Summary
प्रोटोकॉल स्टेफिलोकोकस ऑरियस से संक्रमित एक पूर्व विवो ओविन घायल त्वचा मॉडल स्थापित करने के लिए एक चरण-दर-चरण विधि का वर्णन करता है। यह उच्च-थ्रूपुट मॉडल पारंपरिक माइक्रोबायोलॉजी तकनीकों की तुलना में विवो में संक्रमण का बेहतर अनुकरण करता है और शोधकर्ताओं को उभरते रोगाणुरोधी की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए शारीरिक रूप से प्रासंगिक मंच के साथ प्रस्तुत करता है।
Abstract
एंटीमाइक्रोबियल का विकास तेजी से कम सफलता दर के साथ एक महंगी प्रक्रिया है, जो रोगाणुरोधी खोज अनुसंधान में आगे निवेश को कम आकर्षक बनाता है। रोगाणुरोधी दवा की खोज और बाद में व्यावसायीकरण को अधिक आकर्षक बनाया जा सकता है यदि एक असफल-तेज-और-असफल-सस्ता दृष्टिकोण लीड अनुकूलन चरणों के भीतर लागू किया जा सकता है जहां शोधकर्ताओं के पास दवा डिजाइन और सूत्रीकरण पर अधिक नियंत्रण है। इस लेख में, स्टेफिलोकोकस ऑरियस से संक्रमित एक पूर्व विवो ओविन घायल त्वचा मॉडल के सेटअप का वर्णन किया गया है, जो सरल, लागत प्रभावी, उच्च थ्रूपुट और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। मॉडल में जीवाणु शरीर विज्ञान संक्रमण के दौरान नकल करता है क्योंकि जीवाणु प्रसार ऊतक को नुकसान पहुंचाने के लिए रोगज़नक़ की क्षमता पर निर्भर है। घाव संक्रमण की स्थापना इनोकुलम की तुलना में व्यवहार्य जीवाणु गणना में वृद्धि से सत्यापित होती है। इस मॉडल का उपयोग लीड ऑप्टिमाइज़ेशन चरण में उभरते रोगाणुरोधी की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए एक मंच के रूप में किया जा सकता है। यह तर्क दिया जा सकता है कि इस मॉडल की उपलब्धता एक असफल-फास्ट-एंड-फेल-सस्ते मॉडल के साथ रोगाणुरोधी विकसित करने वाले शोधकर्ताओं को प्रदान करेगी, जो बाद के पशु परीक्षणों में सफलता दर बढ़ाने में मदद करेगी। मॉडल अनुसंधान के लिए पशु उपयोग की कमी और शोधन की सुविधा भी प्रदान करेगा और अंततः क्लिनिक में त्वचा और नरम ऊतक संक्रमण के लिए नए रोगाणुरोधी के तेजी से और अधिक लागत प्रभावी अनुवाद को सक्षम करेगा।
Introduction
त्वचा संक्रमण एक महत्वपूर्ण वैश्विक मुद्दा है, जिसमें दुनिया भर के स्वास्थ्य सेवा प्रदाताओं के लिए बड़ी आर्थिक लागत है। रोगजनकों द्वारा मल्टीड्रग प्रतिरोध और बायोफिल्म गठन का विकास गैर-उपचार घावों के प्रसार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है 1,2,3,4. इसके परिणामस्वरूप, त्वचा और नरम ऊतक संक्रमण विस्तारित अस्पताल में भर्ती होने और बाद मेंपुनः प्रवेश के लिए अधिक सामान्य कारणों में से एक हैं। घाव भरने में देरी रोगी और स्वास्थ्य सेवा प्रदाताओं दोनों के लिए महंगी है, कुछ अनुमानों से पता चलता है कि अमेरिका में सालाना लगभग 6.5 मिलियन रोगी प्रभावित होते हैं। यूके में, त्वचा संक्रमण और संबंधित जटिलताओं के परिणामस्वरूप सालाना लगभग 75,000 मौतेंहोती हैं।
स्टेफिलोकोकस ऑरियस (एस ऑरियस) एक दुर्जेय घाव रोगज़नक़ है जो अक्सर रोगी केघावों से अलग होता है 2,7. 2000 के दशक में मल्टीड्रग प्रतिरोध के उद्भव की दर में भारी वृद्धि हुई। इस समय के दौरान, लगभग 60% तीव्र जीवाणु त्वचा और त्वचा संरचना संक्रमण मेथिसिलिन प्रतिरोधी एस ऑरियस1 के लिए कल्चर पॉजिटिव थे। पिछले 2 दशकों के भीतर स्टेफिलोकोसी, और वास्तव में अन्य रोगजनकों के बीच मल्टीड्रग-प्रतिरोधी उपभेदों की बढ़ती संख्या, कार्रवाई के नए तरीकों के साथ एंटीबायोटिक दवाओं के तेजी से विकास की तत्काल आवश्यकता को इंगित करती है जो प्रतिरोध को दूर कर सकती है।
हालांकि, 2000 के दशक की शुरुआत से, एंटीबायोटिक खोज कार्यक्रमों में लंबे समय तक विकास समय और कम सफलता दर का वर्चस्व रहा है, अमेरिका में नैदानिक परीक्षणों में प्रवेश करने वाले केवल 17% नए एंटीबायोटिक्स बाजार अनुमोदन प्राप्त करतेहैं। यह उभरते एंटीबायोटिक दवाओं के इन विट्रो परीक्षण और उनके नैदानिक परिणामों के बीच असमानता का सुझाव देता है। यह तर्क दिया जा सकता है कि यह असमानता काफी हद तक विवो में संक्रमण के दौरान और पारंपरिक सूक्ष्मजीवविज्ञानी तरीकों के दौरान बैक्टीरियल फिजियोलॉजी में अंतर के कारण है जब इन विट्रो प्रीक्लिनिकल चरणों में एंटीबायोटिक दवाओं की प्रभावकारिता का परीक्षण किया जाता है। इसलिए, एंटीबायोटिक खोज कार्यक्रमों में सफलता दर में सुधार के लिए संक्रमण के दौरान जीवाणु शरीर विज्ञान के अधिक प्रतिनिधि नवीन प्रयोगशाला विधियों की आवश्यकता होती है।
