Summary
En uppsättning protokoll presenteras som beskriver mätningen av kontraktil funktion via sarkomerlängdsdetektering tillsammans med kalcium (Ca2+) övergående mätning i isolerade råttmyocyter. Tillämpningen av detta tillvägagångssätt för studier i djurmodeller av hjärtsvikt ingår också.
Abstract
Kontraktil dysfunktion och Ca2+ transienter analyseras ofta på cellnivå som en del av en omfattande bedömning av hjärtinducerad skada och / eller ombyggnad. Ett tillvägagångssätt för att bedöma dessa funktionella förändringar använder lossad förkortning och Ca2+ övergående analyser i primära vuxna hjärtmyocyter. För detta tillvägagångssätt isoleras vuxna myocyter genom kollagenasförtunning, görs Ca2+ toleranta och fästs sedan vid lamininbelagda täckglas, följt av elektrisk pacing i serumfria medier. Det allmänna protokollet använder vuxna råtta hjärtmyocyter men kan lätt justeras för primära myocyter från andra arter. Funktionella förändringar i myocyter från skadade hjärtan kan jämföras med skenmyocyter och/eller med in vitro-terapeutiska behandlingar. Metoden inkluderar de väsentliga elementen som behövs för myocytpacing, tillsammans med cellkammaren och plattformskomponenterna. Det detaljerade protokollet för detta tillvägagångssätt innehåller stegen för att mäta lossad förkortning genom sarkomerlängdsdetektering och cellulära Ca2+ transienter uppmätta med den ratiometriska indikatorn Fura-2 AM, samt för rådataanalys.
Introduction
Analysen av hjärtpumpens funktion kräver ofta en rad metoder för att få tillräcklig insikt, särskilt för djurmodeller av hjärtsvikt (HF). Ekokardiografi eller hemodynamiska mätningar ger insikt i in vivo hjärtdysfunktion1, medan in vitro-metoder ofta används för att identifiera om dysfunktion uppstår från förändringar i myofilamentet och / eller Ca2+ övergående som är ansvarig för att koppla excitation, eller åtgärdspotentialen, med kontraktil funktion (t.ex. excitation-sammandragning [E-C] koppling). In vitro-metoder ger också en möjlighet att screena det funktionella svaret på neurohormoner, vektorinducerade genetiska förändringar samt potentiella terapeutiska medel2 innan man fortsätter med kostsamma och / eller mödosamma in vivo-behandlingsstrategier .
Flera metoder finns tillgängliga för att undersöka in vitro-kontraktil funktion, inklusive kraftmätningar i intakta trabeculae3 eller permeabiliserade myocyter4, samt lossat förkortning och Ca2+ transienter i intakta myocyter i närvaro och frånvaro av HF 5,6. Var och en av dessa metoder fokuserar på hjärtmyocytkontraktil funktion, som är direkt ansvarig för hjärtpumpfunktionen 2,7. Analysen av både sammandragning och E-C-koppling tillsammans utförs emellertid oftast genom att mäta förkortning av muskellängden och Ca 2+ transienter i isolerade, Ca2+ toleranta vuxna myocyter. Laboratoriet använder ett detaljerat publicerat protokoll för att isolera myocyter från råtthjärtan för detta steg8.
Både Ca2+ övergående och myofilament bidrar till förkortning och förlängning i intakta myocyter och kan bidra till kontraktil dysfunktion 2,7. Således rekommenderas detta tillvägagångssätt när in vitro-funktionell analys kräver en intakt myocyt som innehåller Ca2+ cykelmaskiner plus myofilamenten. Till exempel är intakta isolerade myocyter önskvärda för att studera kontraktil funktion efter modifiering av myofilamentet eller Ca2+ cykelfunktionen via genöverföring9. Dessutom föreslås en intakt myocytmetod för att analysera den funktionella effekten av neurohormoner när man studerar effekten av nedströms andra budbärarsignalvägar och / eller svar på terapeutiska medel2. En alternativ mätning av belastningsberoende kraft i enstaka myocyter utförs oftast efter membranpermeabilisering (eller flåsning) vid låga temperaturer (≤15 °C) för att avlägsna Ca2+ övergående bidrag och fokusera på myofilamentfunktion10. Mätningen av belastningsberoende kraft plus Ca2+ transienter i intakta myocyter är sällsynt på grund av den komplexa och tekniska utmaningen med tillvägagångssättet11, särskilt när högre genomströmning behövs, såsom för att mäta svar på neurohormonsignalering eller som en skärm för terapeutiska medel. Analysen av hjärttrabeculae övervinner dessa tekniska utmaningar men kan också påverkas av icke-myocyter, fibros och / eller extracellulär matrisombyggnad2. Var och en av de metoder som beskrivs ovan kräver ett preparat som innehåller vuxna myocyter eftersom neonatala myocyter och myocyter härledda från inducerbara pluripotenta stamceller (iPSC) ännu inte uttrycker det fullständiga komplementet av vuxna myofilamentproteiner och vanligtvis saknar nivån av myofilamentorganisation som finns i den vuxna stavformade myocyten2. Hittills indikerar bevis i iPSC att den fullständiga övergången till vuxna isoformer överstiger mer än 134 dagar i kultur12.
Med tanke på fokus för denna samling på HF inkluderar protokollen tillvägagångssätt och analys för att skilja kontraktil funktion vid misslyckande kontra icke-sviktande intakta myocyter. Representativa exempel ges från råttmyocyter som studerats 18-20 veckor efter en supra-renal koarctation, beskriven tidigare 5,13. Jämförelser görs sedan med myocyter från bluffbehandlade råttor.
Protokollet och bildplattformen som beskrivs här används för att analysera och övervaka förändringar i förkortning och Ca2+ transienter i stavformade hjärtmyocyter under utvecklingen av HF. För denna analys pläteras 2 x 104 Ca 2+-toleranta, stavformade myocyter på22 mm2 lamininbelagda glasöverdrag (CS) och odlas över natten, som beskrivits tidigare8. Komponenterna monterade för denna bildplattform, tillsammans med media och buffertar som används för optimal avbildning, finns i materialförteckningen. En guide för dataanalys med hjälp av en programvara och de representativa resultaten finns också här. Det övergripande protokollet är uppdelat i separata underavsnitt, med de tre första avsnitten som fokuserar på isolerade råttmyocyter och dataanalys, följt av cellulära Ca2+ övergående experiment och dataanalys i myocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studier utförda på gnagare följde folkhälsopolitiken för human vård och användning av laboratoriedjur och godkändes av University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee. För denna studie isolerades myocyter från 3-34 månader gamla Sprague-Dawley och F344BN råttor som väger ≥ 200 g5. Både manliga och kvinnliga priser användes.
