Summary
Mevcut protokol, Caenorhabditis elegans asetilkolin reseptörlerinin bir sınıfının farmakolojik agonisti olan levamisole'ye yanıtı belirlemek için bir tahlili açıklamaktadır. Bu sıvı levamisol yüzme testinde, araştırmacılar 24 kuyucuklu plakalarda yetiştirilen hayvanların zamana bağlı felcini görsel olarak gözlemler ve nicelleştirir.
Abstract
Nöromüsküler kavşakta (NMJ), uyarıcı nörotransmitter asetilkolinin (ACh) postsinaptik reseptörlere bağlanması kas kasılmasına yol açar. Omurgalı iskelet kasında olduğu gibi, model organizma Caenorhabditis elegans'ın vücut duvarı kaslarında kolinerjik sinyalizasyon lokomotif için gereklidir. Vücut duvarı kaslarındaki bir ACh reseptör sınıfının farmakolojik agonisti olan levamisole'ye maruz kalmak, vahşi tip hayvanların zamana bağlı felce neden olur. Levamizol'e karşı değişmiş duyarlılık, NMJ'de veya kas fonksiyonunda sinyalleşmede kusurları düşündürmektedir. Burada, 24 kuyucuklu plakalarda yetiştirilen C. elegans üzerinde yapılan sıvı levamisol testi için bir protokol sunulmaktadır. Hayvanların sıvı içinde kuvvetli bir şekilde yüzdürülmesi, yüzlerce solucanda levamisol kaynaklı felcin fiziksel manipülasyon gerektirmeden bir saatlik bir süre boyunca değerlendirilmesine ve miktarının belirlenmesine izin verir. Bu prosedür, NMJ'de değiştirilmiş sinyallemenin işlevsel sonuçlarını göstermek için levamisol'a duyarlılığı değiştiren hem vahşi tip hem de mutantlarla kullanılabilir.
Introduction
Postsinaptik asetilkolin reseptörlerinin (AChR) iskelet kası üzerindeki aktivasyonu, kas kasılmasına yol açan bir elektrik sinyaliyle sonuçlanır. Nöromüsküler fonksiyonun bozulması insanlarda miyastenik sendromlar ve kas distrofileri ile sonuçlanır 1,2,3,4. Nematod Caenorhabditis elegans, evrimsel olarak korunmuş temel biyolojik süreçler ve hastalık mekanizmaları hakkında bilgi edinmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Omurgalı iskelet kasları ve C. elegans vücut duvarı kasları fonksiyonel olarak hareket kontrolünde eşdeğerdir5. Burada, vahşi tip C. elegans'ı nöromüsküler sinyalleşmeyi veya kas fonksiyonunu değiştiren mutantlarla karşılaştırmak için kullanılabilecek basit bir tahlil sunulmaktadır.
Sırasıyla kolinerjik ve GABAerjik motor nöronlardan alınan uyarıcı ve inhibitör girdiler, C. elegans vücudunun bir tarafındaki kasların kasılmasına neden olurken, diğer taraftaki kaslar gevşeyerek koordineli hareketsağlar 6. Paraziter nematod enfeksiyonlarını tedavi etmek için kullanılan antelmintik bir ajan olan levamisol, vücut duvarı kaslarındaki bir AChR sınıfına bağlanır ve yapısal olarak aktive eder ve zamana bağlı felç7 ile sonuçlanır. Bu nedenle, levamisol'a karşı değiştirilmiş duyarlılık,uyarıcı ve inhibitör sinyal dengesindeki kusurları olan C. elegans'ı tanımlamak için kullanılabilir 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Örneğin, UNC-63 gibi levamisol duyarlı AChR'nin (L-AChR) alt birimlerindeki mutasyonlar ve sinapsta L-AChR kümelenmesi için gerekli olan Cubilin'in C. elegans homologu, LEV-10, uyarıcı sinyallemeyi etkiler ve levamisol direnci 7,8 ile sonuçlanır. GABAA reseptörü UNC-49'daki mutasyonlar, inhibitör sinyalleşmeyi azaltır ve levamisol12'ye aşırı duyarlılığa neden olur.
