Summary
Den nuværende protokol beskriver et assay for at bestemme respons på levamisol, en farmakologisk agonist af en klasse af Caenorhabditis elegans acetylcholinreceptorer. I dette flydende levamisolsvømmeassay observerer og kvantificerer forskere visuelt den tidsafhængige lammelse af dyr dyrket i 24-brøndplader.
Abstract
Ved det neuromuskulære kryds (NMJ) fører bindingen af den excitatoriske neurotransmitter acetylcholin (ACh) til postsynaptiske receptorer til muskelkontraktion. Som i hvirveldyr skeletmuskulatur er kolinerge signalering i kropsvægsmusklerne i modelorganismen Caenorhabditis elegans nødvendig for bevægelse. Eksponering for levamisol, en farmakologisk agonist af en klasse af ACh-receptorer på kroppens vægmuskler, forårsager tidsafhængig lammelse af vildtypedyr. Ændret følsomhed over for levamisol antyder defekter i signalering ved NMJ eller muskelfunktion. Her præsenteres en protokol for et flydende levamisolassay udført på C. elegans dyrket i 24-brøndplader. Kraftig svømning af dyrene i væske giver mulighed for vurdering og kvantificering af levamisolinduceret lammelse i hundredvis af orme over en times tidsperiode uden at kræve fysisk manipulation. Denne procedure kan anvendes med både vildtype og mutanter, der har ændret følsomhed over for levamisol for at demonstrere de funktionelle konsekvenser af ændret signalering ved NMJ.
Introduction
Aktivering af postsynaptiske acetylcholinreceptorer (AChR'er) på skeletmuskulatur resulterer i et elektrisk signal, der fører til muskelkontraktion. Forstyrrelse af neuromuskulær funktion resulterer i myastheniske syndromer og muskeldystrofier hos mennesker 1,2,3,4. Nematoden Caenorhabditis elegans er blevet brugt i vid udstrækning til at lære om evolutionært bevarede grundlæggende biologiske processer og sygdomsmekanismer. Hvirveldyr skeletmuskler og C. elegans kropsvægsmuskler er funktionelt ækvivalente i kontrollen af bevægelse5. Her præsenteres et simpelt assay, der kan bruges til at sammenligne vildtype C. elegans med mutanter, der har ændret neuromuskulær signalering eller muskelfunktion.
Excitatoriske og hæmmende input modtaget fra henholdsvis kolinerge og GABAerge motorneuroner får musklerne på den ene side af C. elegans krop til at trække sig sammen, mens musklerne på den anden side slapper af, hvilket muliggør koordineret bevægelse6. Levamisol, et anthelmintisk middel, der anvendes til behandling af parasitære nematodeinfektioner, binder sig til og aktiverer konstitutivt en klasse af AChR'er på kropsvægsmusklerne, hvilket resulterer i tidsafhængig lammelse7. Således kan ændret følsomhed over for levamisol anvendes til at identificere C. eleganer med defekter i balancen mellem excitatorisk og hæmmende signalering 7,8,9,10,11,12,13,14,15. For eksempel påvirker mutationer i underenheder af den levamisolfølsomme AChR (L-AChR), såsom UNC-63, såvel som C. elegans homolog af Cubilin, LEV-10, som er nødvendig for L-AChR-klyngedannelse ved synapsen, excitatorisk signalering og resulterer i levamisolresistens 7,8. Mutationer i GABAA-receptoren UNC-49 reducerer hæmmende signalering og forårsager overfølsomhed over for levamisol12.
Overfølsomhed eller resistens over for levamisol er traditionelt blevet vurderet ved at overføre dyr til agarplader indeholdende levamisol og derefter regelmæssigt stikke ormene for at bestemme det tidspunkt, hvor lammelse forekommer 13,14,15. Vi har udviklet et flydende levamisol svømmeassay, der eliminerer behovet for fysisk manipulation af dyrene og giver mulighed for screening af hundredvis af dyr på bare 1 time. Her beskrives brugen af dette assay med vildtype, unc-63(x26), lev-10(x17) og unc-49(e407) dyr. Denne protokol kan dog også udføres på C. eleganer udsat for RNAi, som det blev gjort for at validere knockdowns identificeret i en genom-dækkende RNAi-skærm for ændret levamisolfølsomhed11.
