Summary
Das Protokoll beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode zum Aufbau eines Ex-vivo-Modells für verwundete Haut von Schafen, die mit Staphylococcus aureus infiziert sind. Dieses Hochdurchsatzmodell simuliert Infektionen in vivo im Vergleich zu herkömmlichen mikrobiologischen Techniken besser und bietet Forschern eine physiologisch relevante Plattform, um die Wirksamkeit neuer antimikrobieller Mittel zu testen.
Abstract
Die Entwicklung antimikrobieller Mittel ist ein teurer Prozess mit immer niedrigeren Erfolgsraten, was weitere Investitionen in die Erforschung antimikrobieller Wirkstoffe weniger attraktiv macht. Die Entdeckung antimikrobieller Wirkstoffe und die anschließende Kommerzialisierung können lukrativer gestaltet werden, wenn ein Fail-Fast-and-Fail-Cheap-Ansatz innerhalb der Lead-Optimierungsphasen implementiert werden kann, in denen Forscher eine größere Kontrolle über das Design und die Formulierung von Arzneimitteln haben. In diesem Artikel wird der Aufbau eines ex vivo mit Staphylococcus aureus infizierten Modells für verwundete Schafe beschrieben, das einfach, kostengünstig, durchsatzfähig und reproduzierbar ist. Die bakterielle Physiologie im Modell ahmt nach, dass während der Infektion die bakterielle Proliferation von der Fähigkeit des Erregers abhängt, das Gewebe zu schädigen. Die Etablierung einer Wundinfektion wird durch eine Erhöhung der lebensfähigen Bakterienzahlen im Vergleich zum Inokulum verifiziert. Dieses Modell kann als Plattform verwendet werden, um die Wirksamkeit neuer antimikrobieller Mittel in der Phase der Leitoptimierung zu testen. Es kann behauptet werden, dass die Verfügbarkeit dieses Modells Forschern, die antimikrobielle Mittel entwickeln, ein Fail-Fast-and-Fail-Cheap-Modell bieten wird, das dazu beitragen wird, die Erfolgsraten in nachfolgenden Tierversuchen zu erhöhen. Das Modell wird auch die Reduzierung und Verfeinerung der Verwendung von Tieren für die Forschung erleichtern und letztendlich eine schnellere und kostengünstigere Übertragung neuartiger antimikrobieller Mittel für Haut- und Weichteilinfektionen in die Klinik ermöglichen.
Introduction
Hautinfektionen sind ein wichtiges globales Problem mit hohen wirtschaftlichen Kosten für Gesundheitsdienstleister auf der ganzen Welt. Die Entwicklung von Multidrug-Resistenzen und Biofilmbildung durch Krankheitserreger spielt eine Schlüsselrolle bei der Prävalenz nicht heilender Wunden 1,2,3,4. Infolgedessen sind Haut- und Weichteilinfektionen einer der häufigsten Gründe für einen längeren Krankenhausaufenthalt und eine anschließende Wiederaufnahme5. Verzögerungen bei der Wundheilung sind sowohl für den Patienten als auch für die Gesundheitsdienstleister kostspielig, wobei einige Schätzungen darauf hindeuten, dass in den USA jährlich rund 6,5 Millionen Patienten betroffen sind. In Großbritannien führen Hautinfektionen und damit verbundene Komplikationen jährlich zu etwa 75.000 Todesfällen 2,4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) ist ein gewaltiger Wunderreger, der häufig aus Patientenwunden isoliertwird 2,7. Die Rate der Entstehung von Multidrug-Resistenzen stieg in den 2000er Jahren drastisch an. Während dieser Zeit waren etwa 60% der akuten bakteriellen Haut- und Hautstrukturinfektionen kulturpositiv für Methicillin-resistente S. aureus1. Die zunehmende Anzahl multiresistenter Stämme unter Staphylokokken und anderen Krankheitserregern in den letzten 2 Jahrzehnten weist auf einen dringenden Bedarf an der schnellen Entwicklung von Antibiotika mit neuen Wirkmechanismen hin, die Resistenzen überwinden können.
