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Genetics

एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर एगोनिस्ट लेवामिसोल के लिए कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस संवेदनशीलता को मापना

Published: June 7, 2022 doi: 10.3791/64056
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Delaware

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल लेवामिसोल की प्रतिक्रिया निर्धारित करने के लिए एक परख का वर्णन करता है, जो कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर्स के एक वर्ग का एक औषधीय एगोनिस्ट है। इस तरल लेवामिसोल तैरने परख में, शोधकर्ता नेत्रहीन रूप से 24-अच्छी तरह से प्लेटों में खेती किए गए जानवरों के समय-निर्भर पक्षाघात का निरीक्षण और मात्रा निर्धारित करते हैं।

Abstract

न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) पर, पोस्टसिनेप्टिक रिसेप्टर्स के लिए उत्तेजक न्यूरोट्रांसमीटर एसिटाइलकोलाइन (एसीएच) के बंधन से मांसपेशियों में संकुचन होता है। कशेरुक कंकाल की मांसपेशियों के रूप में, हरकत के लिए मॉडल जीव कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस के शरीर की दीवार की मांसपेशियों में कोलीनर्जिक सिग्नलिंग की आवश्यकता होती है। शरीर की दीवार की मांसपेशियों पर एसीएच रिसेप्टर्स के एक वर्ग के औषधीय एगोनिस्ट लेवामिसोल के संपर्क में, जंगली प्रकार के जानवरों के समय-निर्भर पक्षाघात का कारण बनता है। लेवामिसोल के लिए परिवर्तित संवेदनशीलता एनएमजे या मांसपेशियों के कार्य में सिग्नलिंग में दोष का सुझाव देती है। यहां, 24-अच्छी तरह से प्लेटों में उगाए गए सी एलिगेंस पर किए गए तरल लेवामिसोल परख के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। तरल में जानवरों की जोरदार तैराकी शारीरिक हेरफेर की आवश्यकता के बिना एक घंटे की अवधि में सैकड़ों कीड़े में लेवामिसोल-प्रेरित पक्षाघात के मूल्यांकन और मात्रा के लिए अनुमति देती है। इस प्रक्रिया का उपयोग जंगली प्रकार और म्यूटेंट दोनों के साथ किया जा सकता है जिन्होंने एनएमजे में परिवर्तित सिग्नलिंग के कार्यात्मक परिणामों को प्रदर्शित करने के लिए लेवामिसोल के प्रति संवेदनशीलता को बदल दिया है।

Introduction

कंकाल की मांसपेशियों पर पोस्टसिनेप्टिक एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर्स (एसीएचआर) के सक्रियण के परिणामस्वरूप एक विद्युत संकेत होता है जो मांसपेशियों के संकुचन की ओर जाता है। न्यूरोमस्कुलर फ़ंक्शन के विघटन के परिणामस्वरूप मनुष्यों में मायस्थेनिक सिंड्रोम और मांसपेशियों के डिस्ट्रॉफी 1,2,3,4 होते हैं। विकासवादी रूप से संरक्षित मौलिक जैविक प्रक्रियाओं और रोग के तंत्र के बारे में जानने के लिए नेमाटोड कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। कशेरुक कंकाल की मांसपेशियां और सी एलिगेंस शरीर की दीवार की मांसपेशियां हरकत5 के नियंत्रण में कार्यात्मक रूप से बराबर हैं। यहां, एक साधारण परख प्रस्तुत की जाती है जिसका उपयोग जंगली प्रकार के सी एलिगेंस की तुलना म्यूटेंट के साथ करने के लिए किया जा सकता है जिसने न्यूरोमस्कुलर सिग्नलिंग या मांसपेशियों के कार्य को बदल दिया है।

क्रमशः कोलीनर्जिक और गैबार्जिक मोटर न्यूरॉन्स से प्राप्त उत्तेजक और निरोधात्मक इनपुट, सी एलिगेंस शरीर के एक तरफ की मांसपेशियों को अनुबंधित करने का कारण बनते हैं, जबकि दूसरी तरफ की मांसपेशियां आराम करती हैं, जिससे समन्वित हरकत6 सक्षम होती है। लेवामिसोल, परजीवी सूत्रकृमि संक्रमण के इलाज के लिए उपयोग किया जाने वाला एक एंथेलमिंटिक एजेंट, शरीर की दीवार की मांसपेशियों पर एसीएचआर के एक वर्ग को बांधता है और संवैधानिक रूप से सक्रिय करता है, जिसके परिणामस्वरूप समय-निर्भर पक्षाघात7. इस प्रकार, लेवामिसोल के लिए परिवर्तित संवेदनशीलता का उपयोग उत्तेजक और निरोधात्मक सिग्नलिंग 7,8,9,10,11,12,13,14,15 के संतुलन में दोषों के साथ सी एलिगेंस की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, लेवामिसोल-संवेदनशील एसीएचआर (एल-एसीएचआर) के सबयूनिट्स में उत्परिवर्तन, जैसे कि यूएनसी -63, साथ ही क्यूबिलिन, एलईवी -10 के सी एलिगेंस होमोलॉग, जो सिनैप्स पर एल-एसीएचआर क्लस्टरिंग के लिए आवश्यक है, उत्तेजक सिग्नलिंग को प्रभावित करता है और इसके परिणामस्वरूप लेवामिसोल प्रतिरोध 7,8 होता है। गाबाए रिसेप्टर यूएनसी -49 में उत्परिवर्तन निरोधात्मक सिग्नलिंग को कम करता है और लेवामिसोल12 के लिए अतिसंवेदनशीलता का कारण बनता है।