Til dette farmakologiske assay blev orme dyrket til voksenalderen i 24-brøndplader, 0,4 mM levamisol i M9-buffer blev tilsat til hver brønd, og antallet af bevægelige dyr blev registreret hvert 5. minut i 1 time. Levamisolinduceret lammelse blev visuelt observeret over tid, og efter afslutningen af analysen blev data kvantificeret. Evalueringen af mutanter sammen med vildtype C. elegans giver eleverne mulighed for først at forudsige potentielle fænotypiske effekter og derefter udføre eksperimenter for at teste deres hypoteser. Afslutningsvis er dette enkle, billige, flydende levamisolassay en ideel måde at demonstrere virkningen af tabet af specifikke gener på NMJ-funktionen.
Protocol
1. Forberedelse af plader til levamisolassayet
- Forbered nematodevækstmedium (NGM) medier ved at kombinere 3 g NaCl, 2,5 g pepton og 17 g agar med 1 liter deioniseret (DI) vand i en kolbe med en omrøringsstang.
- Efter autoklavering anbringes mediet på en kogeplade indstillet til 70 °C og omrøres ved moderat hastighed i 1 time.
- Tilsæt 1 ml 5 mg / ml kolesterol dråbevis for at forhindre udfældning, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 MMgSO4 og 25 ml 1 M pH 6,0 kaliumphosphatbuffer til mediet.
- Overfør 2 ml NGM-medier til hver brønd i en 24-brøndplade med en steril serologisk pipette (figur 1).
- Lad pladerne tørre på bordpladen i 2 dage før såning med bakterier. Ved langtidsopbevaring anbringes de ved 4 °C.
- Strib OP50 E. coli ud på en lysogen bouillon (LB) plade og voks natten over ved 37 °C.
- Vælg en enkelt OP50-koloni i B-bouillon (10 g trypton og 5 g NaCl i 1 liter DI H2O), og indstil kulturrystelsen ved 37 ° C natten over.
- Ved hjælp af en steril pipette skal du slippe 30 μL OP50-suspensionen på agaren i midten af hver brønd (figur 1).
BEMÆRK: Sørg for ikke at beskadige agaroverfladen, da dette vil føre til ormgravning. - Lad pladerne sidde ved stuetemperatur i mindst 2 dage efter såning for at tillade dannelse af en bakteriel græsplæne.
BEMÆRK: Hvis bakterierne i midterbrøndene ikke er tørre efter 2 dage, skal pladerne stå åbne i emhætten i 20 minutter (figur 1). Pladerne skal hældes og podes med bakterier 1-2 uger før analysen.
2. Synkronisering af C. elegans (dag 1)
- Dyrk vildtype, unc-63 (x26), lev-10 (x17) og unc-49 (e407) C. elegans til voksenalderen på 6 cm plader, og forbered mindst otte plader pr. Stamme. Bekræft, at der er mange ikke-sultne gravide voksne på pladerne.
BEMÆRK: Dette er dobbelt så mange plader som nødvendigt; Det er dog vigtigt at have backupplader, hvis det første parti æg ødelægges under blegning. - Der fremstilles 10x M9-buffer ved at opløse 59,6 g Na2HPO4 (dibasisk), 29,9 g KH2PO4 (monobasisk), 12,8 g NaCl og 2,5 g MgSO4 i 750 ml DI-vand under omrøring. Når det er opløst, bringes volumenet op til 1 L og filtreres steriliseres. Fortynd 1:10 og autoklave for at gøre 1x M9 buffer.
BEMÆRK: 1x M9-bufferen kan laves uger eller måneder i forvejen. - Forbered blegeopløsning under emhætten på synkroniseringsdagen. Bland 10 ml blegemiddel (materialebord), 2,5 ml 10 N NaOH og 37,5 ml DI-vand i et 50 ml konisk rør. Brug beskyttelsesbriller, handsker og en kittel, når du arbejder med blegeopløsningen.
- Brug et plastoverførselsrør til at vaske gravide voksne orme fra mindst fire plader med 1x M9 buffer og overfør dem til et 15 ml konisk rør.
- Drej ved 716 x g i 1 minut ved stuetemperatur, og fjern derefter supernatanten ved hjælp af et overførselsrør.