त्वचा संक्रमण का अध्ययन करने के लिए वर्तमान तरीकों में जीवित जानवरों (जैसे, चूहों), पूर्व विवो त्वचा मॉडल (जैसे, पोर्सिन), और 3 डी ऊतक-इंजीनियर त्वचा मॉडल (जैसे, मानव) 9,10,11,12 में अध्ययन शामिल हैं। जीवित जानवरों में अध्ययन सख्ती से विनियमित होते हैं और अपेक्षाकृत कम थ्रूपुट होते हैं। पशु मॉडल में, घाव और संक्रमण जानवरों के लिए महत्वपूर्ण संकट का कारण बनता है और नैतिक चिंताओं को बढ़ाता है। मानव त्वचा मॉडल, पूर्व विवो या ऊतक-इंजीनियर, को नैतिक अनुमोदन, स्थानीय और वैश्विक कानून (मानव ऊतक अधिनियम, हेलसिंकी की घोषणा) के अनुपालन की आवश्यकता होती है, और ऊतकों को प्राप्त करने में कठिनाई होती है, कुछअनुरोधों को पूरा करने में वर्षों लगते हैं। दोनों मॉडल प्रकार श्रम गहन हैं और प्रयोगात्मक सफलता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। कुछ वर्तमान पूर्व विवो त्वचा संक्रमण मॉडल को संक्रमण को सक्षम करने के लिए घाव बिस्तर के लिए पूर्व-टीकाकृत डिस्क और एडिटिव्स की आवश्यकता होती है; यद्यपि ये मॉडल अविश्वसनीय रूप से उपयोगी हैं, संक्रमण प्रक्रिया में सीमाएं हैं क्योंकि एडिटिव्स पोषक तत्व स्रोत 10,15,16,17 के रूप में घाव बिस्तर के उपयोग को सीमित करते हैं। इस अध्ययन में वर्णित मॉडल घाव बिस्तर के लिए कोई योजक का उपयोग नहीं करता है, जो यह सुनिश्चित करता है कि संक्रमण की विकृति और व्यवहार्य सेल गिनती एकमात्र पोषक तत्व स्रोत के रूप में घाव बिस्तर के प्रत्यक्ष उपयोग का परिणाम है।
नई प्रयोगशाला विधियों की आवश्यकता को देखते हुए, उभरते एंटीबायोटिक दवाओं की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने में उपयोग के लिए त्वचा संक्रमण का एक नया उच्च-थ्रूपुट एक्स विवो ओविन मॉडल विकसित किया गया है। त्वचा संक्रमण अध्ययन कई चुनौतियों का सामना करते हैं- उच्च लागत, नैतिक चिंताएं और मॉडल जो पूरी तस्वीर 20,21 नहीं दिखाते हैं। पूर्व विवो मॉडल और 3 डी एक्सप्लेंट मॉडल रोग प्रक्रिया के बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देते हैं और प्रभाव उपचार अधिक चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक मॉडल से हो सकते हैं। यहां, एक उपन्यास ओविन त्वचा मॉडल का सेटअप वर्णित है, जो सरल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक है और इसमें उच्च थ्रूपुट है। ओविन त्वचा को चुना गया था क्योंकि भेड़ बड़े स्तनधारियों में से एक हैं जो आमतौर पर विवो में संक्रमण के लिए प्रतिक्रियाओं को मॉडल करने के लिए उपयोग किए जाते हैं। इसके अलावा, वे बूचड़खानों से आसानी से उपलब्ध हैं, अनुसंधान के लिए त्वचा की स्थिर आपूर्ति सुनिश्चित करते हैं, और उनके शवों को झुलसाया नहीं जाता है, जिससे अच्छी ऊतक गुणवत्ता सुनिश्चित होती है। इस अध्ययन ने एस ऑरियस को आदर्श रोगज़नक़ के रूप में इस्तेमाल किया; हालांकि, मॉडल अन्य सूक्ष्मजीवों के साथ अच्छी तरह से काम करता है।
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Protocol
इस परियोजना में त्वचा के नमूनों के स्रोत के रूप में आर.बी इलियट और सोन बूचड़खाने से मेमनों के सिर का उपयोग किया गया था। सभी मेमनों को भोजन के रूप में उपभोग के लिए मार दिया गया था। सिरों को त्यागने के बजाय, इन्हें अनुसंधान के लिए फिर से तैयार किया गया था। नैतिकता अनुमोदन की आवश्यकता नहीं थी क्योंकि ऊतक बूचड़खानों से फेंके गए कचरे से प्राप्त किया गया था।
1. नसबंदी
- 1 घंटे के लिए 200 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में साफ बल लेने और सूखी गर्मी नसबंदी करके सिर के संग्रह से पहले बल को कीटाणुरहित करें। उपयोग करने से पहले 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर सभी ग्लासवेयर को ऑटोक्लेव करें।
- माइक्रोबायोलॉजी क्लास 2 कैबिनेट के भीतर सभी वर्णित काम करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार सभी अभिकर्मकों को तैयार करें।
