Summary
Protokollen beskriver en trinvis metode til opstilling af en ex vivo-model for såret hud, der er inficeret med Staphylococcus aureus. Denne high-throughput-model simulerer bedre infektioner in vivo sammenlignet med konventionelle mikrobiologiske teknikker og præsenterer forskere for en fysiologisk relevant platform til at teste effekten af nye antimikrobielle stoffer.
Abstract
Udviklingen af antimikrobielle stoffer er en dyr proces med stadig lavere succesrater, hvilket gør det mindre attraktivt at investere yderligere i forskning i antimikrobielle opdagelser. Opdagelse af antimikrobielle lægemidler og efterfølgende kommercialisering kan gøres mere lukrativ, hvis en fail-fast-and-fail-cheap-tilgang kan implementeres inden for blyoptimeringsfaserne, hvor forskere har større kontrol over lægemiddeldesign og formulering. I denne artikel beskrives opsætningen af en ex vivo får såret hudmodel inficeret med Staphylococcus aureus, som er enkel, omkostningseffektiv, høj gennemstrømning og reproducerbar. Bakteriefysiologien i modellen efterligner, at under infektion som bakteriel spredning er afhængig af patogenets evne til at beskadige vævet. Etableringen af sårinfektion verificeres af en stigning i levedygtige bakterietal sammenlignet med podningen. Denne model kan bruges som en platform til at teste effektiviteten af nye antimikrobielle stoffer i blyoptimeringsfasen. Det kan hævdes, at tilgængeligheden af denne model vil give forskere, der udvikler antimikrobielle stoffer, en fail-fast-and-fail-cheap-model, som vil bidrage til at øge succesraten i efterfølgende dyreforsøg. Modellen vil også lette reduktionen og forfinelsen af dyrenes brug til forskning og i sidste ende muliggøre hurtigere og mere omkostningseffektiv oversættelse af nye antimikrobielle stoffer til hud- og bløddelsinfektioner til klinikken.
Introduction
Hudinfektioner er et vigtigt globalt problem med store økonomiske omkostninger for sundhedsudbydere over hele verden. Udviklingen af multiresistens og biofilmdannelse af patogener spiller en central rolle i forekomsten af ikke-helbredende sår 1,2,3,4. Som et resultat af dette er hud- og bløddelsinfektioner en af de mere almindelige årsager til forlænget indlæggelse og efterfølgende genindlæggelse5. Forsinkelser i sårheling er dyre for både patienten og sundhedsudbydere, med nogle skøn, der tyder på, at omkring 6,5 millioner patienter påvirkes årligt i USA. I Storbritannien resulterer hudinfektioner og tilhørende komplikationer i ca. 75.000 dødsfald årligt 2,4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) er et formidabelt sårpatogen, der ofte isoleres fra patientsår 2,7. Fremkomsten af multiresistens steg drastisk i 2000'erne. I løbet af denne tid var omkring 60% af akutte bakterielle hud- og hudstrukturinfektioner kulturpositive for methicillinresistente S. aureus1. Det stigende antal multiresistente stammer blandt stafylokokker og faktisk andre patogener inden for de sidste 2 årtier indikerer et presserende behov for hurtig udvikling af antibiotika med nye virkningsmåder, der kan overvinde resistens.
Siden begyndelsen af 2000'erne har antibiotikaopdagelsesprogrammer imidlertid været domineret af længere udviklingstider og lave succesrater, hvor kun 17% af nye antibiotika, der indgår i kliniske forsøg i USA, opnår markedsgodkendelse8. Dette tyder på en forskel mellem resultaterne fra in vitro-test af nye antibiotika og deres kliniske resultater. Det kan hævdes, at denne forskel i vid udstrækning skyldes forskelle i bakteriel fysiologi under infektioner in vivo og under konventionelle mikrobiologiske metoder, når man tester effektiviteten af antibiotika i in vitro prækliniske stadier. Derfor er der behov for nye laboratoriemetoder, der er mere repræsentative for bakteriel fysiologi under infektion, for at forbedre succesraterne i antibiotikaopdagelsesprogrammer.
