Summary
このプロトコルは、アフリカ ツメガエル・ラエビス 卵母細胞へのシナプス膜の微小移植を行うことによって、α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸およびγ-アミノ酪酸受容体の一貫した信頼性の高い応答を記録することが可能であることを実証する。
Abstract
興奮性および抑制性のイオントロピック受容体は、生理学的ニューロン通信中のシナプスの活性を決定するイオンフラックスの主要なゲートである。したがって、それらの存在量、機能、および他のシナプス要素との関係の変化は、神経変性疾患および精神障害における脳機能および認知障害の変化の主要な相関として観察されている。興奮性および抑制性シナプス受容体の機能が疾患によってどのように変化するかを理解することは、効果的な治療法の開発にとって極めて重要である。疾患関連情報を得るためには、罹患したヒトの脳内で機能し続ける神経伝達物質受容体の電気的活動を記録することが重要である。これまでのところ、これは受容体の機能における病理学的変化を評価するための最も近いアプローチである。本研究では、ヒト受容体を含むスナップ凍結ヒト脳組織からシナプス膜を再活性化するシナプス膜を、アフリカツ メガ エルの卵母細胞の膜への注入と後部融合により微細移植する方法論を提示する。このプロトコルはまた、α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸(AMPA)およびγ-アミノ酪酸(GABA)受容体の一貫した信頼性の高い応答を得るための方法論的戦略、ならびに正規化および厳密なデータ分析に使用される新規な詳細な方法を提供する。
Introduction
神経変性障害は、人口の大部分に影響を及ぼす。それらの壊滅的な結果はよく知られていますが、脳機能にとって重要な神経伝達物質受容体の機能的変化とそれらの症状との間の関連性はまだほとんど理解されていません。個人間の変動性、疾患の慢性的な性質、および症状の狡猾な発症は、化学的不均衡が十分に文書化されている多くの脳障害の理解を遅らせた理由のほんの一部です1,2。動物モデルは、非常に貴重な情報を生み出し、進化保存系における生理学と病態生理学の根底にあるメカニズムに関する知識を広げました。しかし、げっ歯類とヒトとの間のいくつかの種間差異は、動物モデルからヒト脳への受容体機能の直接的な外挿を妨げている3。したがって、天然のヒト受容体を研究するための最初の努力は、外科的に除去された組織および凍結サンプルを使用して、Ricardo Milediの研究室によって開発された。これらの初期の実験では、ニューロンシナプス受容体および余分なシナプス受容体ならびに非ニューロン神経伝達物質受容体を含む全膜を使用し、それらは罹患状態に関する重要な情報を提供するが、受容体の混合がデータの解釈を複雑にする懸念がある4、5、6、7。重要なことに、シナプスは多くの神経変性疾患における主要な標的である8,9;したがって、罹患したシナプスの機能特性を試験するためのアッセイは、シナプス通信に影響を及ぼす疾患関連の変化に関する情報を得るための基本である。ここで、元の方法の改変が記載されている:濃縮シナプスタンパク質調製物の生理学的特徴付けに焦点を当て、研究ラットおよびヒトシナプトソームに首尾よく適用されたシナプス膜(MSM)の微小移植10,11,12,13,14,15.この方法論により、かつてヒトの脳内で働いていたシナプス受容体を移植し、独自の天然脂質に埋め込み、関連するタンパク質の独自のコホートを移植することが可能である。さらに、MSMデータは定量的であるため、このデータを使用して、大規模なプロテオームまたはシーケンシングデータセット10と統合することができる。
シナプス受容体の多くの薬理学的および生物物理学的分析が組換えタンパク質に対して行われていることに注意することが重要です16,17。このアプローチは、受容体の構造と機能の関係についてのより良い洞察を提供するが、ニューロンに見られる複雑な多量体受容体複合体およびそれらの疾患の変化に関する情報を提供することはできない。したがって、天然タンパク質と組換えタンパク質の組み合わせは、シナプス受容体のより包括的な分析を提供するはずである。
シナプトソーム10,11,12,13,14,15を調製する方法は数多くあり、ラボの要件に合わせて調整することができます。このプロトコルは、シナプトソーム富化調製物が単離され、微小移植実験のために処理される準備ができているという仮定から始まる。ラボでは、製造元の指示に従って Syn-Per メソッドが使用されます。これは、電気生理学的実験10、11において再現性が高いためである。アフリカツメガエル卵母細胞18、19を単離する方法を説明する豊富な文献もあり、注射20の準備ができて購入することもできる。