1. Myocytpacing för kontraktila funktionsstudier
- Gör färska M199-baserade medier för varje uppsättning isolerade myocyter (materialtabell). 1 dag före pacing, platta 2 x 104 Ca 2+-toleranta, stavformade myocyter på22 mm2 lamininbelagda glasöverdrag (CSs), som beskrivits tidigare8.
- För att förbereda kamrarna, blötlägg varje kammare i 10% blekmedel i 1 timme. Spola sedan kamrarna med rinnande kranvatten i 30-45 min, följt av destillerat vatten som byts ut var 5: e minut i 30 min, följt av avjoniserat vatten som byts ut var 5: e minut i 30 min och en sista sköljning i avjoniserat vatten.
- Torka kamrarna på en ren yta i 20-30 min (kompletterande figur 1A-C). Därefter UV-behandla kamrarna i ett biosäkerhetsskåp i 5 minuter i varje riktning (totalt = 20 min). Detta steg behövs inte för försteriliserade kamrar.
VARNING: Lämna området för att minimera UV-exponering. - Ta bort locket från kammaren, tillsätt 3 ml M199-baserade medier (se materialtabell) till varje brunn (kompletterande figur 1B), sätt tillbaka locket och förvärm kammaren i en 37 °C inkubator med 5%CO2 och 20% O2.
- Sterilisera pincett i en varmsträngsterilisator vid 250 °C i 20-25 s. Överför den förvärmda stimuleringskammaren från inkubatorn till ett biosäkerhetsskåp.
- Överför varje täckglas (CS) som innehåller hjärtmyocyter till enskilda brunnar i stimuleringskammaren med sterila pincett. Överför CSs fyra åt gången, följt av uppvärmning i 10 minuter före överföringen av de återstående fyra CS: erna för att bibehålla medietemperaturen.
- Fäst bananuttag i stimuleringskammaren i ena änden (kompletterande figur 1C) och på stimulatorn i den andra änden (kompletterande figur 1D).
- Ställ in stimulatorns frekvens på 0,2 Hz och ställ in spänningen (~ 12 V) för att uppnå sammandragning i ~ 10% -20% av alla stavformade hjärtmyocyter i en brunn. För att bestämma antalet kontraherande myocyter, placera kammaren under ett inverterat mikroskop med 4x till 10x förstoring.
- Placera stimuleringskammaren i en inkubator vid 37 °C i 5 %CO2 (kompletterande figur 1E). Byt media var 12: e timme med hjälp av media förvärmd i en 37 ° C, 5% CO 2-inkubator i 20-25 minuter. Fortsätt elektrisk stimulering i upp till 3 dagar med media bytt var 12: e timme.
2. Kontraktil funktionsanalys av vuxna råtta hjärtmyocyter
- Förvärm en gelförpackning och media i en 37 °C inkubator i 30 minuter före experimentet.
- Slå på de kontraktila funktionsplattformskomponenterna som anges i materialförteckningen och visas i kompletterande figur 2, med särskild uppmärksamhet på nyckelkomponenterna, som inkluderar en antivibrationstabell (kompletterande figur 2A-1) med ett inverterat mikroskop med ett djuprött (590 nm) filter (kompletterande figur 2A-2,3) och CCD-kamera (kompletterande figur 2A-4) ansluten till en CCD-styrenhet (kompletterande figur 2A-5 och Kompletterande figur 2C-5) och integrerad med en datordator (kompletterande figur 2B-14).
- Montera slangar i den peristaltiska pumpen (kompletterande figur 2A-8; Kompletterande figur 2A-8), överför det förvärmda gelpaketet till rörhållaren (kompletterande figur 2A-9) och slå på vakuumet (kompletterande figur 2A-11) och strömmen till cellstimulatorn (kompletterande figur 2B-13).
- Placera ett 50 ml rör med media i den isolerade rörhållaren (kompletterande figur 2A-9) och börja perfusion vid ~ 0,5 ml / min genom den peristaltiska pumpslangen (kompletterande figur 2E-8).
- Tillsätt en liten mängd förvärmda medier till en liten vägbåt (~ 2 ml). Överför en CS som innehåller myocyter från stimuleringskammaren till vägningsbåten. Återför stimuleringskammaren till 37 °C i 5% CO2-inkubatorn.
- Ta bort CS från vägbåten och torka försiktigt av undersidan. Överför CS till en nysmord CS-kammare (kompletterande figur 2A,F-10; svart pil) och tillsätt försiktigt en droppe media (~ 200 μL) på CS.
- Placera ett platinaelektrodfäste över CS (kompletterande figur 2F; grå pil) och lägg en ny CS över toppen med pincett. Placera ett toppfäste (kompletterande figur 2F; vit pil) över CS-smörgåsen och installera sedan två eller fyra #0 pan-head-skruvar för att slutföra monteringen av kammaren.
- När mediet är närvarande i hela pumpslangen, fäst slangen på förvärmaren och anslut sedan förvärmaren till CS-kammaren monterad i steg 2.7. Börja perfusion vid 0,5 ml / min och placera en vävnadstork under kammaren för att se till att det inte finns några läckor.
- Placera CS-kammaren i scenadaptern. Det perfuserade mediet samlas i motsatt ände av kammaren med slangar anslutna till ett vakuumsystem. Slå på värmesystemet (kompletterande figur 2A, D-7) och balansera kammaren, målet och förvärmaren i ~ 5-10 minuter för att uppnå en konstant medietemperatur på 37 ° C. Visualisera myocyter med 40x vattensänkningsmålet på mikroskopet under denna jämviktstid.
- Aktivera pacingstimulatorn (kompletterande figur 2B-13) genom att ställa in spänningen till 1,5x den inställning som behövs för att 80% av stavformade celler ska dra ihop sig, vilket vanligtvis är 35-40 V. Ställ in stimuleringsfrekvensen till 0,2 Hz för att optimera kontraktil funktion och myocytöverlevnad.
