Summary
我们描述了复合大鼠后肢的手术技术和去细胞化过程。使用低浓度十二烷基硫酸钠通过 离体 机灌注系统进行脱细胞。
Abstract
严重创伤和组织丢失的患者需要复杂的手术重建。血管化复合同种异体移植（VCA）是一种不断发展的重建途径，用于将多个组织作为复合亚单位转移。尽管VCA具有前景，但由于恶性肿瘤、终末器官毒性和机会性感染的风险增加，长期免疫抑制需求是一个重大限制。无细胞复合支架的组织工程是减少免疫抑制需求的潜在替代方案。本文描述了大鼠后肢的获取及其随后使用十二烷基硫酸钠（SDS）的去细胞化。所提出的采购策略基于股总动脉。构建了基于机器灌注的生物反应器系统，用于后肢 离体 脱细胞。成功进行了灌注脱细胞，导致后肢呈白色半透明状外观。观察到整个后肢的完整、可灌注的血管网络。组织学分析显示，所有组织隔室的核内容物去除和组织结构的保存。
Introduction
VCA是需要复杂手术重建的患者的新兴选择。创伤性损伤或肿瘤切除会导致难以重建的体积组织丢失。VCA 提供多种组织的移植，例如皮肤、骨骼、肌肉、神经和血管，作为从供体到受体的复合移植物1.尽管VCA具有希望的性质，但由于长期免疫抑制方案而受到限制。终身使用此类药物会增加机会性感染、恶性肿瘤和终末器官毒性的风险1，2，3。为了帮助减少和/或消除对免疫抑制的需求，使用VCA脱细胞方法的组织工程支架显示出巨大的前景。
组织脱细胞需要保留细胞外基质结构，同时去除细胞和核内容物。这种脱细胞支架可以用患者特异性细胞重新填充4。然而，保存复合组织的ECM网络是一个额外的挑战。这是由于支架内存在多种组织类型，具有不同的组织密度、结构和解剖位置。本协议提供了一种用于大鼠后肢的手术技术和去细胞化方法。这是将这种组织工程技术应用于复合组织的概念验证模型。这也可以促使随后的努力通过细胞再生再生复合组织。
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Protocol
从多伦多总医院研究所获得的尸体雄性刘易斯大鼠（300-430g）用于所有实验。对于所有外科手术，使用无菌器械和用品来维持无菌技术（见 材料表）。所有程序均按照多伦多总医院研究所动物护理委员会的指导方针进行，大学健康网络（加拿大安大略省多伦多市）。共有4个后肢被去细胞化。
1.术前准备
- 准备 50 mL 的 5% 肝素化盐水。从 50 mL 盐水袋中取出 2.5 mL 盐水溶液，使用 5 mL 注射器并丢弃。使用 5 mL 注射器，向盐水袋中加入 2.5 mL 肝素。倒置盐水袋以混合其内容物。
- 将尸体大鼠仰卧在蓝色垫下。使用电动剃须刀将后肢和腹股沟区域沿周剃除并去除毛发。
- 将大鼠带到手术站，并使用纱布将聚维酮碘磨砂溶液涂抹在后肢和腹股沟区域。随后，涂抹70%异丙醇，用纱布擦去磨砂液。
- 丢弃步骤1.2中的蓝色垫子，换上新的无菌手套。
2. 大鼠后肢的采购
- 使用#10手术刀片和#3刀片沿着腹股沟韧带水平进行皮肤切口，从外侧移动到内侧方向（图1A）。使用阿森镊子固定周围的皮肤，以确保切口光滑。
- 当下面的脂肪暴露出来时，使用钝性解剖仔细解剖脂肪。找到上腹部血管。
- 使用显微剪刀解剖近端，暴露腹股沟韧带水平的股神经、动脉和静脉。
- 在解剖显微镜下，识别股血管并使用细钳解剖近端动脉和静脉，以从动脉网络的分叉点获得足够的长度（图1B）。
- 使用6-0缝合线分别结扎股动脉和静脉。
- 在后肢其余部位进行环形解剖，而不破坏结扎的股骨血管。
- 使用骨切割器将股骨横断中段。
- 为了完全隔离后肢，使用显微剪刀横断结扎的股骨血管。
- 在夹层显微镜下使用24 G血管导管插管股动脉。使用细镊子小心地插入套管。用肝素化盐水冲洗，直到观察到股静脉明显流出。
- 通过将一条缝合线绑在空心血管周围，另一条缝合线在套管本身周围远端系好，从而固定套管。确保套管靠近端放置，以防止阻塞分叉点。
- 将获得的后肢浸没在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，直到脱细胞。
图1：大鼠后肢的采购。（A）在腹股沟韧带水平从外侧到内侧的皮肤切口标记。（B）股静脉和股动脉的视图，它们已朝腹股沟韧带近端解剖，由虚线表示。缩写：L = 横向;M = 内侧;FV = 股静脉;FA = 股动脉。 请点击此处查看此图的大图。