- Der tilsættes 10 ml blegeopløsning. Vend eller ryst forsigtigt røret i ~4 minutter, indtil de fleste, men ikke alle, ormekroppe er opløst (figur 1).
BEMÆRK: Pas på ikke at overblege ormene, da dette vil ødelægge æggene. Visse mutationer kan øge vanskeligheden ved ægisolering. - Drej ved 716 x g i 1 min.
- Hæld blegemiddelopløsningen af i en bevægelse; så længe røret ikke rystes på dette tidspunkt, klæber æggene til siden af røret.
- Tilsæt 15 ml 1x M9 buffer og inverter. Drej ved 716 x g i 1 minut, og hæld M9-bufferen af i en jævn bevægelse.
- Udfør i alt tre vaske med 1x M9 buffer, som beskrevet i trin 2.9.
- Efter den sidste vask tilsættes 10 ml frisk 1x M9 og anbringes på en rotator natten over ved 15 °C for at isolere en synkroniseret population af udsultede dyr i første larvestadie (L1).
BEMÆRK: Før du sætter rotatoren på, skal du kontrollere, at der er æg i M9-bufferen. Hvis ikke, gentag forberedelsen med backupplader og blegemiddel i kortere tid.
3. Plettering synkroniseret C. elegans (dag 2)
- Udskriv et 24-brønds pladekort, og tildel stammer til randomiserede steder. Hver stamme skal være repræsenteret i 24-brøndpladen mindst seks gange.
- Ca. 24 timer efter blegemiddelforberedelsen spindes udklækkede L1-orme ned i M9-buffer ved 716 x g i 1 minut ved stuetemperatur.
- Fjern ~ 9 ml M9-buffer med et plastoverførselsrør, og bland derefter forsigtigt de udsultede orme i første larvestadium (L1'er) i den resterende M9-buffer.
- Rør straks 3 μL af ormene i M9-bufferen på et mikroskopglas og bestem antallet af L1'er; det ønskede tal er 20-30 L1s i 3 μL. Spin ned og fjern M9, hvis ormkoncentrationen er for lav, og tilsæt M9, hvis koncentrationen er for høj.
BEMÆRK: Kontroller antallet af orme pr. 3 μL mindst 2x, og vend røret hver gang. - Pipet 3 μL L1s (20-30 orme i alt) i hver brønd i henhold til det præfabrikerede pladekort (trin 3.1; Figur 1).
BEMÆRK: Vend røret med L1'erne i M9 ofte for at opretholde en jævn fordeling af orme, da de vil slå sig ned til bunden. Hvis dette ikke gøres, vil nogle brønde have for få orme, mens andre vil have for mange. Gennembor heller ikke agaren med pipettespidsen, da dette vil få dyrene til at grave sig. - Lad ormene vokse til voksenalderen i 3 dage ved 20 °C.
BEMÆRK: Brugen af forskellige væksttemperaturer og visse mutationer kan påvirke modningshastigheden, så sørg for at overveje C. elegans livscyklus.
4. Udførelse af levamisolassayet (dag 5)
- Udskriv et tomt datablad, som vil blive brugt til at registrere antallet af orme, der bevæger sig i hver brønd hvert 5. minut i 1 time.
BEMÆRK: Eleverne vil kunne tælle ormene i højst 12 brønde hvert 5. minut. De 12 bedste brønde analyseres i den første time, mens de nederste 12 brønde analyseres i den efterfølgende time. - Kontroller ormene i pladerne med 24 brønde. Brug en markør til at lave et "X" på pladelåget over eventuelle brønde, der har forurening, har sultet eller har for mange orme (>40), hvilket vil gøre tælling vanskelig.
- Der fremstilles 0,4 mM levamisolopløsning ved tilsætning af 200 μL 100 mM levamisolbestand til 50 ml 1x M9. 100 mM levamisolbestand forberedes ved at opløse 240,76 mg levamisolhydrochlorid i 10 mlH2Oog opbevares ved -20 °C.
BEMÆRK: Levamisol skal fortyndes i M9; fortynding iH2Ofremskynder lammelse. Studerende skal bære handsker. Indtagelse af høje koncentrationer af levamisol er giftig. - Start en timer, og tilsæt derefter 1 ml 0,4 ml levamisol til de to første brønde ved hjælp af et overførselsrør, således at dyrene svømmer frit. Fortsæt med at tilføje levamisol til de tilstødende brønde, forskyde tiden i henhold til antallet af brønde, der skal analyseres.
