Análise da disfunção contrátil cardíaca e dos transientes de Ca²⁺ em miócitos de roedores

Summary

Um conjunto de protocolos são apresentados que descrevem a medida da função contrátil via detecção do comprimento do sarcômero juntamente com a medição transitória de cálcio (Ca²⁺) em miócitos isolados de ratos. A aplicação desta abordagem para estudos em modelos animais de insuficiência cardíaca também está incluída.

Abstract

A disfunção contrátil e os transientes de Ca²⁺ são frequentemente analisados a nível celular como parte de uma avaliação abrangente da lesão e/ou remodelação induzida pelo coração. Uma abordagem para avaliar essas alterações funcionais utiliza o encurtamento descarregado e análises transitórias de Ca²⁺ em miócitos cardíacos adultos primários. Para esta abordagem, os miócitos adultos são isolados por digestão de colagenase, tornados tolerantes ao Ca²⁺ e, em seguida, aderidos a coberturas revestidas de laminina, seguidas de estimulação elétrica em meio livre de soro. O protocolo geral utiliza miócitos cardíacos de ratos adultos, mas pode ser prontamente ajustado para miócitos primários de outras espécies. Alterações funcionais em miócitos de corações lesados podem ser comparadas a miócitos simulados e/ou a tratamentos terapêuticos in vitro . A metodologia inclui os elementos essenciais necessários para a estimulação dos miócitos, juntamente com a câmara celular e os componentes da plataforma. O protocolo detalhado para esta abordagem incorpora as etapas para medir o encurtamento descarregado pela detecção do comprimento do sarcômero e transientes celulares de Ca²⁺ medidos com o indicador ratiometric Fura-2 AM, bem como para a análise de dados brutos.

Introduction

A análise da função da bomba cardíaca geralmente requer uma série de abordagens para obter uma visão adequada, especialmente para modelos animais de insuficiência cardíaca (IC). A ecocardiografia ou as medidas hemodinâmicas fornecem informações sobre a disfunção cardíaca in vivo ¹, enquanto abordagens in vitro são frequentemente empregadas para identificar se a disfunção surge de alterações no miofilamento e/ou no transiente Ca²⁺ responsável pela excitação do acoplamento, ou o potencial de ação, com função contrátil (por exemplo, acoplamento excitação-contração [E-C]). As abordagens in vitro também oferecem uma oportunidade para rastrear a resposta funcional a neurohormônios, alterações genéticas induzidas por vetores, bem como potenciais agentes terapêuticos² antes de buscar estratégias de tratamento in vivo dispendiosas e/ou trabalhosas.

Várias abordagens estão disponíveis para investigar a função contrátil in vitro, incluindo medidas de força em trabéculas³ intactas ou miócitos permeabilizados⁴, bem como encurtamento descarregado e transientes de Ca²⁺ em miócitos intactos na presença e ausência de IC ^5,6. Cada uma dessas abordagens tem como foco a função contrátil dos miócitos cardíacos, que é diretamente responsável pela função da bomba cardíaca ^2,7. No entanto, a análise da contração e do acoplamento E-C é mais frequentemente realizada medindo o encurtamento do comprimento muscular e os transientes de Ca 2+ em miócitos adultos isolados e tolerantes a Ca²⁺. O laboratório utiliza um protocolo detalhado publicado para isolar miócitos de corações de ratos para esta etapa⁸.

Tanto o transiente de Ca²⁺ quanto os miofilamentos contribuem para o encurtamento e realongamento dos miócitos intactos e podem contribuir para a disfunção contrátil ^2,7. Assim, esta abordagem é recomendada quando a análise funcional in vitro requer um miócito intacto contendo a maquinaria de ciclagem Ca²⁺ mais os miofilamentos. Por exemplo, miócitos isolados intactos são desejáveis para o estudo da função contrátil após a modificação do miofilamento ou da função de ciclagem de Ca²⁺ via transferência gênica⁹. Além disso, uma abordagem de miócitos intactos é sugerida para analisar o impacto funcional dos neurohormônios ao estudar o impacto das vias de sinalização do segundo mensageiro a jusante e/ou a resposta a agentes terapêuticos². Uma medida alternativa da força dependente da carga em miócitos únicos é mais frequentemente realizada após a permeabilização da membrana (ou esfolamento) a baixas temperaturas (≤15 °C) para remover a contribuição transitória de Ca²⁺ e focar na função miofilamentar¹⁰. A medida da força dependente da carga mais transientes de Ca²⁺ em miócitos intactos é rara devido em grande parte ao desafio complexo e técnico da abordagem¹¹, especialmente quando é necessário maior rendimento, como para medir as respostas à sinalização neurohormonal ou como uma tela para agentes terapêuticos. A análise das trabéculas cardíacas supera esses desafios técnicos, mas também pode ser influenciada por não miócitos, fibrose e/ou remodelamento da matriz extracelular². Cada uma das abordagens descritas acima requer uma preparação contendo miócitos adultos porque os miócitos neonatais e miócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzíveis (iPSCs) ainda não expressam o complemento completo de proteínas de miofilamento adulto e geralmente não possuem o nível de organização de miofilamentos presente no miócito adulto em forma de bastonete². Até o momento, evidências em iPSCs indicam que a transição completa para isoformas adultas excede mais de 134 dias em cultura¹².

Dado o foco desta coleção na IC, os protocolos incluem abordagens e análises para diferenciar a função contrátil em miócitos intactos com falha versus não falha. Exemplos representativos são fornecidos a partir de miócitos de ratos estudados 18-20 semanas após uma coarctação suprarrenal, descrita anteriormente ^5,13. Comparações são então feitas com miócitos de ratos tratados com simulação.