3. 溶液的制备
- 在6 L玻璃烧瓶中，通过将12.5g SDS粉末溶解在5 L超纯蒸馏水中，制备0.25%十二烷基硫酸钠（SDS）的5 L洗涤剂储液槽。用封口膜盖住烧瓶的开口以密封它。
- 在 1 L 玻璃罐中，通过将 2.5 g SDS 溶解在 1 L 超纯蒸馏水中，分别制备 1 L 0.25% SDS 溶液。加入搅拌棒以在磁力搅拌器上混合溶液，直到所有SDS溶解。
- 用1%抗生素 - 抗真菌剂（AA）溶液制备1升1x PBS洗涤溶液。在 1 L 烧瓶中，加入 990 mL 的 1x PBS 溶液和 10 mL 的 AA。
- 另外，在 500 mL 玻璃罐中，使用 495 mL 的 1x PBS 溶液和 5 mL 的 AA 再次制备 1x PBS + 1% AA 溶液。
- 制备 200 mL 1% 过氧乙酸 （PAA）/4% 乙醇 （EtOH） 溶液。在通风橱下制备此溶液。
4. 生物反应器和灌注回路建设
注意：有关所列步骤中生物反应器和灌注回路的配置，请参阅 图 2 。
- 在 500 mL 腔室（塑料容器）中，在 图 2 中的标记位置钻三个孔（1/4 in）：端口 A 是入口管路，端口 B 是补充管路，端口 C 是出口管路。去除并丢弃多余的塑料。喷洒并用70%乙醇擦拭腔室。
- 切下三根 5 厘米长的硅胶管，并将一根插入腔室的每个端口。连接面向腔室内部的端口 A 开口处的公鲁尔连接器和腔室外管另一端的母鲁尔连接器。
- 在端口 B 和端口 C 处连接一个母鲁尔连接器，该连接器位于面向腔室外的管子末端。
- 在塑料容器的气密盖中，在盖子表面钻一个孔。
- 切一根 3 厘米的硅胶管并将其插入盖子的孔中。确保管子的大约 2 cm 位于盖子外，如图 2 所示。
- 用管子对腔室和盖子进行消毒。
- 用剪刀剪两个 30 厘米的硅胶管。将 1/16 英寸连接到每根管子一端的 1/8 英寸连接器。
- 分别用剪刀剪下两根 12 厘米的硅胶管。将 1/16 英寸连接到两个管子一端的 1/8 英寸连接器。将一根管子另一端的公鲁尔连接器和另一根管子上的母鲁尔连接器连接起来。
- 对步骤4.7和步骤4.8中的所有管道材料进行灭菌。在灭菌中包括两个 3 截止泵管 （1.85 mm）。
- 准备三个 3 通旋塞阀、一个注射器过滤器、两个 1 mL 血清移液器和一个 10 mL 注射器用于去细胞化设置。从 1 mL 血清移液器中取出过滤器。
图2：生物反应器的制备和灌注回路结构。 所示的灌注回路装置包括（A）蠕动泵和（B）用于入口和出口管路的相应盒。（中、丁）12 cm 和 30 cm 硅胶管也与相应的连接器一起显示。（E） 蠕动泵的管子（1.85 毫米）。生物反应器室，带有标记端口，用于 （F） 流入、（G） 补充端口和 （H） 流出。（I） 带有通风口的生物反应器盖。 请点击此处查看此图的大图。
5.大鼠后肢去细胞化
- 将灭菌室放在入口、出口和补充管路的三个一次性 3 通旋塞阀上。确保补给端口的旋塞阀在其其余两个端口处盖上，以防止泄漏。
- 将步骤 4.8 中制造的管连接到入口和出口管路的旋塞阀上。
- 在上述步骤中将蠕动管连接到管子上。将暗盒固定在蠕动管上，然后将其放在蠕动泵上。不要用管子固定暗盒。
- 将步骤 4.7 中的一根管连接到上述步骤的出口管路蠕动管的末端。连接另一端的 1 mL 血清移液器。将用血清移液管连接的末端悬浮在废储液罐烧瓶中。
- 对入口管路重复步骤 4.7。将连接到血清移液器的管端悬挂到洗涤剂储液槽中。立即用封口膜密封洗涤剂储液瓶的开口。有关脱细胞化电路的概述，请参见 图3A，B 。
- 从1L玻璃罐（步骤3.2）中加入0.25%SDS，进入生物反应器室的中途水平。
- 使用阿森镊子取出采购的后肢，并小心地将其悬浮到生物反应器室中。
- 使用两对 Adson 镊子将后肢的空心部分引导至入口线。用一对镊子握住套管的同时，用另一对镊子扭转并固定套管的入口管。确保套管没有被拉扯或扭曲，以防止脱胎。
- 固定后，根据需要从 1 L 玻璃罐中添加更多 0.25% SDS，以完全浸没肢体。确保出口也浸没在生物反应器储液器中，以确保保持一致的流出（图3C）。
- 将一次性注射器过滤器连接到生物反应器室盖上的通风口，参考步骤4.4和步骤4.5。
