टॉक # 000664) चूहों (मस मस्कुलस) का उपयोग करें जो जैक्सन प्रयोगशाला से प्राप्त किया गया है या मंगोलियाई गेरबिल्स (मेरिओन्स अनगुइकुलटस) मूल रूप से चार्ल्स नदी से प्राप्त किया गया है।
2. ऊतक तैयारी
- ट्रांसकार्डियल छिड़काव के लिए, पेंटोबार्बिटल (120 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन) के साथ रुचि रखने वाली कृंतक प्रजातियों को ओवरडोज करें और ट्रांसकार्डियल रूप से उन्हें फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस; 137 एमएम एनएसीएल, 2.7 एमएम केसीएल, 1.76 एमएम केएच2पीओ4, 10 एमएम एनए2एचपीओ4) के साथ ओवरडोज करें, इसके बाद 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए)24।
- विशेष रूप से, कैंची का उपयोग करके पेट और पसली पिंजरे को खोलें और दिल को उजागर करने के लिए केली हेमोस्टैटिक फोर्स के साथ पसली पिंजरे को पकड़ें।
- छिड़काव पंप से जुड़ी 23 जीए सुई को बाएं वेंट्रिकल में डालें और ठीक कैंची का उपयोग करके दाएं आलिंद को जल्दी से काट लें।
- मस्तिष्क और रक्त के शरीर को साफ करने के लिए 10 मिनट के लिए छिड़काव पंप और दिल में सुई के माध्यम से पीबीएस का प्रबंधन करें।
- छिड़काव पंप को 10 मिनट के लिए 4% पीएफए पर स्विच करें और सफल छिड़काव की पुष्टि करने के लिए अंगों और पूंछ की कठोरता की जांच करें।
- छिड़काव के बाद, जानवरों का सिर काट दें और खोपड़ी से उनके मस्तिष्क को हटा दें। पीबीएस में स्थानांतरित करने से पहले दिमाग को 4% पीएफए में रात भर रखें। ब्रेनस्टेम्स को 4% अगारोस (पीबीएस में) में एम्बेड करें और 200 μm मोटाई पर वाइब्रेटोम का उपयोग करके कोरोनल रूप से स्लाइस करें।
3. धुंधलापन
- एंटीबॉडी मीडिया (एबी मीडिया: 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पीबी: 50 एमएम केएच2पीओ 4, 150एमएम एनए2एचपीओ 4), 150 एमएम एनएसीएल, 3 एमएम ट्राइटन-एक्स, 1% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए)) में सेल बॉडी (1: 100) की कल्पना करने के लिए निएसएल के लिए दाग मुक्त फ्लोटिंग सेक्शन एक मानक प्रयोगशाला शेकर25 पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए।
- एल्यूमीनियम पन्नी और / या कवर का उपयोग करके प्रकाश से वर्गों की रक्षा करें। 550 एनएम या उससे नीचे तरंग दैर्ध्य कार्स इमेजिंग (चित्रा 1) के साथ संगत हैं।
नोट: जबकि हम उम्मीद नहीं करते हैं कि ट्राइटन-एक्स या अन्य अभिकर्मकों का लिपिड की कार्स इमेजिंग पर प्रभाव पड़ता है, विशिष्ट एंटीबॉडी मीडिया के साथ अतिरिक्त नियंत्रण की आवश्यकता हो सकती है।
- एल्यूमीनियम पन्नी और / या कवर का उपयोग करके प्रकाश से वर्गों की रक्षा करें। 550 एनएम या उससे नीचे तरंग दैर्ध्य कार्स इमेजिंग (चित्रा 1) के साथ संगत हैं।
- पॉज़ पॉइंट: इमेजिंग तक पीबीएस में मुफ्त फ्लोटिंग सेक्शन (प्रकाश से संरक्षित रहते हुए) स्टोर करें। एक बार विभाजित होने के बाद, 2 सप्ताह के भीतर मस्तिष्क वर्गों की छवि बनाएं।
चित्रा 1: कार्स इमेजिंग को इम्यूनोफ्लोरोसेंट इमेजिंग के साथ जोड़ा जा सकता है। ग्राफ से पता चलता है कि CARS इमेजिंग 660/640 nm रेड सिग्नल स्पेक्ट्रम26 पर होती है। यह तरंगदैर्ध्य हरे, नीले या यूवी रेंज से पर्याप्त रूप से दूर है, जिससे इन श्रेणियों में इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ कार्स सिग्नल के संयोजन की अनुमति मिलती है। विशेष रूप से, ग्राफ नीले फ्लोरोफोरे के साथ टैग किए गए निस्ल के लिए उत्तेजना और उत्सर्जन को भी इंगित करता है, जिसे इस प्रकाशन के लिए प्रतिनिधि परिणामों के संग्रह के दौरान CARS के साथ जोड़ा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