2. नमूना संग्रह
- बूचड़खाने में, स्वेलेडेल मेमनों को बिजली या बंदी-बोल्ट पिस्तौल का उपयोग करके आश्चर्यजनक रूप से मार दिया गया था और बाहर निकाल दिया गया था। वध के बाद 4 घंटे से अधिक मेमने के सिर इकट्ठा न करें।
3. प्रमुखों की तैयारी
- नमूना क्षेत्र पर लगभग 100 एमएल 200 पीपीएम क्लोरीन डाइऑक्साइड घोल डालकर मेमने के माथे के हिस्से को कीटाणुरहित करें। इलेक्ट्रिक क्लिपर का उपयोग करके सिर के माथे के खंड को शेव करें और 200 पीपीएम क्लोरीन डाइऑक्साइड समाधान के 200 एमएल के साथ क्षेत्र को धोएं।
- इथेनॉल और नीले रोल के साथ क्षेत्र को पोंछें और 35 मिनट के लिए बाल हटाने क्रीम के साथ नमूना क्षेत्र को कवर करें। धीरे से स्क्रैपिंग टूल का उपयोग करके बाल हटाने वाली क्रीम को खुरचें और नमूना क्षेत्र का आकलन करें। यदि बालों की एक महत्वपूर्ण मात्रा बनी हुई है, तो बालों को हटाने की प्रक्रिया को दोहराएं।
- क्षेत्र को कुल्ला करने के लिए क्लोरीन डाइऑक्साइड के घोल के 200 एमएल का उपयोग करें, और फिर इथेनॉल के साथ कुल्ला करें और नीले रोल से पोंछें।
- बाँझ 8 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग करके, तैयार क्षेत्र से 8 मिमी त्वचा के नमूने काट लें। बाँझ बल और 15-ब्लेड स्केलपेल का उपयोग करके नमूने हटा दें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सभी त्वचीय वसा हटा दिए गए हैं।
- नमूनों को बाँझ फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) से भरे बाँझ 0.5 एल जार में रखें, और फिर उन्हें 200 पीपीएम क्लोरीन डाइऑक्साइड समाधान के 50 एमएल के साथ बाँझ 50 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें, दो बार उलट दें, और 30 मिनट के लिए स्टरलाइज़ करने के लिए छोड़ दें।
- क्लोरीन डाइऑक्साइड समाधान से नमूने निकालें और उन्हें बाँझ पीबीएस के 40 एमएल से भरे 50 एमएल ट्यूब में रखकर धो लें। एक बार धोने के बाद, प्रत्येक व्यक्तिगत त्वचा के नमूने को 24-वेल प्लेट के एक अलग कुएं में रखें।
- वायु-तरल इंटरफ़ेस पर नमूने को बनाए रखते हुए पूर्व-गर्म माध्यम का 350 μL जोड़ें। मीडिया की संरचना इस प्रकार है: एमके मीडिया (हैंक्स लवण, एल-ग्लूटामेट, और 1.75 मिलीग्राम / एमएल सोडियम बाइकार्बोनेट के साथ मध्यम 199) और हैम का एफ 12 1: 1 अनुपात में, एफबीएस (10% वी / वी), ईजीएफ (10 एनजी / एमएल), इंसुलिन (5 μg / mL), पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 यू / एमएल), और एम्फोटेरिसिन बी (2.5 गुना ) के साथ।
- गैस पारगम्य प्लेट सील के साथ 24-वेल प्लेटों को सील करें और 24 घंटे तक ह्यूमिडिफाइड 5% सीओ2 ऊतक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
4. त्वचा के नमूनों का रखरखाव
- इनक्यूबेशन के बाद, कल्चर माध्यम को हटा दें और नमूनों को बाँझ पीबीएस के 500 μL में कुल्ला करें। प्रत्येक नमूने में एंटीबायोटिक-मुक्त मीडिया जोड़ें और नमूने में अवशिष्ट एंटीबायोटिक दवाओं को हटाने के लिए24 घंटे के लिए ह्यूमिडिफाइड 5% सीओ 2 ऊतक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- यदि टर्बिडिटी या फंगल संक्रमण 24 घंटे के बाद एंटीबायोटिक मुक्त मीडिया में विकसित होता है, तो नमूने को छोड़ दें।
5. इनोकुलम की तैयारी
- बाँझ ट्राइप्टिक सोया शोरबा के 10 एमएल के साथ 50 एमएल ट्यूब तैयार करें। एस ऑरियस की एक ताजा आगर प्लेट लें और शोरबा में कई कॉलोनियों को स्थानांतरित करने के लिए एक स्वैब का उपयोग करें। 150 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
- सेंट्रीफ्यूज 3 मिनट के लिए 4,000 x g पर। सतह पर तैरने वाले को हटा दें और सेल पेलेट को बाँझ पीबीएस के 10 एमएल में फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं की पर्याप्त धुलाई सुनिश्चित करने के लिए दो बार दोहराएं।
- बाँझ पीबीएस में इनोकुलम को 0.6 ओडी600 में समायोजित करें। मैन्युअल व्यवहार्य प्लेट गणना करके इनोकुलम लोड की पुष्टि करें।
6. त्वचा के नमूनों का संक्रमण
- पूर्व-गर्म एंटीबायोटिक-मुक्त मीडिया के 400 μL के साथ एक ताजा 24-वेल प्लेट तैयार करें और बाँझ बल का उपयोग करके 24-वेल इंसर्ट में जोड़ें।