De nuværende metoder til undersøgelse af hudinfektioner omfatter undersøgelser af levende dyr (f.eks. mus), ex vivo-hudmodeller (f.eks. svin) og hudmodeller konstrueret til 3D-væv (f.eks. mennesker)9,10,11,12. Undersøgelser af levende dyr er strengt regulerede og har relativt lav gennemstrømning. I dyremodeller forårsager sår og infektion betydelig nød for dyrene og giver anledning til etiske bekymringer. Modeller af menneskelig hud, ex vivo- eller vævsmodeller, kræver etisk godkendelse, overholdelse af lokal og global lovgivning (loven om humant væv, Helsingforserklæringen), og der er vanskeligheder med at erhverve væv, idet nogle anmodninger tager år at opfylde13,14. Begge modeltyper er arbejdskrævende og kræver betydelig ekspertise for at sikre eksperimentel succes. Nogle nuværende ex vivo-hudinfektionsmodeller kræver præpodede diske og tilsætningsstoffer til sårbunden for at muliggøre infektion; Selvom disse modeller er utroligt nyttige, er der begrænsninger i infektionsprocessen, da tilsætningsstoffer begrænser brugen af sårbunden som næringskilde10,15,16,17. Den model, der er beskrevet i denne undersøgelse, bruger ingen tilsætningsstoffer til sårlejet, hvilket sikrer, at infektionspatologien og levedygtige celletal er et resultat af direkte udnyttelse af sårlejet som den eneste næringskilde.
I betragtning af behovet for nye laboratoriemetoder er der udviklet en ny ex vivo-fåremodel med høj kapacitet af hudinfektioner til brug ved evaluering af virkningen af nye antibiotika. Hudinfektionsundersøgelser står over for mange udfordringer - høje omkostninger, etiske bekymringer og modeller, der ikke viser et fuldt billede20,21. Ex vivo-modeller og 3D-explant-modeller giver mulighed for bedre visualisering af sygdomsprocessen og den indvirkning, behandlinger kan have fra en mere klinisk relevant model. Her beskrives opsætningen af en ny fårehudsmodel, som er enkel, reproducerbar og klinisk relevant og har høj gennemstrømning. Fåreskind blev valgt som får er et af de store pattedyr, der almindeligvis bruges til at modellere reaktioner på infektioner in vivo. Desuden er de let tilgængelige fra slagterier, hvilket sikrer en stabil forsyning af hud til forskning, og deres kroppe er ikke skoldede, hvilket sikrer god vævskvalitet. Denne undersøgelse brugte S. aureus som det eksemplariske patogen; Modellen fungerer dog godt med andre mikroorganismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Lams hoveder fra R.B Elliott og Son Abattoir blev brugt som kilde til hudprøver i dette projekt. Alle lam blev slagtet til konsum som mad. I stedet for at kassere hovederne blev disse genbrugt til forskning. Etisk godkendelse var ikke påkrævet, da vævet stammede fra affald kasseret fra slagterier.
1. Sterilisering
- Desinficer tang inden opsamling af hovederne ved at tage rene tang og udføre tør varmesterilisering i en ovn ved 200 ° C i 1 time. Autoklave alt glasvarer ved 121 °C i 15 minutter før brug.
- Udfør alt beskrevet arbejde inden for et mikrobiologisk klasse 2 kabinet. Forbered alle reagenser i henhold til producentens anvisninger.
2. Prøveindsamling
- På slagteriet blev Swaledale-lam slagtet ved bedøvelse ved hjælp af elektricitet eller en pistol med fangenskab og ekssanguineret. Saml lammehoveder højst 4 timer efter slagtning.
3. Forberedelse af hovederne
- Lammets pandesektion desinficeres ved at hælde ca. 100 ml 200 ppm klordioxidopløsning på prøveområdet. Barber pandesektionen af hovedet ved hjælp af elektriske klippere og vask området med 200 ml 200 ppm klordioxidopløsning.
- Tør området af med ethanol og blå rulle, og dæk prøveområdet med hårfjerningscreme i 35 minutter. Skrab forsigtigt hårfjerningscremen af ved hjælp af et skrabeværktøj, og vurder prøveområdet. Hvis der er en betydelig mængde hår tilbage, skal du gentage hårfjerningsprocessen.
- Brug yderligere 200 ml klordioxidopløsning til at skylle området, og skyl derefter med ethanol og tør af med en blå rulle.
- Ved hjælp af en steril 8 mm biopsistans skæres 8 mm hudprøver ud af det forberedte område. Fjern prøverne ved hjælp af steril tang og en 15-bladet skalpel, hvilket sikrer, at alt kutant fedt fjernes.