4. इमेजिंग
नोट: कार्स लेजर सेट अप में एक फाइबर लेजर होता है जो 80 मेगाहर्ट्ज घड़ी प्रदान करता है, और 1031 एनएम पर तय स्टोक्स बीम के साथ 770-990 एनएम की एक असमर्थ सीमा के साथ एक ओपीओ (ऑप्टिकल पैरामीट्रिक ऑसिलेटर) लेजर प्रदान करता है, जो कार्स सिग्नल एकत्र करने के लिए आवश्यक हैं। दोनों बीम के लिए एक अपर्चर है।
- माइक्रोस्कोप में नमूने लाने से पहले, कम से कम 1 घंटे के लिए कार्स लेजर को चालू और गर्म करें, कार्स लेजर को संरेखित करें, और कोहलर कंडेनसर ऑप्टिक्स और माइक्रोस्कोप के डायाफ्राम को आगे कार्स इमेजिंग के लिए संरेखित करें।
नोट: यह कदम CARS माइक्रोस्कोपी के उचित कार्य के लिए महत्वपूर्ण है।- दो लेजर बीम (पंप और स्टोक्स) के स्थानिक संरेखण के लिए, कार्स लेजर जीयूआई के माध्यम से दो आंतरिक पीएसडी (स्थिति संवेदनशील डिटेक्टरों) तक पहुंचें।
- कार्स लेजर जीयूआई में देरी फ़ंक्शन का उपयोग करके अस्थायी संरेखण प्राप्त करें, जो दो लेजर (पंप और स्टोक्स) की दालों को ओवरलैप करने में मदद कर सकता है जिनके अलग-अलग तरंग दैर्ध्य के कारण अलग-अलग फैलाव होते हैं। इसलिए, पंप और स्टोक्स बीम के अस्थायी और स्थानिक ओवरलैपिंग दोनों को जीयूआई के माध्यम से उपयोगकर्ता इनपुट के साथ किया जाता है।
- माइक्रोस्कोप के स्कैनिंग हेड मिरर पर स्थानिक रूप से अतिक्रमित दो लेजर को केंद्रित करने के लिए बाहरी पेरिस्कोप (सेटअप के अंतिम दो दर्पण) को समायोजित करें।
- सर्वोत्तम फॉरवर्ड कार्स गैर-डिसकैंच्ड डिटेक्शन के लिए, सुनिश्चित करें कि कंडेनसर कोहलर-एड है (जिसका अर्थ है कि कंडेनसर केंद्रित है और समान रोशनी प्राप्त करने के लिए डायाफ्राम पर केंद्रित है)
- इम्यूनोफ्लोरेसेंस कॉन्फोकल इमेजिंग और कार्स इमेजिंग के लिए, फ्लोरेसेंस इमेजिंग (चित्रा 2) के लिए दृश्यमान लेजर से लैस एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप को शामिल करके, फॉरवर्ड और एपि कार्स नॉन-डिसकैंब्ड डिटेक्टरों (एनडीडी) दोनों के साथ कार्स लेजर फिट करें।
- कवरस्लिप (उल्टे माइक्रोस्कोपी के लिए), ऊतक को सूखने से बचाने के लिए पीबीएस, और ऊतक को कवरस्लिप के पास रखने के लिए ग्लास वजन के साथ एक संस्कृति डिश में अनुभाग रखें।
- 60X, 1.2 NA इन्फ्रारेड सही किए गए पानी के उद्देश्य के साथ z-स्टैक्स या एकल छवियों को लें, जो एपि दिशा में कार्स सिग्नल के संग्रह के लिए कार्य करता है और ट्रेपोज़ॉइड बॉडी (MNTB) के मध्यवर्ती नाभिक जैसे मस्तिष्क क्षेत्रों की इमेजिंग के लिए आगे की दिशा में 0.55 NA कंडेनसर के माध्यम से कार्य करता है।
- कार्स लेजर जीयूआई का उपयोग करके लगभग 600 mW पंप / प्रोब और 300 mW स्टोक्स पर CARS छवियां लें। इन लेजर पावर मानों को सिस्टम द्वारा आंतरिक रूप से मापा जाता है। नमूना स्थान पर दोनों लेजर की शक्तियां 25 किलोवाट से कम हैं और ऊतक के नमूने के लिए सुरक्षित हैं।