O protocolo e a plataforma de imagem aqui descritos são utilizados para analisar e monitorar alterações no encurtamento e transientes de Ca²⁺ em miócitos cardíacos em forma de bastonete durante o desenvolvimento de IC. Para esta análise, miócitos em forma de bastonete tolerantes a 2 x 10 4⁴ Ca²+ são banhados em coberturas de vidro revestidas de laminina (CSs)^{de 22 mm 2} mm e cultivados durante a noite, conforme descrito anteriormente⁸. Os componentes montados para esta plataforma de imagem, juntamente com os meios e buffers usados para imagens ideais, são fornecidos na Tabela de Materiais. Um guia para análise de dados usando um software e os resultados representativos também são fornecidos aqui. O protocolo geral é dividido em subseções separadas, com as três primeiras seções se concentrando em miócitos isolados de ratos e análise de dados, seguidas por experimentos transitórios celulares de Ca²⁺ e análise de dados em miócitos.

Protocol

Os estudos realizados em roedores seguiram a Política do Serviço de Saúde Pública sobre Cuidados Humanitários e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Michigan. Para este estudo, os miócitos foram isolados de ratos Sprague-Dawley e F344BN de 3-34 meses de idade, pesando ≥ 200 g⁵. Foram utilizadas as taxas masculinas e femininas.

1. Estimulação miocitária para estudos da função contrátil

1. Faça meios frescos à base de M199 para cada conjunto de miócitos isolados (Tabela de Materiais). 1 dia antes da marcha, placa 2 x 10⁴ Ca 2+ tolerantes a miócitos em forma de bastonete em²² mm² lâminas de vidro revestidas de laminina (CSs), conforme descrito anteriormente⁸.
2. Para preparar as câmaras, mergulhe cada câmara em 10% de água sanitária por 1 h. Em seguida, lave as câmaras com água corrente da torneira por 30-45 min, seguida de água destilada substituída a cada 5 min por 30 min, seguida de água deionizada substituída a cada 5 min por 30 min e um enxágue final em água deionizada.
3. Secar as câmaras em uma superfície limpa por 20-30 min (Figura suplementar 1A-C). Em seguida, os UV tratam as câmaras em um armário de biossegurança por 5 min em cada direção (total = 20 min). Esta etapa não é necessária para câmaras pré-esterilizadas.
   CUIDADO: Deixe a área para minimizar a exposição aos raios UV.
4. Remova a tampa da câmara, adicione 3 mL de meio à base de M199 (ver Tabela de Materiais) a cada poço (Figura suplementar 1B), substitua a tampa e pré-aqueça a câmara em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO 2 e 20% de O₂.
5. Esterilizar fórceps em um esterilizador de contas quentes a 250 °C por 20-25 s. Transfira a câmara de estimulação pré-aquecida da incubadora para um gabinete de biossegurança.
6. Transfira cada coverslip (CS) contendo miócitos cardíacos para poços individuais na câmara de estimulação usando pinça estéril. Transfira CSs quatro de cada vez, seguido de aquecimento por 10 minutos antes da transferência dos quatro CSs restantes para manter a temperatura do meio.
7. Anexar macacos de banana à câmara de estimulação em uma extremidade (Figura suplementar 1C) e ao estimulador na outra extremidade (Figura suplementar 1D).
8. Defina a frequência do estimulador para 0,2 Hz e defina a tensão (~ 12 V) para alcançar a contração em ~10%-20% de todos os miócitos cardíacos em forma de bastonete dentro de um poço. Para determinar o número de miócitos em contração, coloque a câmara sob um microscópio invertido com ampliação de 4x a 10x.
9. Colocar a câmara de estimulação numa incubadora a 37 °C a 5% de CO₂ (Figura suplementar 1E). Troque o meio a cada 12 h usando o meio pré-aquecido em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO₂ por 20-25 min. Continue a estimulação elétrica por até 3 dias com a mídia trocada a cada 12 h.