- Samla kontraktila förkortnings- och förlängningsspår från kontinuerligt perfuserade och tempo myocyter. För att samla in förkortningsmätningar, använd en CCD-kamera (kompletterande figur 2A-4) ansluten till en CCD-styrenhet (kompletterande figur 2B-5,C) och en dedikerad dator med ett I/O-styrkort (kompletterande bild 2B-14; se materialförteckning). Plattformen mäter sarkomerförkortning i råttmyocyter, även om liknande resultat erhålls från myocytmätningar som samlats in från myocyternas längsgående kanter (se Ecklerle et al.14).
- Om du vill samla in sarkomerförkortningsspår öppnar du programvaran på datorn, väljer OK och sedan Arkiv > nytt. Förbered en skärmmall genom att välja Spårningar > Redigera användargränser > Sarcomere-längd och sedan ställa in maximi- och minimivärden, som vanligtvis ligger mellan 2,0 μm och 1,5 μm. Kalibrera CCD-kameran med en 0,01 mm graticule innan mätningarna görs i myocyterna (figur 1D).
- Om du vill registrera spårningar av sarcomerelängd väljer du Arkiv > Ny. Identifiera en kontraherande myocyt och placera myocyten längs kamerans längsgående axel så att strimlingsmönstret är vertikalt (figur 1B).
- Använd datormusen för att placera rutan för intresseområde (ROI) (rosa ruta) över myocyten (bild 1C). Välj Samla in och Starta för att spela in kontraktilfunktionen. Spela in förkortning för 60 s från varje myocyt vid låga stimuleringsfrekvenser (≤0,5 Hz).
- Spela in sarkomerförkortning från 5-10 celler per CS. Utför mätningar vid 1 cell/CS om studier inkluderar behandling med agonister/antagonister. Förbered separata förvärmda medier och en annan, dedikerad bit av perfusionsslang laddad i en flerkanalig peristaltisk pump och följ steg 2.9.-2.14. att mäta effekten av läkemedels- eller neurohormonleverans på myocytkontraktil funktion.
- För att mäta förkortning över ett frekvensområde, taktmyocyter vid varje frekvens för att erhålla steady-state-förkortning före inspelning av5. För dessa studier, fördubbla perfusionshastigheten och börja registrera 15-20 s efter stimulering vid en ny frekvens för att få konsekventa steady-state kontraktila svar för frekvenser i intervallet 0,2 Hz och 2 Hz. Registrera vanligtvis inte mer än 2 myocyter / CS för förkortning över det givna intervallet av stimuleringsfrekvenser.
- Spela in minst 7 sammandragningar/celler för att få tillförlitliga signalmedelvärdesdata när du analyserar inspelningarna (se steg 3.).
3. Dataanalys av kontraktil funktion i isolerade myocyter
- Börja med att välja Arkiv, välja en inspelad spårning och sedan Öppna. Välj Flik 1 (vänster sida) i basspårningen och ställ sedan in den gula panelen högst upp i spårningen till Sarc-Längd. Välj Spårningar och skärmmallen som förbereddes i steg 2.12.
- Om du vill förbereda en analysmall väljer du Operationer, Alternativ för monoton övergående analys, TTL-händelsemärke i rutan Definition av t0 samt följande alternativ på menyn: Baslinje (vilande sarkomerlängd), Avgångshastighet i förhållande till t0 (dep v), Topp (topphöjd och %topphöjd/baslinje eller bl%topp h), Returhastighet i förhållande till tPeak (ret v), Tid till topp 50 % (TTP 50 %) med t0 och Tid till baslinje 50 % (TTR50 %) med tPeak. Spara dessa analysalternativ genom att välja Mallar > Spara analysmall med en identifierare. Läs in den här analysmallen innan du analyserar varje spårning.
- Om du vill påbörja dataanalysen väljer du Märken > grind > Lägg till tillfälliga > Konvertera från händelsemarkering > analysintervall. Ställ nu in tidsintervallet från -0,01 s till 1,20 s för myocyter som ligger i takt med 0,2 Hz (figur 2A, röda märken på den nedre delen av råspåret). Välj ett kortare tidsintervall för myocyter som stimuleras vid högre frekvenser.
- Skapa en signalgenomsnittsspårning genom att välja Åtgärder > Genomsnittliga händelser. En signalmedelvärdesinspelning visas under den ursprungliga basspårningen.
- Välj Flik 1 för spårningen av signalmedelvärdet (vänster på skärmen) och välj sedan Märken på den övre menyn, följt av Lägg till övergående. Välj Åtgärder på den översta menyn och Monoton transient analys för att visa signalmedelvärdena för baslinjesarkomerlängd, topphöjd, bl%peak h, dep v, ret v, TTP 50% och TTR50% i signalmedelvärdesdisplaypanelen.
- Överför varje övergående sarkomeranalys till ett kalkylblad för sammansatt analys av flera myocyter genom att välja Exportera > monoton övergående analys > urklippsström. Klistra in dessa data i kalkylbladet för varje spårning.
- Om du vill kopiera spårningen med signalmedelvärde väljer du Exportera > aktuell spårning > Urklipp > Alternativ och anger decimalerna till 5, väljer sedan Tabbaravgränsare och klickar på OK och OK. Klistra in de signalgenomsnittliga spåren för varje myocytinspelning i ett andra kalkylblad.
4. Inspelning av Ca2+ transienter i vuxna hjärtmyocyter hos råtta
- Innan du mäter Ca 2+-transienter, slå på plattformskomponenterna som beskrivs i steg 2.2., tillsammans med ytterligare fluorescensavbildningskomponenter (se ytterligare komponenter för Ca2+ bildanalys i materialförteckningen; Kompletterande figur 2A-5,6; 2B-12).
- Bered Fura-2AM stamlösning innehållande 1 mM Fura-2AM plus 0,5 M probenecid i dimetylsulfoxid (DMSO). Probenecid minimerar Fura-2AM-läckage15.
- Späd stamlösningen till 5 μM Fura-2AM och 2,5 mM probenecid i 2,5 ml media (se materialtabell) i en brunn på en 6-brunnsplatta. Tillsätt 2,5 ml media ensam (ingen Fura-2AM) till ytterligare tre brunnar i plattan, täck plattan med aluminiumfolie och förvärm mediet till 37 °C.