Seit Anfang der 2000er Jahre werden Antibiotika-Forschungsprogramme jedoch von längeren Entwicklungszeiten und niedrigen Erfolgsraten dominiert, wobei nur 17% der neuartigen Antibiotika in klinischen Studien in den USA dieMarktzulassung erhalten 8. Dies deutet auf eine Diskrepanz zwischen den Ergebnissen von In-vitro-Tests neuer Antibiotika und ihren klinischen Ergebnissen hin. Es kann argumentiert werden, dass diese Diskrepanz weitgehend auf Unterschiede in der bakteriellen Physiologie während Infektionen in vivo und während konventioneller mikrobiologischer Methoden bei der Prüfung der Wirksamkeit von Antibiotika in den präklinischen In-vitro-Stadien zurückzuführen ist. Daher sind neuartige Labormethoden erforderlich, die repräsentativer für die bakterielle Physiologie während der Infektion sind, um die Erfolgsraten in Antibiotika-Forschungsprogrammen zu verbessern.
Aktuelle Methoden zur Untersuchung von Hautinfektionen umfassen Studien an lebenden Tieren (z. B. Mäuse), Ex-vivo-Hautmodelle (z. B. Schweine) und 3D-Tissue-Engineering-Hautmodelle (z. B. Mensch)9,10,11,12. Studien an lebenden Tieren sind streng reguliert und haben einen relativ geringen Durchsatz. In Tiermodellen verursachen Verletzungen und Infektionen erhebliche Belastungen für die Tiere und werfen ethische Bedenken auf. Menschliche Hautmodelle, ex vivo oder Tissue-Engineering, erfordern eine ethische Genehmigung, die Einhaltung lokaler und globaler Gesetze (das Human Tissue Act, die Deklaration von Helsinki), und es gibt Schwierigkeiten beim Erwerb von Geweben, wobei einige Anfragen Jahre dauern, um13,14 zu erfüllen. Beide Modelltypen sind arbeitsintensiv und erfordern erhebliches Fachwissen, um den experimentellen Erfolg zu gewährleisten. Einige aktuelle Ex-vivo-Hautinfektionsmodelle erfordern vorgeimpfte Bandscheiben und Zusatzstoffe für das Wundbett, um eine Infektion zu ermöglichen. Obwohl diese Modelle unglaublich nützlich sind, gibt es Einschränkungen im Infektionsprozess, da Zusatzstoffe die Nutzung des Wundbettes als Nährstoffquelle einschränken10,15,16,17. Das in dieser Studie beschriebene Modell verwendet keine Zusatzstoffe für das Wundbett, was sicherstellt, dass die Pathologie der Infektion und die Anzahl der lebensfähigen Zellen das Ergebnis der direkten Nutzung des Wundbetts als einzige Nährstoffquelle sind.
Angesichts des Bedarfs an neuen Labormethoden wurde ein neuartiges Ex-vivo-Modell von Hautinfektionen mit hohem Durchsatz entwickelt, das zur Bewertung der Wirksamkeit neuer Antibiotika verwendet werden soll. Hautinfektionsstudien stehen vor vielen Herausforderungen - hohe Kosten, ethische Bedenken und Modelle, die kein vollständiges Bild zeigen20,21. Ex-vivo-Modelle und 3D-Explantatmodelle ermöglichen eine bessere Visualisierung des Krankheitsprozesses und der Auswirkungen, die Behandlungen von einem klinisch relevanteren Modell haben können. Hier wird der Aufbau eines neuartigen Schafhautmodells beschrieben, das einfach, reproduzierbar und klinisch relevant ist und einen hohen Durchsatz aufweist. Schafhaut wurde ausgewählt, da Schafe eines der großen Säugetiere sind, die üblicherweise verwendet werden, um Reaktionen auf Infektionen in vivo zu modellieren. Darüber hinaus sind sie in Schlachthöfen leicht erhältlich, um eine stetige Versorgung mit Haut für die Forschung zu gewährleisten, und ihre Kadaver werden nicht verbrüht, was eine gute Gewebequalität gewährleistet. Diese Studie verwendete S. aureus als exemplarischen Erreger; Das Modell funktioniert jedoch gut mit anderen Mikroorganismen.
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Protocol
Lämmerköpfe aus dem Schlachthof R.B. Elliott und Son wurden in diesem Projekt als Quelle für Hautproben verwendet. Alle Lämmer wurden für den Verzehr als Lebensmittel geschlachtet. Anstatt die Köpfe wegzuwerfen, wurden diese für die Forschung wiederverwendet. Eine ethische Genehmigung war nicht erforderlich, da das Gewebe aus Abfällen stammte, die von Schlachthöfen weggeworfen wurden.
1. Sterilisation
- Desinfizieren Sie die Pinzette vor dem Sammeln der Köpfe, indem Sie eine saubere Pinzette nehmen und eine trockene Hitzesterilisation in einem Ofen bei 200 ° C für 1 h durchführen. Autoklavieren Sie alle Glaswaren bei 121 °C für 15 min vor Gebrauch.