2. Análise da função contrátil de miócitos cardíacos de ratos adultos

1. Pré-aqueça uma embalagem de gel e um meio em uma incubadora de 37 °C por 30 minutos antes do experimento.
2. Ligue os componentes da plataforma de função contrátil listados na Tabela de Materiais e mostrados na Figura Suplementar 2, com especial atenção aos componentes-chave, que incluem uma tabela antivibração (Figura Suplementar 2A-1) com um microscópio invertido com um filtro vermelho profundo (590 nm) (Figura Suplementar 2A-2,3) e uma câmera CCD (Figura Suplementar 2A-4) conectada a um controlador CCD (Figura suplementar 2A-5 e Figura suplementar 2C-5) e integrada com um computador PC (Figura suplementar 2B-14).
3. Montar a tubulação na bomba peristáltica (Figura suplementar 2A-8; Figura suplementar 2A-8), transfira o pacote de gel pré-aquecido para o suporte do tubo (Figura suplementar 2A-9) e ligue o vácuo (Figura suplementar 2A-11) e a alimentação para o estimulador celular (Figura suplementar 2B-13).
4. Colocar um tubo de 50 mL com meio no suporte do tubo isolado (Figura suplementar 2A-9) e iniciar a perfusão a ~0,5 mL/min através do tubo da bomba peristáltica (Figura suplementar 2E-8).
5. Adicione uma pequena quantidade de meio pré-aquecido a um pequeno barco de pesagem (~ 2 mL). Transfira um CS contendo miócitos da câmara de estimulação para o barco de pesagem. Devolver a câmara de estimulação a 37 °C na incubadora de CO₂ a 5%.
6. Remova o CS do barco de pesagem e limpe suavemente a parte inferior. Transfira o CS para uma câmara CS recém-lubrificada (Figura suplementar 2A, F-10; seta preta) e adicione suavemente uma gota de mídia (~200 μL) ao CS.
7. Coloque um suporte de eletrodo de platina sobre o CS (Figura suplementar 2F; seta cinza) e coloque um novo CS por cima usando pinças. Coloque uma montagem superior (Figura 2F suplementar; seta branca) sobre o sanduíche CS e, em seguida, instale dois ou quatro parafusos de cabeça de panela #0 para terminar de montar a câmara.
8. Uma vez que o meio esteja presente em toda a tubulação da bomba, prenda a tubulação ao pré-aquecedor e, em seguida, conecte o pré-aquecedor à câmara CS montada na etapa 2.7. Comece a perfusão a 0,5 mL/min e coloque um lenço de papel abaixo da câmara para se certificar de que não há vazamentos.
9. Coloque a câmara CS no adaptador de palco. O meio perfundido é coletado na extremidade oposta da câmara com tubos conectados a um sistema de vácuo. Ligue o sistema de aquecimento (Figura suplementar 2A, D-7) e equilibre a câmara, a objetiva e o pré-aquecedor por ~5-10 min para atingir uma temperatura constante do meio de 37 °C. Visualize miócitos com a objetiva de imersão em água de 40x no microscópio durante esse tempo de equilíbrio.
10. Ative o estimulador de estimulação (Figura suplementar 2B-13) ajustando a tensão para 1,5x a configuração necessária para que 80% das células em forma de bastonete se contraiam, o que normalmente é de 35-40 V. Defina a frequência de estimulação para 0,2 Hz para otimizar a função contrátil e a sobrevivência dos miócitos.
11. Colete traços contráteis de encurtamento e realongamento de miócitos continuamente perfundidos e cadenciados. Para coletar medições de encurtamento, use uma câmera CCD (Figura suplementar 2A-4) conectada a um controlador CCD (Figura suplementar 2B-5,C) e um computador dedicado com uma placa controladora de E/S (Figura suplementar 2B-14; consulte Tabela de materiais). A plataforma mede o encurtamento do sarcômero em miócitos de ratos, embora resultados semelhantes sejam obtidos a partir de medições de miócitos coletadas das bordas longitudinais dos miócitos (ver Ecklerle et ^al.14).
12. Para coletar rastreamentos de encurtamento de sarcômero, abra o software no computador, selecione OK e Arquivo > Novo. Prepare um modelo de tela selecionando Rastreamentos > Editar Limites de Usuário > Comprimento do Sarcomere e, em seguida, definindo valores máximos e mínimos, que normalmente estão entre 2,0 μm e 1,5 μm. Calibrar a câmera CCD com uma gráticula de 0,01 mm antes de fazer medições nos miócitos (Figura 1D).
13. Para registrar rastreamentos de comprimento de sarcômero, selecione Arquivo > Novo. Identifique um miócito em contração e posicione-o ao longo do eixo longitudinal da câmera de modo que o padrão de estriação seja vertical (Figura 1B).
14. Use o mouse do computador para colocar a caixa da região de interesse (ROI) (caixa rosa) sobre o miócito (Figura 1C). Selecione Coletar e Iniciar para registrar a função contrátil. Recorde de encurtamento por 60 s de cada miócito em baixas frequências de estimulação (≤0,5 Hz).
15. Registre o encurtamento do sarcômero de 5-10 células por CS. Realize medições em 1 célula/CS se os estudos incluírem tratamento com agonistas/antagonistas. Prepare um meio pré-aquecido separado e uma peça de tubo de perfusão diferente e dedicada carregada em uma bomba peristáltica multicanal e siga as etapas 2.9.-2.14. para medir o impacto da administração de drogas ou neuro-hormônios na função contrátil dos miócitos.
16. Para medir o encurtamento em uma faixa de frequências, acelere os miócitos em cada frequência para obter o encurtamento em estado estacionário antes do registro⁵. Para esses estudos, dobre a taxa de perfusão e comece a gravar 15-20 s após a estimulação em uma nova frequência para obter respostas contráteis consistentes no estado estacionário para frequências na faixa de 0,2 Hz e 2 Hz. Normalmente, registre não mais do que 2 miócitos / CS para encurtamento em toda a faixa dada de frequências de estimulação.
17. Registre pelo menos 7 contrações/célula para obter dados confiáveis de média de sinal ao analisar as gravações (consulte a etapa 3).

3. Análise dos dados da função contrátil em miócitos isolados

1. Para começar, selecione Arquivo, escolha um rastreamento gravado e selecione Abrir. Selecione Tab 1 (lado esquerdo) do rastreamento base e defina o painel amarelo na parte superior do rastreamento como Sarc-Length. Selecione Rastreamentos e o modelo de tela preparado na etapa 2.12.
2. Para preparar um modelo de análise, selecione Operações, Opções de Análise Transiente Monotônica, Marca de Evento TTL na caixa Definição de t0, bem como as seguintes opções no menu: Linha de base (comprimento do sarcômero em repouso), Velocidade de partida em relação a t0 (dep v), Pico (altura do pico e %altura do pico/linha de base ou bl%pico h), Velocidade de retorno relativa ao tPeak (ret v), Time to Peak 50% (TTP 50%) usando t0 e Time to Baseline 50% (TTR_50%) usando tPeak. Salve essas opções de análise selecionando Modelos > Salvar modelo de análise com um identificador. Carregue esse modelo de análise antes de analisar cada rastreamento.
3. Para iniciar a análise de dados, selecione Marcas > Porta > Adicionar > Transitória Converter da Marca de Evento > Intervalo de Análise. Agora defina o intervalo de tempo de -0,01 s a 1,20 s para miócitos com ritmo de 0,2 Hz (Figura 2A, marcas vermelhas na porção inferior do traço bruto). Selecione um intervalo de tempo mais curto para miócitos estimulados em frequências mais altas.
4. Produza um rastreamento com média de sinal selecionando Operações > Eventos Médios. Uma gravação com média de sinal aparece abaixo do rastreamento de base original.
5. Selecione a guia 1 do rastreamento com média de sinal (lado esquerdo da tela) e selecione Marcas no menu superior, seguido de Adicionar transitório. Selecione Operações no menu superior e Análise Transiente Monotônica para exibir os valores médios de sinal para comprimento de sarcômero de linha de base, altura de pico, bl%pico h, dep v, ret v, TTP 50% e TTR_50% no painel de exibição com média de sinal.
6. Transfira cada análise transitória de sarcômero para uma planilha para a análise composta de miócitos múltiplos selecionando Exportar > Análise Transiente Monotônica > Corrente da Área de Transferência. Cole esses dados na planilha para cada rastreamento.
7. Para copiar o rastreamento com média de sinal, selecione Exportar > Opções da Área de Transferência > Área >de Transferência Atual e defina as casas decimais como 5, selecione Delimitador de Tabulações e clique em OK e OK. Cole os traços médios de sinal para cada registro de miócitos em uma segunda planilha.