- त्वचा के नमूनों से मीडिया को हटा दें, बाँझ पीबीएस के 500 μL से धो लें, और धोने को हटा दें। नमूने को धीरे से कुएं के तल पर रखने के लिए बाँझ बल का उपयोग करें।
- केंद्रीय घाव फ्लैप बनाने के लिए 4 मिमी पंच बायोप्सी का उपयोग करें, 1-2 मिमी की उबड़-खाबड़ गहराई तक छेद करें। फिर, घाव फ्लैप की शीर्ष परत को हटाने के लिए 15-ब्लेड स्केलपेल और बाँझ टूथेड एलिस ऊतक बल का उपयोग करें। घाव आयामों में परिवर्तनशीलता संक्रमण के परिणाम और समापन बिंदु कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) को प्रभावित कर सकती है।
- एक बार जब सभी नमूने घायल हो जाते हैं, तो उन्हें बाँझ बल का उपयोग करके 24-वेल इंसर्ट में स्थानांतरित करें। घाव के बिस्तर में बैक्टीरियल इनोकुलम का 15 μL पिपेट। फिर, एक ह्यूमिडिफाइड 5% सीओ 2 ऊतक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
- यदि लंबे इनक्यूबेशन अवधि आवश्यक है, तो मीडिया को हटा दें और इसे हर 24 घंटे में ताजा मीडिया के साथ बदलें और समान परिस्थितियों में इनक्यूबेट करें।
7. बैक्टीरियल लोड का निर्धारण
- कुओं के नीचे से मीडिया को हटा दें। बाँझ बल के साथ, प्रत्येक नमूने को बाँझ पीबीएस के 1 एमएल से भरे एक अलग 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- नमूने की सतह को समरूप बनाने के लिए एक बारीक-टिगॉन्ड होमोजेनाइज़र का उपयोग करें। यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखें कि घाव बिस्तर होमोजेनाइज़र की नोक के साथ सीधे संपर्क में है।
- मध्यम /उच्च पर 35 सेकंड के लिए प्रत्येक नमूने को समरूप करें। होमोजिनाइज़र बैक्टीरिया भार की गणना की अनुमति देने के लिए घाव के बिस्तर की सतह से बैक्टीरिया को अलग करता है।
- एक बार जब सभी नमूने संसाधित हो जाते हैं, तो प्रत्येक नमूना, पाइपिंग से पहले, बदले में, भंवर। यह सुनिश्चित करने के लिए है कि बैक्टीरियल होमोजेनेट मिश्रित है।
- पिपेट 20 μL भंवर होमोजिनेट को 96-वेल प्लेट के संबंधित कुएं में मिलाता है जिसमें 180 μL बाँझ पीबीएस होता है।
- क्रमिक रूप से प्रत्येक नमूना होमोजेनेट को 1 x 10−7 और पिपेट 10 μL पतला होमोजेनेट को तीन प्रतियों में ट्राइप्टिक सोया आगर प्लेट पर पतला करें।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए आगर प्लेट को इनक्यूबेट करें। फिर, प्रत्येक नमूने के लिए सीएफयू निर्धारित करने के लिए कॉलोनियों की संख्या की गणना करें।
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Representative Results
घाव संक्रमण मॉडल स्थापित करने से पहले त्वचा को निष्फल करने के लिए एक मार्ग की पहचान चुनौतीपूर्ण थी। चुनौती विभिन्न त्वचा परतों को नुकसान पहुंचाए बिना त्वचा को स्टरलाइज़ करने में निहित है, जो तब संक्रमण के परिणाम में अनपेक्षित परिणाम हो सकते हैं। एक उपयुक्त नसबंदी व्यवस्था की पहचान करने के लिए, अलग-अलग समय के लिए विभिन्न उपचारों की कोशिश की गई, जैसा कि तालिका 1 में उल्लिखित है। त्वचा के नमूनों को बनाए रखने के लिए उपयोग किए जाने वाले एमके माध्यम में 48 घंटे के बाद टर्बिडिटी के विकास के रूप में संदूषण दर्ज किया गया था। ऊतक अखंडता की निगरानी हिस्टोलॉजी द्वारा की गई थी, जिसके बाद उपचार के तुरंत बाद हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) के साथ धुंधला हो गया था (चित्रा 1)। क्लोरीन डाइऑक्साइड के साथ 30 मिनट का उपचार ऊतक अखंडता को संरक्षित करते हुए त्वचा के ऊतकों को पुन: निष्फल रूप से स्टरलाइज़ करने में सबसे प्रभावी साबित हुआ।
प्रायोगिक सेटअप में, घायल बाँझ ऊतक को एयर-लिक्विड इंटरफ़ेस (चित्रा 2 ए) पर 24-वेल इंसर्ट के एपिकल चैंबर में रखा जाता है। दो अलग-अलग घाव हटाने की तकनीकों का प्रयास किया गया था- एक फ्लैप हटाने की तकनीक, जिसमें ऊतक को एक पंच बायोप्सी उपकरण द्वारा घायल किया जाता है और घायल ऊतक की शीर्ष परत को 15-ब्लेड स्केलपेल और बाँझ टूथेड एलिस ऊतक बल के संयोजन का उपयोग करके हटा दिया जाता है, और एक खरोंच तकनीक, जिसमें ऊतक अकेले पंच बायोप्सी उपकरण द्वारा घायल हो जाता है। हालांकि स्क्रैच मॉडल ने 24 घंटे के बाद सीएफयू की एक उच्च औसत संख्या को आश्रय दिया, परिणाम परिवर्तनशील थे। फ्लैप हटाने की तकनीक ने अधिक सुसंगत परिणाम उत्पन्न किए (चित्रा 2 सी)। 