- Anbring prøverne i en steril 0,5 L krukke fyldt med sterilt fosfatbufferet saltvand (PBS), og overfør dem derefter til sterile 50 ml rør med 50 ml 200 ppm klordioxidopløsning, inverter to gange, og lad dem sterilisere i 30 minutter.
- Prøverne fjernes fra klordioxidopløsningen, og dem vaskes ved at anbringes i et 50 ml rør fyldt med 40 ml steril PBS. Når den er vasket, skal du placere hver enkelt hudprøve i en separat brønd på en 24-brøndsplade.
- Der tilsættes 350 μL forvarmet medium, samtidig med at prøven opretholdes ved luft-væske-grænsefladen. Mediets sammensætning er som følger: MK-medier (medium 199 med Hanks salte, L-glutamat og 1,75 mg / ml natriumbicarbonat) og skinkes F12 i forholdet 1: 1 med tilsat FBS (10% v / v), EGF (10 ng / ml), insulin (5 μg / ml), penicillin-streptomycin (100 U / ml) og amphotericin B (2,5 μg / ml).
- De 24 brøndplader forsegles med en gasgennemtrængelig pladeforsegling, og der inkuberes ved 37 °C i en befugtet 5 % CO2 -vævsinkubator i op til 24 timer.
4. Vedligeholdelse af hudprøver
- Efter inkubation fjernes dyrkningsmediet, og prøverne skylles i 500 μL steril PBS. Der tilsættes antibiotikafrie medier til hver prøve, og der inkuberes ved 37 °C i en befugtet 5 % CO2 -vævsinkubator i 24 timer for at fjerne resterende antibiotika i prøven.
- Hvis turbiditet eller svampeinfektion udvikler sig i de antibiotikafrie medier efter 24 timer, skal prøven kasseres.
5. Forberedelse af inokulumet
- Forbered et 50 ml rør med 10 ml steril tryptisk soja bouillon. Tag en frisk agar plade af S. aureus og brug en vatpind til at overføre flere kolonier til bouillon. Inkuberes i 18 timer ved 37 °C ved 150 o/min.
- Centrifuge ved 4.000 x g i 3 min. Supernatanten fjernes, og cellepelleten gensuspenderes i 10 ml steril PBS. Gentag to gange for at sikre tilstrækkelig vask af cellerne.
- Inokulum justeres til 0,6 OD600 i steril PBS. Bekræft podebelastningen ved at foretage en manuel levedygtig pladetælling.
6. Infektion af hudprøver
- Forbered en frisk 24-brønds plade med 400 μL forvarmede antibiotikafrie medier og tilsæt de 24 brøndindsatser ved hjælp af sterile tang.
- Fjern mediet fra hudprøverne, vask med 500 μL steril PBS, og fjern vasken. Brug steril tang til forsigtigt at holde prøven til bunden af brønden.
- Brug en 4 mm stansebiopsi til at lave en central sårklap, der gennemborer til en grov dybde på 1-2 mm. Brug derefter en 15-bladet skalpel og sterile tandede allisvævstang til at fjerne det øverste lag af sårklappen. Variabilitet i sårdimensionerne kan påvirke resultatet af infektionen og endepunktskolonidannende enheder (CFU).
- Når alle prøverne er blevet såret, overføres de til de 24 brøndindsatser ved hjælp af steril tang. Pipetter 15 μL af bakteriepodet i sårlejet. Derefter inkuberes i 24 timer ved 37 °C i en befugtet 5% CO2 vævsinkubator.
- Hvis længere inkubationsperioder er nødvendige, skal du fjerne mediet og erstatte det med friske medier hver 24. time og inkubere under de samme forhold.
7. Bestemmelse af bakteriebelastningen
- Fjern medierne fra bunden af brøndene. Med steril tang overføres hver prøve til et separat 50 ml rør fyldt med 1 ml steril PBS.
- Brug en finspidset homogenisator til at homogenisere overfladen af prøven. Sørg for at sikre, at sårlejet er i direkte kontakt med spidsen af homogenisatoren.
- Hver prøve homogeniseres i 35 s på medium/høj. Homogenisatoren løsner bakterierne fra overfladen af sårbunden for at muliggøre opregning af bakteriebelastningen.
- Når alle prøverne er behandlet, skal hver prøve skiftes inden pipettering. Dette er for at sikre, at bakteriehomogenatet blandes.
- Pipetter 20 μL hvirvelhomogenat i den tilsvarende brønd i en 96-brønds plade indeholdende 180 μL steril PBS.