Levamisol'a aşırı duyarlılık veya direnç geleneksel olarak hayvanları levamisol içeren agar plakalarına aktararak ve daha sonra felcin meydana geldiği zaman noktasını belirlemek için solucanları düzenli olarak teşvik ederek değerlendirilmiştir13,14,15. Hayvanların fiziksel manipülasyon ihtiyacını ortadan kaldıran ve sadece 1 saatte yüzlerce hayvanın taranmasına izin veren sıvı bir levamisol yüzme testi geliştirdik. Burada, bu tahlilin vahşi tip, unc-63 (x26), lev-10 (x17) ve unc-49 (e407) hayvanlarla kullanımı açıklanmaktadır. Bununla birlikte, bu protokol, değiştirilmiş levamisol duyarlılığı11 için genom çapında bir RNAi ekranında tanımlanan nakavtları doğrulamak için yapıldığı gibi, RNAi'ye maruz kalan C. elegans üzerinde de gerçekleştirilebilir.
Bu farmakolojik analiz için, solucanlar 24 kuyucuklu plakalarda yetişkinliğe kadar yetiştirildi, her bir kuyucuğa M9 tamponunda 0.4 mM levamisol eklendi ve hareketli hayvanların sayısı 1 saat boyunca her 5 dakikada bir kaydedildi. Levamisol kaynaklı felç zamanla görsel olarak gözlendi ve tahlilin tamamlanmasından sonra veriler ölçüldü. Vahşi tip C. elegans ile birlikte mutantların değerlendirilmesi, öğrencilerin önce potansiyel fenotipik etkiler hakkında tahminlerde bulunmalarını ve daha sonra hipotezlerini test etmek için deneyler yapmalarını sağlar. Sonuç olarak, bu basit, ucuz, sıvı levamisol testi, spesifik genlerin kaybının NMJ fonksiyonu üzerindeki etkisini göstermek için ideal bir yoldur.
Protocol
1. Levamisol testi için plakaların hazırlanması
- 3 g NaCl, 2.5 g pepton ve 17 g agar'ı karıştırma çubuğuna sahip bir şişede 1 L deiyonize (DI) su ile birleştirerek nematod büyüme ortamı (NGM) ortamı hazırlayın.
- Otoklavlamadan sonra, ortamı 70 ° C'ye ayarlanmış bir sıcak plakaya koyun ve 1 saat boyunca ılımlı bir hızda karıştırın.
- Çökelmeyi önlemek için damla damlasına 1 mL 5 mg/mL kolesterol, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 1 M MgSO4 ve 25 mL 1 M pH 6.0 potasyum fosfat tamponu ekleyin.
- 2 mL NGM ortamını, steril bir serolojik pipet ile 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarın (Şekil 1).
- Bakterilerle tohumlamadan önce plakaların tezgahta 2 gün kurumasını bekleyin. Daha uzun süreli depolama için, bunları 4 ° C'ye yerleştirin.
- OP50 E. coli'yi bir lizojen et suyu (LB) plakasına çizin ve 37 ° C'de gece boyunca büyüyün.
- B-suyuna tek bir OP50 kolonisi seçin (1 L DI H2O'da 10 g tripton ve 5 g NaCl) ve kültürü gece boyunca 37 ° C'de sallayın.
- Steril bir pipet kullanarak, her bir kuyucuğun ortasındaki agarın üzerine 30 μL OP50 süspansiyonu bırakın (Şekil 1).
NOT: Agar yüzeyine zarar vermediğinizden emin olun, çünkü bu solucan yuvasına yol açacaktır. - Bakteriyel bir çimin oluşmasına izin vermek için plakaları tohumlamadan sonra en az 2 gün oda sıcaklığında bekletin.
NOT: Merkez kuyucuklardaki bakteriler 2 gün sonra kurumazsa, plakaları kaputta 20 dakika açık bırakın (Şekil 1). Plakalar tahlilden 1-2 hafta önce dökülmeli ve bakterilerle tohumlanmalıdır.
2. C. elegans'ı senkronize etme (1. gün)
- Vahşi tip, unc-63 (x26), lev-10 (x17) ve unc-49 (e407) C. elegans'ı 6 cm'lik plakalarda yetişkinliğe kadar yetiştirin, gerinim başına en az sekiz plaka hazırlayın. Plakalarda açlıktan ölmeyen birçok yerçekimi yetişkini olduğunu doğrulayın.