लेवामिसोल के लिए अतिसंवेदनशीलता या प्रतिरोध का मूल्यांकन पारंपरिक रूप से जानवरों को लेवामिसोल युक्त अगर प्लेटों में स्थानांतरित करके किया गया है और फिर नियमित रूप से कीड़े को उस समय बिंदु को निर्धारित करने के लिए प्रेरित किया जाता है जिस पर पक्षाघात होता है 13,14,15. हमने एक तरल लेवामिसोल तैरने वाली परख विकसित की है जो जानवरों के शारीरिक हेरफेर की आवश्यकता को समाप्त करती है और केवल 1 घंटे में सैकड़ों जानवरों की स्क्रीनिंग की अनुमति देती है। यहां, जंगली प्रकार, यूएनसी -63 (एक्स 26), लेव -10 (एक्स 17), और यूएनसी -49 (ई 407) जानवरों के साथ इस परख का उपयोग वर्णित है। हालांकि, यह प्रोटोकॉल आरएनएआई के संपर्क में आने वाले सी एलिगेंस पर भी किया जा सकता है, जैसा कि परिवर्तित लेवामिसोल संवेदनशीलता11 के लिए जीनोम-वाइड आरएनएआई स्क्रीन में पहचाने गए नॉकडाउन को मान्य करने के लिए किया गया था।

इस औषधीय परख के लिए, कीड़े 24-अच्छी तरह से प्लेटों में वयस्कता के लिए उगाए गए थे, एम 9 बफर में 0.4 एमएम लेवामिसोल प्रत्येक कुएं में जोड़ा गया था, और चलती जानवरों की संख्या 1 घंटे के लिए हर 5 मिनट में दर्ज की गई थी। लेवामिसोल-प्रेरित पक्षाघात को समय के साथ नेत्रहीन रूप से देखा गया था, और परख के पूरा होने के बाद, डेटा की मात्रा निर्धारित की गई थी। जंगली प्रकार के सी एलिगेंस के साथ म्यूटेंट का मूल्यांकन छात्रों को पहले संभावित फेनोटाइपिक प्रभावों के बारे में भविष्यवाणी करने और फिर अपनी परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए प्रयोग करने की अनुमति देता है। अंत में, यह सरल, सस्ती, तरल लेवामिसोल परख एनएमजे फ़ंक्शन पर विशिष्ट जीन के नुकसान के प्रभाव को प्रदर्शित करने का एक आदर्श तरीका है।

Protocol

1. लेवामिसोल परख के लिए प्लेटों की तैयारी

  1. एक हलचल पट्टी के साथ एक फ्लास्क में 1 एल विआयनीकृत (डीआई) पानी के साथ एनएसीएल के 3 ग्राम, पेप्टोन के 2.5 ग्राम, और 17 ग्राम अगर के संयोजन से नेमाटोड ग्रोथ मीडियम (एनजीएम) मीडिया तैयार करें।
  2. आटोक्लेविंग के बाद, मीडिया को 70 डिग्री सेल्सियस पर सेट गर्म प्लेट पर रखें और 1 घंटे के लिए मध्यम गति से हलचल करें।
  3. एमएल कोलेस्ट्रॉल ड्रॉपवाइज के 1 एमएल जोड़ें वर्षा को रोकने के लिए, 1 एमएल 1 एम सीएसीएल2, 1 एमएल 1 एमजीएसओ4 का, और 25 एमएल 1 एम पीएच 6.0 पोटेशियम फॉस्फेट बफर मीडिया में।
  4. एक बाँझ सीरोलॉजिकल विंदुक (चित्रा 1) के साथ एक 24 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में एनजीएम मीडिया के 2 एमएल स्थानांतरण।
  5. प्लेटों को बैक्टीरिया के साथ बोने से पहले 2 दिनों के लिए बेंचटॉप पर सूखने दें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए, उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  6. लाइसोजेनी शोरबा (एलबी) प्लेट पर ओपी 50 ई कोलाई को लकीर करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ें।
  7. बी-शोरबा (डीआई एच2ओ के 1 एल में ट्रिप्टोन के 10 ग्राम और एनएसीएल के 5 ग्राम) में एक एकल ओपी 50 कॉलोनी चुनें और संस्कृति को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलाएं।
  8. एक बाँझ पिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक कुएं (चित्रा 1) के बीच में अगर पर ओपी 50 निलंबन के 30 μL ड्रॉप।
    नोट: सुनिश्चित करें कि अगर की सतह को नुकसान न पहुंचे क्योंकि इससे कृमि की बुरिंग होगी।
  9. प्लेटों को बोने के बाद कम से कम 2 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर बैठने दें ताकि एक जीवाणु लॉन बन सके।
    नोट: यदि केंद्र कुओं में बैक्टीरिया 2 दिनों के बाद सूखी नहीं है, तो प्लेटों को 20 मिनट (चित्रा 1) के लिए हुड में खुला छोड़ दें। प्लेटों डाला जाना चाहिए और परख से 1-2 सप्ताह पहले बैक्टीरिया के साथ वरीयता प्राप्त.