- Führen Sie alle beschriebenen Arbeiten in einem Mikrobiologie-Schrank der Klasse 2 durch. Bereiten Sie alle Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
2. Probenentnahme
- Im Schlachthof wurden Swaledale-Lämmer durch Betäubung mit Strom oder einer Bolzenpistole geschlachtet und entblutet. Sammeln Sie Lammköpfe nicht später als 4 Stunden nach der Schlachtung.
3. Vorbereitung der Köpfe
- Desinfizieren Sie den Stirnbereich des Lammes, indem Sie etwa 100 ml 200 ppm Chlordioxidlösung auf den Probenbereich gießen. Rasieren Sie den Stirnteil des Kopfes mit elektrischen Haarschneidern und waschen Sie den Bereich mit 200 ml 200 ppm Chlordioxidlösung.
- Wischen Sie den Bereich mit Ethanol und blauer Rolle ab und bedecken Sie den Probenbereich 35 min lang mit einer Haarentfernungscreme. Kratzen Sie die Haarentfernungscreme vorsichtig mit einem Schabenwerkzeug ab und beurteilen Sie den Probenbereich. Wenn eine signifikante Menge an Haaren verbleibt, wiederholen Sie den Haarentfernungsvorgang.
- Verwenden Sie weitere 200 ml Chlordioxidlösung, um den Bereich zu spülen, und spülen Sie dann mit Ethanol ab und wischen Sie mit einer blauen Rolle.
- Schneiden Sie mit einem sterilen 8-mm-Biopsiestempel 8 mm Hautproben aus dem vorbereiteten Bereich aus. Entfernen Sie die Proben mit einer sterilen Pinzette und einem 15-Klingen-Skalpell, um sicherzustellen, dass das gesamte Hautfett entfernt wird.
- Die Proben werden in ein steriles 0,5-l-Glas gegeben, das mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefüllt ist, und dann in sterile 50-ml-Röhrchen mit 50 ml 200 ppm Chlordioxidlösung überführt, zweimal umgedreht und 30 min sterilisieren lassen.
- Nehmen Sie die Proben aus der Chlordioxidlösung und waschen Sie sie, indem Sie sie in ein 50-ml-Röhrchen geben, das mit 40 ml sterilem PBS gefüllt ist. Nach dem Waschen legen Sie jede einzelne Hautprobe in eine separate Vertiefung einer 24-Well-Platte.
- Fügen Sie 350 μL vorgewärmtes Medium hinzu, während die Probe an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche gehalten wird. Die Zusammensetzung der Medien ist wie folgt: MK-Medien (Medium 199 mit Hanks-Salzen, L-Glutamat und 1,75 mg / ml Natriumbicarbonat) und Hams F12 im Verhältnis 1: 1, mit Zusatz von FBS (10% v / v), EGF (10 ng / ml), Insulin (5 μg / ml), Penicillin-Streptomycin (100 U / ml) und Amphotericin B (2,5 μg / ml).
- Verschließen Sie die 24-Well-Platten mit einer gasdurchlässigen Plattendichtung und inkubieren Sie bei 37 °C in einem befeuchteten 5% CO2-Gewebeinkubator für bis zu 24 h.
4. Pflege von Hautproben
- Entfernen Sie nach der Inkubation das Kulturmedium und spülen Sie die Proben in 500 μL sterilem PBS ab. Fügen Sie jeder Probe antibiotikafreie Medien hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C in einem befeuchteten 5%CO2-Gewebeinkubator für 24 Stunden, um Restantibiotika in der Probe zu entfernen.
- Wenn sich nach 24 h Trübung oder Pilzinfektion in den antibiotikafreien Medien entwickelt, verwerfen Sie die Probe.
5. Vorbereitung des Inokulums
- Bereiten Sie eine 50-ml-Tube mit 10 ml steriler tryptischer Sojabrühe vor. Nehmen Sie eine frische Agarplatte von S. aureus und verwenden Sie einen Tupfer, um mehrere Kolonien in die Brühe zu übertragen. 18 h bei 37 °C bei 150 U/min inkubieren.
- Zentrifugieren bei 4.000 x g für 3 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 ml sterilem PBS. Wiederholen Sie dies zweimal, um eine ausreichende Reinigung der Zellen zu gewährleisten.
- Stellen Sie das Inokulum auf 0,6 OD600 in sterilem PBS ein. Bestätigen Sie die Inokulumbelastung, indem Sie eine manuelle Keimzahl durchführen.