- Överför en CS-innehållande myocyter från pacingkammaren till brunnen som innehåller Fura-2AM, täck och återför plattan till 37 ° C-inkubatorn med 5% CO2 i 4 minuter. Montera slangar i perfusionspumpen och perfuse med media under Fura-2AM-laddningsperioden, enligt beskrivningen i steg 2.4.
- Stäng av eller minimera rumsbelysningen för att minska fluorescensfotoblekningen och för att optimera fluorescenssignalen. Ta bort 6-brunnsplattan från inkubatorn och tvätta sedan CS i 10 s i var och en av de tre brunnarna som innehåller media ensam. Överför CS till en liten vägbåt som innehåller förvärmda medier (ingen tillagd Fura-2AM).
- Montera CS på nysmord CS-kammare efter att du försiktigt har torkat av undersidan av CS. Lägg försiktigt till en droppe media till CS och montera sedan elektrodfästet över CS, följt av en andra CS och det övre fästet. Använd #0 pan-head skruvar för att slutföra monteringen av cellkammaren, enligt beskrivningen i steg 2.6.-2.7.
- Anslut pumpslangen fylld med media till förvärmaren, anslut förvärmaren till CS-kammaren och placera i en stegadapter, enligt beskrivningen i steg 2.8. Samla upp mediet med vakuumslangsystemet och slå på värmesystemet (kompletterande bild 2A,D-7) för att balansera kammaren till 37 °C, enligt beskrivningen i steg 2.8–2.9.
- Aktivera pacingstimulatorn (kompletterande figur 2B-13) inställd på 35-40 V och 0,2 Hz, enligt beskrivningen i steg 2.10.
- Innan du spelar in en Ca2+ övergående, slå på en liten ficklampa eller boklampa monterad nära datorns tangentbord för att se tangentbordet. Dessutom registrera fluorescensbakgrunden i ett område utan hjärtmyocyter. Börja med att välja Arkiv > Starta > nytt, enligt beskrivningen i steg 2.12.
- Välj en ROI och ange en flik (eller spårningsfält, vänster sida) för rå täljare och en andra flik för rå nämnare, definierad i övre mitten av varje flik. Spela in bakgrunden för 10-20 s. Högerklicka med musen och dra över en spårningsfältspanel för att hämta de råa signalmedelvärdena för täljaren och nämnaren. Ange dessa värden genom att välja Operationer > konstanter och ange råvärdena.
- Förbered en ny skärmmall för att samla in både förkortning och Ca2+ transienter. För sarcomerelängd väljer du Flik 1 och använder samma process som beskrivs i steg 2.13. För avbildning av Ca2+ väljer du Tabb 2 > Ratio (övre mitten av fliken) > Spårningar > Redigera användargränser för att ange minimi- och maximinivåer för förhållandet, som vanligtvis anges mellan 1 och 5. Använd samma process för att definiera täljaren och nämnarintervallen för flikarna 3 och 4 (vänster sida).
- Placera en ROI-ruta över en myocytbild enligt beskrivningen i steg 2.14. Välj Arkiv > Ny > samla in. Välj nu Start för att samla in förkortnings- och ratiometriska Ca2+ -data. Registrera ≥7 sammandragningar/cell för signalmedelvärdesanalys.
- Upprepa inspelningen av bakgrundsspårningen som beskrivs i steg 4.10. efter inspelning av 2-4 myocyter. Registrera vanligtvis 4-5 myocyter / CS eller färre myocyter om det finns signifikanta förändringar i bakgrundsläsningen.
5. Dataanalys av Ca2+ transienter i isolerade myocyter.
- Öppna önskad fil för analys och välj Mallar > skärmmall för förkortning plus Ca2+ transienter. Välj sedan flikarna 1 och 2 (vänster) för att visa sarkomerlängd respektive Ca2+ förhållande. Välj Operationer > konstanter och ange täljaren och nämnaren värden från bakgrundsspårningen Ca2+ .
- Förbered analysmallar för förkortning plus Ca2+ tillfälliga data. Välj flik 1 (vänster sida) och använd samma process som beskrivs i steg 3.2. för att ställa in sarcomere-längdanalysmallen.
- Välj flik 2 (vänster sida) och välj Operationer, Alternativ för monoton övergående analys, TTL-händelsemarkering i rutan Definition av t0 och följande alternativ på menyn: Baslinje (basalförhållande), Avgångshastighet i förhållande till t0 (dep v), Topp (topphöjd och %topphöjd/baslinje eller bl%topp h), Sönderfallshastighet i förhållande till tPeak (ret v), Tid till topp 50 % (TTP 50 %) med t0 och Tid till baslinje 50 % (TTR50 %) med tPeak. Spara dessa analysalternativ genom att välja Mallar och Spara analysmall med ett nytt identifierarnamn. Läs in den här analysmallen innan du analyserar varje spårning.
- Använd samma process som beskrivs i steg 3.3.-3.6. att medelvärde av signalen och sedan analysera sarkomerlängd, följt av samma steg för Ca2+ transienter. Ange separata märken för sarkomerlängd och för spårningen av det övergående förhållandet Ca2+ .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kontraktila funktionsstudier utförs på råttmyocyter som börjar dagen efter isolering (dag 2) upp till 4 dagar efter isolering. Även om myocyter kan registreras dagen efter isolering (dvs. dag 2), krävs ofta längre odlingstider efter genöverföring eller behandlingar för att modifiera kontraktil funktion8. För myocyter odlade i mer än 18 timmar efter isolering hjälper pacingprotokollet som beskrivs i avsnitt 1 till att upprätthålla t-tubuli och konsekventa förkortnings- och förlängningsresultat.
En representativ del av en CS som innehåller myocyter för förkortningsstudier visas i figur 1A, tillsammans med en lämpligt placerad myocyt innan ROI ställs in (figur 1B). När en ROI har identifierats (figur 1C; rosa ruta) hjälper algoritminformationen som visas under myocyten också till att optimera myocytpositionering före inspelning. Specifikt är den linjära optiska densiteten (LOD; svart linje) en indikator för antalet och avståndet mellan sarkomerer, och ett skarpt effektspektrum i det snabba Fourier-transformspåret (FFT, röd linje) hjälper till att uppnå optimal inriktning för inspelning av förkortning och återförlängning. Det gratikelmönster som används för kalibrering av sarkomerlängd (och kantdetektering) visas i figur 1D. En typisk justerad inspelning av sarkomerlängdsförkortning visas i figur 2A (övre panelen), tillsammans med den signalmedelvärdesanalys som beskrivs i avsnitt 3 (nedre panelen).