2. सिंक्रनाइज़ सी एलिगेंस (दिन 1)

  1. जंगली प्रकार, यूएनसी -63 (एक्स 26), लेव -10 (एक्स 17), और यूएनसी -49 (ई 407) सी एलिगेंस को 6 सेमी प्लेटों पर वयस्कता के लिए बढ़ाएं, प्रति तनाव कम से कम आठ प्लेटें तैयार करें। पुष्टि करें कि प्लेटों पर कई गैर-भूखे ग्रेविड वयस्क हैं।
    नोट: यह आवश्यकतानुसार दो बार कई प्लेटें हैं; हालाँकि, ब्लीचिंग के दौरान अंडे का पहला बैच नष्ट होने की स्थिति में बैकअप प्लेटों का होना महत्वपूर्ण है।
  2. सरगर्मी के साथ डीआई पानी के 750 एमएल में 59.6 ग्राम ना2एचपीओ4 (डिबेसिक), 29.9 ग्राम केएच2पीओ4 (मोनोबेसिक), 12.8 ग्राम एनएसीएल और 2.5 ग्राम एमजीएसओ4 को भंग करके 10 एक्स एम 9 बफर बनाएं। एक बार भंग होने के बाद, वॉल्यूम को 1 एल तक लाएं और फ़िल्टर निष्फल करें। 1x M9 बफर बनाने के लिए 1: 10 और आटोक्लेव पतला करें।
    नोट: 1x M9 बफर सप्ताह या महीने पहले बनाया जा सकता है।
  3. सिंक्रनाइज़ेशन के दिन हुड के नीचे विरंजन समाधान तैयार करें। 10 मिलीलीटर ब्लीच (सामग्री की तालिका), 10 एन एनएओएच के 2.5 एमएल, और 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 37.5 एमएल डीआई पानी मिलाएं। विरंजन समाधान के साथ काम करते समय चश्मे, दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट पहनें।
  4. प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके, 1एक्स एम 9 बफर के साथ कम से कम चार प्लेटों से ग्रेविड वयस्क कीड़े धो लें और उन्हें 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 716 x g पर स्पिन करें, और फिर एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
  6. विरंजन समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें। उलटा या धीरे ~ 4 मिनट के लिए ट्यूब हिला जब तक कि सबसे अधिक, लेकिन सभी नहीं, कीड़े शवों भंग कर दिया है (चित्रा 1)।
    नोट: सावधान रहें कि कीड़े को ओवर-ब्लीच न करें क्योंकि यह अंडे को नष्ट कर देगा। कुछ उत्परिवर्तन अंडे के अलगाव की कठिनाई को बढ़ा सकते हैं।
  7. 1 मिनट के लिए 716 x g पर स्पिन।
  8. एक गति में ब्लीच समाधान डालो; जब तक ट्यूब को इस बिंदु पर हिलाया नहीं जाता है, तब तक अंडे ट्यूब के किनारे चिपक जाएंगे।
  9. 1x M9 बफर के 15 एमएल जोड़ें और पलटें। 1 मिनट के लिए 716 एक्स जी पर स्पिन करें, और एक चिकनी गति में एम 9 बफर डालें।
  10. चरण 2.9 में वर्णित के रूप में 1x M9 बफर के साथ कुल तीन धोने प्रदर्शन करें।
  11. अंतिम धोने के बाद, ताजा 1x M9 के 10 एमएल जोड़ें और भूखे पहले लार्वा (एल 1) चरण जानवरों की सिंक्रनाइज़ आबादी को अलग करने के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रोटेटर पर रखें।
    नोट: रोटेटर पर रखने से पहले, यह सुनिश्चित करने के लिए जांचें कि एम 9 बफर में अंडे हैं। यदि नहीं, तो कम समय के लिए बैकअप प्लेटों और ब्लीच के साथ तैयारी दोहराएं।

3. चढ़ाना सिंक्रनाइज़ सी एलिगेंस (दिन 2)

