Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt einen Assay zur Bestimmung des Ansprechens auf Levamisol, einen pharmakologischen Agonisten einer Klasse von Caenorhabditis elegans-Acetylcholinrezeptoren. In diesem flüssigen Levamisol-Schwimmassay beobachten und quantifizieren Forscher visuell die zeitabhängige Lähmung von Tieren, die in 24-Well-Platten kultiviert werden.
Abstract
An der neuromuskulären Verbindung (NMJ) führt die Bindung des exzitatorischen Neurotransmitters Acetylcholin (ACh) an postsynaptische Rezeptoren zur Muskelkontraktion. Wie bei der Skelettmuskulatur von Wirbeltieren ist für die Fortbewegung eine cholinerge Signalübertragung in der Körperwandmuskulatur des Modellorganismus Caenorhabditis elegans erforderlich. Die Exposition gegenüber Levamisol, einem pharmakologischen Agonisten einer Klasse von ACh-Rezeptoren auf den Körperwandmuskeln, verursacht eine zeitabhängige Lähmung von Wildtyp-Tieren. Eine veränderte Empfindlichkeit gegenüber Levamisol deutet auf Defekte in der Signalübertragung am NMJ oder in der Muskelfunktion hin. Hier wird ein Protokoll für einen flüssigen Levamisol-Assay vorgestellt, der an C. elegans durchgeführt wurde, die in 24-Well-Platten gezüchtet wurden. Das kräftige Schwimmen der Tiere in Flüssigkeit ermöglicht die Beurteilung und Quantifizierung der Levamisol-induzierten Lähmung bei Hunderten von Würmern über einen Zeitraum von einer Stunde, ohne dass eine körperliche Manipulation erforderlich ist. Dieses Verfahren kann sowohl bei Wildtyps als auch bei Mutanten mit veränderter Empfindlichkeit gegenüber Levamisol angewendet werden, um die funktionellen Konsequenzen einer veränderten Signalübertragung am NMJ zu demonstrieren.
Introduction
Die Aktivierung von postsynaptischen Acetylcholinrezeptoren (AChRs) auf der Skelettmuskulatur führt zu einem elektrischen Signal, das zur Muskelkontraktion führt. Eine Störung der neuromuskulären Funktion führt beim Menschen zu myasthenischen Syndromen und Muskeldystrophien 1,2,3,4. Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans wurde ausgiebig verwendet, um über evolutionär konservierte grundlegende biologische Prozesse und Mechanismen von Krankheiten zu lernen. Die Skelettmuskulatur von Wirbeltieren und die Körperwandmuskulatur von C. elegans sind bei der Kontrolle der Fortbewegung funktionell gleichwertig5. Hier wird ein einfacher Assay vorgestellt, mit dem Wildtyp C. elegans mit Mutanten verglichen werden kann, die eine veränderte neuromuskuläre Signalübertragung oder Muskelfunktion aufweisen.
Erregende und hemmende Inputs, die von cholinergen bzw. GABAergen Motoneuronen empfangen werden, bewirken, dass sich die Muskeln auf einer Seite des Körpers von C. elegans zusammenziehen, während sich die Muskeln auf der anderen Seite entspannen, was eine koordinierte Fortbewegung ermöglicht6. Levamisol, ein Anthelminthikum zur Behandlung parasitärer Nematodeninfektionen, bindet an eine Klasse von AChRs an den Körperwandmuskeln und aktiviert diese konstitutiv, was zu einer zeitabhängigen Lähmung führt7. So kann eine veränderte Empfindlichkeit gegenüber Levamisol verwendet werden, um C. elegans mit Defekten im Gleichgewicht der exzitatorischen und inhibitorischen Signalübertragung 7,8,9,10,11,12,13,14,15 zu identifizieren. Zum Beispiel beeinflussen Mutationen in Untereinheiten des Levamisol-sensitiven AChR (L-AChR), wie UNC-63, sowie des C. elegans-Homologs von Cubilin, LEV-10, das für das L-AChR-Clustering an der Synapse erforderlich ist, die exzitatorische Signalisierung und führen zu einer Levamisolresistenz 7,8. Mutationen imGABA-A-Rezeptor UNC-49 reduzieren die hemmende Signalübertragung und verursachen eine Überempfindlichkeit gegen Levamisol-12.
