Summary
Bu yazıda kompozit sıçan arka bacakları için cerrahi teknik ve desellülarizasyon süreci anlatılmaktadır. Desellülarizasyon, bir ex vivo makine perfüzyon sistemi aracılığıyla düşük konsantrasyonlu sodyum dodesil sülfat kullanılarak gerçekleştirilir.
Abstract
Ciddi travmatik yaralanmaları ve doku kaybı olan hastalar karmaşık cerrahi rekonstrüksiyon gerektirir. Vaskülarize kompozit allotransplantasyon (VCA), kompozit bir alt birim olarak birden fazla dokunun transferi için gelişen bir rekonstrüktif yoldur. VCA'nın umut verici doğasına rağmen, uzun süreli immünsüpresif gereksinimler, maligniteler, son organ toksisitesi ve fırsatçı enfeksiyonlar riskinin artması nedeniyle önemli bir sınırlamadır. Asellüler kompozit iskelelerin doku mühendisliği, immünsüpresyon ihtiyacını azaltmada potansiyel bir alternatiftir. Burada, bir sıçan arka bacağının tedariki ve ardından sodyum dodesil sülfat (SDS) kullanılarak desellülarizasyonu açıklanmaktadır. Sunulan tedarik stratejisi ortak femoral artere dayanmaktadır. Bir makine perfüzyon bazlı biyoreaktör sistemi inşa edildi ve arka bacağın ex vivo desellülarizasyonu için kullanıldı. Başarılı perfüzyon desellülarizasyonu gerçekleştirildi ve arka bacak beyaz yarı saydam benzeri bir görünüm elde edildi. Arka bacak boyunca sağlam, perfüzyona uğramış, vasküler bir ağ gözlendi. Histolojik analizler, nükleer içeriğin çıkarıldığını ve tüm doku bölmelerinde doku mimarisinin korunduğunu gösterdi.
Introduction
VCA, karmaşık cerrahi rekonstrüksiyon gerektiren hastalar için yeni ortaya çıkan bir seçenektir. Travmatik yaralanmalar veya tümör rezeksiyonları, rekonstrüksiyonu zor olabilen hacimsel doku kaybına neden olur. VCA, deri, kemik, kas, sinirler ve damarlar gibi çoklu dokuların bir donörden bir alıcıya kompozit greft olarak nakledilmesini sağlar1. Umut verici doğasına rağmen, VCA uzun süreli immünosüpresif rejimler nedeniyle sınırlıdır. Bu tür ilaçların yaşam boyu kullanımı, fırsatçı enfeksiyonlar, maligniteler ve son organ toksisitesi için artmış riske neden olur 1,2,3. İmmünsüpresyon ihtiyacını azaltmaya ve / veya ortadan kaldırmaya yardımcı olmak için, VCA için desellülarizasyon yaklaşımlarını kullanan doku mühendisliği iskeleleri büyük umut vaat etmektedir.
Doku desellülarizasyonu, hücresel ve nükleer içeriği uzaklaştırırken hücre dışı matriks yapısının korunmasını gerektirir. Bu desellülarize iskele, hastaya özgü hücrelerle yeniden doldurulabilir4. Bununla birlikte, ECM kompozit doku ağının korunması ek bir zorluktur. Bunun nedeni, bir iskele içinde değişen doku yoğunluklarına, mimarilerine ve anatomik konumlarına sahip çoklu doku tiplerinin varlığıdır. Mevcut protokol, bir sıçan arka bacağı için cerrahi bir teknik ve bir desellülarizasyon yöntemi sunmaktadır. Bu, bu doku mühendisliği tekniğini kompozit dokulara uygulamak için bir kavram kanıtı modelidir. Bu aynı zamanda reselülilarizasyon yoluyla kompozit dokuları yeniden oluşturmak için sonraki çabaları da tetikleyebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toronto Genel Hastanesi Araştırma Enstitüsü'nden elde edilen kadavra erkek Lewis sıçanları (300-430 g) tüm deneyler için kullanıldı. Tüm cerrahi prosedürler için, aseptik tekniği sürdürmek için steril aletler ve malzemeler kullanıldı ( bakınız Malzeme Tablosu). Tüm prosedürler, Toronto Genel Hastanesi Araştırma Enstitüsü, Üniversite Sağlık Ağı'ndaki (Toronto, ON, Kanada) Hayvan Bakım Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Toplam dört arka bacak hücresizleştirildi.