- पंप और स्टोक्स बीम को स्थानिक और अस्थायी रूप से ओवरलैप करें। ओपीओ को 797.2 एनएम पर ट्यून करें। यह 650 एनएम की कार्स तरंग दैर्ध्य उत्पन्न करता है। उच्च ऊर्जा स्तर के कारण, परिणामस्वरूप जमीन की स्थिति में वापसी उत्तेजना के लिए स्टोक्स विरोधी (नीला स्थानांतरित) है।
- बैंडपास फिल्टर (640-680 एनएम) का उपयोग करके एपि या फॉरवर्ड नॉन-डिसकैंटेन डिटेक्टरों में कार्स सिग्नल को कैप्चर करें, इसके बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबल का अनुक्रमिक पता लगाया जाता है (इस उदाहरण में फ्लोरोसेंटली लेबल निस्सल)।
नोट: निस्ल न्यूरोनल सोमा मार्कर कार्स 640-680 एनएम बैंडपास फिल्टर में नहीं पकड़ा गया है, जिससे नीचे प्रस्तुत छवियों में फ्लोरेसेंस और कार्स इमेजिंग के संयोजन की अनुमति मिलती है। - CARS और प्रतिदीप्ति PMTs साझा नहीं करते हैं। मस्तिष्क क्षेत्र में चुनिंदा रूप से माइलिनेशन की छवि बनाने के लिए इष्टतम लिपिड संकेत के लिए इन सेटिंग्स का उपयोग करें।
चेतावनी: उपयोगकर्ता को लेजर बीम से ढालें
- छवियों को .oib फ़ाइलों के रूप में सहेजें, जिन्हें आगे परिमाणीकरण के लिए छवि विश्लेषण कार्यक्रम में आयात किया जा सकता है (चित्रा 3)।
चित्र 2: कार्स उपकरण आरेख में कार लेजर (लाल तीर) और गैर-डिसे स्कैन (एनडीडी) एपि और फॉरवर्ड डिटेक्शन को लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल पर शामिल किया गया है। आगे एनडीडी में हम 515 एनएम (नारंगी तीर) पर सी-एच बॉन्ड (गहरे लाल तीर) और एसएचजी (दूसरा हार्मोनिक जेनेरेशियोइन) के लिए CARS प्राप्त करते हैं। एपि एनडीडी में, हम सी-एच बॉन्ड (गहरे लाल तीर) और 2 पीई (दो-फोटॉन उत्सर्जन) ऑटोफ्लोरेसेंस (हल्के नीले तीर) के लिए CARS प्राप्त करते हैं। क्रमिक रूप से, प्रतिदीप्ति कॉन्फोकल छवियों का अधिग्रहण किया जा सकता है (दृश्यमान लेजर के लिए हरे तीर, कॉन्फोकल डिटेक्शन के लिए नीले तीर)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: CARS मस्तिष्क के ऊतकों (ब्रेनस्टेम) में माइलिन (मैजेंटा) को रोशन कर सकता है, जबकि निस्ल (सियान) या फ्लोरोसेंट मार्करों की इमेजिंग भी कर सकता है। दो पैनल मंगोलियाई गेरबिल (एकल छवि एम. अनगुइकुलटस, चित्रा 3 ए, सी, ई) और माउस (जेड-स्टैक मैक्स प्रोजेक्शन एम. मस्कुलस, चित्रा 2 बी, डी, एफ) मस्तिष्क से प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं, यह दर्शाता है कि इस तकनीक का उपयोग प्रजातियों में किया जा सकता है। चित्र 3A, B में Nisl को सियान, C, D में दिखाया गया है, जो मैजेंटा में CARS सिग्नल दिखाता है, E, F क्रमशः गर्बिल या माउस के लिए प्रत्येक पैनल के साथ Nissl और CARS संकेतों को जोड़ते हैं। छवियों के दोनों सेट मस्तिष्क स्टेम में ट्रेपोज़ॉइड बॉडी (एमएनटीबी) के औसत दर्जे के नाभिक का एक खंड दिखाते हैं। एमएनटीबी में न्यूरॉन्स भारी माइलिनेटेड अक्षतंतु से इनपुट प्राप्त करते हैं, जो पकड़े गए कैलिक्स में समाप्त होते हैं, एक प्रकार का विशाल सिनैप्स27। स्केल पट्टी 20 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Representative Results