  1. एक 24-अच्छी तरह से प्लेट मानचित्र प्रिंट करें और यादृच्छिक स्थानों पर उपभेदों को असाइन करें। प्रत्येक तनाव को कम से कम छह बार 24-अच्छी तरह से प्लेट में दर्शाया जाना चाहिए।
  2. ब्लीच तैयारी के लगभग 24 घंटे बाद, कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 716 एक्स जी पर एम 9 बफर में भूखे एल 1 कीड़े को स्पिन करें।
  3. एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट के साथ एम 9 बफर के ~ 9 एमएल निकालें, और फिर धीरे-धीरे शेष एम 9 बफर में भूखे पहले लार्वा चरण कीड़े (एल 1 एस) मिलाएं।
  4. तुरंत एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर एम 9 बफर में कीड़े के 3 μL पाइप और एल 1 एस की संख्या निर्धारित; वांछित संख्या 3 μL में 20-30 L1s है नीचे स्पिन और एम 9 को हटा दें यदि कृमि एकाग्रता बहुत कम है, और यदि एकाग्रता बहुत अधिक है तो M9 जोड़ें।
    नोट: हर बार ट्यूब को उलटते हुए, कम से कम 2x प्रति 3 μL प्रति कीड़े की संख्या की जाँच करें।
  5. पूर्व-निर्मित प्लेट मानचित्र (चरण 3.1) के अनुसार प्रत्येक कुएं में एल 1 एस (20-30 कीड़े कुल) के पिपेट 3 μL; चित्र 1)।
    नोट: एम 9 में एल 1 एस के साथ ट्यूब को अक्सर कीड़े के समान वितरण को बनाए रखने के लिए उल्टा करें क्योंकि वे नीचे बस जाएंगे। यदि ऐसा नहीं किया जाता है, तो कुछ कुओं में बहुत कम कीड़े होंगे, जबकि अन्य में बहुत अधिक होंगे। इसके अलावा, पिपेट टिप के साथ अगर को छेदना न करें क्योंकि इससे जानवरों को बिल करना होगा।
  6. कीड़े को 20 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए वयस्कता तक बढ़ने दें।
    नोट: विभिन्न विकास तापमान और कुछ उत्परिवर्तनों का उपयोग परिपक्वता की गति को प्रभावित कर सकता है, इसलिए सी एलिगेंस जीवन चक्र पर विचार करना सुनिश्चित करें।

4. लेवामिसोल परख (दिन 5) प्रदर्शन

  1. एक खाली डेटाशीट प्रिंट करें, जिसका उपयोग 1 घंटे के लिए हर 5 मिनट में प्रत्येक कुएं में चलने वाले कीड़े की संख्या रिकॉर्ड करने के लिए किया जाएगा।
    नोट: छात्र हर 5 मिनट में अधिकतम 12 कुओं में कीड़े की गिनती करने में सक्षम होंगे। शीर्ष 12 कुओं को पहले घंटे में परखा जाता है, बाद के घंटे में नीचे के 12 कुओं की जांच की जाती है।
  2. 24-अच्छी तरह से प्लेटों में कीड़े की जाँच करें। मार्कर का उपयोग करके, किसी भी कुएं पर प्लेट के ढक्कन पर "एक्स" बनाएं जिसमें संदूषण है, भूखा है, या बहुत सारे कीड़े हैं (>40), जिससे गिनती मुश्किल हो जाएगी।
  3. 1x M9 के 50 मिलीलीटर करने के लिए 100 एमएम लेवामिसोल स्टॉक के 200 μL जोड़कर 0.4 एमएम लेवामिसोल समाधान बनाएँ। एच 2 ओ के 10 मिलीलीटर में 240.76 मिलीग्राम लेवामिसोल हाइड्रोक्लोराइड को भंग करके 100 एमएम लेवामिसोल स्टॉक तैयार करें और इसे -20डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: लेवामिसोल को एम 9 में पतला किया जाना चाहिए; एच2ओ में कमजोर पड़ने से पक्षाघात तेज हो जाता है। छात्रों को दस्ताने पहनने चाहिए। लेवामिसोल की उच्च सांद्रता का अंतर्ग्रहण विषाक्त है।
  4. एक टाइमर शुरू करें और फिर, एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके, पहले दो कुओं में 0.4 एमएम लेवामिसोल का 1 मिलीलीटर जोड़ें, जैसे कि जानवर स्वतंत्र रूप से तैर रहे हैं। आसन्न कुओं में लेवामिसोल जोड़ना जारी रखें, परख किए जाने वाले कुओं की संख्या के अनुसार समय को चौंका दें।
    नोट: उदाहरण के लिए, यदि 10 कुओं परख कर रहे हैं, तो लेवामिसोल निम्नलिखित तरीके से जोड़ा जाएगा: कुओं 1 और 2 समय 0 पर, कुओं 3 और 4 1 मिनट के बाद, कुओं 5 और 6 2 मिनट के बाद, कुओं 7 और 8 3 मिनट के बाद, और कुओं 9 और 10 4 मिनट के बाद।
  5. 5 मिनट में, मैन्युअल रूप से प्रत्येक कुएं में चलती कीड़े की संख्या की गिनती शुरू करें, पहले कुएं से शुरू करें, और उस संख्या को डेटाशीट (चित्रा 1) पर रिकॉर्ड करें। काउंटरों का उपयोग किया जा सकता है लेकिन चलती कीड़े की संख्या को सटीक रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता नहीं है।
    नोट: छात्रों को टाइमर पर नज़र रखने की ज़रूरत है क्योंकि वे कभी-कभी कई कीड़े लकवाग्रस्त होने से पहले शुरुआती समय बिंदुओं के दौरान पीछे हो जाएंगे। समय बिंदुओं की संख्या को समायोजित किया जा सकता है, या यदि आवश्यक हो तो प्रत्येक समय बिंदु पर कम कुओं को परख किया जा सकता है।
  6. 1 घंटे के लिए हर 5 मिनट में प्रत्येक कुएं में चलती कीड़े की संख्या की गिनती जारी रखें।
    नोट: एम 9 में विसर्जन इस 1 एच परख के दौरान निरंतर तैराकी आंदोलन को प्रेरित करता है, जो पक्षाघात (चित्रा 2 ए) का आकलन करने के लिए कीड़े के प्रोडिंग की आवश्यकता को समाप्त करता है। 0.4 एमएम लेवामिसोल समाधान के संपर्क में आने से तैराकी की समाप्ति द्वारा देखे गए समय-निर्भर पक्षाघात को प्रेरित किया जाता है; लकवाग्रस्त होने वाले कीड़े ठीक नहीं होते हैं।
  7. चरण 4.4.-4.6 दोहराएँ। प्लेट में बाकी कुओं के लिए।
  8. परख के अंत में, या जब समय अनुमति देता है, प्रत्येक कुएं में कीड़े की कुल संख्या रिकॉर्ड।