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Protocol
すべての研究は、施設のガイドラインに準拠して行われ、カリフォルニア大学アーバイン校(IACUC-1998-1388)およびテキサス大学医学部(IACUC-1803024)の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されています。非アルツハイマー病(AD)脳(女性、74歳、死後間隔2.8時間)およびAD脳(女性、74歳、死後間隔4.5時間)からの側頭皮質は、カリフォルニア大学アーバインアルツハイマー病研究センター(UCI-ADRC)によって提供された。脳提供に対するインフォームドコンセントはUCI-ADRCによって得られた。
注:未固定のヒト脳組織は、血液媒介病原体(BBP)の発生源として扱われるべきである。したがって、実験を開始する前にBBPトレーニングが必要です。このプロトコルは、BSL2要件の下でバイオセーフティレベル2(BSL2)ラボで実施されます。実験室内のガイドラインと予防措置には、実験室で許可されている食べ物や飲み物、実験室での良好な慣行に従わなければならない、個人用保護具(手袋、ガウン、つま先の開いた靴)が必要で、ドアは常に閉じていなければなりません。
1. アフリカツメガエル卵母細胞マイクロインジェクション製剤
- 注射針を作るには、マイクロピペットプーラーを使用して3.5インチのホウケイ酸チューブを引っ張ります。マイクロインジェクション針を引っ張ったら、顕微鏡とカミソリの刃を使用して、マイクロインジェクション(通常2〜3mm)を行うことができるように針の先端を十分に切り落とします。
メモ:切断する針の先端の長さは異なる場合があります。 - 800 mLの蒸留水に200 mLのBarthのストック溶液(5x)を加えて、1xバース溶液を調製する。24ウェルの平底組織培養プレートに18°C 1x Barthの溶液を充填します。
- 5x Barthの原液を以下のように調製する。1Lの蒸留水に、25.71gのNaCl(塩化ナトリウム)、0.372gのKCl(塩化カリウム)、0.301gのCaCl2 (二塩化カルシウム)、0.389gのCa(NO3)2(4H2O)(硝酸カルシウム4水和物)、1.01gのMgSO4(7H2O)(硫酸マグネシウム7水和物)、1.008gのNaHCO3 (炭酸水素ナトリウム)、 91gのHEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)を含む。
- 18,19に記載されているプロトコールを使用し、2倍拡大立体鏡を使用してアフリカツメガエル卵母細胞を単離し、健康に見えるステージV-VI卵母細胞を選択する。1ウェルあたり約10個の卵母細胞を配置し、記録を行う際に対照細胞として使用する非注入卵母細胞を収容するためにウェルの1つを使用する。
- 高さ1cm、直径6cmの小さなペトリ皿を取り出し、皿の底を覆うようにナイロンメッシュを内側に置きます。次いで、卵母細胞のマイクロインジェクションを行うために使用される1xバース溶液15mLを注ぐ。
- ナノインジェクターを顕微鏡プラットフォームの正中線に沿って配置します。磁石を オフ の位置に回し、慎重に支えながらナノインジェクタをゆっくりと目的の位置に移動します。ナノインジェクタが正しく配置されたら、磁石を完全に オン の位置に戻し、しっかりと固定されていることを確認します。
- サンプルサイズが 50.6 nL の場合、ナノインジェクタの側面で次の設定を使用します:1 は D (下)、2 は D、3 は U (上)、4 は D、5 は U です。
注:50 nLは、細胞質が21に耐えることができる注入された材料の最大量に近い。 - インスリン注射器の容量の約半分を鉱物油(約0.5mL / cc)で満たします。このシリンジを使用して、マイクロインジェクション針に鉱物油を充填します。針の先端に油のビーズが見えることを確認します。
- ナノインジェクタープランジャーを最低1〜2cmに露出させます。これを行うには、プランジャーが希望の長さで表示されるまで EMPTY ボタンを押し続けます。プランジャーが露出したら、ミネラルオイル入りのマイクロインジェクションガラス針をナノインジェクタープランジャーにゆっくりと慎重に置き、黒い抵抗Oリングにうまくフィットし、白い抵抗リングで止まることを確認します。プロセス中にナノインジェクタープランジャーを曲げないようにしてください。