Dysfunktion upptäcks ofta i myocyter när det finns in vivo-dysfunktion i djurmodeller. Till exempel detekteras systolisk dysfunktion observerad genom ekokardiografi som svar på trycköverbelastning (PO)13 i myocytförkortningsstudier5. För att illustrera dataspår visas representativa råspår (figur 2; övre panelen) och signalmedelvärden (figur 2; nedre panelen) erhållna vid 0,2 Hz för myocyter från sham- (figur 2A) och PO-behandlade (figur 2B) råttor. För att testa om myocytfunktionen kunde räddas efter PO användes också virusmedierad genöverföring vid tidpunkten för myocytisolering för att ersätta endogent hjärttroponin I (cTnI) med en fosfo-mimetisk cTnI T144D-substitution (T144D) i sarkomeren16. Den inledande analysen visar den PO-inducerade minskningen av kontraktil funktion (tabell 1, övre panelen) som returneras mot skennivåer i PO-myocyter 4 dagar efter genöverföring av cTnIT144D (tabell 1; nedre panelen).
Denna plattform kan också användas för att mäta Ca2+ transienter, tillsammans med förkortning i isolerade myocyter. Förkortning och Ca 2+ registrerades inte efter PO eftersom PO minskar vidhäftningen av råttmyocyter till laminin13, och en jämförbar modell visade tidigare förändrad Ca2+ hantering utvecklas vid en liknande tidpunkt17. Istället utfördes representativa experiment i Fura-2AM-laddade myocyter isolerade från 2-3 månader gamla råttor. En representativ registrering och signalmedelvärden visas i figur 3, tillsammans med dataanalysen i tabell 2. För denna uppsättning experiment studerades myocyter isolerade från vuxna råttor 4 dagar efter adenoviralmedierad genöverföring (infektionsmultiplicitet = 100) av cTnIT144D eller vildtyp cTnI. Både sarkomerförkortning och Ca 2+ transienter mättes efter laddning av myocyter med Fura-2AM. Genöverföring av cTnIT144D förbättrade toppförkortning och förhöjda diastoliska Ca2+ nivåer jämfört med cTnI i dessa inledande studier (tabell 2). Även om mer omfattande analys behövs, tyder de första resultaten på att in vivo-ersättning med cTnIT144D kan ge en komplex hjärtfenotyp på grund av förändringar i både kontraktil funktion och Ca2+ hantering över tid.
Figur 1: Vuxna råtta hjärtmyocyter som används för funktionella studier. (A) Representativa isolerade hjärtmyocyter från en vuxen råtta (skalstreck = 50 μm). Pilen pekar på en representativ myocyt som avbildas för kontraktil funktionsanalys. (B) Representativ myocyt med en ROI (rosa) placerad på sidan (skalstreck = 20 μm). (C) Representativ myocyt med en ROI (övre panel), sarkomermönstret för denna myocyt (nedre panelen, blå; skalstång = 20 μm) och den skarpa toppen av effektspektrumet (nedre panelen, röd). (D) Skärmdump på 0,01 mm graticule för att kalibrera förkortningsmätningarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa inspelningar från råttmyocyter. Ett råregistreringsspår (övre panelen) och signalmedelvärdet (nedre panelen) registreras vid 0,2 Hz i myocyter från (A) sham- och (B) trycköverbelastning (PO) behandlade råttor. Myocyter isolerades 18-20 veckor efter operationen, med PO producerad genom supra-renal koarktation13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativ registrering och analys av sarkomerlängd (SL) och Ca 2+ transienter från Fura-2AM-laddade vuxna hjärtmyocyter. (A) Råspår för SL, Ca 2+ transient ratio (ratio) och täljaren och nämnarspåren som används för att producera det transienta förhållandet Ca2+. (B) Ett exempel på signalmedelvärden för SL (övre spår) och det transienta förhållandet Ca2+ (nedre spåret). (C) Spår analyseras för sarkomerlängd (SL) och Ca2+ övergående förhållande med hjälp av den monotona spåralgoritmen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Råtta grupp | Bluff (n=30) | PO (n=32) |
| Vilande sarkomerlängd (mm; SL) | 1.761 + 0.006 | 1.748 + 0.004 |
| topphöjd (% av baslinjen) | 9.003 + 0.409 | 6.680 + 0.552* |
| Toppamplitud (mm) | 0.159 + 0.007 | 0.117 + 0.010* |
| Förkortningshastighet (mm/s) | -4.674 + 0.285 | -4.143 + 0.335 |
| Omförlängdshastighet (mm/s) | 3.251 + 0.223 | 2.706 + 0.273 |
| Tid till topp (ms; TTP) | 60 + 2 | 59 + 3 |
| Tid till 50% förlängning (ms; TTR50%) | 35 + 2 | 37 + 3 |
| Råtta grupp | Bluff + cTnIT144D (n=14) | PO + cTnIT144D (n=17) |
| Vilande sarkomerlängd (mm; SL) | 1.768 + 0.009 | 1.776 + 0.004 |
| topphöjd (% av baslinjen) | 9.038 + 1.339 | 8.414 + 0.960 |
| Toppamplitud (mm) | 0.160 + 0.023 | 0.149 + 0.016 |
| Förkortningshastighet (mm/s) | -5.972 + 0.711 | -4.173 + 0.726 |
| Omförlängdshastighet (mm/s) | 3.925 + 0.577 | 3.055 + 0.403 |
| Tid till topp (ms; TTP) | 51 + 5 | 59 + 2 |
| Tid till 50% förlängning (ms; TTR50%) | 31 + 3 | 32 + 2 |
Tabell 1: Jämförelse av kontraktil funktion i hjärtmyocyter som svar på trycköverbelastning (PO) och genöverföring. Myocytförkortningsresultat är från bluff- och PO-råtthjärtan 18-20 veckor efter operationen (övre panelen)5,13 och myocyter från bluff- och PO-råttor 4 dagar efter cTnIT144D-genöverföring (nedre panelen). Kontraktil funktion mäts 4 dagar efter myocytisolering/genöverföring i alla grupper. Resultaten uttrycks som medelvärde ± SEM (n = antal myocyter). Varje uppsättning bluff- och PO-data jämförs med en Students t-test, med *p < 0,05 som anses vara statistiskt signifikanta. Toppamplitudresultat för enbart bluff- och PO-myocyter rapporterades tidigare i Ravichandran et al.5.