1. Ameliyat öncesi hazırlık
- 50 mL% 5 heparinize salin hazırlayın. 50 mL'lik bir tuzlu su torbasından, 5 mL'lik bir şırınga kullanarak 2,5 mL'lik bir tuzlu su çözeltisi alın ve atın. 5 mL'lik bir şırınga kullanarak, tuzlu su torbasına 2,5 mL heparin ekleyin. İçeriğini karıştırmak için tuzlu su torbasını ters çevirin.
- Kadavra bir sıçanı mavi bir pedin altına sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Arka bacak ve kasık bölgesini elektrikli tıraş makinesi kullanarak çevresel olarak tıraş edin ve saçları çıkarın.
- Sıçanı cerrahi istasyona getirin ve arka bacak ve kasık bölgesine bir gazlı bez kullanarak Povidon iyot ovma çözeltisi uygulayın. Daha sonra, gazlı bez kullanarak ovma çözeltisini silmek için% 70 izopropil alkol uygulayın.
- Mavi pedi adım 1.2'den atın ve yeni, steril eldivenlere geçin.
2. Sıçan arka bacak tedariki
- Kasık bağı seviyesi boyunca bir # 10 cerrahi bıçak ve bir # 3 bıçak koşucusu kullanarak, yanaldan medial bir yöne doğru hareket ederek bir cilt kesisi yapın (Şekil 1A). Düzgün bir kesi sağlamak için çevreleyen cildi tutmak için Adson forseps kullanın.
- Altta yatan yağ açığa çıktığında, yağdan dikkatlice diseksiyon yapmak için künt diseksiyon kullanın. Superior epigastrik damarları bulun.
- Proksimal olarak diseksiyon yapmak ve altta yatan femoral siniri, arteri ve veni inguinal ligament seviyesinde ortaya çıkarmak için mikromakas kullanın.
- Bir diseksiyon mikroskobu altında, femoral damarları tanımlayın ve arteriyel ağın çatallanma noktalarından yeterli uzunluk elde etmek için ince forseps kullanarak arteri ve veni proksimal olarak diseke edin (Şekil 1B).
- Femoral arter ve veni ayrı ayrı 6-0 sütür kullanarak bağlayın.
- Bağlı femur damarlarını bozmadan arka bacağın geri kalanı etrafında çevresel diseksiyon yapın.
- Bir kemik kesici kullanarak femur kemiğini orta uzunlukta transekte edin.
- Arka bacağı tamamen izole etmek için, mikromakas kullanarak ligatürlerin altındaki bağlı femur damarlarını transekte edin.
- Diseksiyon mikroskobu altında 24 G anjiyokateter kullanarak femoral arteri kanüle edin. Kanülü dikkatlice yerleştirmek için ince forseps kullanın. Femoral venden net bir çıkış gözlenene kadar heparinize salin ile yıkayın.
- Kanüllenmiş kabın etrafına bir dikiş ve kanülün etrafına distal olarak başka bir dikiş bağlayarak kanülü sabitleyin. Bifurkasyon noktalarının tıkanmasını önlemek için kanülün yakınına yerleştirildiğinden emin olun.
- Tedarik edilen arka bacakları desellülarizasyona kadar fosfat tamponlu salin (PBS) içine batırın.
Şekil 1: Sıçan arka bacağı tedariği. (A) Kasık bağı seviyesinde deri kesisinin lateral olandan mediale doğru işaretlenmesi. (B) Kasık ligamentine doğru proksimal edilmiş femoral ven ve femoral arterin görünümü, noktalı çizgi ile gösterilir. Kısaltmalar: L = yanal; M = medial; FV = femoral ven; FA = femoral arter. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
3. Çözeltilerin hazırlanması
- 6 L'lik bir cam şişede, 5 L ultra saf damıtılmış suda 12.5 g SDS tozunu çözerek% 0.25 sodyum dodesil sülfat (SDS) içeren 5 L'lik bir deterjan haznesi hazırlayın. Şişenin açıklığını kapatmak için parafilm ile örtün.