4. Registo de transientes de Ca²⁺ em miócitos cardíacos adultos de ratos

1. Antes de medir os transientes de Ca 2+, ligue os componentes da plataforma descritos na etapa 2.2., juntamente com componentes adicionais de imagem de fluorescência (consulte componentes adicionais para análise de imagem de Ca²⁺ na Tabela de Materiais; Figura suplementar 2A-5,6; 2B-12).
2. Preparar a solução-mãe de Fura-2AM contendo 1 mM de Fura-2AM mais probenecida 0,5 M em dimetilsulfóxido (DMSO). A probenecida minimiza o vazamento de Fura-2AM¹⁵.
3. Diluir a solução-mãe a 5 μM de Fura-2AM e 2,5 mM de probenecida em 2,5 ml de meio (ver Tabela de Materiais) num poço de uma placa de 6 potes. Adicione apenas 2,5 mL de meio (sem Fura-2AM) a três poços adicionais na placa, cubra a placa com papel alumínio e pré-aqueça o meio a 37 °C.
4. Transfira um CS contendo miócitos da câmara de estimulação para o poço contendo Fura-2AM, cubra e devolva a placa à incubadora de 37 °C com 5% de CO₂ por 4 min. Montar a tubulação na bomba de perfusão e perfundir com o meio durante o período de carregamento da Fura-2AM, conforme descrito na etapa 2.4.
5. Desligue ou minimize as luzes da sala para reduzir o fotobranqueamento por fluorescência e otimizar o sinal de fluorescência. Remova a placa de 6 poços da incubadora e, em seguida, lave o CS por 10 s em cada um dos três poços contendo apenas o meio. Transfira o CS para um pequeno barco de pesagem contendo meios pré-aquecidos (sem adição de Fura-2AM).
6. Monte o CS na câmara CS recém-lubrificada depois de limpar suavemente a parte inferior do CS. Adicione suavemente uma gota de mídia ao CS e, em seguida, monte a montagem do eletrodo sobre o CS, seguido por um segundo CS e a montagem superior. Use parafusos de cabeça de panela #0 para terminar de montar a câmara celular, conforme descrito nas etapas 2.6.-2.7.
7. Conecte a tubulação da bomba cheia de mídia ao pré-aquecedor, conecte o pré-aquecedor à câmara CS e coloque em um adaptador de palco, conforme descrito na etapa 2.8. Recolher o meio com o sistema de tubos de vácuo e ligar o sistema de aquecimento (Figura suplementar 2A,D-7) para equilibrar a câmara a 37°C, conforme descrito nos passos 2.8.-2.9.
8. Ative o estimulador de estimulação (Figura suplementar 2B-13) ajustado para 35-40 V e 0,2 Hz, conforme descrito na etapa 2.10.
9. Antes de gravar um transiente Ca²⁺ , ligue uma pequena lanterna ou um booklight montado perto do teclado do computador para ajudar a ver o teclado. Além disso, registre o fundo de fluorescência em uma área sem miócitos cardíacos. Para iniciar, selecione Arquivo > Iniciar > Novo, conforme descrito na etapa 2.12.
10. Selecione um ROI e defina uma guia (ou barra de rastreamento, lado esquerdo) para o numerador bruto e uma segunda guia para o denominador bruto, definido no centro superior de cada guia. Registre o plano de fundo por 10-20 s. Clique com o botão direito do mouse e arraste sobre um painel da barra de rastreamento para obter os valores brutos do numerador e do denominador com média de sinal. Insira esses valores selecionando as Constantes de > de Operações e insira os valores brutos.
11. Prepare um novo modelo de tela para coletar transientes de encurtamento e Ca² +. Para o comprimento do sarcômero, selecione a guia 1 e use o mesmo processo descrito na etapa 2.13. Para imagens Ca² +, selecione Tab 2 > Ratio (centro superior da guia) > Rastreamentos > Editar Limites de Usuário para definir os níveis mínimo e máximo para a proporção, que normalmente são definidos entre 1 e 5. Use o mesmo processo para definir os intervalos de numerador e denominador para as guias 3 e 4 (lado esquerdo).
12. Posicione uma caixa de ROI sobre uma imagem de miócitos, conforme descrito na etapa 2.14. Selecione Arquivo > Nova > Coletar. Agora selecione Iniciar para coletar dados Ca²⁺ de encurtamento e ratiometric. Registre ≥7 contrações/célula para análise da média de sinal.
13. Repita a gravação de rastreamento em segundo plano descrita na etapa 4.10. após o registro de 2-4 miócitos. Normalmente, registre 4-5 miócitos / CS ou menos miócitos se houver alterações significativas na leitura de fundo.

5. Análise dos dados de transientes de Ca²⁺ em miócitos isolados.

1. Abra o arquivo desejado para análise e selecione Modelos > Modelo de tela para encurtamento mais transientes Ca² +. Em seguida, selecione as guias 1 e 2 (à esquerda) para mostrar o comprimento do sarcômero e a proporção Ca² +, respectivamente. Selecione Constantes de > de Operações e insira os valores do numerador e do denominador do rastreamento de plano de fundo Ca² +.
2. Prepare modelos de análise para encurtamento mais dados^{transitórios} Ca 2+. Selecione a guia 1 (lado esquerdo) e use o mesmo processo descrito na etapa 3.2. para definir o modelo de análise de comprimento do sarcômero.
3. Selecione a guia 2 (lado esquerdo) e selecione Operações, Opções de Análise Transiente Monotônica, Marca de evento TTL na caixa Definição de t0 e as seguintes opções no menu: Linha de base (razão basal), Velocidade de saída em relação a t0 (dep v), Pico (altura do pico e %altura do pico/linha de base ou bl%pico h), Velocidade de decaimento em relação ao tPeak (ret v), Time to Peak 50% (TTP 50%) usando t0 e Time to Baseline 50% (TTR_50%) usando tPeak. Salve essas opções de análise selecionando Modelos e Salvar Modelo de Análise usando um novo nome de identificador. Carregue esse modelo de análise antes de analisar cada rastreamento.
4. Use o mesmo processo descrito nas etapas 3.3.-3.6. para calcular a média do sinal e, em seguida, analisar o comprimento do sarcômero, seguido pelos mesmos passos para os transientes Ca² +. Defina marcas separadas para o comprimento do sarcômero e para o traço da razão transitória Ca² +.