6. Infektion von Hautproben
- Bereiten Sie eine frische 24-Well-Platte mit 400 μL vorgewärmtem antibiotikafreiem Medium vor und fügen Sie die 24-Well-Einsätze mit einer sterilen Pinzette hinzu.
- Entfernen Sie die Medien von den Hautproben, waschen Sie sie mit 500 μL sterilem PBS und entfernen Sie die Wäsche. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die Probe vorsichtig am Boden der Vertiefung zu halten.
- Verwenden Sie eine 4-mm-Stanzbiopsie, um eine zentrale Wundklappe herzustellen, die bis zu einer rauen Tiefe von 1-2 mm durchdringt. Verwenden Sie dann ein 15-Klingen-Skalpell und sterile gezahnte Allis-Gewebezangen, um die oberste Schicht des Wundlappens zu entfernen. Variabilität in den Wunddimensionen kann das Ergebnis der Infektion und die Endpunktkolonie bildenden Einheiten (CFU) beeinflussen.
- Sobald alle Proben verwundet sind, werden sie mit einer sterilen Pinzette in die 24-Well-Einsätze überführt. Pipettieren Sie 15 μL des bakteriellen Inokulums in das Wundbett. Anschließend 24 h bei 37 °C in einem befeuchteten 5%CO2-Gewebeinkubator inkubieren.
- Wenn längere Inkubationszeiten erforderlich sind, entfernen Sie die Medien und ersetzen Sie sie alle 24 Stunden durch frische Medien und inkubieren Sie unter den gleichen Bedingungen.
7. Bestimmung der Keimbelastung
- Entfernen Sie das Medium vom Boden der Vertiefungen. Mit einer sterilen Pinzette wird jede Probe in ein separates 50-ml-Röhrchen mit 1 ml sterilem PBS überführt.
- Verwenden Sie einen feinspitzen Homogenisator, um die Oberfläche der Probe zu homogenisieren. Achten Sie darauf, dass das Wundbett in direktem Kontakt mit der Spitze des Homogenisators steht.
- Homogenisieren Sie jede Probe für 35 s auf mittel/hoch. Der Homogenisator löst die Bakterien von der Oberfläche des Wundbettes, um eine Aufzählung der Bakterienbelastung zu ermöglichen.
- Sobald alle Proben verarbeitet sind, wirbeln Sie jede Probe der Reihe nach vor dem Pipettieren durch. Dadurch soll sichergestellt werden, dass das bakterielle Homogenat gemischt wird.
- 20 μL vortexiertes Homogenat werden in die entsprechende Vertiefung einer 96-Well-Platte pipettiert, die 180 μL steriles PBS enthält.
- Jedes Probenhomogenat wird nacheinander auf 1 x 10−7 verdünnt und 10 μL des verdünnten Homogenats auf eine tryptische Sojaagarplatte in dreifacher Ausfertigung pipettiert.
- Die Agarplatte 18 h bei 37 °C inkubieren. Zählen Sie dann die Anzahl der Kolonien, um die KBE für jede Probe zu bestimmen.
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Representative Results
Die Identifizierung eines Weges zur Sterilisation der Haut vor der Einrichtung des Wundinfektionsmodells war eine Herausforderung. Die Herausforderung bestand darin, die Haut zu sterilisieren, ohne die verschiedenen Hautschichten zu beschädigen, was dann unbeabsichtigte Folgen für den Ausgang einer Infektion haben kann. Um ein geeignetes Sterilisationsregime zu identifizieren, wurden verschiedene Behandlungen über unterschiedliche Zeiträume ausprobiert, wie in Tabelle 1 dargestellt. Die Kontamination wurde als Trübungsentwicklung nach 48 h im MK-Medium aufgezeichnet, das zur Pflege der Hautproben verwendet wurde. Die Gewebeintegrität wurde durch Histologie überwacht, gefolgt von einer Färbung mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) unmittelbar nach der Behandlung (Abbildung 1). Eine 30-minütige Behandlung mit Chlordioxid erwies sich als am effektivsten bei der reproduzierbaren Sterilisation des Hautgewebes unter Wahrung der Gewebeintegrität.