अन्य तकनीकों पर कार्स माइक्रोस्कोपी के सबसे बड़े फायदों में से एक फ्लोरोसेंट इमेजिंग23 के साथ संगतता है। चित्र 1 इम्यूनोफ्लोरोसेंट मार्कर के साथ टैग किए गए निस्सल की तुलना में कार्स स्पेक्ट्रा को दर्शाता है जो स्पेक्ट्रा में बहुत कम / कोई ओवरलैप नहीं दिखाता है। चित्रा 2 कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में CARS के लिए स्थापित लेजर को दर्शाता है। चित्रा 3 दो प्रतिनिधि छवियों को प्रदर्शित करता है, एक एकल स्टैक के रूप में और गेरबिल और माउस से एक जेड-स्टैक मैक्स प्रोजेक्शन जो सेल बॉडी (सियान) और माइलिन सिग्नल (मैजेंटा) दोनों को दिखाते हुए कार्स इमेजिंग का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है।
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Discussion
साहित्य का एक बढ़ता हुआ शरीर मस्तिष्क समारोह में माइलिन की भूमिका पर जोर देताहै 13,16,21,28। इसके अलावा, हम जानते हैं कि माइलिनेशन मोटाई और माइलिनेशन पैटर्न कई न्यूरोलॉजिकल स्थितियों में बदल सकते हैं जैसे कि मल्टीपल स्केलेरोसिस (29 में समीक्षा), उम्र बढ़ने (30 में समीक्षा की गई), ऑटिज़्म20,31, और कई अन्य। इसलिए यह आश्चर्य की बात नहीं है कि अधिक से अधिक जांचकर्ताओं को मस्तिष्क के ऊतकों और पशु मॉडल में, कई चिकित्सा स्थितियों में और प्रयोगात्मक स्थितियों की बढ़ती संख्या में माइलिनेशन का आकलन करने की आवश्यकता है। मस्तिष्क के ऊतकों में माइलिनेशन की छवि बनाने के पारंपरिक तरीकों में एंटीबॉडी लेबलिंग शामिल है, जिसके बाद प्रकाश माइक्रोस्कोपी, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) शामिल हैं। दोनों तकनीकें समय लेने वाली हैं और बहु-चरण ऊतक तैयारी प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है, जो संभावित त्रुटियों और ऊतक संरचना में परिवर्तन से जुड़े होते हैं। हमने एक वैकल्पिक विधि का प्रदर्शन किया जो माइलिन को बहुत तेजी से छवि बनाने की क्षमता के कारण समान परिणाम दे सकता है, और जिसे अतिरिक्त प्रतिदीप्ति प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ जोड़ा जा सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, इस तकनीक का उपयोग अतिरिक्त मार्करों या लेबल की आवश्यकता के बिना मस्तिष्क के ऊतकों में लिपिड की छवि बनाने के लिए किया जा सकता है। यह तकनीक न केवल बरकरार अक्षतंतु के साथ माइलिन की इमेजिंग की अनुमति देती है, बल्कि यह माइलिन ब्रेकडाउन उत्पादों जैसे सजीले टुकड़े या तरल बूंदों32 की इमेजिंग की अनुमति देती है, जिन्हें दिखाया गया है, उदाहरण के लिए, मल्टीपल स्केलेरोसिस33 में।
जिस आवृत्ति के लिए CARS लेजर को ट्यून किया गया था, वह लिपिड के पक्ष में छवि को भारी पूर्वाग्रह करने के लिए उपयुक्त था, जिसके परिणामस्वरूप माइलिनेशन की समग्र उच्च गुणवत्ता वाली छवियां थीं, क्योंकि माइलिन मस्तिष्क में अब तक का सबसे आम लिपिड युक्त पदार्थ है। इस तकनीक का सिद्धांत यह है कि एक कार्स लेजर, जिसे विभिन्न आवृत्तियों के लिए ट्यून किया जा सकता है, 792.2 एनएम तक ट्यून किया जाता है, जो सीएच2 बॉन्ड को उत्तेजित करने के लिए उपयुक्त आवृत्ति है। ये लिपिड में प्रचुर मात्रा में हैं, जिसमें अंत में एक टर्मिनल कार्बोक्जिलिक एसिड समूह के साथ कार्बन-कार्बन बांड से जुड़े सीएच2 समूहों की लंबी श्रृंखलाएं होती हैं। इस आवृत्ति के साथ रोमांचक लिपिड के परिणामस्वरूप एक संकेत मिला जिसे तब मानक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप डिटेक्शन तकनीक के साथ चित्रित किया जा सकता था। परिणामी छवियों की गुणवत्ता मात्रात्मक