NOT: Bu, gerekenden iki kat daha fazla plakadır; Bununla birlikte, ağartma sırasında ilk yumurta partisinin tahrip olması durumunda yedek plakalara sahip olmak önemlidir. - 750 mL DI suyunda 59.6 g Na 2 HPO 4 (dibasic), 29.9 g KH 2 PO 4 (monobazik), 12.8 g NaCl ve2.5gMgSO4'ü karıştırarak10x M9 tamponu yapın. Çözüldükten sonra, hacmi 1 L'ye kadar getirin ve sterilize edin. 1x M9 tampon oluşturmak için 1:10 ve otoklav seyreltin.
NOT: 1x M9 tampon belleği haftalar veya aylar öncesinden yapılabilir. - Senkronizasyon gününde kaputun altında ağartma çözeltisi hazırlayın. 50 mL'lik konik bir tüpte 10 mL ağartıcı (Malzeme Tablosu), 2,5 mL 10 N NaOH ve 37,5 mL DI suyu karıştırın. Ağartma solüsyonuyla çalışırken gözlük, eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin.
- Plastik bir transfer pipeti kullanarak, gravid yetişkin solucanları 1x M9 tampon ile en az dört plakadan yıkayın ve bunları 15 mL konik bir tüpe aktarın.
- Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 716 x g'de döndürün ve ardından bir transfer pipeti kullanarak süpernatantı çıkarın.
- 10 mL beyazlatma çözeltisi ekleyin. Solucan karkaslarının çoğu çözünene kadar tüpü ~ 4 dakika boyunca ters çevirin veya hafifçe sallayın (Şekil 1).
NOT: Solucanları aşırı ağartmamaya dikkat edin, çünkü bu yumurtaları yok edecektir. Bazı mutasyonlar yumurta izolasyonunun zorluğunu artırabilir. - 1 dakika boyunca 716 x g'de döndürün.
- Ağartıcı çözeltisini tek bir hareketle dökün; tüp bu noktada çalkalanmadığı sürece, yumurtalar tüpün yan tarafına yapışacaktır.
- 15 mL 1x M9 tampon ekleyin ve ters çevirin. 1 dakika boyunca 716 x g'de döndürün ve M9 tamponunu tek bir yumuşak hareketle dökün.
- Adım 2.9'da açıklandığı gibi 1x M9 tamponla toplamda üç yıkama gerçekleştirin.
- Son yıkamadan sonra, 10 mL taze 1x M9 ekleyin ve aç ilk larva (L1) evre hayvanlarının senkronize bir popülasyonunu izole etmek için 15 ° C'de gece boyunca bir rotatöre yerleştirin.
NOT: Döndürücüye yerleştirmeden önce, M9 tamponunda yumurta olduğundan emin olun. Değilse, hazırlığı yedek plakalarla tekrarlayın ve daha kısa bir süre için ağartın.
3. Kaplama senkronize C. elegans (2. gün)
- 24 kuyulu bir plaka haritası yazdırın ve rastgele yerlere gerinimler atayın. Her bir gerinim, 24 delikli plakada en az altı kez temsil edilmelidir.
- Ağartıcı hazırlığından yaklaşık 24 saat sonra, yumurtadan çıkmış aç L1 solucanlarını M9 tamponunda 716 x g'de oda sıcaklığında 1 dakika boyunca döndürün.
- ~9 mL M9 tamponunu plastik bir transfer pipeti ile çıkarın ve ardından açlıktan ölen ilk larva aşaması solucanlarını (L1'ler) kalan M9 tamponunda yavaşça karıştırın.
- Hemen M9 tamponundaki solucanların 3 μL'sini mikroskop sürgüsüne pipetin ve L1'lerin sayısını belirleyin; İstenilen sayı 3 μL'de 20-30 L1'dir. Solucan konsantrasyonu çok düşükse M9'u aşağı doğru döndürün ve çıkarın ve konsantrasyon çok yüksekse M9 ekleyin.
NOT: 3 μL başına solucan sayısını en az 2x kontrol edin ve her seferinde tüpü ters çevirin. - Pipet 3 μL L1s (toplam 20-30 solucan) önceden hazırlanmış plaka haritasına göre her bir kuyucuğun içine (adım 3.1; Şekil 1).