48 घंटे के बाद, इनोकुलम (चित्रा 2 डी) की तुलना में घायल ऊतक से लगभग 100 गुना अधिक जीवाणु सीएफयू बरामद किए गए थे। यह एक सफल संक्रमण का संकेत माना जाता था। घाव के बिस्तर में एक सफेद फिल्म संक्रमण के 48 घंटे बाद ऊतक पर स्पष्ट थी (चित्रा 2 बी)। संक्रमित ऊतक के ग्राम-दाग वाले हिस्टोलॉजी अनुभागों ने घाव बिस्तर में एस ऑरियस कोशिकाओं की उपस्थिति का संकेत दिया (चित्रा 2 ई, एफ)। असंक्रमित ऊतक के ग्राम-दाग वाले हिस्टोलॉजी अनुभागों को एक तुलनित्र के रूप में प्रदान किया जाता है (चित्रा 2 जी, एच)।
एक मेमने के सिर से, एक 100 सेमी2 खंड (10 सेमी x 10 सेमी) को वास्तविक रूप से एक्सेस किया जा सकता है। यह देखते हुए कि त्वचा के प्रत्येक पैच को एक गोलाकार 8 मिमी व्यास पंच बायोप्सी का उपयोग करके माथे से बाहर निकाला जाता है, प्रति सप्ताह एक मेमने के माथे से लगभग 100 त्वचा पैच प्राप्त किए जा सकते हैं। आगे भेड़ के बच्चों के सिर को आनुपातिक रूप से प्राप्त करने से त्वचा के नमूनों की संख्या बढ़ जाती है जिन्हें प्रति सप्ताह प्राप्त किया जा सकता है। इसलिए, यह दावा किया जाता है कि प्रक्रिया अपेक्षाकृत उच्च थ्रूपुट है। इस अध्ययन के लिए, प्रति सप्ताह नियमित रूप से 24 त्वचा के नमूने प्राप्त किए गए थे। विभिन्न मेमनों के सिर से त्वचा को संभावित दाता से दाता परिवर्तनशीलता के लिए जैविक प्रतिकृति के रूप में संसाधित किया गया था। त्वचा पैच (चरण 3.1-3.8) की तैयारी के दौरान, प्रमुख समय की खपत क्लोरीन डाइऑक्साइड समाधान में त्वचा के नमूनों की 30 मिनट इनक्यूबेशन और बाल हटाने क्रीम उपचार के लिए 2 x 35 मिनट की प्रतीक्षा है। 24 त्वचा पैच उत्पन्न करने के लिए पंच बायोप्सी का उपयोग लगभग 15 मिनट लगता है। यह वह समय है जो रैखिक रूप से स्केल करेगा यदि त्वचा पैच की संख्या में वृद्धि हुई थी।
| कीटाणुनाशक | 10 मिनट | 30 मिनट | 60 मिनट |
| 1% उच्च स्तरीय चिकित्सा सतह कीटाणुनाशक | F | P | P |
| 1% बहुउद्देश्यीय कीटाणुनाशक | F | F | P |
| 3% povidone | F | F | F |
| 5% povidone | F | P | P |
| 10% povidone | F | P | P |
| 70% इथेनॉल | F | P | P |
| यूवी | F | F | F |
| 0.55% हाइपोक्लोराइट | F | P | P |
| 200 पीपीएम क्लोरीन डाइऑक्साइड | F | P | P |
तालिका 1: ताजा मेमने की त्वचा की नसबंदी। प्रत्येक त्वचा के नमूने को निर्दिष्ट समय के लिए कीटाणुनाशक में छोड़ दिया गया था। एफ मीडिया में मौजूद जीवाणु संदूषण के साथ ऊतक को निष्फल करने में विफलता को दर्शाता है। पी पासिंग को दर्शाता है, जिसमें मीडिया में कोई जीवाणु संदूषण मौजूद नहीं है।
चित्र 1: असंक्रमित ईएक्स विवो ओविन त्वचा की हिस्टोलॉजी 100 एक्स आवर्धन पर कीटाणुनाशक (एच एंड ई दाग) के साथ इलाज किया जाता है। (ए) पीबीएस में 30 मिनट के उपचार के साथ त्वचा के नमूने को नियंत्रित करें। कुछ एपिडर्मल शेडिंग देखी जा सकती है, लेकिन एपिडर्मिस बाधित नहीं होता है। (बी) ओविन त्वचा को 30 मिनट के लिए 1% उच्च-स्तरीय चिकित्सा सतह कीटाणुनाशक के साथ इलाज किया जाता है। एपिडर्मल शेडिंग (काला तीर) के साथ-साथ स्ट्रेटम ग्रैनुलोसम (नीला तीर) में कुछ व्यवधान। (सी) ओविन त्वचा को 30 मिनट के लिए 5% पोविडोन के साथ इलाज किया जाता है। ऊतक को मध्यम क्षति यहां देखी जा सकती है, जिसमें स्ट्रेटम कॉर्नियम (काला तीर) के एपिडर्मल शेडिंग होती है। अंतर्निहित एपिडर्मल परतों में न्यूनतम व्यवधान है। (डी) ओविन त्वचा को 30 मिनट के लिए 10% पोविडोन के साथ इलाज किया जाता है। एपिडर्मिस की शीर्ष परतों को क्षतिग्रस्त कर दिया गया है, जिसमें शेडिंग (काला तीर) और पतला (हरा तीर) के सबूत हैं। (ई) ओविन त्वचा को 30 मिनट के लिए 2% बहुउद्देश्यीय कीटाणुनाशक के साथ इलाज किया जाता है। नमूने को गंभीर नुकसान देखा जा सकता है, जिसमें महत्वपूर्ण एपिडर्मल शेडिंग (काला तीर) और स्ट्रेटम कॉर्नियम (लाल तीर) का पूर्ण उन्मूलन होता है। (एफ) ओविन त्वचा 30 मिनट के लिए 200 पीपीएम क्लोरीन डाइऑक्साइड में इलाज किया जाता है। कुछ एपिडर्मल शेडिंग देखी जा सकती है, लेकिन एपिडर्मिस बरकरार है। (जी) ओविन त्वचा को 30 