Representative Results

Estudos de função contrátil são realizados em miócitos de ratos a partir do dia seguinte ao isolamento (dia 2) até 4 dias após o isolamento. Embora os miócitos possam ser registrados no dia seguinte ao isolamento (ou seja, dia 2), tempos de cultura mais longos são frequentemente necessários após a transferência gênica ou tratamentos para modificar a função contrátil⁸. Para miócitos cultivados por mais de 18 h após o isolamento, o protocolo de estimulação descrito na seção 1 ajuda a manter os túbulos t e resultados consistentes de encurtamento e realongamento.

Uma porção representativa de um CS contendo miócitos para estudos de encurtamento é mostrada na Figura 1A, juntamente com um miócito adequadamente posicionado antes de definir o ROI (Figura 1B). Uma vez que um ROI é identificado (Figura 1C; caixa rosa), as informações do algoritmo mostradas abaixo do miócito também ajudam a otimizar o posicionamento dos miócitos antes do registro. Especificamente, a densidade óptica linear (LOD; linha preta) é um indicador para o número e espaçamento dos sarcômeros, e um espectro de potência nítido no traço rápido da transformada de Fourier (FFT, linha vermelha) ajuda a alcançar o alinhamento ideal para o registro de encurtamento e realongamento. O padrão de gratícula usado para a calibração do comprimento do sarcômero (e detecção de borda) é mostrado na Figura 1D. Um registro alinhado típico do encurtamento do comprimento do sarcômero é mostrado na Figura 2A (painel superior), juntamente com a análise da média de sinal descrita na seção 3 (painel inferior).

A disfunção é frequentemente detectada em miócitos quando há disfunção in vivo em modelos animais. Por exemplo, a disfunção sistólica observada pela ecocardiografia em resposta à sobrecarga pressórica (PO)¹³ também é detectada em estudos de encurtamento de^miócitos5. Para ilustrar os traços dos dados, são mostrados traços representativos brutos (Figura 2; painel superior) e médios de sinal (Figura 2; painel inferior) obtidos a 0,2 Hz para miócitos de ratos sham- (Figura 2A) e tratados com PO (Figura 2B). Para testar se a função dos miócitos poderia ser resgatada após a PO, a transferência gênica mediada por vírus no momento do isolamento de miócitos também foi usada para substituir a troponina cardíaca endógena I (cTnI) por uma substituição fosfo-mimética de cTnI T144D (T144D) no sarcômero¹⁶. A análise inicial mostra que a redução da função contrátil induzida pelo PO (Tabela 1, painel superior) retornou aos níveis simulados nos miócitos PO 4 dias após a transferência gênica de cTnIT144D (Tabela 1; painel inferior).

Esta plataforma também pode ser usada para medir transientes de Ca²⁺, juntamente com o encurtamento em miócitos isolados. O encurtamento e o Ca 2+ não foram registrados após o PO, pois o PO reduz a aderência dos miócitos de ratos à laminina¹³, e um modelo comparável mostrou anteriormente que o manuseio alterado do Ca²⁺ se desenvolve em um ponto de tempo semelhante¹⁷. Em vez disso, experimentos representativos foram realizados em miócitos carregados de Fura-2AM isolados de ratos de 2-3 meses de idade. Um registro representativo e traços médios de sinal são mostrados na Figura 3, juntamente com a análise dos dados na Tabela 2. Para este conjunto de experimentos, miócitos isolados de ratos adultos foram estudados 4 dias após a transferência gênica mediada por adenovírus (multiplicidade de infecção = 100) de cTnIT144D ou cTnI do tipo selvagem. Tanto o encurtamento do sarcômero quanto os transientes de Ca 2+ foram medidos após a carga de miócitos com^Fura-2AM. A transferência gênica de cTnIT144D aumentou o encurtamento do pico e os níveis elevados de Ca²⁺ diastólico em comparação com cTnI nesses estudos iniciais (Tabela 2). Embora seja necessária uma análise mais extensa, os resultados iniciais sugerem que a substituição in vivo por cTnIT144D poderia produzir um fenótipo cardíaco complexo devido a mudanças na função contrátil e no manuseio do Ca²⁺ ao longo do tempo.