NOT: Solucanların dibe çökecekleri için eşit bir dağılımını korumak için tüpü M9'daki L1'lerle sık sık ters çevirin. Bu yapılmazsa, bazı kuyularda çok az solucan bulunurken, diğerlerinde çok fazla solucan olacaktır. Ayrıca, agar'ı pipet ucuyla delmeyin, çünkü bu hayvanların yuvalanmasına neden olur. - Solucanların 20 ° C'de 3 gün boyunca yetişkinliğe kadar büyümesine izin verin.
NOT: Farklı büyüme sıcaklıklarının ve belirli mutasyonların kullanılması olgunlaşma hızını etkileyebilir, bu nedenle C. elegans yaşam döngüsünü göz önünde bulundurduğunuzdan emin olun.
4. Levimalol testinin yapılması (5. gün)
- Her kuyucukta 1 saat boyunca her 5 dakikada bir hareket eden solucan sayısını kaydetmek için kullanılacak boş bir veri sayfası yazdırın.
NOT: Öğrenciler her 5 dakikada bir en fazla 12 kuyudaki solucanları sayabileceklerdir. En üstteki 12 kuyu ilk saatte, en alttaki 12 kuyu ise sonraki saatte tahlil edilir. - 24 delikli plakalardaki solucanları kontrol edin. Bir işaretleyici kullanarak, kontaminasyonu olan, açlıktan ölen veya saymayı zorlaştıracak çok fazla solucanı (>40) olan kuyucukların üzerinde plaka kapağında bir "X" yapın.
- 50 mL 1x M9'a 200 μL 100 mM levamisol stoğu ekleyerek 0,4 mM levamisol çözeltisi yapın. 240.76 mg levamisol hidroklorürü 10 mLH2O içinde çözerek 100 mM levamisol stoğu hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın.
NOT: Levamisol M9'da seyreltilmelidir; H2 O'daseyreltme felci hızlandırır. Öğrenciler eldiven giymelidir. Yüksek konsantrasyonlarda levamisol alımı toksiktir. - Bir zamanlayıcı başlatın ve daha sonra, bir transfer pipeti kullanarak, hayvanların serbestçe yüzdüğü ilk iki kuyucuğa 1 mL 0,4 mM levamisol ekleyin. Bitişik kuyulara levamisol eklemeye devam edin, zamanı test edilecek kuyu sayısına göre şaşırtın.
NOT: Örneğin, 10 kuyu tahlil edilirse, levamisol şu şekilde eklenecektir: 0 numaralı kuyu 1 ve 2 kuyusu, 1 dakika sonra 3 ve 4 numaralı kuyular, 2 dakika sonra kuyu 5 ve 6, 3 dakika sonra 7 ve 8 numaralı kuyular ve 4 dakika sonra 9 ve 10 numaralı kuyular. - 5 dakikada, ilk kuyudan başlayarak her bir kuyucuktaki yalnızca hareketli solucan sayısını manuel olarak saymaya başlayın ve bu sayıyı veri sayfasına kaydedin (Şekil 1). Sayaçlar kullanılabilir, ancak hareketli solucanların sayısını doğru bir şekilde belirlemek için gerekli değildir.
NOT: Öğrencilerin zamanlayıcıya dikkat etmeleri gerekir, çünkü birçok solucan felç olmadan önce bazen erken zaman noktalarında geride kalırlar. Zaman noktalarının sayısı ayarlanabilir veya gerekirse her zaman noktasında daha az kuyu test edilebilir. - Her kuyucuktaki hareketli solucanların sayısını 1 saat boyunca her 5 dakikada bir saymaya devam edin.
NOT: M9'a daldırma, bu 1 saatlik test boyunca sürekli yüzme hareketini indükler, bu da felci değerlendirmek için solucanların dürtülmesi ihtiyacını ortadan kaldırır (Şekil 2A). 0.4 mM levamisol çözeltisine maruz kalmak, yüzmenin kesilmesiyle gözlendiği gibi zamana bağlı felci indükler; felç eden solucanlar iyileşmez. - 4.4.-4.6 arasındaki adımları yineleyin. plakadaki kuyuların geri kalanı için.
- Tahlilin sonunda veya zaman izin verdiğinde, her bir kuyucuktaki toplam solucan sayısını kaydedin.
5. Veri analizi
- Plaka haritasını edinin (adım 3.1.) ve her bir kuyucuğa hangi gerinimin karşılık geldiğini kaydedin.