Überempfindlichkeit oder Resistenz gegen Levamisol wurde traditionell beurteilt, indem Tiere auf Agarplatten übertragen wurden, die Levamisol enthielten, und dann die Würmer regelmäßig angestossen wurden, um den Zeitpunkt zu bestimmen, zu dem die Lähmung auftritt13,14,15. Wir haben einen flüssigen Levamisol-Schwimmtest entwickelt, der die Notwendigkeit einer physischen Manipulation der Tiere eliminiert und das Screening von Hunderten von Tieren in nur 1 Stunde ermöglicht. Hier wird die Verwendung dieses Assays mit Wildtyp-, unc-63(x26), lev-10(x17)- und unc-49(e407)-Tieren beschrieben. Dieses Protokoll kann jedoch auch an C. elegans durchgeführt werden, die RNAi ausgesetzt waren, wie es getan wurde, um Knockdowns zu validieren, die in einem genomweiten RNAi-Screening auf veränderte Levamisol-Sensitivität identifiziert wurden11.
Für diesen pharmakologischen Test wurden Würmer in 24-Well-Platten bis zum Erwachsenenalter gezüchtet, 0,4 mM Levamisol in M9-Puffer wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt, und die Anzahl der sich bewegenden Tiere wurde alle 5 Minuten für 1 h aufgezeichnet. Levamisol-induzierte Lähmungen wurden im Laufe der Zeit visuell beobachtet, und nach Abschluss des Assays wurden die Daten quantifiziert. Die Bewertung von Mutanten zusammen mit Wildtyp C. elegans ermöglicht es den Schülern, zunächst Vorhersagen über mögliche phänotypische Effekte zu treffen und dann Experimente durchzuführen, um ihre Hypothesen zu testen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser einfache, kostengünstige, flüssige Levamisol-Assay ein idealer Weg ist, um die Auswirkungen des Verlusts spezifischer Gene auf die NMJ-Funktion zu demonstrieren.
Protocol
1. Vorbereitung der Platten für den Levamisol-Test
- Nematodenwachstumsmedium (NGM) werden hergestellt, indem 3 g NaCl, 2,5 g Pepton und 17 g Agar mit 1 l entionisiertem (DI) Wasser in einem Kolben mit einem Rührbalken kombiniert werden.
- Nach dem Autoklavieren die Medien auf eine auf 70 °C eingestellte Heizplatte legen und 1 h lang mit mäßiger Geschwindigkeit umrühren.
- Geben Sie 1 ml 5 mg / ml Cholesterin tropfenweise, um Ausfällungen zu verhindern, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 MMgSO4 und 25 ml 1 M pH 6,0 Kaliumphosphatpuffer in das Medium.
- 2 ml NGM-Medien werden mit einer sterilen serologischen Pipette in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte überführt (Abbildung 1).
- Lassen Sie die Platten 2 Tage auf dem Tisch trocknen, bevor Sie sie mit Bakterien aussäen. Für eine längerfristige Lagerung stellen Sie sie auf 4 °C.
- Streifen Sie OP50 E. coli auf einer Lysogeny-Brühe (LB) -Platte aus und wachsen Sie über Nacht bei 37 ° C.
- Eine einzelne OP50-Kolonie in B-Brühe (10 g Trypton und 5 g NaCl in 1 L DIH2O) pflücken und die Kultur über Nacht auf 37 °C schütteln.
- Tropfen Sie mit einer sterilen Pipette 30 μL OP50-Suspension auf den Agar in der Mitte jeder Vertiefung (Abbildung 1).
HINWEIS: Achten Sie darauf, die Agaroberfläche nicht zu beschädigen, da dies zum Eingraben von Würmern führt. - Lassen Sie die Platten nach der Aussaat mindestens 2 Tage bei Raumtemperatur stehen, damit sich ein Bakterienrasen bilden kann.