5. डेटा विश्लेषण

  1. प्लेट मानचित्र (चरण 3.1.) प्राप्त करें और रिकॉर्ड करें कि कौन सा तनाव प्रत्येक कुएं से मेल खाता है।
    नोट: एकत्र किए गए डेटा की मात्रा के कारण, डेटा के बाद के विश्लेषण और चर्चा में कम से कम कुछ घंटे लगेंगे।
  2. डेटा को स्प्रेडशीट में दर्ज करें, प्रत्येक कुएं में कीड़े की कुल संख्या से शुरू करें और जीनोटाइप द्वारा व्यवस्थित करें।
  3. कुओं से डेटा के संयोजन, प्रत्येक तनाव के लिए प्रत्येक समय बिंदु पर चलने वाले कीड़े की संख्या निर्धारित करें।
  4. जनसंख्या के समय-निर्भर पक्षाघात (चित्रा 2 बी) को नेत्रहीन रूप से प्रदर्शित करने के लिए सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर (सामग्री की तालिका) में "उत्तरजीविता वक्र" बनाने के लिए इन आंकड़ों का उपयोग करें।
  5. एक डेटा तालिका ऐसी बनाएं कि बाएं हाथ का स्तंभ समय को इंगित करता है और बाद के स्तंभों में प्रत्येक तनाव के लिए डेटा होता है। पहले 5 मिनट के भीतर लकवाग्रस्त होने वाले प्रत्येक जानवर के लिए, एक पंक्ति बनाएं और 5 मिनट के लिए "1" दर्ज करें। इसे हर बार दोहराएं। परख के अंत तक पंगु नहीं है कि सभी जानवरों के लिए, 60 मिनट के लिए एक "0" दर्ज करें।
  6. सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर (सामग्री की तालिका) में लॉग-रैंक (मेंटल-कॉक्स) परीक्षण का उपयोग करके युग्मवार तुलना करें ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि दो अलग-अलग उपभेदों के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर है या नहीं।
  7. वैकल्पिक विश्लेषण के लिए, चरण 5.3 करने के बजाय। और चरण 5.4., हर समय बिंदु पर प्रत्येक कुएं में चलने वाले जानवरों का प्रतिशत निर्धारित करें। स्प्रेडशीट प्रोग्राम या सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर (चित्रा 2 सी) का उपयोग करके परख किए गए सभी उपभेदों के लिए प्रत्येक समय बिंदु पर मानक त्रुटि के साथ औसत प्लॉट करें।