NOT: Toplanan veri miktarı nedeniyle, verilerin daha sonra analiz edilmesi ve tartışılması en az birkaç saat sürecektir. - Her bir kuyucuktaki toplam solucan sayısından başlayarak ve genotipe göre düzenleyerek verileri bir elektronik tabloya girin.
- Kuyulardan gelen verileri birleştirerek, her suş için her zaman noktasında hareket eden solucanların sayısını belirleyin.
- Bu verileri, popülasyonun zamana bağlı felcini görsel olarak görüntülemek için istatistiksel yazılımda (Malzeme Tablosu) bir "hayatta kalma eğrisi" oluşturmak için kullanın (Şekil 2B).
- Sol sütunda zamanı gösterecek ve sonraki sütunlar her gerinim için verileri içerecek şekilde bir veri tablosu oluşturun. İlk 5 dakika içinde felç olan her hayvan için bir satır oluşturun ve 5 dakika boyunca bir "1" girin. Bunu her zaman noktası için tekrarlayın. Tahlilin sonunda felç olmayan tüm hayvanlar için, 60 dakika boyunca bir "0" girin.
- İki farklı suş arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olup olmadığını belirlemek için istatistiksel yazılımdaki (Malzeme Tablosu) log-rank (Mantel-Cox) testini kullanarak ikili karşılaştırmalar yapın.
- Ek / alternatif analiz için, adım 5.3'ü gerçekleştirmek yerine. ve adım 5.4., her zaman noktasında her kuyucukta hareket eden hayvanların yüzdesini belirleyin. Bir elektronik tablo programı veya istatistiksel yazılım kullanılarak test edilen tüm suşlar için her zaman noktasında standart hata ile ortalamayı çizin (Şekil 2C).
Representative Results
AChRs ve GABA reseptörleri aracılığıyla sinyal vermek, C. elegans gövdesinin bir tarafındaki kasların kasılmasına izin verirken, diğer taraftaki kaslar gevşeyerek koordineli hareket 6,16'yı mümkün kılar. İyonotropik L-AChR'lere levamisol bağlanması, vahşi tip hayvanların zamana bağlı felce yol açan kasılmaya neden olur. Burada, vahşi tip, unc-63 L-AChR mutant, lev-10 L-AChR kümeleme mutantı ve unc-49 GABAA reseptör mutantı C. elegans'ın levamisol'a duyarlılığını değerlendirdik. L-AChR'nin alt birimlerindeki mutasyonların yanı sıra L-AChR'lerin kas plazma zarına ticareti, postsinaptik L-AChR'lerin kümelenmesi ve aşağı akış Ca 2+ sinyalizasyonu, unc-63 ve lev-10 mutantlarında gözlemlendiği gibi, levamisol kaynaklı felce 7,8,9,10,11,16,17 direncine neden olur (Şekil2B) ,C). GABA kapılı iyon kanalı UNC-49'un kaybı, kolinerjik ve GABAerjik sinyalizasyon 12'nin uygun dengesinin bozulmasına bağlı olarak levamisol aşırı duyarlılığına neden olmuştur (Şekil2B, C). Bu tahlil yakın zamanda lisans öğrencileri tarafından ileri bir genetik laboratuvarında yapıldığında, öğrencilerin% 100'ü unc-63 ve lev-10 mutantları ile levamisol direnci gözlemlerken,% 88'i unc-49 mutantı ile levamisol aşırı duyarlılığı gözlemlemiştir. Sıvı levamisol yüzme testi ile toplanan bu veriler, geleneksel plaka bazlı levamisol tahlilleri 7,8,11,12,13'te gözlenen fenotiplerle tutarlıdır.
Şekil 1: Levamizol tahlilinin hazırlanması ve uygulanmasının şeması. 24 delikli NGM plakaları dökülür; 2 gün sonra, OP50 Escherichia coli kuyucuklara ekilir. C. elegans , çamaşır suyu hazırlığı ve test edilecek her suş için ilk larva aşaması (L1) hayvanları (vahşi tip, siyah; unc-63(x26), macenta; lev-10(x17), yeşil; unc-49(e407), mavi) ertesi gün önceden belirlenmiş bir plaka haritasına göre kuyucuklara pipetlenir. 20 ºC'de 3 günlük büyümeden sonra veya hayvanlar yetişkinliğe ulaştığında, her bir kuyucuğa M9 tamponunda 0,4 mM levamisol eklenir ve hareketli hayvanların sayısı 1 saat boyunca her 5 dakikada bir sayılır.