| Sarkomerlängd analys | ||
| Genöverföringsgrupp | cTnI (n=21) | cTnIT144D (n=16) |
| Vilande sarkomerlängd (mm; SL) | 1.81 + 0.01 | 1.81 + 0.01 |
| Toppamplitud (mm) | 0.11 + 0.01 | 0.14 + 0.02* |
| Förkortningshastighet (mm/s) | -4.29 + 0.42 | -4.67 + 0.77 |
| Omförlängdshastighet (mm/s) | 2.92 + 0.43 | 3.71 + 0.64 |
| Tid till topp (ms; TTP) | 50 + 4 | 84 + 28 |
| Tid till 50% förlängning (ms; TTR50%) | 37 + 4 | 35 + 6 |
| Ca2+ övergående analys | ||
| Genöverföringsgrupp | cTnI (n=21) | cTnIT144D (n=19) |
| Vilande Ca2+ förhållande | 0.89 + 0.02 | 1.04 + 0.04* |
| Högsta Ca2+ -förhållande | 0.50 + 0.05 | 0.42 + 0.07 |
| Ca2+ transient hastighet (D/sek) | 45.24 + 5.85 | 40.53 + 10.95 |
| Ca2+ sönderfallshastighet (D/s) | -4.91 + 0.99 | -2.87 + 0.57 |
| Tid till topp Ca2+ (ms; TTP) | 34 + 2 | 41 + 3 |
| Tid till 50% Ca2+ Förfall (ms; TTD50%) | 101 + 8 | 117 + 6 |
Tabell 2: Kontraktil funktion och Ca2+ transienter hos vuxna råttmyocyter 4 dagar efter cTnIT144D-genöverföring. En analys av kontraktil funktion (övre panel) och Ca2+ transienter (nedre panelen) visas i myocyter efter genöverföring av cTnIT144D jämfört med vildtyp cTnI. Myocyter isoleras från 2-3 månader gamla vuxna råttor, och data presenteras som medelvärde ± SEM (n = antal myocyter). Statistiska jämförelser av kontraktila funktioner (vänster) och Ca2+ transienter (höger) utförs med hjälp av ett oparat Students t-test med signifikans inställd på *p < 0,05.
Kompletterande figur 1: Komponenter i pacingsystemet för myocyter pläterade på lamininbelagda CSs. (A) Anpassad pacingkammare som innehåller platinaelektroder i varje kammare. (B) Tempokammare med de fyra första kamrarna fyllda med media. (C) Pacing kammare fäst vid banan-jack-kablar, som är anslutna till kammaren och (D) stimulatorn. (E) Förbindelsen mellan stimulatorn (höger) och 37 °C-inkubatorn (vänster). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Komponenter som behövs för myocytkontraktil funktion och/eller Ca2+ övergående mätningar. (A) Den kontraktila funktionsplattform som visar varje komponent, med de numrerade posterna förklarade mer detaljerat i materialförteckningen. Komponenterna i plattformen inkluderar ett antivibrationsbord , inverterat ljusfältmikroskop (#2,3), CCD-kamera , CCD-styrenhet och xenonströmförsörjning , ljuskälla med dubbla utsläpp , temperaturregulator , peristaltisk pump , isolerad rörhållare , täckglasmonterad perfusionskammare (#10) och vakuumsystem (#11). (B) Ytterligare komponenter inkluderar fluorescensgränssnittet (#12), kammarstimulatorn (#13) och PC-datorn (#14), som förklaras mer detaljerat i materialförteckningen. Närbilder av numrerade objekt i panel A visas i C-F. (C) Vy över xenonströmförsörjningen (vänster) och CCD-styrenheten (höger). D) Temperaturregulator. (E) Peristaltisk pump. (F) Vy över basen för CS-perfusionskammaren (svart pil), platinaelektrodfästet (grå pil) och det övre fästet (vit pil) med #0 pan-head-skruvar. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det kroniska pacingprotokollet som beskrivs i steg 1 förlänger den användbara tiden för att studera isolerade myocyter och bedöma effekterna av längre behandlingar. I vårt laboratorium erhölls konsekventa resultat upp till 4 dagar efter isolering vid mätning av kontraktil funktion med sarkomerlängd på kroniskt tempo myocyter. Myocytkontraktilfunktionen försämras emellertid snabbt när man använder media som är äldre än 1 vecka för att takta myocyter.
För kontraktila funktionsstudier samlas data in vid 37 °C, vilket är nära kroppstemperaturen för råttor. För att optimera myocytens livskraft och få konsekventa spår för varje myocyt utförs dessa experiment med en pacingfrekvens som är lägre än den fysiologiska hjärtfrekvensen på ~ 5 Hz hos råttor. Dessa inställningar ger konsekventa kontraktila funktionsdata, men kammartemperatur och/eller pacingfrekvens kan justeras om förkortningsspåren förblir konsekventa över flera CS som innehåller samma behandlingsgrupp av myocyter. Dessutom erhålls optimala resultat genom att välja myocyter som saknar fläckar, är helt vidhäftade med en CS och kontraherar i båda ändarna av en stavformad cell. Celler fästa i endast ena änden, de med flera blebs och / eller myocyter som drar ihop sig i endast en ände är inte önskvärda och är ofta svårare att spela in på grund av bakgrundsrörelse. För dessa studier ingår ≥ 20 sarkomerer i ROI för att uppnå en skarp effektspektrumtopp, reproducerbara vilande sarkomerlängder och ett optimalt signal/ brusförhållande för det förkortande spåret. En ROI med så få som sju sarkomerer kan användas om effektspektrumtoppen förblir skarp. Den vilande sarkomerlängden i isolerade råttmyocyter varierar vanligtvis från 2,00-1,80 μm. Om en vilande sarkomerlängd är mindre än 1,5 μm är en aktiv sammandragning inte realistisk baserat på vår förståelse av sarkomerarkitektur18 och är vanligtvis resultatet av suboptimal myocytorientering.