BEMÆRK: Hvis der f.eks. analyseres 10 brønde, tilsættes levamisol på følgende måde: brønde 1 og 2 ved tid 0, brønde 3 og 4 efter 1 min, brønde 5 og 6 efter 2 min, brønde 7 og 8 efter 3 min og brønde 9 og 10 efter 4 min. - Efter 5 minutter skal du begynde manuelt kun at tælle antallet af bevægelige orme i hver brønd, begyndende med den første brønd, og registrere dette nummer på databladet (figur 1). Tællere kan bruges, men er ikke forpligtet til nøjagtigt at bestemme antallet af bevægelige orme.
BEMÆRK: Studerende skal holde øje med timeren, da de nogle gange kommer bagud i de tidlige tidspunkter, før mange orme lammes. Antallet af tidspunkter kan justeres, eller færre brønde kan analyseres på hvert tidspunkt, hvis det er nødvendigt. - Fortsæt med at tælle antallet af bevægelige orme i hver brønd hvert 5. minut i 1 time.
BEMÆRK: Nedsænkning i M9 inducerer konstant svømmebevægelse i løbet af dette 1 timers assay, hvilket eliminerer behovet for ormens prodding for at vurdere lammelse (figur 2A). Eksponering for 0,4 mM levamisolopløsning inducerer tidsafhængig lammelse som observeret ved ophør af svømning; orme, der lammer, kommer sig ikke. - Gentag trin 4.4.-4.6. for resten af brøndene i pladen.
- I slutningen af analysen, eller når tiden tillader det, skal du registrere det samlede antal orme i hver brønd.
5. Analyse af data
- Ophent pladekortet (trin 3.1), og registrer, hvilken stamme der svarer til hver brønd.
BEMÆRK: På grund af mængden af indsamlede data vil den efterfølgende analyse og diskussion af dataene tage mindst et par timer. - Indtast dataene i et regneark, der starter med det samlede antal orme i hver brønd og organiserer efter genotype.
- Ved at kombinere data fra brøndene skal du bestemme antallet af orme, der bevæger sig på hvert tidspunkt for hver stamme.
- Brug disse data til at oprette en "overlevelseskurve" i den statistiske software (Table of Materials) for visuelt at vise befolkningens tidsafhængige lammelse (figur 2B).
- Opret en datatabel, så venstre kolonne angiver klokkeslæt, og efterfølgende kolonner indeholder dataene for hver stamme. For hvert dyr, der er lammet inden for de første 5 minutter, skal du oprette en række og indtaste en "1" i 5 min. Gentag dette for hvert tidspunkt. For alle dyr, der ikke lammer ved afslutningen af analysen, skal du indtaste et "0" i 60 min.
- Udfør parvise sammenligninger ved hjælp af log-rank (Mantel-Cox) testen i den statistiske software (Table of Materials) for at afgøre, om der er en statistisk signifikant forskel mellem to forskellige stammer.
- Til yderligere/alternativ analyse i stedet for at udføre trin 5.3. og trin 5.4, bestemmes procentdelen af dyr, der bevæger sig i hver brønd på hvert tidspunkt. Afbild gennemsnittet med standardfejl på hvert tidspunkt for alle stammer, der er analyseret ved hjælp af et regnearksprogram eller den statistiske software (figur 2C).
Representative Results
Signalering gennem AChR'er og GABA-receptorer gør det muligt for muskler på den ene side af C. elegans krop at trække sig sammen, mens musklerne på den anden side slapper af, hvilket muliggør koordineret bevægelse 6,16. Levamisolbinding til ionotrope L-AChR'er forårsager sammentrækning, hvilket fører til tidsafhængig lammelse af vildtypedyr. Her vurderede vi følsomheden af vildtype, unc-63 L-AChR mutant, lev-10 L-AChR clustering mutant og unc-49 GABAA receptor mutant C. elegans til levamisol. Mutationer i underenheder af L-AChR såvel som i gener, der kræves til handel med L-AChR'er til muskelplasmamembranen, klyngedannelse af postsynaptiske L-AChR'er og nedstrøms Ca2+ signalering, forårsager resistens over for levamisolinduceret lammelse 7,8,9,10,11,16,17, som observeret i unc-63 og lev-10 mutanter (figur 2B ,C). Tab af den GABA-gatede ionkanal UNC-49 forårsagede levamisoloverfølsomhed (figur 2B, C) på grund af forstyrrelse af den korrekte balance mellem kolinerge og GABAerge signalering12. Da dette assay for nylig blev udført af studerende i et avanceret genetiklaboratorium, observerede 100% af eleverne levamisolresistens med unc-63 og lev-10 mutanter, mens 88% observerede levamisoloverfølsomhed med unc-49 mutanten. Disse data indsamlet med det flydende levamisol svømmeassay er i overensstemmelse med fænotyper observeret i traditionelle pladebaserede levamisolassaysays 7,8,11,12,13.