Representative Results

एसीएचआर और गाबा रिसेप्टर्स के माध्यम से सिग्नलिंग सी एलिगेंस शरीर के एक तरफ की मांसपेशियों को अनुबंधित करने की अनुमति देती है जबकि दूसरी तरफ की मांसपेशियां आराम करती हैं, जिससे समन्वित हरकत6,16 सक्षम होती है। आयनोट्रोपिक एल-एसीएचआर के लिए लेवामिसोल बाध्यकारी संकुचन का कारण बनता है, जिससे जंगली प्रकार के जानवरों का समय-निर्भर पक्षाघात होता है। यहां, हमने जंगली प्रकार की संवेदनशीलता का आकलन किया, यूएनसी -63 एल-एसीएचआर उत्परिवर्ती, लेव -10 एल-एसीएचआर क्लस्टरिंग उत्परिवर्ती, और यूएनसी -49 गाबा ए रिसेप्टर उत्परिवर्ती सी। एल-एसीएचआर के सबयूनिट्स में उत्परिवर्तन, साथ ही मांसपेशियों के प्लाज्मा झिल्ली में एल-एसीएचआर की तस्करी के लिए आवश्यक जीन में, पोस्टसिनेप्टिक एल-एसीएचआर के क्लस्टरिंग, और डाउनस्ट्रीम सीए2 + सिग्नलिंग, लेवामिसोल-प्रेरित पक्षाघात 7,8,9,10,11,16,17 के प्रतिरोध का कारण बनता है, जैसा कि यूएनसी -63 और लेव -10 म्यूटेंट में देखा गया है (सी)। गाबा-गेटेड आयन चैनल यूएनसी -49 के नुकसान ने कोलीनर्जिक और गैबार्जिक सिग्नलिंग12 के उचित संतुलन के व्यवधान के कारण लेवामिसोल अतिसंवेदनशीलता (चित्रा 2 बी, सी) का कारण बना। जब यह परख हाल ही में एक उन्नत आनुवंशिकी प्रयोगशाला में अंडरग्रेजुएट्स द्वारा की गई थी, तो 100% छात्रों ने यूएनसी -63 और लेव -10 म्यूटेंट के साथ लेवामिसोल प्रतिरोध देखा, जबकि 88% ने यूएनसी -49 उत्परिवर्ती के साथ लेवामिसोल अतिसंवेदनशीलता देखी। तरल लेवामिसोल तैरना परख के साथ एकत्र किए गए ये डेटा पारंपरिक प्लेट-आधारित लेवामिसोल परख 7,8,11,12,13 में देखे गए फेनोटाइप के अनुरूप हैं।

Figure 1
चित्रा 1: लेवामिसोल परख तैयारी और कार्यान्वयन की योजनाबद्ध. 24-अच्छी तरह से एनजीएम प्लेटें डाली जाती हैं; 2 दिन बाद, ओपी 50 एस्चेरिचिया कोलाई को कुओं में वरीयता दी जाती है। एलिगेंस को ब्लीच प्रेप के माध्यम से सिंक्रनाइज़ किया जाता है, और प्रत्येक तनाव के लिए पहले लार्वा चरण (एल 1) जानवरों को परख किया जाता है (जंगली प्रकार, काला; यूएनसी -63 (एक्स 26), मैजेंटा; लेव -10 (एक्स 17), हरा; यूएनसी -49 (ई 407), नीला) अगले दिन एक पूर्व निर्धारित प्लेट मानचित्र के अनुसार कुओं में पाइप किया जाता है। 20 डिग्री सेल्सियस पर विकास के 3 दिनों के बाद, या जब जानवर वयस्कता तक पहुंचते हैं, तो एम 9 बफर में 0.4 एमएम लेवामिसोल प्रत्येक कुएं में जोड़ा जाता है, और चलती जानवरों की संख्या 1 घंटे के लिए हर 5 मिनट में गिनी जाती है ।

Figure 2
चित्रा 2: जंगली प्रकार और प्रतिनिधि उत्परिवर्ती सी एलिगेंस में लेवामिसोल-प्रेरित पक्षाघात। (ए) 0.4 एमएम लेवामिसोल के संपर्क में आने से समय-निर्भर पक्षाघात होता है; (बी) जंगली प्रकार (काला), यूएनसी -63 (एक्स 26) (मैजेंटा), लेव -10 (एक्स 17) (हरा), और यूएनसी -49 (ई 407) (नीला) जानवरों के समय-निर्भर पक्षाघात लेवामिसोल तैरना परख में। एल-एसीएचआर सबयूनिट यूएनसी -63 या एल-एसीएचआर क्लस्टरिंग प्रोटीन एलईवी -10 के नुकसान के परिणामस्वरूप लेवामिसोल प्रतिरोध हुआ, और गाबाए रिसेप्टर यूएनसी -49 के नुकसान ने लेवामिसोल अतिसंवेदनशीलता का कारण बना। एन ≥ 50 प्रति जीनोटाइप, पी < इस प्रतिनिधि प्रयोग में जंगली प्रकार की तुलना में सभी म्यूटेंट के लिए 0.0001। (सी) पैनल (बी) के समान डेटा का उपयोग करते हुए, प्रत्येक समय बिंदु पर चलती जानवरों का प्रतिशत (प्रत्येक कुएं ± एसई के लिए प्रतिशत का औसत) प्रत्येक तनाव के लिए निर्धारित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

लेवामिसोल के लिए परिवर्तित प्रतिक्रिया पोस्टसिनेप्टिक कोलीनर्जिक सिग्नलिंग और मांसपेशियों के कार्य के लिए आवश्यक जीन की पहचान कर सकती है। यहां प्रोटोकॉल एक तरल लेवामिसोल परख का वर्णन करता है जिसका उपयोग 1 घंटे की समय अवधि में समय-निर्भर पक्षाघात को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। छात्र कुछ आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के प्रभावों के बारे में भविष्यवाणी करते हैं, बड़े नमूना आकार के साथ एक प्रयोग करते हैं, और फिर उनके परिणामों की मात्रा निर्धारित करते हैं। यह परख जानवरों को चुनने या प्रोडिंग किए बिना लेवामिसोल-प्रेरित पक्षाघात को मापने का एक सरल, कुशल तरीका है, जिससे यह स्नातक प्रयोगशालाओं के साथ-साथ न्यूरोमस्कुलर ट्रांसमिशन का अध्ययन करने वाले शोधकर्ताओं के लिए उपयुक्त है। यहां चर्चा की गई कुछ सबसे आम नुकसान, परख की सीमाएं, और प्रोटोकॉल के लिए एक भिन्नता है जो आरएनएआई नॉकडाउन जानवरों के साथ इसके उपयोग को सक्षम बनाती है; यहाँ भी चर्चा की है कि कैसे इस परख एक पाठ्यक्रम आधारित स्नातक अनुसंधान अनुभव में एम्बेडेड किया जा सकता है.