Figura 1: Miócitos cardíacos de ratos adultos utilizados para estudos funcionais. (A) Miócitos cardíacos isolados representativos de um rato adulto (barra de escala = 50 μm). A seta aponta para um miócito representativo fotografado para análise da função contrátil. (B) Miócito representativo com ROI (rosa) localizado na lateral (barra de escala = 20 μm). (C) Miócito representativo com ROI (painel superior), o padrão sarcômero para este miócito (painel inferior, azul; barra de escala = 20 μm) e o pico acentuado do espectro de potência (painel inferior, vermelho). (D) Captura de tela de gratícula de 0,01 mm para calibrar as medidas de encurtamento. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Registos representativos de miócitos de ratos. Um traço de gravação bruta (painel superior) e de média de sinal (painel inferior) registrado a 0,2 Hz em miócitos de ratos tratados com (A) sham e (B) sobrecarga de pressão (PO). Os miócitos foram isolados 18-20 semanas após a cirurgia, com PO produzido por coarctação suprarrenal¹³. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Registro e análise representativos do comprimento do sarcômero (SL) e dos transientes Ca 2+ de miócitos cardíacos adultos carregados de Fura-2AM. (A) Traços brutos para SL, razão transitória (razão) Ca 2+ e os traços do numerador e denominador usados para produzir a razão transitória Ca²⁺. (B) Um exemplo de traços médios de sinal para SL (traço superior) e a razão transitória Ca²⁺ (traço inferior). (C) Os traços são analisados quanto ao comprimento do sarcômero (SL) e à razão transitória de Ca²⁺ usando o algoritmo de traço monotônico. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Grupo de ratos	Farsa (n=30)	PO (n=32)
Comprimento do sarcômero em repouso (mm; SL)	1.761 + 0.006	1.748 + 0.004
altura de pico (% da linha de base)	9.003 + 0.409	6.680 + 0.552*
Amplitude de pico (mm)	0.159 + 0.007	0.117 + 0.010*
Taxa de encurtamento (mm/s)	-4.674 + 0.285	-4.143 + 0.335
Taxa de realongamento (mm/s)	3.251 + 0.223	2.706 + 0.273
Tempo para o pico (ms; TTP)	60 + 2	59 + 3
Tempo para 50% de realongamento (ms; TTR50%)	35 + 2	37 + 3
Grupo de ratos	Sham + cTnIT144D (n=14)	PO + cTnIT144D (n=17)
Comprimento do sarcômero em repouso (mm; SL)	1.768 + 0.009	1.776 + 0.004
altura de pico (% da linha de base)	9.038 + 1.339	8.414 + 0.960
Amplitude de pico (mm)	0.160 + 0.023	0.149 + 0.016
Taxa de encurtamento (mm/s)	-5.972 + 0.711	-4.173 + 0.726
Taxa de realongamento (mm/s)	3.925 + 0.577	3.055 + 0.403
Tempo para o pico (ms; TTP)	51 + 5	59 + 2
Tempo para 50% de realongamento (ms; TTR50%)	31 + 3	32 + 2

Tabela 1: Comparação da função contrátil em miócitos cardíacos em resposta à sobrecarga pressórica (PO) e transferência gênica. Os resultados do encurtamento de miócitos são de corações de ratos simulados e PO 18-20 semanas após a cirurgia (painel superior)^5,13 e miócitos de ratos simulados e PO 4 dias após a transferência do gene cTnIT144D (painel inferior). A função contrátil é medida 4 dias após o isolamento dos miócitos/transferência gênica em todos os grupos. Os resultados são expressos como ± SEM médio (n = número de miócitos). Cada conjunto de dados simulados e PO é comparado por um teste t de Student, com *p < 0,05 considerados estatisticamente significativos. Resultados de amplitude de pico para miócitos simulados e PO isolados foram relatados anteriormente em Ravichandran et ^al.5.

	Análise do comprimento do Sarcomere
Grupo de transferência de genes	cTnI (n=21)	cTnIT144D (n=16)
Comprimento do sarcômero em repouso (mm; SL)	1.81 + 0.01	1.81 + 0.01
Amplitude de pico (mm)	0.11 + 0.01	0.14 + 0.02*
Taxa de encurtamento (mm/s)	-4.29 + 0.42	-4.67 + 0.77
Taxa de realongamento (mm/s)	2.92 + 0.43	3.71 + 0.64
Tempo para o pico (ms; TTP)	50 + 4	84 + 28
Tempo para 50% de realongamento (ms; TTR50%)	37 + 4	35 + 6
	Análise transitória de Ca2+
Grupo de transferência de genes	cTnI (n=21)	cTnIT144D (n=19)
Relação Ca2+ de repouso	0.89 + 0.02	1.04 + 0.04*
Relação Pico Ca2+	0.50 + 0.05	0.42 + 0.07
Taxa transitória de Ca2+ (D/seg)	45.24 + 5.85	40.53 + 10.95
Taxa de decaimento de Ca2+ (D/s)	-4.91 + 0.99	-2.87 + 0.57
Tempo para o pico Ca2+ (ms; TTP)	34 + 2	41 + 3
Tempo para 50% de Ca2+ Decaimento (ms; TTD50%)	101 + 8	117 + 6

Tabela 2: Função contrátil e transientes de Ca²⁺ em miócitos de ratos adultos 4 dias após a transferência do gene cTnIT144D. Uma análise da função contrátil (painel superior) e dos transientes Ca²⁺ (painel inferior) é mostrada em miócitos após a transferência gênica de cTnIT144D em comparação com cTnI do tipo selvagem. Os miócitos são isolados de ratos adultos de 2-3 meses de idade, e os dados são apresentados como média ± MEV (n = número de miócitos). Comparações estatísticas da função contrátil (esquerda) e transientes Ca²⁺ (direita) são realizadas usando um teste t de Student não pareado com significância definida como *p < 0,05.

Figura suplementar 1: Componentes do sistema de estimulação para miócitos banhados em CSs revestidos de laminina. (A) Câmara de estimulação personalizada contendo eletrodos de platina em cada câmara. (B) Câmara de estimulação com as quatro primeiras câmaras cheias de suporte. (C) Câmara de estimulação ligada a cabos de banana-jack, que estão ligados à câmara e (D) ao estimulador. (E) A ligação entre o estimulador (à direita) e a incubadora a 37 °C (à esquerda). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 2 Suplementar: Componentes necessários para a função contrátil dos miócitos e/ou medições^{transitórias de} Ca 2+. (A) A plataforma de função contrátil mostrando cada componente, com os itens numerados explicados em mais detalhes na Tabela de Materiais. Os componentes da plataforma incluem uma mesa antivibração (1º), microscópio de campo brilhante invertido (#2,3), câmera CCD (4), controlador CCD e fonte de alimentação de xenônio (5), fonte de luz de emissão dupla (6), controlador de temperatura 7, bomba peristáltica (8º), suporte de tubo isolado (9º), câmara de perfusão montada em deslizamento de cobertura (nº 10) e sistema de vácuo (nº 11). (B) Componentes adicionais incluem a interface de fluorescência (#12), estimulador de câmara (#13) e computador PC (#14), que são explicados em mais detalhes na Tabela de Materiais. As exibições em close-up de itens numerados no painel A são mostradas em C-F. (C) Vista da fonte de alimentação de xenônio (esquerda) e do controlador CCD (direita). (D) Controlador de temperatura. (E) Bomba peristáltica. (F) Vista da base para a câmara de perfusão CS (seta preta), o suporte do eletrodo de platina (seta cinza) e o suporte superior (seta branca) com parafusos pan-head #0. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

O protocolo de estimulação crônica descrito na etapa 1 estende o tempo útil para estudar miócitos isolados e avaliar o impacto de tratamentos mais longos. Em nosso laboratório, resultados consistentes foram obtidos até 4 dias após o isolamento ao medir a função contrátil usando o comprimento do sarcômero em miócitos cronicamente cadenciados. No entanto, a função contrátil dos miócitos se deteriora rapidamente ao usar meios com mais de 1 semana para acelerar os miócitos.