- マイクロインジェクションガラスの針が固定され、所定の位置に収まったら、 EMPTY を押して潜在的な気泡を無効にします。紙のティッシュで優しく、余分なミネラルオイルをきれいにしてください。
2. サンプルのロード
- 10、11、12、13、14、15に記載されているように、関心のあるヒト脳領域からシナプトソーム富化製剤(サンプル)を調製し、注射の瞬間まで-80°Cで約5μLのアリコートに保存する。
- 注射前に、アリコートを湿った氷に移し、超音波処理と取り出しを除いて常に氷の上に保管してください。サンプルの数と種類は、実験計画によって決定されます。
- サンプルのウォームアップを避けるために、浮遊したウェットアイスの入った浴中で選択したサンプル3xを超音波処理します。毎回5秒サイクルを使用し、サイクル間のウェットアイスで1分間待ちます。
- 1 μL のサンプルを熱可塑性プラスチックの上に置きます。必要に応じて、サンプルの配置前に表面にくぼみを作り、サンプルの動きを防ぎます。
- ナノインジェクターを保持するマニピュレーターのつまみを使用して針を配置し、充填するサンプルに向かって移動させます。針先がサンプルに入ったら、十分なサンプルが取り込まれるまで FILL ボタンを押し続けます。10個の卵母細胞に約0.5μLが必要である。ノブを使用して、ナノインジェクターの針を最も高い位置に戻します。
3. 卵母細胞の注入
注:標準化されたラット皮質シナプトソーム膜はまた、卵母細胞の異なるバッチ間の融合能力の変化を測定するために、すべての実験において卵母細胞のセットに注入される。
- 選択した卵母細胞を、ナイロンメッシュとバース溶液(約10個の卵母細胞)が取り付けられた小さなペトリ皿の上に置きます。卵母細胞がお互いの上にないように配置します;これは、注入プロセス中に役立ちます。
- ナノインジェクターを保持するマニピュレーターのつまみを使用して、針を卵母細胞に向かって動かします。針がBarthの溶液に沈んだら、ナノインジェクターのフットペダルを使用して、マイクロインジェクション針がサンプルを放出していることを確認します。サンプルが放出されている場合、顕微鏡ビューから見えます。
- サンプルが放出されていることが自信を持って確立されたら、卵母細胞のマイクロインジェクションに進みます。サンプルが放出されない場合は、針を充填するプロセスを繰り返します。
- 針で表面のすぐ下の卵母細胞に浸透し、深くは浸透させず、フットペダルを使用してサンプルを注入します。フットペダルは、サンプルを離すとビープ音を鳴らします。約2〜3秒待ちます。注射が成功した場合、細胞は膨張する。このような場合は、マニピュレーターのノブを使用してセルを終了します。
注:卵母細胞内の膜の融合は分極プロセスである。したがって、卵母細胞は、細胞の動物側、好ましくは赤道より上に、膜融合を最大化するために動物側に向かって針の角度で注入されるべきである。 - 次の卵母細胞が針と整列するようにペトリ皿を動かし、皿内のすべての卵母細胞が注入されるまでこのプロセスを繰り返す。所望の数の卵母細胞が注入されるまでこのプロセスを繰り返す。卵母細胞の1つのウェルがコントロールとして使用されるように注射されていないままであることを確認してください。
- すべての卵母細胞が注入されたら、ナノインジェクターを元の位置に引っ込め、針を取り外します。
4. 2電極電圧クランプによるイオン電流の記録
- 2本の電極電圧クランプ(TEVC)電極針を作るには、マイクロピペットプーラーを使用して長さ15cmの火磨きホウケイ酸ガラス管を引っ張ります。引っ張りが完了したら、長い毛細血管針を使用して3 M KClで充填するか、または針を3 M KCl溶液に沈めて連続真空下で15分間沸騰させます。高温は、電極の充填および気泡の除去に役立つ。
- 結晶形のKClと脱イオン水を用いて3M KCl電極充填液を調製し、電極の基準電位が変化しないように慎重にこれらの手順に従う。KClをオーブンで2〜3時間慎重に乾燥させます。分析天秤を使用して、223.68gのKClを慎重に計量し、KClを1Lガラス瓶に移します。この溶液を使用して、銀電極ワイヤを塩素化します。
注:ガラス電極を引っ張るには、ピペットクックブックをここからダウンロードできます:https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf。