HINWEIS: Wenn die Bakterien in den Mittelmulden nach 2 Tagen nicht trocken sind, lassen Sie die Platten 20 Minuten lang in der Haube offen (Abbildung 1). Die Platten sollten 1-2 Wochen vor dem Test gegossen und mit Bakterien besät werden.
2. Synchronisation von C. elegans (Tag 1)
- Züchten Sie Wildtyp, unc-63 (x26), lev-10 (x17) und unc-49 (e407) C. elegans bis zum Erwachsenenalter auf 6 cm Platten und bereiten Sie mindestens acht Platten pro Stamm vor. Bestätigen Sie, dass es viele nicht verhungerte Gravid-Erwachsene auf den Tellern gibt.
HINWEIS: Dies sind doppelt so viele Platten wie benötigt; Es ist jedoch wichtig, Backup-Platten zu haben, falls die erste Charge Eier während des Bleichens zerstört wird. - Machen Sie 10x M9-Puffer, indem Sie 59,6 g Na2HPO4(dibasisch), 29,9 gKH2PO4(einbasisch), 12,8 g NaCl und 2,5 gMgSO4 in 750 ml DI-Wasser unter Rühren auflösen. Nach dem Auflösen das Volumen auf 1 L erhöhen und filtern. 1:10 verdünnen und autoklavieren, um 1x M9-Puffer herzustellen.
HINWEIS: Der 1x M9-Puffer kann Wochen oder Monate im Voraus hergestellt werden. - Bereiten Sie die Bleichlösung am Tag der Synchronisierung unter der Haube vor. Mischen Sie 10 mL Bleichmittel (Table of Materials), 2,5 mL 10 N NaOH und 37,5 mL DI-Wasser in einem 50 mL konischen Röhrchen. Tragen Sie eine Schutzbrille, Handschuhe und einen Laborkittel, wenn Sie mit der Bleichlösung arbeiten.
- Mit einer Kunststoff-Transferpipette gravide adulte Würmer von mindestens vier Platten mit 1x M9-Puffer waschen und in ein 15 ml konisches Röhrchen überführen.
- Bei 716 x g 1 min bei Raumtemperatur schleudern und dann den Überstand mit einer Transferpipette entfernen.
- Fügen Sie 10 ml der Bleichlösung hinzu. Drehen oder schütteln Sie das Röhrchen vorsichtig für ~4 Minuten, bis sich die meisten, aber nicht alle Wurmkadaver aufgelöst haben (Abbildung 1).
HINWEIS: Achten Sie darauf, die Würmer nicht zu bleichen, da dies die Eier zerstört. Bestimmte Mutationen können die Schwierigkeit der Eiisolierung erhöhen. - Drehen Sie mit 716 x g für 1 min.
- Gießen Sie die Bleichlösung in einer Bewegung ab; Solange die Röhre an dieser Stelle nicht geschüttelt wird, bleiben die Eier an der Seite der Röhre haften.
- 15 mL 1x M9-Puffer hinzufügen und umkehren. Drehen Sie mit 716 x g für 1 Minute und gießen Sie den M9-Puffer in einer sanften Bewegung ab.
- Führen Sie insgesamt drei Waschgänge mit 1x M9-Puffer durch, wie in Schritt 2.9 beschrieben.
- Nach dem letzten Waschgang 10 ml frisches 1x M9 hinzufügen und über Nacht bei 15 °C auf einen Rotator legen, um eine synchronisierte Population ausgehungerter Tiere im ersten Larvenstadium (L1) zu isolieren.
HINWEIS: Überprüfen Sie vor dem Aufsetzen des Rotators, ob sich Eier im M9-Puffer befinden. Wenn nicht, wiederholen Sie die Vorbereitung mit Backup-Platten und Bleichmittel für eine kürzere Zeit.
3. Beschichtung synchronisierter C. elegans (Tag 2)
- Drucken Sie eine 24-Well-Plattenkarte aus und weisen Sie Dehnungen zufälligen Stellen zu. Jeder Stamm sollte mindestens sechsmal in der 24-Well-Platte dargestellt werden.
- Etwa 24 h nach der Bleichmittelvorbereitung geschlüpfte ausgehungerte L1-Würmer im M9-Puffer bei 716 x g für 1 min bei Raumtemperatur herunterdrehen.