Şekil 2: Vahşi tipte levamisol kaynaklı felç ve temsili mutant C. elegans. (A) 0,4 mM levamisolün maruz kalması zamana bağlı felce neden olur; bu, 1 saat boyunca 1x M9 tamponunda yüzen hayvanlar için gözlenmez. (B) Levamizol yüzme testinde vahşi tip (siyah), unc-63 (x26 ) (macenta), lev-10 (x17 ) (yeşil) ve unc-49 (e407) ( mavi) hayvanların zamana bağlı felci. L-AChR alt birimi UNC-63 veya L-AChR kümeleme proteini LEV-10'un kaybı levamisol direncine neden oldu ve GABAA reseptörü UNC-49'un kaybı levamisol aşırı duyarlılığına neden oldu. n ≥ genotip başına 50, p < bu temsili deneydeki vahşi tipe kıyasla tüm mutantlar için 0.0001. (C) Panel (B)'deki verilerin aynısı kullanılarak, her bir zaman noktasında hareket eden hayvanların yüzdesi (SE'± her kuyu için yüzdelerin ortalaması) her bir suş için belirlenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Levamizol'e verilen değişmiş yanıt, postsinaptik kolinerjik sinyalizasyon ve kas fonksiyonu için gerekli genleri tanımlayabilir. Buradaki protokol, zamana bağlı felci 1 saatlik bir süre boyunca ölçmek için kullanılan bir sıvı levamisol testini tanımlamaktadır. Öğrenciler belirli genetik mutasyonların etkileri hakkında tahminlerde bulunurlar, büyük örneklem büyüklüğünde bir deney yaparlar ve daha sonra sonuçlarını ölçerler. Bu tahlil, levamisol kaynaklı felci hayvanları toplamadan veya üretmeden ölçmenin basit ve etkili bir yoludur, bu da onu lisans laboratuvarları ve nöromüsküler iletimi inceleyen araştırmacılar için uygun hale getirir. Burada tartışılanlar, en yaygın tuzaklardan bazıları, tahlilin sınırlamaları ve RNAi nakavt hayvanlarıyla kullanımını sağlayan protokoldeki bir varyasyondur; Ayrıca burada bu tahlilin ders tabanlı bir lisans araştırma deneyimine nasıl yerleştirilebileceği de tartışılmaktadır.
24 delikli plakaların uygun şekilde hazırlanması esastır. İlk olarak, kuyucuklarda L1 hayvanlarını tespit etmeden önce bakteriyel çimler tamamen kuru olmalıdır. Yeterince kurutulmazsa, bakteriler tahlil sırasında levamisol çözeltisi ile karışır, sıvıyı bulanıklaştırır ve bireylerin solucanları saymasını önler. İkincisi, solucanları ağartıcı hazırlığı ile senkronize ederken, hayvanlar ağartıcı çözeltisine çok uzun süre maruz bırakılmamalıdır, çünkü bu yumurtaların üzerindeki koruyucu kaplamanın parçalanmasına neden olacaktır. Üçüncüsü, kuyu başına sadece 20-30 L1 tespit etmek çok önemlidir, çünkü kuyulardaki çok fazla solucan, ayrılan sürede hareket eden sayıyı doğru bir şekilde saymayı son derece zorlaştırır. Son olarak, plakaların hazırlanması sırasında aseptik bir tekniğin sürdürülmesi önemlidir, çünkü kirlenmiş kuyular test edilemez.