Im Versuchsaufbau wird das verwundete sterile Gewebe in die apikale Kammer eines 24-Well-Einsatzes an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche gegeben (Abbildung 2A). Zwei verschiedene Wundtechniken wurden versucht - eine Lappenentfernungstechnik, bei der das Gewebe durch ein Stanzbiopsiewerkzeug verwundet wird und die oberste Schicht des verwundeten Gewebes mit einer Kombination aus einem 15-Klingen-Skalpell und steriler Zahn-Allis-Gewebezange entfernt wird, und eine Kratztechnik, bei der das Gewebe allein durch ein Stanzbiopsiewerkzeug verwundet wird. Obwohl das Scratch-Modell nach 24 Stunden eine höhere durchschnittliche Anzahl von CFUs beherbergte, waren die Ergebnisse variabel. Die Klappenentfernungstechnik führte zu konsistenteren Ergebnissen (Abbildung 2C). Nach 48 h wurden im Vergleich zum Inokulum etwa 100-mal mehr bakterielle KBE aus dem verwundeten Gewebe gewonnen (Abbildung 2D). Dies wurde als Hinweis auf eine erfolgreiche Infektion gewertet. Ein weißer Film im Wundbett war 48 h nach der Infektion auf dem Gewebe sichtbar (Abbildung 2B). Gram-gefärbte histologische Schnitte von infiziertem Gewebe zeigten das Vorhandensein von S. aureus-Zellen im Wundbett an (Abbildung 2E,F). Als Komparator werden gramgefärbte histologische Schnitte von nicht infiziertem Gewebe bereitgestellt (Abbildung 2G,H).
Von einem Lammkopf aus kann ein 100 cm2 Abschnitt (10 cm x 10 cm) realistisch erreicht werden. Da jedes Hautstück mit einer kreisförmigen Stanzbiopsie mit einem Durchmesser von 8 mm aus der Stirn gestanzt wird, können pro Woche etwa 100 Hautflecken von einer Lammstirn gewonnen werden. Die Beschaffung weiterer Lämmerköpfe erhöht proportional die Anzahl der Hautproben, die pro Woche entnommen werden können. Daher wird behauptet, dass das Verfahren einen relativ hohen Durchsatz aufweist. Für diese Studie wurden routinemäßig 24 Hautproben pro Woche entnommen. Die Haut verschiedener Lämmerköpfe wurde als biologische Replikate verarbeitet, um die potenzielle Spender-zu-Spender-Variabilität zu berücksichtigen. Während der Vorbereitung der Hautpflaster (Schritte 3.1-3.8) ist der Hauptzeitaufwand die 30-minütige Inkubation der Hautproben in der Chlordioxidlösung und die 2 x 35 Minuten Wartezeit auf die Haarentfernungscremebehandlung. Die Anwendung der Stanzbiopsie zur Erzeugung der 24 Hautflecken dauert ca. 15 min. Es ist diese Zeit, die linear skalieren würde, wenn die Anzahl der Hautflecken erhöht würde.
| Desinfektionsmittel | 10 Min. | 30 min | 60 min |
| 1% hochwertiges medizinisches Flächendesinfektionsmittel | F | P | P |
| 1% Mehrzweck-Desinfektionsmittel | F | F | P |
| 3% Povidon | F | F | F |
| 5% Povidon | F | P | P |
| 10% Povidon | F | P | P |
| 70% Ethanol | F | P | P |
| UV | F | F | F |
| 0,55% Hypochlorit | F | P | P |
| 200 ppm Chlordioxid | F | P | P |
Tabelle 1: Sterilisation von frischer Lammhaut. Jede Hautprobe wurde für die angegebene Zeit im Desinfektionsmittel belassen. F bedeutet das Versagen, das Gewebe zu sterilisieren, mit bakterieller Kontamination in den Medien. P steht für Passieren, ohne dass eine bakterielle Kontamination in den Medien vorhanden ist.