Para estudos de função contrátil, os dados são coletados a 37 °C, o que está próximo da temperatura corporal para ratos. Para otimizar a viabilidade dos miócitos e obter traços consistentes para cada miócito, esses experimentos são realizados em uma frequência de estimulação inferior à frequência cardíaca fisiológica de ~ 5 Hz em ratos. Essas configurações produzem dados consistentes de função contrátil, mas a temperatura da câmara e/ou a frequência de estimulação podem ser ajustadas se os traços de encurtamento permanecerem consistentes em vários CSs contendo o mesmo grupo de tratamento de miócitos. Além disso, os melhores resultados são obtidos pela escolha de miócitos que não possuem bolhas, são totalmente aderidos a um CS e se contraem em ambas as extremidades de uma célula em forma de bastonete. Células ligadas em apenas uma extremidade, aquelas com múltiplas bolhas e/ou miócitos se contraindo em apenas uma extremidade não são desejáveis e muitas vezes são mais difíceis de registrar devido ao movimento de fundo. Para esses estudos, ≥20 sarcômeros são incluídos no ROI para atingir um pico acentuado do espectro de potência, comprimentos de sarcômero de repouso reprodutíveis e uma ótima relação sinal/ruído para o encurtamento do traço. Um ROI com apenas sete sarcômeros pode ser usado se o pico do espectro de potência permanecer nítido. O comprimento do sarcômero em repouso em miócitos isolados de ratos geralmente varia de 2,00-1,80 μm. Se um comprimento de sarcômero em repouso é inferior a 1,5 μm, uma contração ativa não é realista com base em nossa compreensão da arquitetura do sarcômero¹⁸ e geralmente é o resultado de uma orientação de miócitos sub-ótima.

A medição da função contrátil com ou sem medições transitórias de Ca²⁺ em miócitos intactos é uma abordagem de maior rendimento que requer menos investimento no desenvolvimento do conhecimento técnico necessário para medições de força em células únicas intactas¹¹. Estudos de miócitos intactos também se concentram exclusivamente na função dos miócitos, sem a contribuição de outros tipos celulares em preparações multicelulares². Uma área emergente neste campo é o desenvolvimento de uma análise de maior rendimento, medindo simultaneamente o encurtamento e/ou os transientes de Ca²⁺ em miócitos múltiplos intactos para acelerar a triagem de agentes terapêuticos no nível celular antes de uma análise in vivo mais extensa.

A função contrátil e as medições transitórias de Ca²⁺ também são possíveis em miócitos intactos isolados de outros modelos de roedores, como camundongos, embora existam algumas considerações e diferenças importantes em comparação com os miócitos de ratos. Os miócitos de camundongos são viáveis em cultura por 24-36 h, mas a viabilidade diminui progressivamente nos miócitos cultivados por mais de 48 h¹⁹. Esse intervalo de cultura truncado deve ser considerado ao usar a transferência gênica baseada em vetores, especialmente para proteínas de miofilamentos que têm meia-vida em dias, em vez de horas²⁰. Ao contrário dos miócitos de ratos, o isolamento bem-sucedido e a cultura de miócitos de camundongos também dependem da adição de inibidores da miosina ATPase, como o monóxido de 2,3-butanodiona ou a blebistatina, aos meios de cultura¹⁹. Como resultado, a estimulação crônica não é uma opção viável em culturas de miócitos de camundongos. Um tempo de equilíbrio mais longo, de 15 a 20 minutos, também é necessário para remover o impacto funcional desses inibidores de miosina nos miócitos isolados de camundongos. Finalmente, os miócitos de camundongos são otimamente compactados a 0,5 Hz para obter traços de encurtamento reprodutíveis em comparação com os 0,2 Hz utilizados para miócitos de ratos.

Em estudos em ratos tratados com PO, a disfunção contrátil é consistentemente detectada com estimulação de baixa frequência em miócitos de ratos. Uma maior redução dependente da frequência no encurtamento também é detectada em miócitos após PO em comparação com ratos simulados quando há disfunção contrátil in vivo ^5,13. Durante um estudo usando uma faixa de frequências, dobrar a velocidade da bomba para fornecer meios adequados produziu encurtamento em estado estacionário dentro de 15-20 s após a alteração da frequência de estimulação entre 0,2 e 2 Hz. Miócitos de rato também respondem à estimulação de curto prazo em frequências mais altas até 8 Hz, embora a viabilidade celular se deteriore rapidamente nessas frequências mais altas. No geral, a função contrátil dos miócitos provou ser uma abordagem reprodutível para confirmar ou validar a disfunção cardíaca in vivo em modelos de ratos, como o PO- em comparação com ratos tratados com simulação (Tabela 1; ver Kim et al.13). Além disso, esta plataforma pode testar se um tratamento direcionado aos miócitos restaura ou prejudica a função contrátil antes de buscar abordagens in vivo mais caras e/ou trabalhosas. Tanto o parto agudo quanto a exposição mais longa a agentes terapêuticos e/ou após a entrega gênica durante a cultura primária são possíveis usando essa abordagem. Por exemplo, experimentos de transferência de genes para substituir cTnI endógeno por cTnIT144D não indicam nenhuma mudança significativa na amplitude de encurtamento em miócitos de ratos simulados. Em contraste, o cTnIT144D restaura a amplitude de encurtamento de pico em direção a valores simulados em miócitos de ratos tratados com PO (Tabela 1). Uma fraqueza inerente a esta abordagem é a ausência da carga típica presente nos miócitos em condições in vivo. Como resultado, as respostas podem diferir das respostas funcionais dependentes da carga, e o experimento de exemplo indica que abordagens in vivo são necessárias para investigar melhor se o cTnIT144D melhora o desempenho cardíaco durante a PO.