- 1 L'lik bir cam kavanozda, 1 L ultra saf damıtılmış suda 2.5 g SDS'yi çözerek 1 L% 0.25 SDS çözeltisini ayrı ayrı hazırlayın. Tüm SDS çözülene kadar çözeltiyi manyetik bir karıştırıcı üzerinde karıştırmak için bir karıştırma çubuğu ekleyin.
- % 1 Antibiyotik-Antimikotik (AA) çözelti ile 1 L 1x PBS yıkama çözeltisi hazırlayın. 1 L'lik bir şişeye 990 mL 1x PBS çözeltisi ve 10 mL AA çözeltisi ekleyin.
- Ayrı olarak, 500 mL'lik bir cam kavanozda, 495 mL 1x PBS çözeltisi ve 5 mL AA kullanarak tekrar 1x PBS +% 1 AA çözeltisi hazırlayın.
- 200 mL% 1 perasetik asit (PAA) / % 4 etanol (EtOH) çözeltisi hazırlayın. Bu çözeltiyi bir duman başlığı altında hazırlayın.
4. Biyoreaktör ve perfüzyon devresi yapımı
NOT: Listelenen adımlar boyunca biyoreaktör ve perfüzyon devresinin konfigürasyonu için Şekil 2'ye bakınız.
- 500 mL'lik bir haznede (plastik kap), Şekil 2'deki etiketli yerlerde üç delik (1/4 inç) delin: Port A giriş hattıdır, Port B ikmal hattıdır ve Port C çıkış hattıdır. Fazla plastiği çıkarın ve atın. Odaya% 70 etanol püskürtün ve silin.
- 5 cm uzunluğunda üç silikon tüp kesin ve odanın her bir portuna yarıya kadar yerleştirin. Odanın içine bakan A Limanı'nın açıklığına bir erkek Luer konektörü ve odanın dışındaki tüpün diğer ucuna bir dişi Luer konektörü bağlayın.
- B ve C Bağlantı Noktalarında bir dişi Luer konektörünü, haznenin dışına bakan boruların uçlarına bağlayın.
- Plastik kap için hava geçirmez bir kapakta, kapağın yüzeyinde bir delik açın.
- 3 cm'lik bir silikon tüp kesin ve kapağın deliğine yerleştirin. Şekil 2'de gösterildiği gibi, tüpün yaklaşık 2 cm'sinin kapaktan dışarı yerleştirildiğinden emin olun.
- Hem odayı hem de kapağı boru ile sterilize edin.
- Makas kullanarak iki adet 30 cm'lik silikon tüp kesin. Her tüpün bir ucundaki 1/8 inçlik konektöre 1/16 inç bağlayın.
- Ayrı olarak, makas kullanarak iki adet 12 cm'lik silikon tüp kesin. Her iki borunun bir ucundaki 1/8 inçlik konektöre 1/16 inç bağlayın. Bir tüpün diğer ucuna bir erkek Luer konektörü ve diğer tüpe bir dişi Luer konektörü bağlayın.
- Tüm boru malzemesini adım 4.7 ve adım 4.8'den sterilize edin. Sterilizasyona iki adet 3 kademeli pompa borusu (1,85 mm) ekleyin.
- Desellülarizasyon kurulumu için üç adet 3 stopcock, bir şırınga filtresi, iki adet 1 mL serolojik pipet ve bir adet 10 mL şırınga hazırlayın. Filtreyi 1 mL serolojik pipetlerden çıkarın.
Resim 2: Biyoreaktör ve perfüzyon devresi yapımının hazırlanması. Perfüzyon devresinin (A) peristaltik pompa ve (B) hem giriş hem de çıkış hatları için karşılık gelen kasetleri içeren aparatı. (C, D) 12 cm ve 30 cm'lik silikon borular da ilgili konektörlerle birlikte gösterilmektedir. (E) Peristaltik pompa borusu (1,85 mm). (F) giriş, (G) ikmal portu ve (H) çıkış için etiketli portlara sahip biyoreaktör odası. (I) Havalandırma portu ile gösterilen biyoreaktör kapağı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
5. Sıçan arka bacaklarının desellülarizasyonu
- Sterilize edilmiş hazneyi yerleştirin ve vidayı giriş, çıkış ve ikmal hatlarındaki üç adet tek kullanımlık 3 stopcock'a yerleştirin. Sızıntıyı önlemek için ikmal portunun stopcock'unun kalan iki portunda kapatıldığından emin olun.