- 結晶形のKClと脱イオン水を用いて3M KCl電極充填液を調製し、電極の基準電位が変化しないように慎重にこれらの手順に従う。KClをオーブンで2〜3時間慎重に乾燥させます。分析天秤を使用して、223.68gのKClを慎重に計量し、KClを1Lガラス瓶に移します。この溶液を使用して、銀電極ワイヤを塩素化します。
- イオン電流の記録に使用されるすべての機器(メインシステム、溶液バルブ、顕微鏡ライト、バルブシステム、卵母細胞クランプ、真空システム)をオンにします。デスクトップ コンピューターの電源を入れ、WinEDR V3.9.1 にログインし、プログラムが実行中であること、およびセットアップ値が正しいことを確認します (ディスクへの記録、記録期間の設定、シミュレーター オプションの選択)。
- アンプに次の初期セットアップ値を指定します:電圧電極(Vm)セクションの場合は、負の容量補償(-C)をオフにします。バス電極(Im)セクションの場合、ゲインセレクタスイッチ(0.1~10の範囲)を10に設定し、ゲイン乗算器(x0.1、x1.0、x10)を選択する3ポジショントグルスイッチをx1.0に設定します。LEDライトはゲイン乗数の選択を示します。クランプセクションの場合は、クランプモードセレクタをオフにし、DCゲイン制御を INに設定し、ゲイン制御の全帯域幅オープンループ(0〜2000の範囲)を約1200に設定します。コマンドの場合は、40mVに設定し、ホールドコントロールを負に設定し、スケール乗数をx2に設定します。電流電極の場合、Veオフセットを使用して、卵母細胞に衝突する前にゼロ基準を確立します。
- 録音するには、WinEDR V3.9.1ソフトウェアを開き、トップメニューに移動して、[ファイル] >[新しいファイルを開く]を選択します。独自のフォルダを作成し、ファイルを保存します。
- 次に、メインメニューで [レコード]>[ディスクに記録]を選択します。2つの電極がooctyteの内部にある場合は、VC-8バルブコントローラの着信音をオンにし、OC-725Cアンプでクランプを Slow にします。次に、WinEDRソフトウェアに戻り、画面の左上にある [録音 ]を選択します。
- 左下のマークチャートに、最初の膜電位を書き留め、Enter キーを押し ます。実験が進むにつれて、使用されている薬の名前を書き留めることができます。実験が終了したら、画面の左上にある [ 停止 ] を選択します。
注: TEVC を実行するために WinEDR または WinWCP ソフトウェアを使用するのは、これらは無料で実験に適しているためですが、利用可能な他のソフトウェアでも使用できます。
- 実験の実行に必要なすべての薬物溶液(GABA、カイネートなど)を構成し、溶液バルブのオン/オフを切り替え、ピンチバルブの変位を観察して、溶液バルブが正しく機能していることを確認します。
- チューブに接続されたシリンジレセプタクルに対応する溶液を注ぎ、バルブコントローラにラベルを付けて溶液チューブと相関させてチューブを満たします。溶液の流れが安定していること、気泡がないこと、真空システムが正しく機能していることを確認します。
- 顕微鏡と記録チャンバー領域を設定します。寒天ブリッジ(下記参照)を記録室の後ろのそれぞれの円形の穴(取り扱い領域から遠位)に置き、グランド基準として使用される電極用のウェルと記録室とを接続する。リンゲルの作業溶液(1x)を記録チャンバとグランド参照電極ウェルに加えます。
- 寒天ブリッジは、長さ2〜3cmのU字型のホウケイ酸塩チューブで、リンゲル溶液中の3%寒天で満たされています。長さ15cmのチューブを切断し、裸火で曲げ、インスリン注射器を使用して熱い3%寒天で満たしてU字型のチューブを作ります。充填された寒天ブリッジをリンガーの溶液に使用時まで冷蔵庫に保管してください。
- 1Lの蒸留水に、134.4gのNaCl、2.982gのKCl、5.29gのCaCl2、および23.83gのHEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)を加える。1x Ringerの作業溶液の場合、メスフラスコに200 mLのRingerの原液(20x)を3,800 mLの蒸留水に加えます。
- 各実験の前に、3M KCl溶液に銀線を入れ、銀電極を9V電池の正極端子に接続して電気分解することにより、塩素化銀電極を作製した。約3分後、AgClの固体褐色層が電極に堆積する。塩素処理された銀の電極配線を電極ハウジングに入れます。
メモ: 接地基準および記録塩素化電極は、銀/塩化銀(Ag/AgCl)電極です。 - KCl溶液からホウケイ酸針を取り外します。シリンジを使用して、電極針の開放端から少量のKCl溶液を抽出し、KCl溶液を鉱物油と交換する。これにより、水の蒸発や針内のKCl濃度の変化が回避されます。ガラスの針を塩素処理した銀の電極線の上にスライドさせ、所定の位置に締め付けます。