Mätningen av kontraktil funktion med eller utan Ca2+ transienta mätningar i intakta myocyter är en högre genomströmningsmetod som kräver mindre investeringar i att utveckla den tekniska expertis som behövs för kraftmätningar i intakta enskilda celler11. Intakta myocytstudier fokuserar också uteslutande på myocytfunktion, utan bidrag från andra celltyper i flercelliga preparat2. Ett framväxande område inom detta område är utvecklingen av analys med högre genomströmning genom att samtidigt mäta förkortning och/eller Ca2+ transienter i flera intakta myocyter för att påskynda screeningen av terapeutiska medel på cellnivå före mer omfattande in vivo-analys .
Kontraktil funktion och Ca2+ övergående mätningar är också möjliga i intakta myocyter isolerade från andra gnagarmodeller som möss, även om det finns några viktiga överväganden och skillnader jämfört med råttmyocyter. Musmyocyter är livskraftiga i odling i 24-36 timmar, men livskraften minskar gradvis i myocyter odlade i mer än 48 h19. Detta stympade odlingsintervall bör beaktas vid användning av vektorbaserad genöverföring, särskilt för myofilamentproteiner som har en halveringstid i dagar snarare än timmar20. Till skillnad från råttmyocyter beror den framgångsrika isoleringen och odlingen av musmyocyter också på tillsatsen av myosin ATPas-hämmare, såsom 2,3-butandionmonoxid eller blebbistatin, till odlingsmedier19. Som ett resultat är kronisk pacing inte ett genomförbart alternativ i musmyocytkulturer. En längre jämviktstid på 15-20 min behövs också för att avlägsna den funktionella effekten av dessa myosinhämmare på isolerade musmyocyter. Slutligen är musmyocyter optimalt tempo vid 0,5 Hz för att erhålla reproducerbara förkortningsspår jämfört med de 0,2 Hz som används för råttmyocyter.
I studier på PO-behandlade råttor detekteras kontraktil dysfunktion konsekvent med lågfrekvent pacing i råttmyocyter. En större frekvensberoende minskning av förkortningen detekteras också i myocyter efter PO jämfört med skenråttor när det finns in vivo kontraktil dysfunktion 5,13. Under en studie med ett frekvensområde producerade en fördubbling av pumphastigheten för att tillhandahålla adekvata medier steady-state-förkortning inom 15-20 s efter att stimuleringsfrekvensen ändrats mellan 0,2 och 2 Hz. Råttmyocyter svarar också på kortvarig stimulering vid högre frekvenser upp till 8 Hz, även om cellviabiliteten snabbt försämras vid dessa högre frekvenser. Sammantaget har myocytkontraktil funktion visat sig vara en reproducerbar metod för att bekräfta eller validera hjärtdysfunktion in vivo i råttmodeller, såsom PO- jämfört med skenbehandlade råttor (tabell 1; se Kim et al.13). Dessutom kan denna plattform testa om en behandling som riktar sig mot myocyter återställer eller försämrar kontraktil funktion innan den bedriver dyrare och / eller mödosamma in vivo-metoder. Både akut leverans och längre exponering för terapeutiska medel och/eller efter genleverans under primär odling är möjliga med hjälp av detta tillvägagångssätt. Till exempel indikerar genöverföringsexperiment för att ersätta endogen cTnI med cTnIT144D ingen signifikant förändring i förkortningsamplituden i myocyter från skenråttor. Däremot återställer cTnIT144D toppförkortningsamplituden mot skenvärden i myocyter från PO-behandlade råttor (tabell 1). En inneboende svaghet med detta tillvägagångssätt är frånvaron av den typiska belastningen som finns i myocyter under in vivo-förhållanden. Som ett resultat kan svaren skilja sig från belastningsberoende funktionella svar, och exempelexperimentet indikerar att in vivo-metoder behövs för att ytterligare undersöka om cTnIT144D förbättrar hjärtprestanda under PO.
Mätningen av både förkortning och Ca2+ transienter i samma myocyt är en fördel med denna plattform. Till exempel kan förändringsriktningen skilja sig åt för Ca2+ transienter jämfört med kontraktil funktion. Som visas i tabell 2 ökar toppförkortningen signifikant efter genöverföring av cTnIT144D till myocyter från 2-3 månader gamla råttor. Detta resultat skiljer sig från de data som erhållits i äldre, skenbehandlade myocyter (tabell 1) och kan vara relaterade till råtta5 års ålder. Ytterligare tester behövs dock för att bevisa denna tolkning. Data i tabell 2 visar också att cTnIT144D inte ändrar den högsta Ca 2+ amplituden och istället tenderar att sakta ner Ca 2+ sönderfallshastigheten och höja vilande Ca 2+. Dessa resultat tyder på att cTnIT144D-uttryck förbättrar kontraktil funktion, medan Ca2+ cykelmaskiner kompenserar för att dämpa denna effekt. Dessa resultat belyser förmågan hos detta tillvägagångssätt att skilja mellan förändringar i kontraktil funktion och Ca2+ cykling. Även om de specifika resultaten som presenteras här ännu inte är definitiva, ger de en solid motivering för att utveckla en genetisk djurmodell för att uttrycka myokardiell cTnIT144D och utvärdera om dess uttryck trubbar dysfunktion orsakad av PO i framtiden. En sista observation från Ca 2+ övergående data är att fluorescerande färgämnen såsom Fura-2AM förändrar kontraktilfunktionskinetiken i myocyter21. Även om det relativa svaret som produceras av en given behandling eller djurmodell är jämförbart inom Fura-2-laddade myocyter, bör dessa resultat inte kombineras med förkortningsmätningar som gjorts i frånvaro av Fura-2AM. För att optimera användningen av Fura-2AM för Ca 2+ transient analys mäter laboratoriet oftast förkortning i frånvaro av Fura-2AM och utför en delmängd av experiment för att mäta Ca2+ transienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av National Institutes of Health (NIH) bidrag R01 HL144777 (MVW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEDIA | |||
| Bovine serum albumin | Sigma (Roche) | 3117057001 | Final concentration = 0.2% (w/v) |
| Glutathione | Sigma | G-6529 | Final concentration = 10 mM |
| HEPES | Sigma | H-7006 | Final concentration = 15 mM |
| M199 | Sigma | M-2520 | 1 bottle makes 1 L; pH 7.45 |
| NaHCO3 | Sigma | S-8875 | Final concentration = 4 mM |
| Penicillin/streptomycin | Fisher | 15140122 | Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin |
| REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING | |||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Fura-2AM | Invitrogen (Molecular Probes) | F1221 | 50 μg/vial; Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO; Final Fura2-AM concentration in media is 5 μM |
| Probenicid | Invitrogen (Fisher) | P36400 | Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM |
| MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING | |||
| #1 22 mm2 glass coverslips | Corning | 2845-22 | |
| 3 x 36 inch cables with banana jacks | Pomona Electronics | B-36-2 | Supplemental Figure 1, panel C |
| 37oC Incubator with 95% O2:5% CO2 | Forma | 3110 | Supplemental Figure 1, panel E. Multiple models are appropriate |
| Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp | Forma | 1286 | Multiple models are appropriate |
| Forceps - Dumont #5 5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 1800-45 | |