- Serielt fortyndes hver prøve homogenat til 1 x 10-7 og pipetterer 10 μL af det fortyndede homogenat på en tryptisk sojaagarplade i tre eksemplarer.
- Agarpladen inkuberes i 18 timer ved 37 °C. Tæl derefter antallet af kolonier for at bestemme CFU for hver prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Identifikationen af en rute til sterilisering af huden, før sårinfektionsmodellen blev oprettet, var udfordrende. Udfordringen lå i at sterilisere huden uden at beskadige de forskellige hudlag, som så kan få utilsigtede konsekvenser for udfaldet af infektionen. For at identificere et passende steriliseringsregime blev forskellige behandlinger forsøgt i varierende tid, som beskrevet i tabel 1. Forurening blev registreret som udvikling af turbiditet efter 48 timer i MK-mediet, der blev brugt til at vedligeholde hudprøverne. Vævsintegritet blev overvåget ved histologi efterfulgt af farvning med hæmatoxylin og eosin (H&E) umiddelbart efter behandlingen (figur 1). En 30 minutters behandling med klordioxid viste sig at være den mest effektive til reproducerbar sterilisering af hudvævet og samtidig bevare vævets integritet.
I forsøgsopstillingen placeres det sårede sterile væv i det apikale kammer i en 24-brøndsindsats ved luft-væske-grænsefladen (figur 2A). To forskellige sårteknikker blev forsøgt - en klapfjernelsesteknik, hvor vævet såres af et slagbiopsiværktøj, og det øverste lag af det sårede væv fjernes ved hjælp af en kombination af en 15-bladet skalpel og steril tandet allisvævstang og en ridseteknik, hvor vævet såres af et slagbiopsiværktøj alene. Selvom skrabemodellen havde et højere gennemsnitligt antal CFU'er efter 24 timer, var resultaterne variable. Kloppefjernelsesteknikken gav mere ensartede resultater (figur 2C). Efter 48 timer blev der genvundet ca. 100 gange flere bakterielle CFU'er fra det sårede væv sammenlignet med podemusklen (figur 2D). Dette blev anset for at indikere en vellykket infektion. En hvid film i sårlejet var tydelig på vævet 48 timer efter infektion (figur 2B). Gramfarvede histologiske sektioner af inficeret væv indikerede tilstedeværelsen af S. aureus-celler i sårlejet (figur 2E, F). Gramfarvede histologiafsnit af uinficeret væv leveres som komparator (figur 2G, H).
Fra et lammehoved kan en 100 cm2 sektion (10 cm x 10 cm) være realistisk tilgængelig. Da hvert hudplaster er stanset ud af panden ved hjælp af en cirkulær punchbiopsi med en diameter på 8 mm, kan der fås ca. 100 hudpletter fra et lams pande om ugen. Anskaffelse af yderligere lammehoveder øger forholdsmæssigt antallet af skindprøver, der kan fås om ugen. Derfor hævdes det, at proceduren er relativt høj gennemstrømning. Til denne undersøgelse blev der rutinemæssigt taget 24 hudprøver om ugen. Hud fra forskellige lammehoveder blev behandlet som biologiske replikater for at tage højde for den potentielle donor til donorvariation. Under tilberedningen af hudplastrene (trin 3.1-3.8) er det største tidsforbrug 30 minutters inkubation af hudprøverne i klordioxidopløsningen og 2 x 35 minutters ventetid på hårfjerningscremebehandlingen. Brugen af punch biopsi til at generere de 24 hudplastre tager ca. 15 min. Det er denne gang, der ville skalere lineært, hvis antallet af hudpletter blev øget.
| Desinfektionsmiddel | 10 minutter | 30 minutter | 60 minutter |
| 1% medicinsk overfladedesinfektionsmiddel på højt niveau | F | P | P |
| 1% multifunktionelt desinfektionsmiddel | F | F | P |
| 3% povidon | F | F | F |
| 5% povidon | F | P | P |
| 10% povidon | F | P | P |
| 70% ethanol | F | P | P |
| UV | F | F | F |
| 0,55% hypochlorit | F | P | P |
| 200 ppm klordioxid | F | P | P |
Tabel 1: Sterilisering af fersk lammeskind. Hver hudprøve blev efterladt i desinfektionsmidlet i den angivne tid. F betegner manglende sterilisering af vævet, med bakteriel forurening til stede i medierne. P betegner forbipasserende, uden bakteriel forurening til stede i medierne.