- 電極を保持する左右のマニピュレータを使用して、電極針をリンゲル溶液で満たされた記録チャンバに導きます。
- VmおよびVeオフセットノブをゼロにし、 電極テスト ボタンを押して、各電極の抵抗を確認します。抵抗は0.5~3MΩ(画面上では5~30mVと直接読み取れます)でなければなりません。抵抗が範囲外にある場合は、新しいマイクロ電極を使用して交換してください。
- 録音室を新鮮なリンガーの溶液で満たしてください。ガラスピペットを用いて、非注射または微小移植卵母細胞を記録チャンバの中央に配置する。卵母細胞が顕微鏡下で、動物側を上にしてはっきりと見えることを確認します(ステップ3.4の注を参照)。
- 電極をリンゲル溶液に導き、卵母細胞膜に触れるまで導きます。動物側の卵母細胞膜を両方の電極で優しく突き刺し(ステップ3.4の注を参照)、静止膜電位を記録します。リンガーのソリューションフローをオンにします。
- 卵母細胞クランプアンプを使用して、モードを電圧 クランプ に変更し、保持電圧を-80mVに設定します。モニタの電流は負で、通常は0~0.4マイクロアンペアです。
- 新しいファイルを作成して、記録を [ファイル] > [新規] として保存する > [記録をソフトウェアに保存する] をクリックします。録音を開始し、 録音>ディスクに録音を押します。マークボックスダイアログを使用して、関連情報(テスト名、使用された薬など)をファイルに追加します。
- アゴニスト(例えば、GABA、グルタミン酸塩、またはカイネート)を化学的刺激のために適用し、バルブを開き、それらを記録チャンバに15秒間灌流する。通常、ゲイン10倍を使用して最大点数をプロットし、応答を再構築します。電流が非常に小さい場合は、増幅またはゲインを増やして、電流を評価して可視化します。これらの変更を常にメモしておいてください。
注:灌流の持続時間は、実験パラダイムに依存する。主な目標が最大振幅を測定することである場合、GABAのピークまたはカイネイトのプラトーに達するには15秒で十分です。 - 常にソリューション レベルを監視します。Ringerのソリューションは、すべてのソリューションの使用間で使用されるため、頻繁に補充する必要があります。録音が完了したら、電圧クランプを OFF の位置にし、リンガーのソリューションバルブをオフにします。卵母細胞を除去します。記録を停止し、ファイルを保存します。注射されたすべての卵母細胞についてこれらの手順を繰り返します。
5. TEVC記録の分析
- 録画のコピーをUSBドライブに保存します。そこから、分析するファイルを開きます。開いたファイルで、記録を表示、マーク、および測定できます。最も一般的な分析には、最大振幅、起動時間、感度低下、および反復アプリケーションのランダウンの測定が含まれます。
- AMPA最大応答とGABAピーク応答を測定します。これらの測定値を取得するには、まずカーソルで赤い線を見つけ、Ringerアプリケーションまたはベースラインによって生成された電流にドラッグして、ゼロレベルまたはベースラインを確立します。
- ゼロレベルが確立されたら、マウスを使用して緑色の垂直読み出しカーソルをグラフトレーサの目的の部分にドラッグして、応答測定値を決定します。必要に応じて、トレースをエクスポートして、他の優先ソフトウェアで分析します。
メモ: ゼロレベルを定義できない場合、またはトレーサーに示されたノイズが多すぎる場合は、WinEDR ファイルをオフラインの分析ソフトウェアにエクスポートします。これにより、レベルのベースラインを提供するための変更と、ノイズを低減するためのフィルタの追加が可能になります。
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Representative Results
注射後数時間以内に、神経伝達物質受容体およびイオンチャネルを運ぶシナプス膜は、卵母細胞原形質膜と融合し始める。図1は、アフリカツメガエル卵母細胞に微小移植されたAMPAおよびGABAA受容体の記録を示す。ほとんどの分析において、異なるカエル由来の卵母細胞の2つまたは3つのバッチを使用して、サンプルあたり合計6〜9個の卵母細胞について、サンプルあたり2つまたは3つの卵母細胞からの応答を測定した。これは、ヒト被験者の大規模なコホートがグループの違いを観察するために行われます。分析は簡単で、応答の振幅を測定します。移植された膜の融合は分極プロセスであり、したがって注射部位の選択が非常に重要であることに注意することは重要である。