Figur 1: Skematisk af levamisolassayforberedelse og implementering. 24-brønd NGM-plader hældes; 2 dage senere sås OP50 Escherichia coli i brøndene. C. eleganer synkroniseres gennem blegemiddelforberedelse og første larvetrin (L1) dyr for hver stamme, der skal analyseres (vildtype, sort; unc-63(x26), magenta; lev-10(x17), grøn; unc-49(e407), blå) pipetteres i brøndene i henhold til et forudbestemt pladekort den følgende dag. Efter 3 dages vækst ved 20 ºC, eller når dyrene når voksenalderen, tilføjes 0,4 mM levamisol i M9 buffer til hver brønd, og antallet af bevægelige dyr tælles hvert 5. minut i 1 time. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Levamisol-induceret lammelse i vildtype og repræsentativ mutant C. elegans. (A) Eksponering for 0,4 mM levamisol forårsager tidsafhængig lammelse; dette observeres ikke for dyr, der svømmer i 1x M9 buffer i 1 time. (B) Tidsafhængig lammelse af vildtype (sort), unc-63 (x26) (magenta), lev-10 (x17) (grøn) og unc-49 (e407) (blå) dyr i levamisol svømmeassayet. Tab af L-AChR-underenheden UNC-63 eller L-AChR-klyngeprotein LEV-10 resulterede i levamisolresistens, og tab af GABAA-receptoren UNC-49 forårsagede levamisoloverfølsomhed. n ≥ 50 pr. genotype, p < 0,0001 for alle mutanter sammenlignet med vildtypen i dette repræsentative eksperiment. C) Ved hjælp af de samme data som i panel B) blev procentdelen af dyr i bevægelse på hvert tidspunkt (gennemsnit af procentdelene for hvert brønd ± SE) bestemt for hver stamme. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Ændret respons på levamisol kan identificere gener, der kræves til postsynaptisk kolinerg signalering og muskelfunktion. Protokollen beskriver her et flydende levamisolassay, der bruges til at kvantificere tidsafhængig lammelse over en 1 times tidsperiode. Studerende forudsiger virkningerne af visse genetiske mutationer, udfører et eksperiment med stor prøvestørrelse og kvantificerer derefter deres resultater. Dette assay er en enkel, effektiv måde at kvantificere levamisolinduceret lammelse uden at plukke eller stikke dyr, hvilket gør den velegnet til bachelorlaboratorier samt forskere, der studerer neuromuskulær transmission. Diskuteret her er nogle af de mest almindelige faldgruber, begrænsningerne i analysen og en variation til protokollen, der muliggør dens anvendelse med RNAi knockdown-dyr; også diskuteret her er, hvordan dette assay kan indlejres i en kursusbaseret bachelorforskningserfaring.
Korrekt forberedelse af pladerne med 24 brønde er afgørende. For det første skal bakterieplæner være helt tørre, før de spotter L1-dyr i brøndene. Hvis de ikke tørres nok, blandes bakterierne med levamisolopløsningen under analysen, hvilket gør væsken uklar og forhindrer enkeltpersoner i at kunne tælle ormene. For det andet, når de synkroniserer orme gennem blegemiddelforberedelse, må dyrene ikke udsættes for blegemiddelopløsningen for længe, da dette vil få den beskyttende belægning på æggene til at gå i opløsning. For det tredje er det afgørende kun at få øje på 20-30 L1'er pr. Brønd, da for mange orme i brøndene gør det ekstremt vanskeligt at tælle antallet, der bevæger sig nøjagtigt inden for den tildelte tid. Endelig er det vigtigt at opretholde en aseptisk teknik under fremstillingen af pladerne, da forurenede brønde ikke kan analyseres.