- Entfernen Sie ~ 9 ml M9-Puffer mit einer Kunststofftransferpipette und mischen Sie dann vorsichtig die ausgehungerten Würmer im ersten Larvenstadium (L1s) in den verbleibenden M9-Puffer.
- Sofort werden 3 μL der Würmer im M9-Puffer auf einen Objektträger pipettiert und die Anzahl der L1s bestimmt; Die gewünschte Anzahl beträgt 20-30 L1s in 3 μL. Drehen Sie M9 herunter und entfernen Sie es, wenn die Wurmkonzentration zu niedrig ist, und fügen Sie M9 hinzu, wenn die Konzentration zu hoch ist.
HINWEIS: Überprüfen Sie die Anzahl der Würmer pro 3 μL mindestens 2x, indem Sie die Röhre jedes Mal umdrehen. - Pipet 3 μL L1s (insgesamt 20-30 Würmer) in jede Vertiefung gemäß der vorgefertigten Plattenkarte (Schritt 3.1; Abbildung 1).
HINWEIS: Drehen Sie das Rohr häufig mit den L1s in M9 um, um eine gleichmäßige Verteilung der Würmer aufrechtzuerhalten, da sie sich am Boden absetzen. Wenn dies nicht getan wird, haben einige Brunnen zu wenige Würmer, während andere zu viele haben. Durchstechen Sie den Agar auch nicht mit der Pipetenspitze, da dies dazu führt, dass sich die Tiere eingraben. - Lassen Sie die Würmer 3 Tage bei 20 °C erwachsen werden.
HINWEIS: Die Verwendung unterschiedlicher Wachstumstemperaturen und bestimmter Mutationen kann die Reifungsgeschwindigkeit beeinflussen, also achten Sie darauf, den Lebenszyklus von C. elegans zu berücksichtigen.
4. Durchführung des Levamisol-Tests (Tag 5)
- Drucken Sie ein leeres Datenblatt, mit dem die Anzahl der Würmer, die sich alle 5 Minuten für 1 h in jedem Bohrloch bewegen, aufgezeichnet wird.
HINWEIS: Die Schüler können die Würmer in höchstens 12 Brunnen alle 5 Minuten zählen. Die ersten 12 Bohrlöcher werden in der ersten Stunde untersucht, die unteren 12 Bohrlöcher in der folgenden Stunde. - Überprüfen Sie die Würmer in den 24-Well-Platten. Machen Sie mit einem Marker ein "X" auf dem Plattendeckel über alle Brunnen, die kontaminiert sind, verhungert sind oder zu viele Würmer haben (>40), was das Zählen erschwert.
- Stellen Sie 0,4 mM Levamisollösung her, indem Sie 200 μL 100 mM Levamisolschaft zu 50 ml 1x M9 hinzufügen. 100 mM Levamisolvorrat durch Auflösen von 240,76 mg Levamisolhydrochlorid in 10 mlH2Ound Lagerung bei −20 °C vorbereiten.
HINWEIS: Levamisol muss in M9 verdünnt werden; Die Verdünnung inH2Obeschleunigt die Lähmung. Die Schüler sollten Handschuhe tragen. Die Einnahme hoher Konzentrationen von Levamisol ist toxisch. - Starten Sie einen Timer und geben Sie dann mit einer Transferpipette 1 ml 0,4 mM Levamisol in die ersten beiden Vertiefungen, so dass die Tiere frei schwimmen können. Fügen Sie den benachbarten Bohrlöchern weiterhin Levamisol hinzu und staffeln Sie die Zeit entsprechend der Anzahl der zu untersuchenden Bohrlöcher.