植物半球または赤道への注入は、一貫した結果をもたらし、注入されたすべての卵母細胞は受容体を首尾よく挿入し、単峰性分布22に従うイオン電流を生成する。興味深いことに、膜が最初に動物極に注入されたとき、卵母細胞応答は二峰性分布に従った:卵母細胞の1つのグループは応答が全くまたは非常に低く、他方のグループは大きな応答を有し、植物極または赤道に注入された卵母細胞からのものよりもさらに大きい。ヒトの膜が注入され、卵母細胞の核内に閉じ込められていたため、動物極に注入された卵母細胞の一部が低い応答を有するかどうかを決定するために、魚雷の電気器官から単離された膜とGABAρ1サブユニットをコードするcDNAの混合物を動物側の極に注入した。魚雷膜からのニコチン性受容体はアセチルコリン23の灌流中に速い活性化および速い脱感作を示したが、ρ1サブユニットはGABA24、25、26、27の連続灌流中に脱感作しないホモマーGABAρ1受容体を形成する。共注入されたサンプルが誤って細胞質ではなく核に送達された場合、cDNAはRNAに転写され、機能的なGABAρ1受容体に翻訳される。図2は、注射が核を標的としたとき、アセチルコリンに対する高い応答を有する卵母細胞がGABAρ1受容体を発現しなかったことを示す。逆に、アセチルコリンに対する応答がゼロまたは低い卵母細胞はGABA受容体を発現した。この実験の結果は、まず、低応答卵母細胞において、膜が誤って卵母細胞の核に沈着したことを示している。第二に、核への魚雷膜の注入は、ρ1 cDNAの転写に大きく干渉しない。いくつかの共注射された卵母細胞は、アセチルコリンおよびGABAの両方に対して大きな応答を有し、注射中の核の破裂を示唆した。卵母細胞の動物半球への移植膜の挿入の増強は、異種発現神経伝達物質受容体26、28の分極局在を反映している。したがって、核を標的とせずに動物半球に注入することにより、より大きな応答を得ることができる。これは、受容体の数が少ないアルツハイマー病(AD)組織など、受容体の密度が低い標本を研究するために重要です(図3)。
図1:卵母細胞の代表的なイオン電流。 ヒトシナプス受容体からの膜を注入した卵母細胞からのイオン電流が記録された。AMPA受容体は100mM Kainateで活性化され、GABAA 受容体は1mM GABAで活性化された。VH = -80 mV. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:魚雷とGABAρ1の同時注入 アセチルコリン受容体に富むトルペドの電気器官からの濾過膜(0.1μm)とGABAρ1受容体をコードするcDNAの動物極への同時注入は、それらの応答に基づいて主に2群の卵母細胞を産生した:卵母細胞の1群(A)はアセチルコリン(Ach; 1mM)に対して大きな応答を示したが、1μM GABA(電圧は-80mVにクランプされた)に対する応答はなかった。 グループ(B)の卵母細胞は、AChに対する応答はヌルまたは低であったが、GABAに対する応答は大きかった。(c)グラフは、グループ1(n=5卵母細胞)およびグループ2(n=11卵母細胞)におけるピーク電流の平均(SEM)の平均±標準誤差を示す。グループ2の1つの卵母細胞は、核の破裂を示唆する大きなGABAおよびACh応答を有していた。その結果、応答の分布は、膜電流の分布の平均値と中央値の差(22nA対6nA)によって示されるように、低い値 に 歪んだ。この結果は、低応答卵母細胞の原因の1つが、膜が注入され、卵母細胞の核に閉じ込められていることを示している。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3: アフリカツメガエル 卵母細胞における細胞膜の分極挿入。 非AD脳(女性、74歳、死後間隔2.8時間)およびAD脳(女性、74歳、死後間隔4.5時間)から得られた濾過されていない膜を有する、動物または植物極に注射された卵母細胞のGABAおよびカイニン酸応答。核を標的とすることなく、動物極の近くに注射された卵母細胞は、植物極に注入された卵母細胞よりも大きな応答を与え、したがって、受容体の数が非常に少ない組織サンプルの研究を可能にした。植物極と動物極の間のスチューデン トのt検定:** p <0.01、*** p <0.001、バーはピーク電流の平均±SEMを示し、 n =5個の卵母細胞を各カラムに示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ヒトの脳からの天然タンパク質複合体の分析は、脳障害における恒常性および病理学的プロセスを理解し、疾患を予防または治療するための治療戦略を開発するために必要である。