Der er et par begrænsninger, der skal overvejes, når du udfører dette assay. For det første kan det være overvældende at tælle antallet af bevægelige orme i hver brønd hvert 5. minut for personer, der mangler forudgående laboratorieerfaring, og dette kan føre til upræcis dataindsamling. Hvad angår andre assays, der bruges til at bestemme lægemiddelfølsomhed18,19, kan dette eksperiment udføres med færre tidspunkter. For det andet er plettering af sultne L1'er isoleret fra en blegemiddelforberedelse en nem metode til at opnå en synkroniseret population; Der skal dog foretages justeringer, hvis udviklingstidspunktet varierer mellem de stammer, der analyseres. Det er muligt at plukke sene fjerde larvestadiedyr (L4'er) i en 24-brøndplade til dette assay; Men når man forbereder mange plader, er dette for arbejdskrævende. Alternativt bør man bestemme, hvor lang tid det tager for hver stamme at nå L4 og derefter placere L1'erne i brøndene på forskellige tidspunkter for at justere for forskelle i modningshastighed. Endelig, mens dette assay kan bruges til at identificere nye gener, der er vigtige for postsynaptisk muskelfunktion11, kan ændret levamisolrespons også være forårsaget af mutation eller RNAi knockdown af præsynaptiske gener12. Hvis der observeres ændret levamisolfølsomhed, skal der udføres yderligere forsøg for at bestemme årsagen til denne fænotype.
Ved at foretage et par ændringer af pladerne med 24 brønde kan den beskrevne levamisol svømmeassay også udføres på RNAi knockdown dyr11. Gen knockdown gennem RNAi kan opnås ved at fodre C. elegans bakterier, der udtrykker dobbeltstrenget RNA svarende til genet af interesse20. Til fremstilling af RNAi-plader skal der tilsættes 1 ml 1 ml IPTG og 1 ml 25 mg/ml carbenicillin pr. liter medie efter fjernelse fra autoklaven. Bakteriekulturer dyrkes ved at plukke en enkelt koloni i 3 ml LB bouillon plus 3 μL 25 mg/mlcarbenicillin og ryste ved 37 °C natten over, og pladekortet laves, når de forskellige bakterier ses i brøndene. C. elegans synkroniseres ved blegemiddelforberedelse som beskrevet; dog bør den RNAi overfølsomme eri-1 (mg366) stamme anvendes i stedet for vildtypen for at øge gen knockdown. RNAi knockdowns resulterer i de samme levamisolfænotyper observeret for funktionstab mutanter11.
Protokollen, der præsenteres her, kan bruges i laboratorieforskning, som et selvstændigt eksperiment i bachelorlaboratoriet eller i de første uger af et avanceret bachelorkursus som en introduktion til grundlæggende C. elegans teknikker og neuromuskulær funktion. I et mere avanceret opdagelsesbaseret kursus kan eleverne bruge dette assay til at afgøre, om tabet af C. elegans homologer af gener muteret hos personer med myastheniske syndromer, muskeldystrofier eller myopatier ændrer levamisolfølsomhed. Afslutningsvis giver dette enkle, billige levamisolfølsomhedsassay en praktisk tilgang til at lære om signalering ved NMJ og få erfaring med at arbejde med C. elegans-modelsystemet .