HINWEIS: Wenn beispielsweise 10 Bohrlöcher untersucht werden, wird Levamisol auf folgende Weise hinzugefügt: Vertiefungen 1 und 2 zum Zeitpunkt 0, Vertiefungen 3 und 4 nach 1 Minute, Vertiefungen 5 und 6 nach 2 Minuten, Vertiefungen 7 und 8 nach 3 Minuten und Vertiefungen 9 und 10 nach 4 Minuten. - Beginnen Sie nach 5 Minuten damit, manuell nur die Anzahl der sich bewegenden Würmer in jedem Bohrloch zu zählen, beginnend mit dem ersten Bohrloch, und notieren Sie diese Zahl im Datenblatt (Abbildung 1). Zähler können verwendet werden, sind aber nicht erforderlich, um die Anzahl der sich bewegenden Würmer genau zu bestimmen.
HINWEIS: Die Schüler müssen den Timer im Auge behalten, da sie manchmal in frühen Zeiten in Rückstand geraten, bevor viele Würmer lähmen. Die Anzahl der Zeitpunkte kann angepasst werden, oder bei Bedarf können zu jedem Zeitpunkt weniger Bohrlöcher untersucht werden. - Zählen Sie weiterhin die Anzahl der sich bewegenden Würmer in jedem Brunnen alle 5 Minuten für 1 h.
HINWEIS: Das Eintauchen in M9 induziert während dieses 1-stündigen Assays eine konstante Schwimmbewegung, wodurch das Anstoßen der Würmer zur Beurteilung der Lähmung entfällt (Abbildung 2A). Die Exposition gegenüber 0,4 mM Levamisollösung induziert eine zeitabhängige Lähmung, wie sie durch Aufhören des Schwimmens beobachtet wird; Lähmende Würmer erholen sich nicht. - Wiederholen Sie die Schritte 4.4.-4.6. für den Rest der Vertiefungen in der Platte.
- Am Ende der Untersuchung oder wenn es die Zeit erlaubt, ist die Gesamtzahl der Würmer in jedem Bohrloch aufzuzeichnen.
5. Datenanalyse
- Ermitteln Sie die Plattenkarte (Schritt 3.1) und notieren Sie, welche Dehnung jeder Vertiefung entspricht.
HINWEIS: Aufgrund der Menge der gesammelten Daten dauert die anschließende Analyse und Diskussion der Daten mindestens einige Stunden. - Geben Sie die Daten in eine Tabelle ein, beginnend mit der Gesamtzahl der Würmer in jedem Bohrloch und organisieren Sie nach Genotyp.
- Bestimmen Sie durch die Kombination von Daten aus den Bohrlöchern die Anzahl der Würmer, die sich zu jedem Zeitpunkt für jeden Stamm bewegen.
- Verwenden Sie diese Daten, um eine "Überlebenskurve" in der statistischen Software (Table of Materials) zu erstellen, um die zeitabhängige Lähmung der Bevölkerung visuell darzustellen (Abbildung 2B).
- Erstellen Sie eine Datentabelle so, dass die linke Spalte die Zeit angibt und nachfolgende Spalten die Daten für jede Dehnung enthalten. Erstellen Sie für jedes Tier, das innerhalb der ersten 5 Minuten gelähmt ist, eine Reihe und geben Sie eine "1" für 5 Minuten ein. Wiederholen Sie dies für jeden Zeitpunkt. Für alle Tiere, die am Ende des Tests nicht gelähmt sind, geben Sie eine "0" für 60 min ein.
- Führen Sie paarweise Vergleiche mit dem Log-Rank-Test (Mantel-Cox) in der statistischen Software (Table of Materials) durch, um festzustellen, ob ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen zwei verschiedenen Stämmen besteht.
- Für zusätzliche/alternative Analysen, anstatt Schritt 5.3 auszuführen. und Schritt 5.4., bestimmen Sie den Prozentsatz der Tiere, die sich zu jedem Zeitpunkt in jedem Brunnen bewegen. Zeichnen Sie den Mittelwert mit Standardfehler zu jedem Zeitpunkt für alle Stämme, die mit einem Tabellenkalkulationsprogramm oder der Statistiksoftware untersucht wurden (Abbildung 2C).