मिनट के लिए 0.6% हाइपोक्लोराइट के साथ इलाज किया जाता है। एपिडर्मिस को गंभीर नुकसान मौजूद है, जिसमें उच्च स्तर का एपिडर्मल शेडिंग (काला तीर) और स्थानों (लाल तीर) में एपिडर्मिस का उन्मूलन होता है। (एच) ओविन त्वचा को 30 मिनट के लिए 70% इथेनॉल के साथ इलाज किया जाता है। एपिडर्मिस को नुकसान देखा जा सकता है, जिसमें महत्वपूर्ण एपिडर्मल शेडिंग (काला तीर) होता है। स्केल पट्टी 200 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: एस ऑरियस से संक्रमित पूर्व विवो ओविन त्वचा( ए) प्रयोगात्मक सेटअप का योजनाबद्ध। (बी) संक्रमण से पहले एक्स विवो ओविन त्वचा की तस्वीरें (बाएं छवि) और 48 घंटे के संक्रमण (दाएं छवि) के बाद। संक्रमित ऊतक में 48 घंटे इनक्यूबेशन के बाद मौजूद सफेद फिल्म पर ध्यान दें, जो असंक्रमित ऊतक में अनुपस्थित है। (सी) होमोजेनाइजेशन के बाद अंतिम कॉलोनी बनाने वाली इकाई (सीएफयू) गणना पर विभिन्न घाव विधियों के प्रभाव का परीक्षण करना। फ्लैप हटाने (एन = 6) और स्क्रैच (एन = 9) 24 घंटे के लिए एस ऑरियस से संक्रमित। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन इंगित करती हैं. 0.0001 < पी-मान इंगित करता है। (डी) होमोजेनाइजेशन के बाद सीएफयू गणनाओं पर इनक्यूबेशन समय के प्रभाव का परीक्षण करना। 24 h इनक्यूबेशन (n = 6) और 48 h इनक्यूबेशन (n = 12)। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन इंगित करती हैं. 0.0001 < पी-मान इंगित करता है। (E, F) संक्रमित ओविन त्वचा के हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण की प्रतिनिधि छवियां 100 x आवर्धन (200 μm का स्केल बार) पर एक संशोधित ग्राम दाग (ई) के साथ 48 घंटे के संक्रमण के बाद। बॉक्स 1,000x आवर्धन (50 μm की स्केल पट्टी) पर (F) में आवर्धित क्षेत्र को इंगित करता है। काले तीर बैक्टीरिया का संकेत देते हैं। (G, H) 100x आवर्धन (200 μm की स्केल पट्टी) पर संशोधित gGram दाग (G) के साथ 48 घंटे की अवधि (नियंत्रण) के बाद असंक्रमित ओविन त्वचा के हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण की प्रतिनिधि छवियां। बॉक्स 1,000x आवर्धन (50 μm की स्केल पट्टी) पर (H) में आवर्धित क्षेत्र को इंगित करता है। सांख्यिकीय विश्लेषण एक तरफ़ा एनोवा के रूप में किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
रोगाणुरोधी का विकास एक महत्वपूर्ण लेकिन महंगा उद्यम है जिसकी लागत लगभग $ 1 बिलियन है और इसे पूरा करने में लगभग 15 साल लगते हैं। रोगाणुरोधी दवा की खोज और रोगाणुरोधी दवा प्रभावकारिता के प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के 90% से अधिक अकादमिक शोधकर्ताओं और छोटी से मध्यम कंपनियों द्वारा किए जाते हैं, जिनमें आमतौर पर 50 से कम कर्मचारीहोते हैं। ये टीमें बहुत आर्थिक रूप से विवश हैं, जो ट्रांसलेशनल अनुसंधान के बाद के चरणों में लीड अणुओं की विफलता को घातक बनाती हैं। रोगाणुरोधी प्रतिरोध में वृद्धि नए रोगाणुरोधी के विकास को आगे बढ़ा रही है, जो रोगाणुरोधी अनुसंधान मेंपहले से ही सीमित निवेश को जिम्मेदारी से प्रबंधित करने की आवश्यकता को और तेज करती है।
विवो और इन विट्रो प्रयोगशाला संस्कृतियों में संक्रमण के बीच जीवाणु शरीर विज्ञान में असमानता लीड पहचान चरण के दौरान हिट की रोगाणुरोधी प्रभावकारिता की अतिवृद्धि का कारण बनती है। इस तरह की अतिवृद्धि अनुवाद के बाद के चरणों के दौरान देखी गई उच्च एट्रिशन दर में योगदान देती है। इन विट्रो रोगाणुरोधी प्रभावकारिता परीक्षण प्लेटफार्मों की उपलब्धता जो एक शरीर विज्ञान के साथ बैक्टीरिया को शामिल करती है जो विवो में संक्रमण के दौरान पाए जाने वाले बेहतर नकल करती है, रोगाणुरोधी प्रभावकारिता का अधिक सटीक अनुमान लगाने में सक्षम होगी और शोधकर्ताओं को महंगे और कसकर विनियमित पशु परीक्षणों पर निर्भरता के बिना लीड अनुकूलन का अधिक नियंत्रण प्रदान करेगी। इस तरह के मॉडल अनुवाद के बाद के चरणों के दौरान नौकरी छोड़ने की दर को भी कम करेंगे और निवेश के लिए रोगाणुरोधी दवा की खोज को अधिक आकर्षक बना सकते हैं।