विश्लेषण का समर्थन करती है जो या तो मानव पर्यवेक्षक या स्वचालित एल्गोरिदम34 द्वारा की जा सकती है। हालांकि, यह विधि विशेष रूप से माइलिन को लेबल नहीं करती है क्योंकि सीएच2 बॉन्ड माइलिन के लिए अनन्य नहीं हैं, और इसलिए कार्स एंटीबॉडी की तुलना में कम विशिष्ट है। नतीजतन, छवियां कुछ लेबल दिखाती हैं, जो माइलिन से जुड़ी नहीं है। महत्वपूर्ण रूप से, यह पृष्ठभूमि लेबल माप की गुणवत्ता या मात्रात्मक विश्लेषण की क्षमता से समझौता नहीं करता है।
कार्स इमेजिंग का रिज़ॉल्यूशन विवर्तन सीमित है और दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी (~ 250 एनएम) के समान है और इस प्रकार ईएम की तुलना में कम है। इसलिए, जांचकर्ता जो माइलिनेशन मोटाई में बहुत छोटे अंतर का आकलन करने का लक्ष्य रखते हैं, उदाहरण के लिए, कुछ चिकित्सा स्थितियों में, इस सीमा से अवगत होने की आवश्यकता है। एक छोटे से नमूने में अतिरिक्त ईएम नियंत्रण यह पुष्टि कर सकते हैं कि संकल्प उनके शोध उद्देश्य के लिए पर्याप्त है।
माइलिन की इमेजिंग के लिए कार्स का एक प्रमुख लाभ, गति और आसानी के अलावा, फ्लोरेसेंस कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ लेबल-मुक्त लिपिड इमेजिंग को संयोजित करने की क्षमता है। कार्स के लिए उपयोग किए जाने वाले माइक्रोस्कोप के आधार पर, दो या यहां तक कि तीन अतिरिक्त चैनलों को चित्रित किया जा सकता है जैसे कि माइलिन इमेजिंग को एंटीबॉडी लेबलिंग, निस्ल स्टेन, फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाली ट्रांसजेनिक माउस लाइनों या इसी तरह के साथ जोड़ा जा सकता है। लंबी तरंग दैर्ध्य फ्लोरोफोरे का उपयोग करने वाली संभावित सीमाएं ज्यादातर इसलिए हैं क्योंकि कार्स सिग्नल 640-680 एनएम बैंडपास फिल्टर के माध्यम से देखा जाता है जो हरे और / या लाल फ्लोरोफोरे के उत्सर्जन को पकड़ सकता है। हालांकि, कार्स उत्तेजना के लिए उपयोग किए जाने वाले पिकोसेकंड लेजर में दो-फोटॉन उत्तेजना के लिए उपयोग किए जाने वाले मानक फेम्टोसेकंड लेजर की तुलना में ~ 10 गुना कम की पीक पल्स ऊर्जा होती है, जिसका अनुवाद ~ 100 कम प्रतिदीप्ति में किया जाता है। इसके अलावा, कार्स उत्तेजना के लिए उपयोग किया जाने वाला 797.2 एनएम पल्स पिकोसेकंड लेजर वर्णक्रमीय रूप से दृश्यमान फ्लोरोफोरेस के दो-फोटॉन क्रॉस-सेक्शन अवशोषण के शिखर से दूर है। इसलिए, कार्स पिकोसेकंड लेजर दृश्यमान फ्लोरोफोरे के दो-फोटॉन उत्तेजना के लिए बहुत अक्षम है, जिससे कार्स का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंट सिग्नल नगण्य हो जाता है। हालांकि, यह एक नकारात्मक नियंत्रण नमूने की इमेजिंग द्वारा परीक्षण किया जाना चाहिए जिसमें फ्लोरोसेंट मार्करों के साथ नमूने की तुलना में कोई फ्लोरोसेंट लेबल नहीं है।
अंत में, कार्स इमेजिंग मस्तिष्क के ऊतकों में माइलिन की छवि बनाने के लिए एक उपयुक्त तकनीक है। जबकि रिज़ॉल्यूशन मानक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के बराबर है और इस प्रकार ईएम से कम है, गति और उपयोग में आसानी इस तकनीक को मौजूदा तरीकों के लिए एक आकर्षक विकल्प बनाती है।
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Disclosures
लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