Representative Results
Die Signalübertragung durch AChR- und GABA-Rezeptoren ermöglicht es den Muskeln auf der einen Seite des C. elegans-Körpers, sich zusammenzuziehen, während sich die Muskeln auf der anderen Seite entspannen, was eine koordinierte Fortbewegung ermöglicht 6,16. Die Bindung von Levamisol an ionotrope L-AChRs verursacht eine Kontraktion, die zu einer zeitabhängigen Lähmung von Wildtyp-Tieren führt. Hier bewerteten wir die Sensitivität des Wildtyps, der unc-63 L-AChR-Mutante, der Lev-10 L-AChR-Clustering-Mutante und der unc-49 GABA-A-Rezeptormutante C. elegans gegenüber Levamisol. Mutationen in Untereinheiten des L-AChR sowie in Genen, die für den Transport von L-AChR zur Muskelplasmamembran, die Häufung postsynaptischer L-AChRs und die nachgeschaltete Ca 2+-Signalisierung erforderlich sind, verursachen eine Resistenz gegen Levamisol-induzierte Lähmung 7,8,9,10,11,16,17, wie sie bei den unc-63- und lev-10-Mutanten beobachtet wurde (Abbildung2B) ,C). Der Verlust des GABA-gesteuerten Ionenkanals UNC-49 verursachte Levamisol-Überempfindlichkeit (Abbildung 2B,C) aufgrund einer Störung des richtigen Gleichgewichts von cholinergen und GABAergen Signalen12. Als dieser Test kürzlich von Studenten in einem fortgeschrittenen Genetiklabor durchgeführt wurde, beobachteten 100% der Studenten Levamisolresistenz mit den unc-63- und Lev-10-Mutanten, während 88% Levamisol-Überempfindlichkeit mit der unc-49-Mutante beobachteten. Diese mit dem flüssigen Levamisol-Schwimmtest gesammelten Daten stimmen mit den Phänotypen überein, die in den traditionellen plattenbasierten Levamisol-Assays 7,8,11,12,13 beobachtet wurden.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Vorbereitung und Durchführung des Levamisol-Assays. 24-Well-NGM-Platten werden gegossen; 2 Tage später wird OP50 Escherichia coli in die Vertiefungen ausgesät. C. elegans werden durch Bleichmittelvorbereitung synchronisiert, und Tiere im ersten Larvenstadium (L1) für jeden zu untersuchenden Stamm (Wildtyp, schwarz; UNC-63(x26), Magenta; Lev-10(x17), grün; UNC-49(E407), blau) werden am nächsten Tag nach einer vorgegebenen Plattenkarte in die Vertiefungen pipettiert. Nach 3 Tagen Wachstum bei 20 ºC oder wenn die Tiere das Erwachsenenalter erreichen, werden 0,4 mM Levamisol in M9-Puffer zu jeder Vertiefung hinzugefügt, und die Anzahl der sich bewegenden Tiere wird alle 5 Minuten für 1 h gezählt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Levamisol-induzierte Lähmung bei Wildtyp- und repräsentativer Mutante C. elegans. (A) Die Exposition gegenüber 0,4 mM Levamisol verursacht eine zeitabhängige Lähmung; Dies wird nicht bei Tieren beobachtet, die 1 h lang in 1x M9-Puffer schwimmen. (B) Zeitabhängige Lähmung von Wildtyp-Tieren (schwarz), UNC-63(x26) (Magenta), Lev-10(x17) (grün) und UNC-49(E407) (blau) im Levamisol-Schwimmassay. Der Verlust der L-AChR-Untereinheit UNC-63 oder des L-AChR-Clustering-Proteins LEV-10 führte zu einer Levamisolresistenz und der Verlust des GABA-A-Rezeptors UNC-49 verursachte Levamisol-Überempfindlichkeit. n ≥ 50 pro Genotyp, p < 0,0001 für alle Mutanten im Vergleich zum Wildtyp in diesem repräsentativen Experiment. (C) Unter Verwendung derselben Daten wie in Panel (B) wurde der Prozentsatz der sich bewegenden Tiere zu jedem Zeitpunkt (Durchschnitt der Prozentsätze für jede Bohrung ± SE) für jeden Stamm bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Discussion
Eine veränderte Reaktion auf Levamisol kann Gene identifizieren, die für die postsynaptische cholinerge Signalübertragung und Muskelfunktion erforderlich sind. Das vorliegende Protokoll beschreibt einen flüssigen Levamisol-Assay, der zur Quantifizierung einer zeitabhängigen Lähmung über einen Zeitraum von 1 h verwendet wird. Die Schüler treffen Vorhersagen über die Auswirkungen bestimmter genetischer Mutationen, führen ein Experiment mit großer Stichprobengröße durch und quantifizieren dann ihre Ergebnisse. Dieser Assay ist eine einfache, effiziente Möglichkeit, Levamisol-induzierte Lähmungen zu quantifizieren, ohne Tiere zu pflücken oder anzustoßen, wodurch er für Bachelor-Laboratorien sowie für Forscher, die die neuromuskuläre Übertragung untersuchen, geeignet ist. Hier werden einige der häufigsten Fallstricke, die Einschränkungen des Assays und eine Variation des Protokolls diskutiert, die seine Verwendung mit RNAi-Knockdown-Tieren ermöglicht. Hier wird auch diskutiert, wie dieser Assay in eine kursbasierte Bachelor-Forschungserfahrung eingebettet werden kann.