- Adım 4.8'de yapılan tüpleri giriş ve çıkış hatlarındaki tıpalara takın.
- Peristaltik boruları yukarıdaki adımda tüplere bağlayın. Kaseti peristaltik boruya sabitleyin ve peristaltik pompaya yerleştirin. Kasetleri henüz boru ile sabitlemeyin.
- Bir tüpü adım 4.7'den çıkış hattının peristaltik borusunun sonuna yukarıdaki adımdan bağlayın. Diğer uca 1 mL'lik bir serolojik pipet bağlayın. Atık haznesi şişesinde serolojik bir pipetle tutturulmuş ucu askıya alın.
- Giriş satırı için adım 4.7'yi yineleyin. Serolojik pipete bağlı tüpün ucunu deterjan haznesine askıya alın. Deterjan haznesi şişesinin açıklığını derhal parafilm ile kapatın. Desellülarizasyon devresine genel bir bakış için Şekil 3A,B'ye bakınız.
- 1 L cam kavanozdan (adım 3.2) yarı yolda biyoreaktör odasına %0,25 SDS ekleyin.
- Adson forseps kullanarak tedarik edilen arka bacağı alın ve biyoreaktör odasına dikkatlice askıya alın.
- Arka bacağın kanüllenmiş kısmını giriş çizgisine yönlendirmek için iki çift Adson forseps kullanın. Kanülü bir çift forseps ile tutarken, giriş çizgisini kanüle bükmek ve sabitlemek için diğer forseps çiftini kullanın. Silinmeyi önlemek için kanülün çekilmediğinden veya bükülmediğinden emin olun.
- Sabitlendikten sonra, gerektiğinde uzuvları tamamen suya batırmak için 1 L cam kavanozdan% 0,25 daha fazla% SDS ekleyin. Tutarlı çıkışın korunmasını sağlamak için çıkış portunun da biyoreaktör rezervuarına batırıldığından emin olun (Şekil 3C).
- Adım 4.4 ve adım 4.5'e atıfta bulunarak biyoreaktör odasının kapağındaki havalandırma portuna tek kullanımlık bir şırınga filtresi takın.
- Biyoreaktörün kapağını sabitleyin ve odanın her taraftan kapatıldığından emin olun (Şekil 3B).
- Havayı borudan çıkarmak ve perfüzyon devresini hazırlamak için, giriş hattındaki 3 stopcock'u kullanarak deterjanı deterjan haznesinden çekmek için yeni, tek kullanımlık 10 mL şırınga kullanın.
- Çekildikten sonra, çıkış hattındaki 3 stopcock'a yerleştirmek için aynı sıvıyı kullanın. Boru boyunca hem giriş hem de çıkış hatlarında deterjan bulunduğundan emin olun.
- Kasetleri aşağı bastırın ve boruyla peristaltik pompaya sabitleyin. Güç düğmesini kullanarak peristaltik pompayı açın.
- Peristaltik pompa ekranında, ilk kanalın perfüzyon hızını ayarlamak için ok tuşunu kullanarak ikinci sekmeye geçin. Teslimat şekli olarak giriş debisi ve perfüzyon hızını 1 mL / dak olarak ayarlayın. Aparat kurulumuna göre akış yönünün doğru olduğundan emin olun. İkinci kanal için bu işlemi tekrarlayın.
- Giriş hattından iletilen ve/veya çıkış hattından alınan sıvı miktarının ikisi arasında tutarlı bir hızda aktığından emin olmak için peristaltik pompayı kalibre edin. Boru kimliğinin 1,85 mm'ye ayarlandığından emin olun.
- Tuş takımındaki güç düğmesine basarak hem giriş hem de çıkış hatları için 1 mL/dak'da makine perfüzyonu yoluyla hücre desellülarizasyonuna başlayın. Akışın hem giriş hem de çıkış hatlarında tutarlı ve sürekli olduğundan emin olun ve izleyin.
- Desellülarizasyona devam edin ve günlük olarak izleyin. Biyoreaktör rezervuarını gerektiğinde ikmal portundan doldurmak için 1 L% 0.25 SDS'yi (adım 3.2) kullanın. Sıçan arka bacaklarının desellülarizasyonunu gösteren, 5. günde ortaya çıkacak olan dokunun beyaz, yarı saydam bir görünümünü arayın.