यहां वर्णित यह ओविन त्वचा संक्रमण मॉडल एक उपयोगी उपकरण है जो शोधकर्ताओं को प्रीक्लिनिकल चरणों में उभरते सामयिक रोगाणुरोधी योगों की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए संक्रमित घाव के शारीरिक रूप से प्रासंगिक इन विट्रो मॉडल प्रदान करेगा। वैज्ञानिक साहित्य 10,15,24,25,26,27,28 में वर्णित अधिकांश पूर्व विवो संक्रमण मॉडल के विपरीत, इस मॉडल में, पूर्व विवो ऊतक के संपर्क में आने वाले रोगजनकों को संक्रमण के दौरान कल्चर मीडिया के साथ पूरक नहीं किया जाता है। रोगज़नक़ प्रसार और बाद में संक्रमण ऊतक को नुकसान पहुंचाने के लिए जीव की क्षमता पर निर्भर हैं। इसलिए, इस मॉडल में रोगज़नक़ शरीर विज्ञान पारंपरिक सूक्ष्मजीवविज्ञानी संस्कृतियों की तुलना में विवो संक्रमण के दौरान अधिक निकटता से संबंधित है। इस मॉडल से एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संक्रमण प्राप्त होता है, जैसा कि इनक्यूबेशन के बाद ऊतक से पुनर्प्राप्त सीएफयू की संख्या से आंका जाता है।
मानव त्वचा के समकक्षों और मानव और पोर्सिन पूर्व विवो घाव मॉडल की अधिकता के साथ, इस मॉडल में ओविन ऊतक के उपयोग को सतही रूप से एक सीमा होने का तर्क दिया जा सकता है। हालांकि, भेड़ विवो 29,30,31 में संक्रमण के मॉडल के रूप में उपयोग किए जाने वाले बड़े जानवरों के समूह में से हैं। इसके अलावा, भेड़ को इम्यूनोलॉजी अनुसंधान और वैक्सीन विकास में मनुष्यों के लिए सरोगेट के रूप में इस्तेमाल किया गया है, यह दर्शाता है कि उनकी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएंमनुष्यों के समान हैं। घाव भरने के दौरान ऊतक की मरम्मत प्रक्रिया भेड़ और मनुष्यों सहित बड़े स्तनधारियों में समान है, 33,34, और घाव भरने में सुधार के लिए हस्तक्षेप जो भेड़ में सफलतापूर्वक प्रदर्शित किए गए हैं, उन्हें मनुष्यों में अनुवाद के लिए सुझाया गया है35,36,37। इसलिए, इस घाव मॉडल में एक्स विवो ओविन त्वचा का उपयोग एक सीमा नहीं है। इसके अलावा, इस ओविन मॉडल को निम्नलिखित कारणों से मानव या पोर्सिन त्वचा को शामिल करने वाले मॉडल के लिए एक विश्वसनीय विकल्प माना जा सकता है। उपलब्ध होने पर मानव त्वचा की उपलब्धता सीमित और परिवर्तनशील गुणवत्ता कीहोती है। ऊतक-इंजीनियर मानव एपिडर्मिस और जीवित त्वचा समकक्षों को ऊतक शरीर विज्ञान में प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए उनकी संवर्धन स्थितियों में शोधन की आवश्यकता होतीहै। यद्यपि पोर्सिन त्वचा मानव त्वचा की तुलना में अधिक सुलभ है, व्यापक रूप से उपलब्ध पोर्सिन त्वचा को बूचड़खाने में शव प्रसंस्करण के हिस्से के रूप में जलाया जाता है, जो एपिडर्मिस10 को हटा देता है। अनुभव से, अनस्केल्ड पोर्सिन त्वचा बूचड़खानों से कम आसानी से उपलब्ध है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल के दौरान, महत्वपूर्ण कदम हैं जो मॉडल की सफलता सुनिश्चित करते हैं। सबसे महत्वपूर्ण कदम में कटाई के बाद ऊतक की नसबंदी शामिल है। क्लोरीन डाइऑक्साइड समाधान को ऊतक के नमूनों के साथ मिलाया जाना चाहिए, और ऊतक को पर्याप्त रूप से कीटाणुरहित करने और दूषित पदार्थों को हटाने के लिए 30 मिनट के संपर्क समय की अनुमति दी जानी चाहिए। इसके अलावा, इस प्रयोग को स्थापित करते समय, कीटाणुनाशक और एंटीबायोटिक मीडिया के साथ अनुचित हैंडलिंग या अप्रभावी उपचार के कारण टर्बिडिटी या फंगल संदूषण हो सकता है। ऐसे मामले में, मैलापन विकसित करने वाले नमूनों को छोड़ दिया जाना चाहिए। टर्बिडिटी और संदूषण के विकास को कम करने के लिए, प्रयोगशाला के वातावरण को साफ रखा जाना चाहिए, इनक्यूबेटर की लगातार नसबंदी, फिल्टर टिप्स का उपयोग, और नमूनों के साथ उपयोग किए जाने वाले उपकरणों और कंटेनरों की पूर्ण नसबंदी सुनिश्चित करना। प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम तब होता है जब ऊतक को घाव करने के लिए 4 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग किया जाता है। इस उपकरण का उपयोग प्रोटोकॉल की पुनरावृत्ति और प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए समान आकार के घाव बेड की अनुमति देता है। घाव बिस्तर के आकार में परिवर्तनशीलता समापन बिंदु सीएफयू को प्रभावित करती है। जब ऊतक फ्लैप को पर्याप्त रूप से हटाया जाता है, तो परिणाम बहुत अधिक सुसंगत होते हैं। एंडपॉइंट सीएफयू गिनती की अखंडता से जुड़ा एक और महत्वपूर्ण कदम जीवाणु कोशिकाओं को मुक्त करने के लिए बारीक-टिप्ड होमोजेनाइज़र का उपयोग है। होमोजेनाइज़र टिप की स्थिति को नमूने से नमूने तक सीएफयू गिनती पर प्रभाव देखा गया था; जब टिप को घाव के बिस्तर पर सीधे रखा गया था, तो नमूने से नमूने में बहुत कम परिवर्तनशीलता देखी गई थी।