Die richtige Vorbereitung der 24-Well-Platten ist unerlässlich. Zuerst müssen Bakterienrasen vollständig trocken sein, bevor L1-Tiere in den Brunnen entdeckt werden. Wenn sie nicht ausreichend getrocknet sind, vermischen sich die Bakterien während des Tests mit der Levamisollösung, wodurch die Flüssigkeit trüb wird und die Individuen daran gehindert werden, die Würmer zu zählen. Zweitens dürfen die Tiere bei der Synchronisierung von Würmern durch Bleichmittelvorbereitung nicht zu lange der Bleichlösung ausgesetzt werden, da sonst die Schutzschicht auf den Eiern zerfällt. Drittens ist es wichtig, nur 20-30 L1 pro Bohrloch zu entdecken, da zu viele Würmer in den Brunnen es extrem schwierig machen, die Anzahl genau zu zählen, die sich in der zugewiesenen Zeit bewegt. Schließlich ist es wichtig, während der Vorbereitung der Platten eine aseptische Technik beizubehalten, da kontaminierte Brunnen nicht untersucht werden können.
Es gibt einige Einschränkungen, die bei der Durchführung dieses Assays berücksichtigt werden müssen. Erstens kann das Zählen der Anzahl der sich bewegenden Würmer in jedem Brunnen alle 5 Minuten für Personen ohne vorherige Laborerfahrung überwältigend sein, und dies könnte zu einer ungenauen Datenerfassung führen. Wie bei anderen Assays zur Bestimmung der Arzneimittelsensitivität18,19 kann dieses Experiment mit weniger Zeitpunkten durchgeführt werden. Zweitens ist die Beschichtung von ausgehungerten L1s, die aus einer Bleichmittelvorbereitung isoliert wurden, eine einfache Methode, um eine synchronisierte Population zu erhalten. Anpassungen müssen jedoch vorgenommen werden, wenn der Entwicklungszeitpunkt zwischen den untersuchten Stämmen unterschiedlich ist. Es ist möglich, Tiere im späten vierten Larvenstadium (L4s) für diesen Test in eine 24-Well-Platte zu pflücken; Bei der Zubereitung vieler Teller ist dies jedoch zu arbeitsintensiv. Alternativ sollte man die Zeitspanne bestimmen, die jeder Stamm benötigt, um L4 zu erreichen, und dann die L1s zu verschiedenen Zeiten in die Vertiefungen legen, um Unterschiede in der Reifungsgeschwindigkeit auszugleichen. Während dieser Assay verwendet werden kann, um neue Gene zu identifizieren, die für die postsynaptische Muskelfunktion wichtigsind 11, kann eine veränderte Levamisolantwort auch durch Mutation oder RNAi-Knockdown von präsynaptischen Genenverursacht werden 12. Wenn eine veränderte Levamisolempfindlichkeit beobachtet wird, müssen zusätzliche Experimente durchgeführt werden, um den Grund für diesen Phänotyp zu bestimmen.