Figur 1: Histologi af uinficeret ex vivo fårehud behandlet med desinfektionsmidler (H&E plet) ved 100x forstørrelse. (A) Kontrollere hudprøve med 30 minutters behandling i PBS. Nogle epidermale shedding kan ses, men epidermis er ikke forstyrret. (B) Fåreskind behandlet med 1% medicinsk overfladedesinfektionsmiddel på højt niveau i 30 min. Epidermal shedding (sort pil) sammen med en vis forstyrrelse af stratum granulosum (blå pil). C) Fåreskind behandlet med 5% povidon i 30 min. Moderat skade på vævet kan ses her, med epidermal udgydelse af stratum corneum (sort pil). Der er minimal forstyrrelse af de underliggende epidermale lag. D) Fåreskind behandlet med 10% povidon i 30 min. De øverste lag af epidermis er blevet beskadiget, med tegn på kaste (sort pil) og udtynding (grøn pil). (E) Fåreskind behandlet med 2% multifunktionelt desinfektionsmiddel i 30 min. Alvorlig skade på prøven kan observeres med signifikant epidermal afgivelse (sort pil) og fuldstændig udryddelse af stratum corneum (rød pil). (F) Fåreskind behandlet med 200 ppm klordioxid i 30 min. Nogle epidermale shedding kan ses, men epidermis er intakt. (G) Fåreskind behandlet med 0,6% hypochlorit i 30 min. Alvorlig skade på epidermis er til stede, med et højt niveau af epidermal shedding (sort pil) og udryddelse af epidermis på steder (rød pil). H) Fåreskind behandlet med 70 % ethanol i 30 min. Skader på epidermis kan ses, med betydelig epidermal shedding (sort pil). Skalabjælken er 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Ex vivo fårehud inficeret med S. aureus. (A) Skematisk for forsøgsopstillingen. (B) Billeder af ex vivo fårehud før infektion (venstre billede) og post 48 h infektion (højre billede). Bemærk den hvide film, der er til stede efter 48 timers inkubation i inficeret væv, som er fraværende i uinficeret væv. (C) Test af virkningen af forskellige sårmetoder på den endelige kolonidannende enhed (CFU) tæller efter homogenisering. Flap fjernelse (n = 6) og ridse (n = 9) inficeret med S. aureus i 24 timer. Fejllinjer angiver standardafvigelse. angiver en p-værdi < 0,0001. (D) Test af inkubationstidernes effekt på CFU-tællinger efter homogenisering. 24 timers inkubation (n = 6) og 48 timer inkubation (n = 12). Fejllinjer angiver standardafvigelse. angiver en p-værdi < 0,0001. (E,F) Repræsentative billeder af histopatologisk analyse af inficeret fårehud efter 48 timers infektion med en modificeret Gram-plet (E) ved 100x forstørrelse (skalabar på 200 μm). Feltet angiver arealet forstørret i (F) ved 1.000x forstørrelse (skalabjælke på 50 μm). Sorte pile angiver bakterier. (G,H) Repræsentative billeder af histopatologisk analyse af uinficeret fårehud efter en 48 timers periode (kontrol) med en modificeret gGram-plet (G) ved 100x forstørrelse (skalabar på 200 μm). Feltet angiver arealet forstørret i (H) ved 1.000x forstørrelse (skalabjælke på 50 μm). Statistisk analyse blev udført som en envejs ANOVA. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Udviklingen af antimikrobielle stoffer er et vigtigt, men dyrt foretagende, der anslås at koste omkring 1 milliard dollars og tage omkring 15 år at gennemføre. Over 90% af antimikrobielle lægemiddelopdagelser og prækliniske undersøgelser af antimikrobiel lægemiddeleffektivitet udføres af akademiske forskere og små til mellemstore virksomheder med typisk mindre end 50 ansatte22. Disse hold er meget økonomisk begrænsede, hvilket gør blymolekylernes svigt i senere stadier af translationel forskning katastrofal. Stigningen i antimikrobiel resistens overhaler udviklingen af nye antimikrobielle stoffer, hvilket yderligere forstærker behovet for at forvalte de allerede begrænsede investeringer i antimikrobiel forskning ansvarligt23.