Bu tahlili yaparken göz önünde bulundurulması gereken birkaç sınırlama vardır. İlk olarak, her 5 dakikada bir her kuyucuktaki hareketli solucanların sayısını saymak, daha önce laboratuvar deneyimine sahip olmayan bireyler için çok zor olabilir ve bu da kesin olmayan veri toplamaya yol açabilir. İlaç duyarlılığını belirlemek için kullanılan diğer tahlillere gelince 18,19, bu deney daha az zaman noktası ile gerçekleştirilebilir. İkincisi, bir ağartıcı hazırlığından izole edilen aç L1'lerin kaplanması, senkronize bir popülasyon elde etmek için kolay bir yöntemdir; Bununla birlikte, gelişimsel zamanlama test edilen suşlar arasında farklılık gösteriyorsa ayarlamalar yapılmalıdır. Bu tahlil için dördüncü larva evre hayvanlarını (L4'ler) 24 kuyucuklu bir plakaya seçmek mümkündür; ancak, birçok plaka hazırlarken, bu çok emek yoğundur. Alternatif olarak, her bir suşun L4'e ulaşması için gereken süreyi belirlemeli ve daha sonra olgunlaşma hızındaki farklılıkları ayarlamak için L1'leri farklı zamanlarda kuyucuklara yerleştirmelidir. Son olarak, bu tahlil postsinaptik kas fonksiyonu11 için önemli olan yeni genleri tanımlamak için kullanılabilirken, değişmiş levamisol yanıt, presinaptik genlerin mutasyonu veya RNAi nakavtından da kaynaklanabilir12. Değişmiş levamisol duyarlılığı gözlenirse, bu fenotipin nedenini belirlemek için ek deneyler yapılmalıdır.
24 kuyucuklu plakalarda birkaç değişiklik yaparak, tarif edilen levamisol yüzme testi, RNAi nakavt hayvanlarında da yapılabilir11. RNAi yoluyla gen nakavtı, ilgilenilen gene karşılık gelen çift sarmallı RNA'yı eksprese eden C. elegans bakterilerinin beslenmesiyle sağlanabilir20. RNAi plakalarının hazırlanması için, otoklavdan çıkarıldıktan sonra bir litre ortam başına 1 mL 1M IPTG ve 1 mL 25 mg / mL karbenikilin eklenmelidir. Bakteri kültürleri, tek bir koloninin 3 mL LB suyu artı 3 μL 25 mg / mLkarbenisilin içine toplanması ve gece boyunca 37 ° C'de çalkalanması ile yetiştirilir ve kuyucuklarda farklı bakteriler tespit edildiğinde plaka haritası yapılır. C. elegans , tarif edildiği gibi ağartıcı hazırlığı ile senkronize edilir; Bununla birlikte, RNAi aşırı duyarlı eri-1 (mg366) suşu, gen nakavtını arttırmak için vahşi tip yerine kullanılmalıdır. RNAi nakavtları, fonksiyon kaybı mutantları için gözlenen aynı levamisol fenotiplerine neden olur11.
Burada sunulan protokol, laboratuvar araştırmalarında, lisans laboratuvarında bağımsız bir deney olarak veya temel C. elegans tekniklerine ve nöromüsküler fonksiyona giriş olarak ileri bir lisans dersinin açılış haftalarında kullanılabilir. Daha gelişmiş bir keşif temelli derste, öğrenciler bu testi, miyastenik sendromları, kas distrofileri veya miyopatileri olan bireylerde mutasyona uğramış genlerin C. elegans homologlarının kaybının levamisol duyarlılığını değiştirip değiştirmediğini belirlemek için kullanabilirler. Sonuç olarak, bu basit, ucuz levamisol duyarlılık testi, NMJ'de sinyalizasyon hakkında bilgi edinmek ve C. elegans model sistemi ile çalışma deneyimi kazanmak için uygulamalı bir yaklaşım sunmaktadır.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Delaware Üniversitesi'ndeki BISC413 İleri Genetik Laboratuvarı'nda (Bahar 2022) genotipe kör Şekil 2B, C'deki verileri toplayan Riya Dattani ve Lauren Hogstrom'a teşekkür ederiz. BISC413 ders tabanlı lisans araştırma deneyimi (CURE) hakkında ek bilgi ve J. Tanis tarafından tasarlanan laboratuvar el kitabına erişim talep üzerine mevcuttur. Nematod suşları, NIH-ORIP (P40 OD010440) tarafından desteklenen Caenorhabditis Genetik Merkezi tarafından sağlanmıştır. Bu çalışma P20 GM103446 Delaware INBRE Mentored CURE Ödülü (J.E.T.'ye) ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm non-vented, sharp edge Petri Dishes | TriTech Research | Cat #: T3308 | |
| BD Difco Bacto Agar | Fisher Scientific | Cat#: DF0140-01-0 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Fisher Scientific | Cat#:12-556-006 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP510-500 | |
| Cholesterol | MP Biomedicals | Cat#: 02101382-CF | |
| eri-1(mg366) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | GR1373 | |
| Gibco Bacto Peptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0118-17-0 | |
| Gibco Bacto Tryptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0123-17-3 | |
| GraphPad Prism (Statistical software) | GraphPad Software, Inc. | ||
| lev-10(x17) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ17 | |
| Levamisole hydrochloride | Fisher Scientific | Cat#: AC187870100 | |
| Low Splash Regular Bleach - 121oz - up & up | Target | Search target.com | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP213-1 | |
| Microsoft Excel | Microsoft, Inc | ||
| N2 wild type | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Bristol N2 | |
| OP50 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP363-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | Cat#: BP362-500 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | Cat#: BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide 10N | Fisher Scientific | Cat#: SS255-1 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP332-1 | |
| unc-49(e407) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB407 | |
| unc-63(x26) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ26 |
References
- Engel, A. G., Shen, X. M., Selcen, D., Sine, S. M. Congenital myasthenic syndromes: Pathogenesis, diagnosis, and treatment. The Lancet Neurology. 14 (4), 420-434 (2015).