24-अच्छी तरह से प्लेटों की उचित तैयारी आवश्यक है। सबसे पहले, कुओं में एल 1 जानवरों को खोजने से पहले बैक्टीरिया लॉन पूरी तरह से सूखा होना चाहिए। यदि पर्याप्त रूप से सूख नहीं जाता है, तो बैक्टीरिया परख के दौरान लेवामिसोल समाधान के साथ मिश्रण करता है, तरल बादल को मोड़ता है और व्यक्तियों को कीड़े की गिनती करने में सक्षम होने से रोकता है। दूसरा, ब्लीच प्रेप के माध्यम से कीड़े को सिंक्रनाइज़ करते समय, जानवरों को बहुत लंबे समय तक ब्लीच समाधान के संपर्क में नहीं आना चाहिए क्योंकि इससे अंडे पर सुरक्षात्मक कोटिंग विघटित हो जाएगी। तीसरा, प्रति अच्छी तरह से केवल 20-30 एल 1 को स्पॉट करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि कुओं में बहुत सारे कीड़े आवंटित समय में चलती संख्या को सटीक रूप से गिनना बेहद मुश्किल बनाते हैं। अंत में, प्लेटों की तैयारी के दौरान एक सड़न रोकनेवाला तकनीक को बनाए रखना महत्वपूर्ण है क्योंकि दूषित कुओं को परख नहीं किया जा सकता है।

वहाँ कुछ सीमाओं है कि जब इस परख प्रदर्शन पर विचार किया जाना चाहिए रहे हैं. सबसे पहले, प्रत्येक 5 मिनट में प्रत्येक कुएं में चलती कीड़े की संख्या की गिनती उन व्यक्तियों के लिए भारी हो सकती है जिनके पास पूर्व प्रयोगशाला अनुभव की कमी है, और इससे अशुद्ध डेटा संग्रह हो सकता है। दवा संवेदनशीलता18,19 निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य परखों के लिए, यह प्रयोग कम समय बिंदुओं के साथ किया जा सकता है। दूसरा, ब्लीच प्रेप से पृथक भूखे एल 1 एस की चढ़ाना एक सिंक्रनाइज़ आबादी प्राप्त करने का एक आसान तरीका है; हालाँकि, समायोजन किया जाना चाहिए यदि विकास का समय परख किए जा रहे उपभेदों के बीच भिन्न होता है। इस परख के लिए 24-अच्छी तरह से प्लेट में देर से चौथे लार्वा चरण जानवरों (एल 4 एस) को चुनना संभव है; हालाँकि, कई प्लेटें तैयार करते समय, यह बहुत श्रम-गहन है। वैकल्पिक रूप से, किसी को एल 4 तक पहुंचने के लिए प्रत्येक तनाव के लिए लगने वाले समय की लंबाई निर्धारित करनी चाहिए और फिर परिपक्वता गति में अंतर के लिए समायोजित करने के लिए अलग-अलग समय पर कुओं में एल 1 एस रखना चाहिए। अंत में, जबकि इस परख का उपयोग पोस्टसिनेप्टिक मांसपेशी समारोह11 के लिए महत्वपूर्ण नए जीनों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, परिवर्तित लेवामिसोल प्रतिक्रिया भी प्रीसिनेप्टिक जीन12 के उत्परिवर्तन या आरएनएआई नॉकडाउन के कारण हो सकती है। यदि परिवर्तित लेवामिसोल संवेदनशीलता देखी जाती है, तो इस फेनोटाइप के कारण को निर्धारित करने के लिए अतिरिक्त प्रयोग किए जाने चाहिए।