Abbildung 1: Histologie von nicht infizierter ex vivo Schafhaut, die mit Desinfektionsmitteln (H&E-Färbung) bei 100-facher Vergrößerung behandelt wurde. (A) Kontrolle der Hautprobe mit 30-minütiger Behandlung in PBS. Einige epidermale Ausscheidungen sind zu sehen, aber die Epidermis ist nicht gestört. (B) Schafhaut, die 30 min lang mit 1% hochwertigem medizinischem Flächendesinfektionsmittel behandelt wurde. Epidermaler Abwurf (schwarzer Pfeil) zusammen mit einer Störung des Stratum granulosum (blauer Pfeil). (C) Schafhaut, die 30 Minuten lang mit 5% Povidon behandelt wurde. Moderate Schädigungen des Gewebes sind hier zu sehen, mit epidermalem Abwurf des Stratum corneum (schwarzer Pfeil). Es gibt minimale Störungen in den darunter liegenden epidermalen Schichten. (D) Schafhaut, die 30 min lang mit 10% Povidon behandelt wurde. Die oberen Schichten der Epidermis sind beschädigt, mit Anzeichen von Abwurf (schwarzer Pfeil) und Ausdünnung (grüner Pfeil). (E) Schafhaut 30 min lang mit 2% Mehrzweckdesinfektionsmittel behandelt. Es können schwere Schäden an der Probe beobachtet werden, mit signifikanter epidermaler Ausscheidung (schwarzer Pfeil) und vollständiger Tilgung des Stratum corneum (roter Pfeil). (F) Schafhaut, die 30 min lang mit 200 ppm Chlordioxid behandelt wurde. Einige epidermale Ausscheidungen sind zu sehen, aber die Epidermis ist intakt. (G) Schafhaut 30 min lang mit 0,6% Hypochlorit behandelt. Es liegt eine schwere Schädigung der Epidermis vor, mit einem hohen Maß an epidermalem Haarausfall (schwarzer Pfeil) und stellenweise einer Ausrottung der Epidermis (roter Pfeil). (H) Schafhaut, die 30 min lang mit 70% Ethanol behandelt wurde. Eine Schädigung der Epidermis ist zu sehen, mit signifikanter epidermaler Ausscheidung (schwarzer Pfeil). Der Maßstabsbalken beträgt 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Ex-vivo-Schafhaut, die mit S. aureus infiziert ist. (A) Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus. (B) Bilder von ex vivo Schafhaut vor der Infektion (linkes Bild) und nach 48 h Infektion (rechtes Bild). Beachten Sie den weißen Film, der nach 48 h Inkubation in infiziertem Gewebe vorhanden ist, der in nicht infiziertem Gewebe fehlt. (C) Prüfung der Wirkung verschiedener Wundmethoden auf die endgültige Koloniebildungseinheit (CFU) nach der Homogenisierung. Lappenentfernung (n = 6) und Kratzen (n = 9) infiziert mit S. aureus für 24 h. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. gibt einen p-Wert < 0,0001 an. (D) Prüfung des Einflusses der Inkubationszeiten auf die KBE-Anzahl nach der Homogenisierung. 24 h Inkubation (n = 6) und 48 h Inkubation (n = 12). Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. gibt einen p-Wert < 0,0001 an. (E,F) Repräsentative Bilder der histopathologischen Analyse der infizierten Schafhaut nach 48 h Infektion mit einer modifizierten Gram-Färbung (E) bei 100-facher Vergrößerung (Maßstabsbalken von 200 μm). Das Feld zeigt den in (F) vergrößerten Bereich bei 1.000-facher Vergrößerung (Maßstabsbalken von 50 μm). Schwarze Pfeile zeigen Bakterien an. (G,H) Repräsentative Bilder der histopathologischen Analyse der nicht infizierten Schafhaut nach einer 48-Stunden-Periode (Kontrolle) mit einer modifizierten gGram-Färbung (G) bei 100-facher Vergrößerung (Maßstabsbalken von 200 μm). Das Feld zeigt den in (H) vergrößerten Bereich bei 1.000-facher Vergrößerung (Maßstabsbalken von 50 μm). Die statistische Analyse wurde als Einweg-ANOVA durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die Entwicklung antimikrobieller Mittel ist ein wichtiges, aber teures Unterfangen, das schätzungsweise rund 1 Milliarde US-Dollar kostet und etwa 15 Jahre in Anspruch nimmt. Über 90 % der antimikrobiellen Wirkstoffforschung und präklinischen Studien zur Wirksamkeit antimikrobieller Arzneimittel werden von akademischen Forschern und kleinen und mittleren Unternehmen mit typischerweise weniger als 50 Mitarbeitern durchgeführt22. Diese Teams sind finanziell sehr eingeschränkt, was das Versagen von Leitmolekülen in späteren Phasen der translationalen Forschung katastrophal macht. Der Anstieg der antimikrobiellen Resistenz übertrifft die Entwicklung neuartiger antimikrobieller Wirkstoffe, was die Notwendigkeit, die bereits begrenzten Investitionen in die antimikrobielle Forschung verantwortungsvoll zu steuern, weiter verschärft23.