- 将盖子固定在生物反应器上，并确保腔室从各个侧面密封（图3B）。
- 要从管道中去除空气并灌注回路，请使用新的一次性 10 mL 注射器使用入口管路处的 3 路旋塞阀从洗涤剂储液槽中抽取洗涤剂。
- 拉出后，使用相同的流体插入出口管路处的 3 向旋塞阀中。确保入口和出口管路的整个管道中都有清洁剂。
- 按下并用管子将盒式磁带固定到蠕动泵中。使用电源按钮打开蠕动泵。
- 在蠕动泵屏幕上，使用箭头键进入第二个选项卡，设置第一个通道的灌注速率。输入 流速 作为 输送方式 ，并将 灌注速率 设置为 1 mL/min。确保根据设备设置正确流动方向。对第二个通道重复此操作。
- 校准蠕动泵，以确保通过入口管路输送和/或从出口管路输送的流体量在两者之间以一致的速率流动。确保 卡套管 ID 设置为 1.85 mm。
- 按下键盘上的 电源 按钮，通过机器灌注以 1 mL/min 的速度开始对入口和出口管路进行脱细胞。监控并确保入口和出口管路的流量一致且持续。
- 继续去细胞化并每天监测。根据需要，使用1升0.25%SDS（步骤3.2）通过补充端口补充生物反应器储液器。寻找白色，半透明的组织外观，这将在第5天出现，表明大鼠后肢去细胞化。
图3： 大鼠后肢灌注脱细胞生物反应器电路概述 。 （A）生物反应器灌注回路示意图。蓝色箭头表示洗涤剂和废物流动的方向。（B）含有大鼠后肢的生物反应器的脱细胞回路概述。SDS储液罐（左烧瓶）通向蠕动泵和生物反应器的入口管。流出物通过蠕动泵连接到废物储液罐（右烧瓶）。（C）（I）含有大鼠后肢的生物反应器，其入口管连接到股动脉空心。（二）位于角落的补给口，用于灌注洗涤剂。（三）悬挂在悬浮液库中的流出油管。缩写：SDS = 十二烷基硫酸钠。 请点击此处查看此图的大图。
6. 脱细胞后洗涤和灭菌
- 确认去细胞化后，用 1x PBS + 1% AA 储液槽更换洗涤剂储液槽。用封口膜密封烧瓶的开口。以 1 mL/min 的速度开始 1x PBS + 1% AA 灌注，并持续 2 天。
- 用 200 mL 的 0.1% PAA/4% EtOH 储液槽替换 1x PBS + 1% AA 储液槽，并以 1 mL/min 的速度开始灌注 2 小时。
- 使用两对无菌 Adson 镊子断开后肢与入口线的连接，一对镊子扭曲入口线，另一对夹住套管。确保不拉动套管以防止脱胎。
- 将肢体储存在含有1x PBS + 1%AA的500mL玻璃罐中，在4°C下直至进一步使用。
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Representative Results
采购方案成功地分离和插管股总动脉以进行后续灌注步骤。 图1A，B 中的代表性解剖图像显示了距分叉点足够距离的股血管的切口位置和暴露。 图2 示出了制备生物反应器和灌注回路所需的装置。通过观察组织的白色半透明外观来确定去细胞化的终点。 离体 机灌注系统成功地实现了大鼠后肢的灌注去细胞化。维持单通道闭合系统电路（图 3）。在0.25%SDS灌注5天后，天然后肢的总体形态变为白色，苍白的外观（图4）。
当用苏木精和伊红（H&E）染色时，在未发现细胞核的股血管，皮肤，神经，骨骼和肌肉中观察到细胞含量的去除。分析每个组织结构相对于天然组织的结构。由于缺乏蓝色染色的细胞核，脱细胞的股动脉和静脉都显示出所有层和周围结缔组织的核内容物损失，否则存在于天然血管中（图5A，B和图5D，E）。股静脉和动脉的内膜、中膜和外膜维持在脱细胞血管中（图 5D，E）。股神经显示组织结构保存，包括神经内膜（图5C和图5F）。骨在脱细胞后保留了其整体组织结构，可观察到骨以及周围内膜和骨膜层的骨细胞染色核丢失（图5G和图5J）。皮肤显示表皮和真皮细胞丢失。真皮显示保留的胶原纤维，类似于天然皮肤组织（图5H和图5K）。最后，骨骼肌的横视图显示位于肌内膜外围的细胞核丢失。肌纤维含量在脱细胞后保留在各自的分束内（图5I和图5L）。还使用Picogreen进行了DNA定量，其中股血管，神经，皮肤，肌肉和骨骼的DNA含量显着降低（图6）。
图4：原生和去细胞大鼠后肢的大体形态 。 （A）自体后肢的股动脉在采购后用24G血管导管插管。（B）脱细胞5天后后肢呈白色半透明外观，SDS为0.25%。 请点击此处查看此图的大图。