फिर भी, यहां प्रस्तावित मॉडल सीमाओं के बिना नहीं है। इस मॉडल में सभी पूर्व विवो अध्ययनों (यानी, सक्रिय संवहनी प्रवाह की कमी, कॉमेंसल माइक्रोबायोटा की अनुपस्थिति, जो संक्रमण की प्रगति को संशोधित कर सकता है, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की अनुपस्थिति) में निहित सीमाएं हैं। यह तर्क दिया जा सकता है कि, चूंकि एक्स विवो घाव मॉडल सक्रिय प्रतिरक्षा कोशिकाओं को शामिल नहीं करता है, इसलिए इन कोशिकाओं की उपस्थिति में विवो में संक्रमण की प्रगति पूर्व विवो मॉडल में देखी गई तुलना में अलग हो सकती है। भले ही, एक्स विवो मॉडल लगाव के लिए एक ऊतक सतह और बैक्टीरिया के लिए एक पोषक तत्व स्रोत प्रदान करते हैं और योगों के लिए 3 डी प्रसार बाधा प्रस्तुत करते हैं, जो पारंपरिक माइक्रोबायोलॉजी कल्चर तकनीकों की तुलना में रोगाणुरोधी प्रभावकारिता का अधिक सटीक मूल्यांकन सक्षम बनाता है।
मॉडल का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि ऊतक मेमनों से प्राप्त होता है जो मानव उपभोग के लिए उगाए जाते हैं। विशेष रूप से, मॉडल भेड़ के बच्चे के सिर से त्वचा को फिर से तैयार करता है, जिसे आमतौर पर छोड़ दिया जाता है। इसके अलावा, मॉडल में उच्च थ्रूपुट है और लागत प्रभावी, तेजी से और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तुलनात्मक अध्ययन को सक्षम बनाता है। यह तर्क दिया जा सकता है कि इस मॉडल की उपलब्धता तीन आर के सिद्धांतों के अनुरूप ट्रांसलेशनल अनुसंधान के लिए उद्देश्य-निर्मित जानवरों की आवश्यकता को कम और परिष्कृत करेगी, जो अधिक मानवीय अनुसंधान प्रथाओं की सुविधा प्रदान करते हैं। यद्यपि यहां वर्णित मॉडल में एस ऑरियस को आदर्श रोगज़नक़ के रूप में शामिल किया गया है, मॉडल का उपयोग अन्य बैक्टीरिया, कवक और वायरस सहित अन्य सूक्ष्मजीवों के साथ किया जा सकता है, इस प्रकार दवा के विकास के दायरे को व्यापक बनाया जा सकता है जो मॉडल सक्षम बनाता है। यह कल्पना की जा सकती है कि इस मॉडल का उपयोग प्रीक्लिनिकल चरणों में दवा डिजाइन और फॉर्मूलेशन पर शोधकर्ताओं को अधिक नियंत्रण प्रदान करके त्वचा संक्रमण के लिए बहुत आवश्यक एंटीबायोटिक दवाओं के तेजी से अनुवाद को सक्षम करेगा।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है
Acknowledgments
लेखक वित्त पोषण के लिए ईपीएसआरसी (ईपी / आर 513313/1) को धन्यवाद देना चाहते हैं। लेखक मेमनों के सिर प्रदान करने और परियोजना के शुरुआती चरणों में इतने मिलनसार होने के लिए कैलो, चेस्टरफील्ड में आर बी इलियट और सोन बूचड़खाना को भी धन्यवाद देना चाहते हैं, इस प्रोटोकॉल के विकास के दौरान उनके समर्थन के लिए कासिया एमरी, और हिस्टोलॉजी नमूनों को संसाधित करने के लिए शेफील्ड विश्वविद्यालय में संक्रमण, प्रतिरक्षा और कार्डियोवैस्कुलर रोग विभाग से फियोना राइट और इस परियोजना में अविश्वसनीय रूप से सहायक होने के लिए।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
| 4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| 8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
| Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
| Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
| Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
| Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
| Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
| Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
| Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
| Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
| Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |
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