| Low magnification inverted microscope | Leica | DM-IL | Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes; 4X and 10X objectives recommended |
| Pacing chamber | Custom | Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22 | |
| Stimulator | Ionoptix | Myopacer | Supplemental Figure 1, panel D. |
| MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS | ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options | ||
| Additional components for Ca2+ imaging analysis | Ionoptix | Essential system components: -- Photon counting system -- Xenon power supply with dual excitation light source -- Fluorescence interface | - The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera (panel A #4). - The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6. - The fluorescence interface between the computer and light source is shown in panel B, #12. |
| CCD camera with image acquisition hardware and software (240 frames/s) | Ionoptix | Myocam with CCD controller | Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4 and panel A #5 & panel C #5 (right), respectively. The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14). |
| Chamber stimulator | Ionoptix | Myopacer | Panel B, #13; Alternative: Grass model S48 |
| Coverslip mounted perfusion chamber | Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws (arrow, panel F) | Panel A #10 & panel F; Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller). Commercial alternatives: Ionoptix FHD or C-stim cell chambers; Cell MicroControls culture stimulation system | |
| Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients | Ionoptix | PC with Ionwizard PC board and software | Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. - A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator. The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below). |
| Forceps - Dumont #5 TI | Fine Science Tools | 11252-40 | Panel F |
| Insulated tube holder for media | Custom | Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm | |
| Inverted brightfield microscope | Nikon | TE-2000S | Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging. A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging. |
| Isolator Table | TMC Vibration Control | 30 x 36 inches | Panel A, #1; Desirable: elevated shelving, Faraday shielding |
| Microscope eyepieces & objective | Nikon | 10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective | Panel A #3; 40X objective: n.a. 0.08; w.d. 2 mm. A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below). NOTE: water immersion dispensers also are now available for water-based objectives. |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | Panel A #8 and panel E |
| small weigh boat | Fisher | 08-732-112 | |
| Temperature controller | Cell MicroControls | TC2BIP | Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC. A preheater and objective heater are recommended for this platform. A Cell MicroControls HPRE2 preheater and HLS-1 objective heater are controlled by the TC2BIP temperature controller for our studies. |
| Under cabinet LED light with motion sensor | Sylvania | #72423 LED light | Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light.. Alternative: A clip on flashlight/book light with flexible neck - multiple suppliers are available. |
| Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter | Fisher | Tygon tubing - E363; polypropylene Ehrlenmeyer flask - 10-182-50B; Vacuum filter - 09-703-90 | Panel A #11 |
References
- Reihle, C., Bauersachs, J. Small animal models of heart failure. Cardiovascular Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).
- Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. Biology of the cardiac myocyte in heart disease. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016).
- Rossman, E. I., et al. Abnormal frequency-dependent responses represent the pathophysiologic signature of contractile failure in human myocardium. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 36 (1), 33-42 (2004).
- McDonald, K. S., Hanft, L. M., Robinett, J. C., Guglin, M., Campbell, K. S. Regulation of myofilament contractile function in human donor and failing hearts. Frontiers in Physiology. 11, 468 (2020).
- Ravichandran, V. S., Patel, H. J., Pagani, F. D., Westfall, M. V. Cardiac contractile dysfunction and protein kinase C-mediated myofilament phosphorylation in disease and aging. The Journal of General Physiology. 151 (9), 1070-1080 (2019).
- Chaudhary, K. W., et al. Altered myocardial Ca2+ cycling after left ventricular assist device support in failing human heart. Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 837-845 (2004).
- Walker, C. A., Spinale, F. G. The structure and function of the cardiac myocyte: A review of fundamental concepts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 118 (2), 375-382 (1999).
- Lang, S. E., Westfall, M. V. Gene transfer into cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 1299, 177-190 (2015).
- Davis, J., et al. Designing heart performance by gene transfer. Physiological Reviews. 88 (4), 1567-1651 (2008).
- Sweitzer, N. K., Moss, R. L. Determinants of loaded shortening velocity in single cardiac myocytes permeabilized with a-hemolysin. Circulation Research. 73 (6), 1150-1162 (1993).
- Yasuda, S., et al. Unloaded shortening increases peak of Ca2+ transients but accelerates their decay in rat single cardiac myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (2), 470-475 (2003).
- Racca, A. W., et al. Contractile properties of developing human fetal cardiac muscle. The Journal of Physiology. 594 (2), 437-452 (2016).
- Kim, E. H., et al. Differential protein expression and basal lamina remodeling in human heart failure. Proteomics Clinical Applications. 10 (5), 585-596 (2016).
- Eckerle, L. G., Felix, S. B., Herda, L. R. Measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e4237 (2013).
- Robbins, H., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. The history and future of probenecid. Cardiovascular Toxicology. 12 (1), 1-9 (2012).
- Sakthivel, S., et al. In vivo and in vitro analysis of cardiac troponin I phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 703-714 (2005).
- Qi, M., et al. Downregulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase during progression of left ventricular hypertrophy. The American Journal of Physiology. 272 (5), 2416-2424 (1997).
- Sonnenblick, E. H., Spiro, D., Spotnitz, H. M. The ultrastructure basis of Starling's law of the heart: the role of the sarcomere is determining ventricular size and stroke volume. American Heart Journal. 68 (3), 336-346 (1964).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (4), 1667-1674 (2008).
- Zak, R. Metabolism of myofibrillar proteins in the normal and hypertrophic heart. Basic Research in Cardiology. 72 (2-3), 235-240 (1977).
- Palmer, B. M., Thayer, A. M., Snyder, S. M., Moore, R. L. Shortening and [Ca2+] dynamics of left ventricular myocytes isolated from exercise-trained rats. Journal of Applied Physiology. 85 (6), 2159-2168 (1998).