图5：使用苏木精和伊红对大鼠后肢组织进行组织学染色。H&E染色的天然（上图）和去细胞化（下图）（A，D）股静脉和（B，E）动脉，（C，F）神经，（G，J）骨，（H，K）皮肤和（I，L）肌肉。所有去细胞化样品中可见的细胞核和细胞含量损失。比例尺= 200 μm（血管、神经、骨骼）和 300 μm（皮肤、肌肉）。请点击此处查看此图的大图。
图6：天然和去细胞大鼠后肢组织的DNA定量。 天然和去细胞化血管、神经、肌肉、皮肤和骨骼的 DNA 含量降低，以 ng/mg 干重表示。将组织干燥并在65°C下在木瓜蛋白酶中消化过夜，使用PicoGreen荧光检测DNA。进行了多个未配对 的t检验。数据以标准±平均值表示。 **p < 0.01，****p < 0.001，****p < 0.0001。缩写：N = 本地;D = 去细胞化。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
大鼠后肢可用作VCA5中的实验模型。无细胞支架的组织工程是解决与VCA相关的长期免疫抑制方案缺点的第一步。鉴于存在多种组织，每种组织都具有独特的功能、免疫原性和结构特性，复合移植物的使用带来了额外的挑战。本协议显示了获得无细胞复合大鼠后肢的成功方法。这些支架可以进一步重新细胞化，并代表VCA的概念验证模型。
为了确保成功的采购和去细胞化，在手术和去细胞化阶段有各种关键步骤。为了确保洗涤剂和灭菌剂溶液在整个天然脉管系统中的全身分布，关键步骤包括结扎上腹部血管，以及在结扎股血管之前与动静脉网络的分叉点保持足够的距离。所描述的灭菌程序有助于减少细胞再细胞化实验的生物负荷，其中细胞附着，存活和生长需要无菌环境6。
我们还介绍了一种灌注生物反应器系统，该系统旨在实现脱细胞化。关键组件包括使用蠕动泵连续灌注的能力，以及允许通过空心动脉单程灌注洗涤剂和灭菌剂的能力。蠕动泵也被设置为脉动流，类似于生理条件。最后，包括一个补给端口，用于补充生物反应器中的悬浮液库，而不会将后肢暴露在外部环境中。因此，该生物反应器系统是有利的，因为它可以以封闭系统，单程方式离 体对 大鼠后肢进行去细胞化和灭菌。该回路的组件是可高压灭菌的，并且可以在每个脱细胞循环之前灭菌。鉴于后肢肌肉的密度和相对较大的存在，洗涤剂灌注和浸没方法都纳入了这种 离体 回路的设计中，以帮助进入和去细胞化肌肉。
尽管生物反应器室和脱细胞回路经过精心设计并针对大鼠后肢量身定制，但它具有可重复的设计，可以在使该协议适应其他组织时进行修改。其他修改可能包括在灌注回路中加入气泡阱，以确保流速不会因气泡7，8而中断。此外，我们没有采用压力监测系统来监测整个脱细胞过程中的灌注压力。灌注压可能因腔内细胞碎片而波动。最近，Cohen等人报告了SDS灌注期间灌注压力的暂时波动，该方法使用1-2mL / min的类似目标流速在大鼠后肢产生血管嵌合。在处理潜在堵塞后稳定灌注压9。对于当前方案的未来灌注系统设计修改，结合压力监测仪可以提供任何腔内闭塞的信息，并指示需要治疗以帮助防止血管系统受损。
在该模型中，在去细胞化期间和之后观察到流出。为了确保支架的活力和功能，需要血管通畅性才能将氧气和营养物质输送到复合移植物10中的不同组织。随着这种去细胞化方案的潜力扩展到进一步的细胞再化研究，流出的观察至关重要，以便脱细胞化的血管树可以在细胞再生过程中重新填充和重新功能化。血管成像可用于细胞化后确认血管通畅性。
迄今为止，很少有关于大鼠后肢去细胞化的研究，每个组织隔室的成功结果有限9，11。本研究中的代表性结果表明了后肢中存在的所有组织隔室的去细胞化的影响。手术方法还保留了大量的肌肉和皮肤，可以连续活检并用于进一步分析。此外，该协议建议通过采用比复合和分离组织的脱细胞方案中通常用于的SDS浓度更低的SDS浓度来降低毒性的脱细胞方法12。所提出的离体生物反应器系统也可以适用于其他组织和模型。
总之，所提出的方案提供了一种可靠且可重复的手术技术和使用 离体 机灌注系统的大鼠后肢脱细胞方法。未来的应用包括用组织特异性细胞重新填充这种支架，并研究在骨骼、肌肉和神经等组织中再生功能能力的途径。未来的研究还可以表征细胞外基质、天然脉管系统的保留和生化特性。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