したがって、スナップ凍結サンプルを含む脳バンクは、大規模でほとんど未開発の豊富な生理学的情報の非常に貴重な情報源である29,30。死後組織を使用するための最初の懸念は、データの解釈を混乱させる可能性のあるmRNAまたはタンパク質分解の明確な可能性である。例えば、脳のpHは、定量的リアルタイムPCRによるmRNAの定量と一貫して正の相関を示しており、この相関は病態31とは無関係である。被験者間のpHの違いは、結果の解釈を曖昧にする可能性のある大きな分散を伴うmRNA定量の違いをもたらし得る32。興味深いことに、pHが酸性になるにつれてmRNA転写産物の定量性が低くなるにもかかわらず、異なる転写産物間の共分散は維持され33、病理学的状態の信頼できるトランスクリプトームプロファイリングを得るためのフレームワークを提供する。重要なことに、mRNAは分解性が高いが、死後組織中の膜貫通タンパク質は分解に対して非常に耐性がある34。実験室での以前の実験は、ヒト脳のGABAおよびグルタミン酸受容体が、非常に大きな死後間隔の後に機能することを実証している35。さらに、MSM法は、死の瞬間のpH、アゴナル状態、mRNAおよびタンパク質の分解などの潜在的な交絡因子が受容体の機能に及ぼす影響を直接測定することを可能にするため、この情報をデータの分析および解釈に使用する方法を提供する。
手法の変更とトラブルシューティング
前述のように、MSMは、全膜の元の移植のわずかな変更であり、これは、学者および製薬業界の多くの研究室によって広く検証および確認されている方法である12、36、37、38、39、40。例えば、受容体の微小移植は、脳領域選択性を示すAMPA受容体のTARPガンマ-8選択的アンタゴニストであるイーライリリーのLY3130481の開発において重要であった12。MSMは、シナプトソーム濃縮製剤を用いた同じ微小移植原理に従う。したがって、良好なシナプトソーム調製物を有することが重要である。Syn-Per法を使用するのは、この手順で得られた結果が非常に一貫しており、イオン電流の振幅がプロテオーム実験におけるシナプスタンパク質のレベルと非常によく相関するためです10。しかしながら、微小移植またはMSMは、優れた結果を有する多くの供給源(例えば、昆虫膜38、39、ニューロレンマ40)からの受容体を研究するために適合させることができる。シナプスがアルツハイマー病のように強く影響されるいくつかの障害があります, または少量で利用可能です;この場合、動物側の膜の注入は、より大きな電流を得るのに役立ちます。注入されるタンパク質の量を増やすと、膜の融合および応答のサイズも増加する。注入された膜の濃度と卵母細胞の生存との間には負の相関があるが、所与の実験分析を可能にする適切な濃度の膜を見出すことが可能である。
MSM の制限事項
MSMは、ヒト受容体またはイオンチャネルの研究のために開発された定量的方法である。したがって、入手が限られている組織を研究するのに適しています。 アフリカツメガエル 卵母細胞は内因性のグルタミン酸またはGABA受容体を有さないので、微小移植卵母細胞におけるGABAまたはグルタミン酸に対する応答は、卵母細胞の膜と融合した注射された受容体から来る。しかし、MSMの重要な制限は、微小移植および内因性チャネル/トランスポーターからのイオン電流の分離が困難であるため、卵母細胞においても内因的に発現されるイオンチャネルまたはトランスポーターの研究である。内因性遺伝子をサイレンシングする将来の研究は、この制限に役立つかもしれない。
既存の方法の意義は、MSMが天然膜をそれに対応するタンパク質および受容体と組み込んでおり、したがって、分析のためのより生理学的環境を提供することである。培養細胞41由来の神経伝達物質受容体AMPA型GluR1、α7-AcChoRs、およびα4β2-AcChoRsに観察されるように、卵母細胞への移植後も天然膜中の受容体の性質が保持されることが見出された。
この技術の将来の応用には、健常および罹患したヒト脳由来の培養および非培養細胞および組織の膜における目的の異なるタンパク質および受容体の電気生理学的特性の研究が含まれる。
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Disclosures