Forskellen i bakteriel fysiologi mellem infektioner in vivo og in vitro laboratoriekulturer har tendens til at forårsage en overvurdering af den antimikrobielle effekt af hits i blyidentifikationsfasen. En sådan overvurdering bidrager til de høje nedslidningsrater, der ses i de efterfølgende stadier af oversættelsen. Tilgængeligheden af in vitro antimikrobielle effektivitetstestplatforme, der inkorporerer bakterier med en fysiologi, der bedre efterligner det, der findes under infektioner in vivo, vil muliggøre en mere nøjagtig estimering af antimikrobiel effektivitet og give forskere større kontrol med blyoptimering uden afhængighed af dyre og tæt regulerede dyreforsøg. Sådanne modeller vil også mindske nedslidningsraten i de efterfølgende faser af oversættelsen og kan gøre opdagelse af antimikrobielle lægemidler mere attraktiv for investeringer.
Denne model for infektion i fårehud, der er beskrevet her, er et nyttigt værktøj, der vil give forskere en fysiologisk relevant in vitro-model af et inficeret sår til at teste effekten af nye topiske antimikrobielle formuleringer i de prækliniske stadier. I modsætning til de fleste ex vivo-infektionsmodeller, der er beskrevet i den videnskabelige litteratur10,15,24,25,26,27,28, suppleres patogenerne i denne model ikke med kulturmedier under infektion. Patogenspredning og efterfølgende infektion er afhængig af organismens evne til at beskadige vævet. Derfor er patogenfysiologien i denne model tættere forbundet med den under in vivo-infektioner sammenlignet med konventionelle mikrobiologiske kulturer. En meget reproducerbar infektion opnås fra denne model, som bedømt ud fra antallet af CFU'er hentet fra vævet efter inkubation.
Med overfloden af humane hudækvivalenter og human og svin ex vivo sårmodeller kan brugen af fårevæv i denne model overfladisk hævdes at være en begrænsning. Får er dog blandt gruppen af store dyr, der anvendes som modeller for infektioner in vivo 29,30,31. Desuden er får blevet brugt som surrogater for mennesker i immunologisk forskning og vaccineudvikling, hvilket indikerer, at deres immunrespons ligner menneskers32. Vævsreparationsprocessen under sårheling er ens hos store pattedyr, herunder får og mennesker33,34, og interventioner til forbedring af sårheling, der med succes er blevet demonstreret hos får, er blevet foreslået til oversættelse til mennesker35,36,37. Derfor er brugen af ex vivo fårehud i denne sårmodel ikke en begrænsning. Desuden kan denne fåremodel vurderes at være et pålideligt alternativ til modeller, der inkorporerer menneske- eller svinehud af følgende grunde. Tilgængeligheden af menneskelig hud er begrænset og af varierende kvalitet, når den er tilgængelig38. Vævsmanipuleret human epidermis og levende hudækvivalenter kræver forbedringer i deres dyrkningsforhold for at sikre reproducerbarhed i vævsfysiologi39. Selvom svinehud er mere tilgængelig end menneskelig hud, skoldes den bredt tilgængelige svinehud som en del af slagtekropsforarbejdning i slagteriet, hvilket fjerner epidermis10. Erfaringsmæssigt er uskoldet svinehud mindre let tilgængelig fra slagterier.
I hele protokollen beskrevet her er der kritiske trin, der sikrer modellens succes. Det mest kritiske trin involverer sterilisering af vævet efter høst. Klordioxidopløsning skal blandes med vævsprøverne, og der skal tillades en kontakttid på 30 minutter for at desinficere vævet tilstrækkeligt og fjerne forurenende stoffer. Desuden kan der ved opsætning af dette eksperiment forekomme turbiditet eller svampekontaminering på grund af forkert håndtering eller ineffektiv behandling med desinfektionsmidler og antibiotiske medier. I et sådant tilfælde skal prøver, der udvikler turbiditet, kasseres. For at reducere udviklingen af turbiditet og forurening skal laboratoriemiljøet holdes rent med hyppig sterilisering af inkubatoren, brug af filterspidser og sikring af fuldstændig sterilisering af de værktøjer og beholdere, der anvendes sammen med prøverne. Et andet kritisk trin i protokollen er, når 4 mm biopsistansen bruges til at såre vævet. Brugen af dette værktøj giver mulighed for sårsenge af samme størrelse for at sikre protokollens repeterbarhed og reproducerbarhed. Variabilitet i sårlejets størrelse påvirker endepunktet CFU. Når der er tilstrækkelig fjernelse af vævsklappen, er resultaterne meget mere konsistente. Et yderligere kritisk trin forbundet med integriteten af endepunkts CFU-tælling er brugen af den finspidsede homogenisator til at frigøre bakterieceller. Homogenisatorspidsens position blev set at have indflydelse på CFU-tællingen fra prøve til prøve; Når spidsen var korrekt placeret direkte på sårlejet, var der meget mindre variation set fra prøve til prøve.
