Протокол демонстрирует, что, выполняя микротрансплантацию синаптических мембран в ооциты Xenopus laevis , можно регистрировать последовательные и надежные ответы рецепторов α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты и γ-аминомасляной кислоты.
Возбуждающие и ингибирующие ионотропные рецепторы являются основными воротами потоков ионов, определяющих активность синапсов при физиологической нейронной коммуникации. Таким образом, изменения в их изобилии, функции и отношениях с другими синаптическими элементами наблюдались как основной коррелят изменений в функции мозга и когнитивных нарушений при нейродегенеративных заболеваниях и психических расстройствах. Понимание того, как функция возбуждающих и тормозных синаптических рецепторов изменяется болезнью, имеет решающее значение для разработки эффективных методов лечения. Чтобы получить информацию, относящуюся к заболеванию, важно регистрировать электрическую активность рецепторов нейротрансмиттеров, которые остаются функциональными в больном мозге человека. Пока это самый близкий подход к оценке патологических изменений в функции рецепторов. В данной работе представлена методика выполнения микротрансплантации синаптических мембран, которая заключается в реактивации синаптических мембран из замороженной ткани головного мозга человека, содержащей рецепторы человека, путем ее введения и заднего слияния в мембрану ооцитов Xenopus laevis . Протокол также обеспечивает методологическую стратегию получения последовательных и надежных ответов рецепторов α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (AMPA) и γ-аминомасляной кислоты (ГАМК), а также новые подробные методы, которые используются для нормализации и тщательного анализа данных.
Нейродегенеративными расстройствами страдает большой процент населения. Хотя их разрушительные последствия хорошо известны, связь между функциональными изменениями рецепторов нейротрансмиттеров, которые имеют решающее значение для функции мозга, и их симптоматикой все еще плохо изучена. Межиндивидуальная изменчивость, хронический характер заболевания и коварное появление симптомов — это лишь некоторые из причин, которые задержали понимание многих заболеваний головного мозга, где химический дисбаланс хорошо задокументирован 1,2. Животные модели генерировали бесценную информацию и расширили наши знания о механизмах, лежащих в основе физиологии и патофизиологии в эволюционно-консервативных системах; однако несколько межвидовых различий между грызунами и людьми исключают прямую экстраполяцию функции рецепторов от животных моделей к человеческому мозгу3. Таким образом, первоначальные усилия по изучению нативных рецепторов человека были разработаны лабораторией Рикардо Миледи с использованием хирургически удаленной ткани и замороженных образцов. В этих первоначальных экспериментах использовались целые мембраны, которые включают нейрональные синаптические и экстрасинаптические рецепторы, а также ненейрональные нейротрансмиттерные рецепторы, и хотя они предоставляют важную информацию о болезненных состояниях, существует опасение, что сочетание рецепторов усложняет интерпретацию данных 4,5,6,7. Важно отметить, что синапсы являются основной мишенью при многих нейродегенеративных расстройствах 8,9; поэтому анализы для проверки функциональных свойств пораженных синапсов имеют основополагающее значение для получения информации о связанных с заболеванием изменениях, влияющих на синаптическую связь. Здесь описана модификация оригинального метода: микротрансплантация синаптических мембран (МСМ), которая фокусируется на физиологической характеристике обогащенных синаптических белковых препаратов и успешно применяется для изучения синаптосом крыс и человека 10,11,12,13,14,15 . С помощью этой методологии можно трансплантировать синаптические рецепторы, которые когда-то работали в человеческом мозге, встроенные в их собственные нативные липиды и в их собственную когорту связанных белков. Более того, поскольку данные МСМ являются количественными, можно использовать эти данные для интеграции с большими протеомными или секвенирующими наборами данных10.
Важно отметить, что многие фармакологические и биофизические анализы синаптических рецепторов проводятся на рекомбинантных белках16,17. Хотя этот подход обеспечивает лучшее понимание структурно-функциональных отношений рецепторов, он не может предоставить информацию о сложных многомерных рецепторных комплексах, обнаруженных в нейронах, и их изменениях при заболевании. Поэтому комбинация нативных и рекомбинантных белков должна обеспечить более комплексный анализ синаптических рецепторов.
Существует множество методов получения синаптосом 10,11,12,13,14,15, которые могут быть скорректированы с учетом требований лаборатории. Протокол начинается с предположения, что синаптосомно-обогащенные препараты были выделены и готовы к переработке для экспериментов по микротрансплантации. В лаборатории используется метод Syn-Per в соответствии с инструкциями производителя. Сделано это из-за высокой воспроизводимости в электрофизиологических экспериментах10,11. Существует также обильная литература, объясняющая, как выделить ооциты Xenopus 18,19, которые также можно приобрести готовыми к инъекции20.
Анализ нативных белковых комплексов из мозга человека необходим для понимания гомеостатических и патологических процессов при заболеваниях головного мозга и разработки терапевтических стратегий профилактики или лечения заболеваний. Таким образом, банки мозга, содержащие заморожен…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами NIA/NIH R01AG070255 и R01AG073133 для AL. Мы также благодарим Исследовательский центр болезни Альцгеймера Калифорнийского университета в Ирвине (UCI-ADRC) за предоставление тканей человека, показанных в этой рукописи. UCI-ADRC финансируется грантом NIH/NIA P30 AG066519.
For Microinjection | |||
3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
24 well, flat bottom Tissue Culture Plate | Thermofisher | FB012929 | |
Flaming/Brown type micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
Injection Dish | Thermofisher | 08-772B | |
Microcentrifuge Tubes | Thermofisher | 02-682-002 | |
Mineral Oil | Thermofisher | O121-1 | |
Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | |
Nylon mesh | Industrial Netting | WN0800 | |
Parafilm | Thermofisher | S37440 | |
Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
Syringe | Thermofisher | 14-841-31 | |
Ultrasonic cleaning bath | Thermofisher | FS20D | |
Xenopus laevis frogs | Xenopus 1 | 4217 | |
For Two Electrode Voltage clamp | |||
15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries | Sutter | B200-116-15 | |
Any PC computer or laptop | |||
Low-pass Bessel Filter | Warner Instruments | LPF-8 | |
Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
Two electrode voltage clamp workstation | Warner Instruments | TEV-700 | |
ValveLink 8.2 Perfusion Controller | Automate Scientific | SKU:01-18 | |
WInEDR Free software | University of Strathclyde Glasgow | https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | |
X Series Multifunction DAQ | National Instruments | NI USB-6341 | |
Reagents | |||
Calcium dichloride | Thermofisher | C79 | |
Calcium nitrate tetrahydrate | Thermofisher | C109 | |
Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Thermofisher | BP310 | |
Kainic acid | Tocris | 0222 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Thermofisher | M63 | |
Potassium chloride | Thermofisher | P217 | |
Sodium bicarbonate | Thermofisher | S233 | |
Sodium chloride | Thermofisher | S271-1 | |
Ultrafree-0.1 µm MC filter, | Amicon |