著者らは、開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、NIA/NIHのALへのR01AG070255およびR01AG073133の助成金によって支援された。我々はまた、この原稿に示されたヒト組織を提供してくれたカリフォルニア大学アーバイン・アルツハイマー病研究センター(UCI-ADRC)にも感謝する。UCI-ADRCは、NIH/NIA助成金P30 AG066519によって資金提供されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Microinjection | |||
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| 24 well, flat bottom Tissue Culture Plate | Thermofisher | FB012929 | |
| Flaming/Brown type micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
| Injection Dish | Thermofisher | 08-772B | |
| Microcentrifuge Tubes | Thermofisher | 02-682-002 | |
| Mineral Oil | Thermofisher | O121-1 | |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | |
| Nylon mesh | Industrial Netting | WN0800 | |
| Parafilm | Thermofisher | S37440 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Syringe | Thermofisher | 14-841-31 | |
| Ultrasonic cleaning bath | Thermofisher | FS20D | |
| Xenopus laevis frogs | Xenopus 1 | 4217 | |
| For Two Electrode Voltage clamp | |||
| 15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries | Sutter | B200-116-15 | |
| Any PC computer or laptop | |||
| Low-pass Bessel Filter | Warner Instruments | LPF-8 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Two electrode voltage clamp workstation | Warner Instruments | TEV-700 | |
| ValveLink 8.2 Perfusion Controller | Automate Scientific | SKU:01-18 | |
| WInEDR Free software | University of Strathclyde Glasgow | https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | |
| X Series Multifunction DAQ | National Instruments | NI USB-6341 | |
| Reagents | |||
| Calcium dichloride | Thermofisher | C79 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Thermofisher | C109 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Thermofisher | BP310 | |
| Kainic acid | Tocris | 0222 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Thermofisher | M63 | |
| Potassium chloride | Thermofisher | P217 | |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher | S233 | |
| Sodium chloride | Thermofisher | S271-1 | |
| Ultrafree-0.1 µm MC filter, | Amicon |
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