Ikke desto mindre er den model, der foreslås her, ikke uden begrænsninger. Denne model har begrænsninger, der er forbundet med alle ex vivo-undersøgelser (dvs. manglen på aktiv vaskulær strømning, fraværet af kommensal mikrobiota, som kan modulere infektionsfremskridt, og fraværet af immunceller). Det kan hævdes, at eftersom ex vivo-sårmodellen ikke indeholder aktive immunceller, kan infektionsprogressionen in vivo i disse cellers tilstedeværelse være forskellig fra den, der observeres i ex vivo-modeller. Uanset hvad giver ex vivo-modeller en vævsoverflade til fastgørelse og en næringskilde til bakterier og præsenterer en 3D-diffusionsbarriere for formuleringer, som muliggør en mere nøjagtig vurdering af antimikrobiel effektivitet end konventionelle mikrobiologiske kulturteknikker.
En vigtig fordel ved modellen er, at vævet stammer fra lam, der dyrkes til konsum. Mere specifikt genbruger modellen hud fra lammehoveder, som normalt kasseres. Desuden har modellen høj kapacitet og muliggør omkostningseffektive, hurtige og reproducerbare sammenlignende undersøgelser. Det kan hævdes, at tilgængeligheden af denne model vil reducere og forfine behovet for dyr, der er målrettet opdrættet til translationel forskning i overensstemmelse med principperne i de tre R'er, som letter mere human forskningspraksis. Selvom den model, der er beskrevet her, inkorporerer S. aureus som det eksemplariske patogen, kan modellen bruges sammen med andre mikroorganismer, herunder andre bakterier, svampe og vira, hvilket udvider omfanget af lægemiddeludvikling, som modellen muliggør. Det kan forestilles, at brugen af denne model vil muliggøre hurtig oversættelse af tiltrængte antibiotika til hudinfektioner ved at give forskere større kontrol over lægemiddeldesign og formulering i de prækliniske stadier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke EPSRC (EP/R513313/1) for finansieringen. Forfatterne vil også gerne takke R.B Elliot og Son Abattoir i Calow, Chesterfield, for at levere lammehoveder og for at være så imødekommende i de tidlige stadier af projektet, Kasia Emery for hendes støtte gennem hele udviklingen af denne protokol og Fiona Wright fra Institut for Infektion, Immunitet og Kardiovaskulær Sygdom ved University of Sheffield for at behandle histologiprøverne og være så utroligt hjælpsomme gennem hele dette projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
| 4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| 8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
| Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
| Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
| Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
| Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
| Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
| Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
| Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
| Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
| Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |
References
- Claeys, K. C., et al. Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections. International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).
- Rahim, K., et al.
- Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. Costs and outcomes in evaluating management of unhealed surgical wounds in the community in clinical practice in the UK: A cohort study. BMJ Open. 8 (12), 022591 (2018).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Wilcox, M. H., Dryden, M. Update on the epidemiology of healthcare-acquired bacterial infections: Focus on complicated skin and skin structure infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76, Supplement 4 (2021).
- Han, G., Ceilley, R. Chronic wound healing: A review of current management and treatments. Advances in Therapy. 34 (3), 599-610 (2017).
- Percival, S. L., Hill, K. E., Malic, S., Thomas, D. W., Williams, D. W. Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 1-9 (2011).
- Dheman, N., et al. An analysis of antibacterial drug development trends in the United States, 1980-2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (11), 4444-4450 (2021).
- MacNeil, S., Shepherd, J., Smith, L. Production of tissue-engineered skin and oral mucosa for clinical and experimental use. Methods in Molecular Biology. 695, 129-153 (2011).
- Yang, Q., et al. Development of a novel ex vivo porcine skin explant model for the assessment of mature bacterial biofilms. Wound Repair and Regeneration. 21 (5), 704-714 (2013).
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Lovaglio, J., Deleo, F. R. Mouse model of Staphylococcus aureus skin infection. Methods in Molecular Biology. 1031, 109-116 (2013).