A medição de ambos os transientes de encurtamento e Ca²⁺ no mesmo miócito é uma vantagem desta plataforma. Por exemplo, a direção da mudança pode diferir para transientes Ca²⁺ em comparação com a função contrátil. Como mostrado na Tabela 2, o pico de encurtamento aumenta significativamente após a transferência gênica de cTnIT144D para miócitos de ratos de 2-3 meses de idade. Esse desfecho difere dos dados obtidos em miócitos mais antigos, tratados com simulação (Tabela 1) e pode estar relacionado à idade de ratos⁵. No entanto, mais testes são necessários para provar essa interpretação. Os dados da Tabela 2 também mostram que o cTnIT144D não altera a amplitude de pico de Ca 2+ e, em vez disso, tende a diminuir a taxa de decaimento de Ca 2⁺ e elevar o Ca²+ em repouso. Esses achados sugerem que a expressão de cTnIT144D melhora a função contrátil, enquanto o maquinário de ciclagem Ca²⁺ compensa para amortecer esse efeito. Esses resultados destacam a capacidade dessa abordagem de distinguir entre mudanças na função contrátil e o ciclo Ca²+. Embora os resultados específicos aqui apresentados ainda não sejam definitivos, eles fornecem uma justificativa sólida para o desenvolvimento de um modelo animal genético para expressar a cTnIT144D miocárdica e avaliar se sua expressão atenua a disfunção causada pela OP no futuro. Uma observação final a partir dos dados transitórios de Ca 2⁺ é que corantes fluorescentes como Fura-2AM alteram a cinética da função contrátil nos miócitos²¹. Embora a resposta relativa produzida por um determinado tratamento ou modelo animal seja comparável dentro dos miócitos carregados de Fura-2, esses resultados não devem ser combinados com medições de encurtamento feitas na ausência de Fura-2AM. Para otimizar o uso de Fura-2AM para análise transitória de Ca 2+, o laboratório mais frequentemente mede o encurtamento na ausência de Fura-2AM e realiza um subconjunto de experimentos para medir transientes de Ca²⁺.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEDIA
Bovine serum albumin	Sigma (Roche)	3117057001	Final concentration = 0.2% (w/v)
Glutathione	Sigma	G-6529	Final concentration = 10 mM
HEPES	Sigma	H-7006	Final concentration = 15 mM
M199	Sigma	M-2520	1 bottle makes 1 L; pH 7.45
NaHCO3	Sigma	S-8875	Final concentration = 4 mM
Penicillin/streptomycin	Fisher	15140122	Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin
REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Fura-2AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	50 μg/vial;  Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO;  Final Fura2-AM concentration in media is  5 μM
Probenicid	Invitrogen (Fisher)	P36400	Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM
MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING
#1 22  mm2 glass coverslips	Corning	2845-22
3 x 36 inch cables with banana jacks	Pomona Electronics	B-36-2	Supplemental Figure 1, panel C
37oC Incubator  with 95% O2:5% CO2	Forma	3110	Supplemental Figure 1, panel E.  Multiple models are appropriate
Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp	Forma	1286	Multiple models are appropriate
Forceps - Dumont #5 5/45	Fine Science Tools	11251-35
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	1800-45
Low magnification inverted microscope	Leica	DM-IL	Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes;  4X and 10X objectives recommended
Pacing chamber	Custom		Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22
Stimulator	Ionoptix	Myopacer	Supplemental Figure 1, panel D.
MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS			ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options
Additional components for Ca2+ imaging analysis	Ionoptix	Essential system components: -- Photon counting system            --  Xenon power supply with dual excitation light source            --  Fluorescence interface	- The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera  (panel A #4).                                                                      - The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm  excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6.                                                                                                                                 - The fluorescence interface between the computer and  light source is shown in panel B, #12.
CCD camera with image acquisition  hardware and software (240 frames/s)	Ionoptix	Myocam with CCD controller	Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4  and  panel A #5 & panel C #5 (right), respectively.  The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14).
Chamber stimulator	Ionoptix	Myopacer	Panel B, #13; Alternative:  Grass model S48
Coverslip mounted perfusion chamber	Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws  (arrow, panel F)		Panel A #10 & panel F;   Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller).  Commercial alternatives:  Ionoptix FHD or C-stim cell  chambers; Cell MicroControls culture stimulation system
Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients	Ionoptix	PC with Ionwizard PC board and software	Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric  Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. - A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator.  The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below).
Forceps - Dumont #5 TI	Fine Science Tools	11252-40	Panel F
Insulated tube holder for media	Custom		Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm
Inverted brightfield microscope	Nikon	TE-2000S	Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging.   A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging.
Isolator Table	TMC Vibration Control	30 x 36 inches	Panel A, #1; Desirable:  elevated shelving, Faraday shielding
Microscope eyepieces & objective	Nikon	10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective	Panel A #3; 40X objective:  n.a. 0.08; w.d. 2 mm.  A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below).          NOTE:  water immersion dispensers also are now available for water-based objectives.
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls 3	Panel A #8 and panel E
small weigh boat	Fisher	08-732-112
Temperature controller	Cell MicroControls	TC2BIP	Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC.    A preheater and objective heater are recommended for this platform.  A Cell MicroControls HPRE2 preheater and  HLS-1 objective heater are controlled  by the TC2BIP temperature controller for our studies.
Under cabinet LED light with motion sensor	Sylvania	#72423 LED light	Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light..  Alternative:  A clip on flashlight/book light with flexible neck - multiple suppliers are available.
Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter	Fisher	Tygon tubing - E363;  polypropylene Ehrlenmeyer flask - 10-182-50B; Vacuum filter - 09-703-90	Panel A #11