Durch einige Modifikationen an den 24-Well-Platten kann der beschriebene Levamisol-Schwimmtest auch an RNAi-Knockdown-Tieren11 durchgeführt werden. Gen-Knockdown durch RNAi kann erreicht werden, indem C. elegans-Bakterien gefüttert werden, die doppelsträngige RNA exprimieren, die dem interessierenden Gen20 entspricht. Zur Herstellung von RNAi-Platten muss nach der Entnahme aus dem Autoklaven 1 ml 1 ml IPTG und 1 ml 25 mg/ml Carbenicillin pro Liter Medium zugegeben werden. Bakterienkulturen werden gezüchtet, indem eine einzelne Kolonie in 3 ml LB-Brühe plus 3 μL 25 mg / ml Carbenicillin gepflückt und bei 37 ° C über Nacht geschüttelt wird, und die Plattenkarte wird erstellt, wenn die verschiedenen Bakterien in den Vertiefungen entdeckt werden. C. elegans werden wie beschrieben durch Bleichmittelvorbereitung synchronisiert; Der RNAi-hypersensitive ERi-1 (mg366) - Stamm sollte jedoch anstelle des Wildtyps verwendet werden, um den Gen-Knockdown zu erhöhen. RNAi-Knockdowns führen zu den gleichen Levamisol-Phänotypen, die für Funktionsverlust-Mutanten beobachtet werden11.
Das hier vorgestellte Protokoll kann in der Laborforschung, als eigenständiges Experiment im Bachelor-Labor oder in den ersten Wochen eines fortgeschrittenen Grundstudiums als Einführung in grundlegende C. elegans-Techniken und neuromuskuläre Funktion verwendet werden. In einem fortgeschritteneren entdeckungsbasierten Kurs können die Studierenden diesen Assay verwenden, um festzustellen, ob der Verlust von C. elegans-Homologen mutierter Gene bei Personen mit myasthenischen Syndromen, Muskeldystrophien oder Myopathien die Levamisolempfindlichkeit verändert . Zusammenfassend bietet dieser einfache, kostengünstige Levamisol-Sensitivitätstest einen praktischen Ansatz, um etwas über Signalübertragung am NMJ zu lernen und Erfahrungen mit dem C. elegans-Modellsystem zu sammeln.
Disclosures
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Wir danken Riya Dattani und Lauren Hogstrom, die die Daten in Abbildung 2B,C blind für den Genotyp im BISC413 Advanced Genetics Laboratory (Frühjahr 2022) an der University of Delaware gesammelt haben. Weitere Informationen über die BISC413 Course-based Undergraduate Research Experience (CURE) sowie Zugang zum von J. Tanis entworfenen Laborhandbuch sind auf Anfrage erhältlich. Nematodenstämme wurden vom Caenorhabditis Genetics Center zur Verfügung gestellt, das vom NIH-ORIP (P40 OD010440) unterstützt wird. Diese Arbeit wurde durch einen P20 GM103446 Delaware INBRE Mentored CURE Award (an J.E.T.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm non-vented, sharp edge Petri Dishes | TriTech Research | Cat #: T3308 | |
| BD Difco Bacto Agar | Fisher Scientific | Cat#: DF0140-01-0 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Fisher Scientific | Cat#:12-556-006 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP510-500 | |
| Cholesterol | MP Biomedicals | Cat#: 02101382-CF | |
| eri-1(mg366) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | GR1373 | |
| Gibco Bacto Peptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0118-17-0 | |
| Gibco Bacto Tryptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0123-17-3 | |
| GraphPad Prism (Statistical software) | GraphPad Software, Inc. | ||
| lev-10(x17) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ17 | |
| Levamisole hydrochloride | Fisher Scientific | Cat#: AC187870100 | |
| Low Splash Regular Bleach - 121oz - up & up | Target | Search target.com | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP213-1 | |
| Microsoft Excel | Microsoft, Inc | ||
| N2 wild type | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Bristol N2 | |
| OP50 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP363-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | Cat#: BP362-500 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | Cat#: BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide 10N | Fisher Scientific | Cat#: SS255-1 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP332-1 | |
| unc-49(e407) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB407 | |
| unc-63(x26) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ26 |
References
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