एनआईएच आर 01 डीसी 17924, आर 01 डीसी 18401 (क्लग), और एनआईएच 1 आर 15एचडी 105231-01, टी 32 डीसी 012280 और एफआरएएक्सए (मैककुलाघ) द्वारा समर्थित। कार्स इमेजिंग को कोलोराडो एनशुट्ज़ मेडिकल कैंपस विश्वविद्यालय में न्यूरोटेक्नोलॉजी सेंटर के उन्नत प्रकाश माइक्रोस्कोपी कोर भाग में एनआईएच पी 30 एनएस 048154 और एनआईएच पी 30 डीके 116073 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: | |||
| 1 mL disposable syringe with needle 27 GA x 0.5" | Exel int | 260040 | |
| Fatal + | Vortech | ||
| Surgery: | |||
| Spring Scissors - 8mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Perfusion: | |||
| 4% Paraformaldehyde | Fisher Chemical | SF994 (CS) | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Kelly hemostats | Fine Science Tools | 13019-14 | |
| Millipore H2O | |||
| Needle tip, 23 GA x 1" | BD precision glide | 305193 | |
| Phosphate buffered saline (PBS): | |||
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Potassium phosphate monobase | Sigma | P5655 | |
| pump with variable flow or equivalent | |||
| Sodium chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Sodiumphosphate dibasic | Sigma | S7907 | |
| Dissection: | |||
| 50 mL vial with 4% PFA | |||
| Bochem Chemical Spoon 180mm | Bochem | 230331000 | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10" | |||
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Surgical Scissors - Blunt | Fine Science Tools | 14000-20 | |
| Slicing: | |||
| Agar, plant | RPI | 9002-18-0 | |
| Vibratome | Leica | VT1000s | |
| well plate | Alkali Sci. | TPN1048-NT | |
| Staining: | |||
| AB Media: | 1n 1,000 mL of Millipore H2O | ||
| Phosphate buffered (PB): | |||
| Potassium Phosphate Monobase | Sigma | P5655 | |
| Sodium Phosohate Dibasic | Sigma | S7907 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma life science | A2153-100g | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Triton X-100 | Sigma - Aldrich | x100-500ml | |
| Nissl 435/455 | Invitrogen | N21479 | |
| CARS: | |||
| APE picoemerald laser | Angewandte Physik & Elektronik GmbH | ||
| bandpass filter (420-520 nm) | Chroma Technology | HQ470/100m-2P | |
| bandpass filter (500-530 nm) | Chroma Technology | HQ515/30m-2P | |
| bandpass filters (640-680 nm) | Chroma Technology | HQ660/40m-2P | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Cut Transfer pipet | Fisher | 13-711-7M | |
| dichroic longpass 565 nm | Chroma Technology | 565dcxr | |
| dichroic longpass 585 nm | Chroma Technology | 585dcxr | |
| dichroic shortpass 750 nm | Chroma Technology | T750spxrxt | |
| glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-10-C | |
| glass weight (10 mm x 10 mm boro rod) | Allen Scientific Glass Inc | ||
| multiphoton shortpass emission filter 680 nm | Chroma Technology | ET680sp-2p8 | |
| PBS |
References
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