图 3A 是在 BioRender.com 中创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL | Baxter Corporation | JB1308M | |
| 1 mL Disposable Serological Pipets | VWR | 75816-102 | |
| 10 cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 3-way Stopcock | Obtained from Research Institution | ||
| 5cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 70% Isopropyl Alcohol | Obtained from Research Institution | ||
| Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm | VWR | CA28143-310 | |
| Adson Forceps, Straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”) | VWR | 38112 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL | Multicell | 450-115-EL | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 12029-12 | |
| Connectors for 1/16" to 1/8" Tubes | McMasterCarr | 5117K52 | |
| Female Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K328 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Fine Forceps with Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL | LEO Pharma Inc. | 006174-09 | |
| Male Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K322 | |
| Micro Needle Holder | WLorenz | 04-4125 | |
| Microscissors | WLorenz | SP-4506 | |
| Peracetic Acid | Sigma Aldrich | 269336-100ML | |
| Peristaltic Pump, 3-Channel | Cole Parmer | RK-78001-68 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL | Wisent | 311-425-CL | |
| Povidone Surgical Scrub Solution | Obtained from Research Institution | ||
| Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL | Cole Parmer | RK-96450-40 | |
| Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone | Cole Parmer | RK-96410-16 | |
| Scalpel Blade - #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg | Bioshop | SDS003.1 | |
| Surgical Suture #6-0 | Covidien | VS889 |
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