- Brandenburg, K. S., Calderon, D. F., Kierski, P. R., Czuprynski, C. J., Mcanulty, J. F. Novel murine model for delayed wound healing using a biological wound dressing with Pseudomonas aeruginosa biofilms. Microbial Pathogenesis. 122, 30-38 (2018).
- Bledsoe, M. J., Grizzle, W. E. The use of human tissues for research: What investigators need to know. Alternatives to Laboratory Animals. , (2022).
- Danso, M. O., Berkers, T., Mieremet, A., Hausil, F., Bouwstra, J. A. An ex vivo human skin model for studying skin barrier repair. Experimental Dermatology. 24 (1), 48-54 (2015).
- Torres, J. P., et al. Ex vivo murine skin model for B. burgdorferi biofilm. Antibiotics. 9 (9), 1-18 (2020).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge: A model for the study of chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 18 (5), 467-477 (2010).
- Schierle, C. F., Dela Garza, M., Mustoe, T. A., Galiano, R. D. Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelialization in a murine cutaneous wound model. Wound Repair and Regeneration. 17 (3), 354-359 (2009).
- Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).
- Thompson, M. G., et al. Evaluation of gallium citrate formulations against a multidrug-resistant strain of Klebsiella pneumoniae in a murine wound model of infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (10), 6484-6493 (2015).
- Maboni, G., et al. A novel 3D skin explant model to study anaerobic bacterial infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 404 (2017).
- Macneil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).
- Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A., Karlén, A. The global preclinical antibacterial pipeline. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 275-285 (2019).
- Miethke, M., et al. Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics. Nature Reviews Chemistry. 5 (10), 726-749 (2021).
- Guedes, G. M. M., et al. Ex situ model of biofilm-associated wounds: Providing a host-like environment for the study of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Applied Microbiology. 131 (3), 1487-1497 (2021).
- Johnson, C. J., et al. Augmenting the activity of chlorhexidine for decolonization of Candida auris from porcine skin. Journal of Fungi. 7 (10), 804 (2021).
- Horton, M. V., et al. Candida auris Forms High-Burden Biofilms in Skin Niche Conditions and on Porcine Skin. mSphere. 5 (1), 00910-00919 (2020).
- Ashrafi, M., et al. Validation of biofilm formation on human skin wound models and demonstration of clinically translatable bacteria-specific volatile signatures. Scientific Reports. 8, 1-16 (2018).
- Brackman, G., Coenye, T. In vitro and in vivo biofilm wound models and their application. Advances in Experimental Medicine and Biology. 897, 15-32 (2016).
- Rumbaugh, K. P., Carty, N. L. In Vivo Models of Biofilm Infection. Biofilm Infections. , Springer. New York, NY. 267-290 (2011).
- Boase, S., Valentine, R., Singhal, D., Tan, L. W., Wormald, P. J. A sheep model to investigate the role of fungal biofilms in sinusitis: Fungal and bacterial synergy. International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (5), 340-347 (2011).
- Williams, D. L., et al. Experimental model of biofilm implant-related osteomyelitis to test combination biomaterials using biofilms as initial inocula. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 100 (7), 1888-1900 (2012).
- Scheerlinck, J. P. Y., Snibson, K. J., Bowles, V. M., Sutton, P. Biomedical applications of sheep models: From asthma to vaccines. Trends in Biotechnology. 26 (5), 259-266 (2008).
- Metcalfe, A. D., Ferguson, M. W. J. Tissue engineering of replacement skin: The crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration. Journal of the Royal Society Interface. 4 (14), 413-417 (2007).
- Kazemi-Darabadi, S., Sarrafzadeh-Rezaei, F., Farshid, A. A., Dalir-Naghadeh, B. Allogenous skin fibroblast transplantation enhances excisional wound healing following alloxan diabetes in sheep, a randomized controlled trial. International Journal of Surgery. 12 (8), 751-756 (2014).
- Martinello, T., et al. Allogeneic mesenchymal stem cells improve the wound healing process of sheep skin. BMC Veterinary Research. 14 (1), 1-9 (2018).
- Roberts, C. D., Windsor, P. A. Innovative pain management solutions in animals may provide improved wound pain reduction during debridement in humans: An opinion informed by veterinary literature. International Wound Journal. 16 (4), 968 (2019).
- Mazzone, L., et al. Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).
- Olkowska, E., Gržinić, G. Skin models for dermal exposure assessment of phthalates. Chemosphere. 295, 133909 (2022).
- Couto, N., et al. Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model. Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).