Die Unterschiede in der bakteriellen Physiologie zwischen Infektionen in In-vivo - und In-vitro-Laborkulturen führen tendenziell zu einer Überschätzung der antimikrobiellen Wirksamkeit der Treffer während der Bleiidentifizierungsphase. Eine solche Überschätzung trägt zu den hohen Fluktuationsraten bei, die in den nachfolgenden Übersetzungsphasen beobachtet werden. Die Verfügbarkeit von In-vitro-Plattformen für antimikrobielle Wirksamkeitstests, die Bakterien mit einer Physiologie enthalten, die die bei Infektionen in vivo gefundene besser nachahmt, wird eine genauere Abschätzung der antimikrobiellen Wirksamkeit ermöglichen und Forschern eine bessere Kontrolle der Bleioptimierung ermöglichen, ohne auf teure und streng regulierte Tierversuche angewiesen zu sein. Solche Modelle werden auch die Fluktuationsraten in den nachfolgenden Phasen der Translation verringern und die Entdeckung antimikrobieller Medikamente für Investitionen attraktiver machen.
Dieses hier beschriebene Modell der Schafhautinfektion ist ein nützliches Werkzeug, das Forschern ein physiologisch relevantes In-vitro-Modell einer infizierten Wunde zur Verfügung stellt, um die Wirksamkeit neuer topischer antimikrobieller Formulierungen in den präklinischen Stadien zu testen. Im Gegensatz zu den meisten ex vivo Infektionsmodellen, die in der wissenschaftlichen Literatur 10,15,24,25,26,27,28 beschrieben sind, werden in diesem Modell die Erreger, die dem ex vivo Gewebe ausgesetzt sind, während der Infektion nicht mit Kulturmedien ergänzt. Die Vermehrung von Krankheitserregern und die anschließende Infektion hängen von der Fähigkeit des Organismus ab, das Gewebe zu schädigen. Daher ist die Physiologie des Erregers in diesem Modell enger mit der bei in vivo Infektionen verwandt als bei herkömmlichen mikrobiologischen Kulturen. Aus diesem Modell wird eine hochgradig reproduzierbare Infektion erhalten, die anhand der Anzahl der nach der Inkubation aus dem Gewebe gewonnenen KBE beurteilt wird.
Mit der Fülle von menschlichen Hautäquivalenten und menschlichen und porcinen Ex-vivo-Wundmodellen könnte die Verwendung von Schafgewebe in diesem Modell oberflächlich als Einschränkung argumentiert werden. Schafe gehören jedoch zu der Gruppe der Großtiere, die als Modelle für Infektionen in vivoverwendet werden 29,30,31. Darüber hinaus wurden Schafe als Ersatz für Menschen in der immunologischen Forschung und Impfstoffentwicklung verwendet, was darauf hindeutet, dass ihre Immunantwort der des Menschen ähnlich ist32. Der Gewebereparaturprozess während der Wundheilung ist bei großen Säugetieren, einschließlich Schafen und Menschen, ähnlich33,34, und Interventionen zur Verbesserung der Wundheilung, die erfolgreich bei Schafen nachgewiesen wurden, wurden für die Translation auf den Menschen vorgeschlagen35,36,37. Daher ist die Verwendung von ex vivo Schafhaut in diesem Wundmodell keine Einschränkung. Darüber hinaus kann dieses Schafmodell aus folgenden Gründen als zuverlässige Alternative zu Modellen mit menschlicher oder schweinischer Haut beurteilt werden. Die Verfügbarkeit menschlicher Haut ist begrenzt und von unterschiedlicher Qualität, wenn verfügbar38. Tissue-Engineering-menschliche Epidermis und lebende Hautäquivalente erfordern Verfeinerungen ihrer Kulturbedingungen, um die Reproduzierbarkeit in der Gewebephysiologie zu gewährleisten39. Obwohl Schweinehaut zugänglicher ist als menschliche Haut, wird die weit verbreitete Schweinehaut im Rahmen der Schlachtkörperverarbeitung verbrüht, wodurch die Epidermisentfernt wird 10. Erfahrungsgemäß ist unverbrühte Schweinehaut in Schlachthöfen weniger leicht erhältlich.