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker Riya Dattani og Lauren Hogstrom, der indsamlede dataene i figur 2B, C blind for genotype i BISC413 Advanced Genetics Laboratory (forår 2022) ved University of Delaware. Yderligere oplysninger om BISC413 kursusbaseret bachelorforskningserfaring (CURE) samt adgang til laboratoriemanualen designet af J. Tanis er tilgængelig efter anmodning. Nematodestammer blev leveret af Caenorhabditis Genetics Center, som understøttes af NIH-ORIP (P40 OD010440). Dette arbejde blev støttet af en P20 GM103446 Delaware INBRE Mentored CURE Award (til J.E.T.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm non-vented, sharp edge Petri Dishes | TriTech Research | Cat #: T3308 | |
| BD Difco Bacto Agar | Fisher Scientific | Cat#: DF0140-01-0 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Fisher Scientific | Cat#:12-556-006 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP510-500 | |
| Cholesterol | MP Biomedicals | Cat#: 02101382-CF | |
| eri-1(mg366) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | GR1373 | |
| Gibco Bacto Peptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0118-17-0 | |
| Gibco Bacto Tryptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0123-17-3 | |
| GraphPad Prism (Statistical software) | GraphPad Software, Inc. | ||
| lev-10(x17) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ17 | |
| Levamisole hydrochloride | Fisher Scientific | Cat#: AC187870100 | |
| Low Splash Regular Bleach - 121oz - up & up | Target | Search target.com | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP213-1 | |
| Microsoft Excel | Microsoft, Inc | ||
| N2 wild type | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Bristol N2 | |
| OP50 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP363-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | Cat#: BP362-500 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | Cat#: BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide 10N | Fisher Scientific | Cat#: SS255-1 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP332-1 | |
| unc-49(e407) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB407 | |
| unc-63(x26) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ26 |
References
- Engel, A. G., Shen, X. M., Selcen, D., Sine, S. M. Congenital myasthenic syndromes: Pathogenesis, diagnosis, and treatment. The Lancet Neurology. 14 (4), 420-434 (2015).
- Mahjneh, I., Lochmüller, H., Muntoni, F., Abicht, A. DOK7 limb-girdle myasthenic syndrome mimicking congenital muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 23 (1), 36-42 (2013).
- Rodríguez Cruz, P. M., et al. Congenital myopathies with secondary neuromuscular transmission defects; A case report and review of the literature. Neuromuscular Disorders. 24 (12), 1103-1110 (2014).
- Montagnese, F., et al. Two patients with GMPPB mutation: The overlapping phenotypes of limb-girdle myasthenic syndrome and limb-girdle muscular dystrophy dystroglycanopathy. Muscle and Nerve. 56 (2), 334-340 (2017).
- Gieseler, K., Qadota, H., Benian, G. M. Development, structure, and maintenance of C. elegans body wall muscle. WormBook. , 1-59 (2017).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 2 (9), 791-797 (1999).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
- Gally, C., Eimer, S., Richmond, J. E., Bessereau, J. L. A transmembrane protein required for acetylcholine receptor clustering in Caenorhabditis elegans. Nature. 431 (7008), 578-582 (2004).
- Eimer, S., et al. Regulation of nicotinic receptor trafficking by the transmembrane Golgi protein UNC-50. The EMBO Journal. 26 (20), 4313-4323 (2007).
- Gendrel, M., Rapti, G., Richmond, J. E., Bessereau, J. L. A secreted complement-control-related protein ensures acetylcholine receptor clustering. Nature. 461 (7266), 992-996 (2009).
- Chaya, T., et al. A C. elegans genome-wide RNAi screen for altered levamisole sensitivity identifies genes required for muscle function. G3: Genes, Genomes, Genetics. 11 (4), 047 (2021).
- Vashlishan, A. B., et al. An RNAi screen identifies genes that regulate GABA synapses. Neuron. 58 (3), 346-361 (2008).
- Krajacic, P., Pistilli, E. E., Tanis, J. E., Khurana, T. S., Lamitina, S. T. FER-1/Dysferlin promotes cholinergic signaling at the neuromuscular junction in C. elegans and mice. Biology Open. 2 (11), 1245-1252 (2013).
- Gottschalk, A., et al. Identification and characterization of novel nicotinic receptor-associated proteins in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 24 (14), 2566-2578 (2005).
- Loria, P. M., Hodgkin, J., Hobert, O. A conserved postsynaptic transmembrane protein affecting neuromuscular signaling in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 24 (9), 2191-2201 (2004).
- Treinin, M., Jin, Y. Cholinergic transmission in C. elegans: Functions, diversity, and maturation of ACh-activated ion channels. Journal of Neurochemistry. 158 (6), 1274-1291 (2021).
- Rapti, G., Richmond, J., Bessereau, J. L. A single immunoglobulin-domain protein required for clustering acetylcholine receptors in C. elegans. The EMBO Journal. 30 (4), 706-718 (2011).
- Kim, S., Sieburth, D. A receptor tyrosine kinase network regulates neuromuscular function in response to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (4), 1283-1295 (2019).
- Oh, K., Kim, H. Aldicarb-induced paralysis assay to determine defects in synaptic transmission in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 7 (14), 2400 (2017).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