24-अच्छी तरह से प्लेटों में कुछ संशोधन करके, वर्णित लेवामिसोल तैरना परख आरएनएआई नॉकडाउन जानवरों11 पर भी किया जा सकता है। आरएनएआई के माध्यम से जीन नॉकडाउन को सी एलिगेंस बैक्टीरिया को खिलाकर प्राप्त किया जा सकता है जो ब्याज20 के जीन के अनुरूप डबल-फंसे आरएनए को व्यक्त करते हैं। आरएनएआई प्लेटों की तैयारी के लिए, आटोक्लेव से हटाने के बाद 1 एम आईपीटीजी के 1 एमएल और 25 मिलीग्राम / एमएल कार्बेनिसिलिन के 1 एमएल को प्रति लीटर मीडिया जोड़ा जाना चाहिए। एमएलकारबेनिसिलिन के 3 एमएल में एक एकल कॉलोनी को चुनकर बैक्टीरिया संस्कृतियों को उगाया जाता है, और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए, और प्लेट का नक्शा तब बनाया जाता है जब विभिन्न बैक्टीरिया कुओं में देखे जाते हैं। एलिगेंस को ब्लीच प्रेप द्वारा सिंक्रनाइज़ किया जाता है जैसा कि वर्णित है; हालांकि, जीन नॉकडाउन को बढ़ाने के लिए जंगली प्रकार के बजाय आरएनएआई अतिसंवेदनशील एरी -1 (मिलीग्राम 366) तनाव का उपयोग किया जाना चाहिए। आरएनएआई नॉकडाउन के परिणामस्वरूप हानि-ऑफ-फंक्शन म्यूटेंट के लिए देखे गए एक ही लेवामिसोल फेनोटाइप11.

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग प्रयोगशाला अनुसंधान में, स्नातक प्रयोगशाला में एक स्टैंड-अलोन प्रयोग के रूप में, या एक उन्नत स्नातक पाठ्यक्रम के शुरुआती हफ्तों में बुनियादी सी एलिगेंस तकनीकों और न्यूरोमस्कुलर फ़ंक्शन के परिचय के रूप में किया जा सकता है। अधिक उन्नत खोज-आधारित पाठ्यक्रम में, छात्र यह निर्धारित करने के लिए इस परख का उपयोग कर सकते हैं कि क्या मायस्थेनिक सिंड्रोम, मांसपेशियों के डिस्ट्रॉफी या मायोपैथी वाले व्यक्तियों में उत्परिवर्तित जीन के सी एलिगेंस होमोलॉग का नुकसान लेवामिसोल संवेदनशीलता को बदल देता है। अंत में, यह सरल, सस्ती लेवामिसोल संवेदनशीलता परख एनएमजे में सिग्नलिंग के बारे में सीखने और सी एलिगेंस मॉडल सिस्टम के साथ काम करने का अनुभव प्राप्त करने के लिए एक हाथ से दृष्टिकोण प्रदान करती है।

Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम रिया दत्तानी और लॉरेन हॉगस्ट्रॉम को धन्यवाद देते हैं, जिन्होंने डेलावेयर विश्वविद्यालय में बीआईएससी 413 उन्नत आनुवंशिकी प्रयोगशाला (स्प्रिंग 2022) में जीनोटाइप के लिए चित्रा 2 बी, सी अंधा में डेटा एकत्र किया। बीआईएससी 413 पाठ्यक्रम-आधारित स्नातक अनुसंधान अनुभव (इलाज) के बारे में अतिरिक्त जानकारी, साथ ही जे टैनिस द्वारा डिज़ाइन किए गए प्रयोगशाला मैनुअल तक पहुंच, अनुरोध पर उपलब्ध है। नेमाटोड उपभेदों को कैनोरहाब्डाइटिस जेनेटिक्स सेंटर द्वारा प्रदान किया गया था, जो एनआईएच-ओआरआईपी (पी 40 ओडी 010440) द्वारा समर्थित है। इस काम को पी 20 जीएम 103446 डेलावेयर इनब्रे मेंटरेड क्योर अवार्ड (जेईटी को) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mm non-vented, sharp edge Petri Dishes TriTech Research Cat #: T3308
BD Difco Bacto Agar Fisher Scientific Cat#: DF0140-01-0
BioLite 24 Well Multidish Fisher Scientific Cat#:12-556-006
Calcium Chloride Dihydrate Fisher Scientific Cat#: BP510-500
Cholesterol MP Biomedicals Cat#: 02101382-CF
eri-1(mg366) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) GR1373
Gibco Bacto Peptone Fisher Scientific Cat#: DF0118-17-0
Gibco Bacto Tryptone Fisher Scientific Cat#: DF0123-17-3
GraphPad Prism (Statistical software) GraphPad Software, Inc.
lev-10(x17) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) ZZ17
Levamisole hydrochloride Fisher Scientific Cat#: AC187870100
Low Splash Regular Bleach - 121oz - up & up Target Search target.com
Magnesium Sulfate Heptahydrate Fisher Scientific Cat#: BP213-1
Microsoft Excel Microsoft, Inc
N2 wild type Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Bristol N2
OP50 E. coli Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Scientific Cat#: BP363-1
Potassium Phosphate Monobasic Fisher Scientific Cat#: BP362-500
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific Cat#: BP358-1
Sodium Hydroxide 10N Fisher Scientific Cat#: SS255-1
Sodium Phosphate Dibasic Fisher Scientific Cat#: BP332-1
unc-49(e407) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) CB407
unc-63(x26) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) ZZ26

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References

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आनुवंशिकी अंक 184
एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर एगोनिस्ट लेवामिसोल के लिए <em>कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस</em> संवेदनशीलता को मापना
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Davis, A. N., Tanis, J. E. Measuring … More

Davis, A. N., Tanis, J. E. Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole. J. Vis. Exp. (184), e64056, doi:10.3791/64056 (2022).

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