Im gesamten hier beschriebenen Protokoll gibt es kritische Schritte, die den Erfolg des Modells sicherstellen. Der kritischste Schritt ist die Sterilisation des Gewebes nach der Entnahme. Chlordioxidlösung muss mit den Gewebeproben gemischt werden, und eine Kontaktzeit von 30 Minuten muss eingehalten werden, um das Gewebe ausreichend zu desinfizieren und Verunreinigungen zu entfernen. Darüber hinaus kann es beim Aufbau dieses Experiments zu Trübungen oder Pilzbefallen aufgrund unsachgemäßer Handhabung oder unwirksamer Behandlung mit Desinfektionsmitteln und antibiotischen Medien kommen. In einem solchen Fall müssen Proben, die Trübung entwickeln, verworfen werden. Um die Entwicklung von Trübung und Kontamination zu reduzieren, sollte die Laborumgebung sauber gehalten werden, mit häufigem Sterilisieren des Inkubators, Verwendung von Filterspitzen und Sicherstellung einer vollständigen Sterilisation der Werkzeuge und Behälter, die mit den Proben verwendet werden. Ein weiterer kritischer Schritt im Protokoll ist, wenn der 4-mm-Biopsiestempel verwendet wird, um das Gewebe zu wickeln. Die Verwendung dieses Tools ermöglicht ähnlich große Wundbetten, um die Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit des Protokolls zu gewährleisten. Die Variabilität der Wundbettgröße wirkt sich auf den Endpunkt CFU aus. Bei ausreichender Entfernung des Gewebelappens sind die Ergebnisse viel konsistenter. Ein weiterer kritischer Schritt im Zusammenhang mit der Integrität der Endpunkt-CFU-Zahl ist die Verwendung des feinspitzen Homogenisators zur Freisetzung von Bakterienzellen. Es wurde festgestellt, dass die Position der Homogenisatorspitze einen Einfluss auf die KBE-Anzahl von Probe zu Probe hat; Wenn die Spitze korrekt direkt auf dem Wundbett platziert wurde, gab es viel weniger Variabilität von Probe zu Probe.
Dennoch ist das hier vorgeschlagene Modell nicht ohne Einschränkungen. Dieses Modell hat Einschränkungen, die allen Ex-vivo-Studien innewohnen (d.h. das Fehlen eines aktiven Gefäßflusses, das Fehlen kommensaler Mikrobiota, die den Infektionsfortschritt modulieren können, und das Fehlen von Immunzellen). Da das Ex-vivo-Wundmodell keine aktiven Immunzellen enthält, kann argumentiert werden, dass sich der Infektionsverlauf in vivo in Gegenwart dieser Zellen von dem in Ex-vivo-Modellen beobachteten unterscheiden könnte. Unabhängig davon bieten Ex-vivo-Modelle eine Gewebeoberfläche für die Anheftung und eine Nährstoffquelle für Bakterien und stellen eine 3D-Diffusionsbarriere für Formulierungen dar, die eine genauere Bewertung der antimikrobiellen Wirksamkeit ermöglicht als herkömmliche mikrobiologische Kulturtechniken.
Ein wesentlicher Vorteil des Modells besteht darin, dass das Gewebe von Lämmern stammt, die für den menschlichen Verzehr gezüchtet werden. Insbesondere verwendet das Modell Haut von Lämmerköpfen, die normalerweise weggeworfen werden. Darüber hinaus hat das Modell einen hohen Durchsatz und ermöglicht kostengünstige, schnelle und reproduzierbare Vergleichsstudien. Es kann behauptet werden, dass die Verfügbarkeit dieses Modells den Bedarf an Tieren, die speziell für die translationale Forschung gezüchtet wurden, im Einklang mit den Prinzipien der drei R, die humanere Forschungspraktiken ermöglichen, verringern und verfeinern wird. Obwohl das hier beschriebene Modell S. aureus als exemplarischen Erreger enthält, kann das Modell mit anderen Mikroorganismen einschließlich anderer Bakterien, Pilze und Viren verwendet werden, wodurch der Umfang der Arzneimittelentwicklung, den das Modell ermöglicht, erweitert wird. Es ist vorstellbar, dass die Verwendung dieses Modells die schnelle Übersetzung dringend benötigter Antibiotika für Hautinfektionen ermöglichen wird, indem es Forschern eine größere Kontrolle über das Design und die Formulierung von Arzneimitteln in den präklinischen Stadien bietet.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten
Acknowledgments
Die Autoren danken EPSRC (EP/R513313/1) für die Förderung. Die Autoren danken auch R.B. Elliot und Son Abattoir in Calow, Chesterfield, für die Bereitstellung von Lämmerköpfen und für ihr Entgegenkommen in den frühen Phasen des Projekts, Kasia Emery für ihre Unterstützung bei der Entwicklung dieses Protokolls und Fiona Wright von der Abteilung für Infektion, Immunität und Herz-Kreislauf-Erkrankungen an der Universität Sheffield für die Verarbeitung der histologischen Proben und ihre unglaubliche Hilfe während dieses Projekts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
| 4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| 8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
| Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
| Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
| Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
| Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
| Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
| Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
| Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
| Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
| Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |
References
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