- Mahjneh, I., Lochmüller, H., Muntoni, F., Abicht, A. DOK7 limb-girdle myasthenic syndrome mimicking congenital muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 23 (1), 36-42 (2013).
- Rodríguez Cruz, P. M., et al. Congenital myopathies with secondary neuromuscular transmission defects; A case report and review of the literature. Neuromuscular Disorders. 24 (12), 1103-1110 (2014).
- Montagnese, F., et al. Two patients with GMPPB mutation: The overlapping phenotypes of limb-girdle myasthenic syndrome and limb-girdle muscular dystrophy dystroglycanopathy. Muscle and Nerve. 56 (2), 334-340 (2017).
- Gieseler, K., Qadota, H., Benian, G. M. Development, structure, and maintenance of C. elegans body wall muscle. WormBook. , 1-59 (2017).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 2 (9), 791-797 (1999).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
- Gally, C., Eimer, S., Richmond, J. E., Bessereau, J. L. A transmembrane protein required for acetylcholine receptor clustering in Caenorhabditis elegans. Nature. 431 (7008), 578-582 (2004).
- Eimer, S., et al. Regulation of nicotinic receptor trafficking by the transmembrane Golgi protein UNC-50. The EMBO Journal. 26 (20), 4313-4323 (2007).
- Gendrel, M., Rapti, G., Richmond, J. E., Bessereau, J. L. A secreted complement-control-related protein ensures acetylcholine receptor clustering. Nature. 461 (7266), 992-996 (2009).
- Chaya, T., et al. A C. elegans genome-wide RNAi screen for altered levamisole sensitivity identifies genes required for muscle function. G3: Genes, Genomes, Genetics. 11 (4), 047 (2021).
- Vashlishan, A. B., et al. An RNAi screen identifies genes that regulate GABA synapses. Neuron. 58 (3), 346-361 (2008).
- Krajacic, P., Pistilli, E. E., Tanis, J. E., Khurana, T. S., Lamitina, S. T. FER-1/Dysferlin promotes cholinergic signaling at the neuromuscular junction in C. elegans and mice. Biology Open. 2 (11), 1245-1252 (2013).
- Gottschalk, A., et al. Identification and characterization of novel nicotinic receptor-associated proteins in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 24 (14), 2566-2578 (2005).
- Loria, P. M., Hodgkin, J., Hobert, O. A conserved postsynaptic transmembrane protein affecting neuromuscular signaling in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 24 (9), 2191-2201 (2004).
- Treinin, M., Jin, Y. Cholinergic transmission in C. elegans: Functions, diversity, and maturation of ACh-activated ion channels. Journal of Neurochemistry. 158 (6), 1274-1291 (2021).
- Rapti, G., Richmond, J., Bessereau, J. L. A single immunoglobulin-domain protein required for clustering acetylcholine receptors in C. elegans. The EMBO Journal. 30 (4), 706-718 (2011).
- Kim, S., Sieburth, D. A receptor tyrosine kinase network regulates neuromuscular function in response to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (4), 1283-1295 (2019).
- Oh, K., Kim, H. Aldicarb-induced paralysis assay to determine defects in synaptic transmission in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 7 (14), 2400 (2017).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