Şekil 3: Sıçan arka bacağının perfüzyon desellülarizasyon biyoreaktör devresine genel bakış. (A) Biyoreaktör perfüzyon devresinin şematik gösterimi. Mavi oklar deterjan ve atık akışının yönünü gösterir. (B) Sıçan arka bacağını içeren biyoreaktörlü desellülarizasyon devresine genel bakış. SDS rezervuarı (sol şişe) peristaltik pompaya ve biyoreaktörün giriş borusuna yol açar. Çıkış, peristaltik pompa aracılığıyla atık rezervuarına (sağ şişe) bağlanır. (C) (I) Kanüllenmiş femoral artere bağlı giriş borusu ile sıçan arka bacağı içeren biyoreaktör. (II) Perfüze deterjan için köşede bulunan ikmal portu. (III) Süspansiyon haznesinde asılı duran çıkış borusu. Kısaltma: SDS = sodyum dodesil sülfat. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
6. Desellülarizasyon sonrası yıkama ve sterilizasyon
- Desellülarizasyonun onaylanmasını takiben, deterjan haznesini 1x PBS +% 1 AA haznesi ile değiştirin. Şişenin açıklığını parafilm ile kapatın. 1x PBS +% 1 AA perfüzyonuna 1 mL / dak'da başlayın ve 2 gün boyunca devam edin.
- 1x PBS + %1 AA rezervuarını 200 mL'lik %0,1 PAA/%4 EtOH rezervuarı ile değiştirin ve 2 saat boyunca 1 mL/dk'da perfüzyona başlayın.
- İki çift steril Adson forseps kullanarak arka bacağı giriş hattından ayırın, bir çift forseps giriş çizgisini bükmek için diğeri kanülü tutar. Dekülasyonu önlemek için kanülün çekilmediğinden emin olun.
- Uzuvları, daha fazla kullanana kadar 4 ° C'de 1x PBS +% 1 AA içeren 500 mL'lik bir cam kavanozda saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tedarik protokolü, sonraki perfüzyon adımları için ortak femoral arterlerin izole edilmesi ve kanülasyonunda başarılı olmuştur. Şekil 1A,B'deki temsili diseksiyon görüntüleri, bifurkasyon noktalarından yeterli mesafede femur damarlarının insizyon yerini ve maruziyetini göstermektedir. Şekil 2, biyoreaktör ve perfüzyon devresini hazırlamak için gerekli olan aparatı göstermektedir. Desellülarizasyonun bitiş noktası, dokunun beyaz, yarı saydam benzeri bir görünümünü gözlemleyerek belirlendi. Ex vivo makine perfüzyon sistemi, sıçan arka bacağındaki perfüzyon desellülarizasyonunda başarılı olmuştur. Tek geçişli, kapalı sistem devresi bakımı yapılmıştır (Şekil 3). Doğal arka bacağın brüt morfolojisi, 5 gün sonra% 0.25 SDS perfüzyonundan sonra beyaz, soluk bir görünüme dönüştü (Şekil 4).
Hücresel içeriğin çıkarılması, çekirdeğin bulunmadığı femur damarlarında, deride, sinirde, kemikte ve kaslarda hematoksilin ve eozin (H & E) ile boyandığında gözlendi. Her doku yapısının yapıları doğal dokuya göre analiz edildi. Hem desellülarize femoral arter hem de ven, doğal damarlarda bulunan mavi lekeli çekirdeklerin eksikliği göz önüne alındığında, tüm katmanlarda ve çevreleyen bağ dokusunda nükleer içerik kaybı gösterdi (Şekil 5A, B ve Şekil 5D, E). Hem femoral venin hem de arterlerin tunika intima, media ve adventitisi desellülarize damarlarda tutuldu (Şekil 5D, E). Femoral sinir, endoneurium da dahil olmak üzere doku yapısının korunduğunu gösterdi (Şekil 5C ve Şekil 5F). Kemik, desellülarizasyon sonrası genel doku yapısını korudu, kemikten ve çevredeki endosteum ve periost tabakalarından lekeli osteosit çekirdeklerinin gözlemlenebilir bir kaybı ile (Şekil 5G ve Şekil 5J). Deri, epidermis ve dermisten hücre kaybı gösterdi. Dermis, doğal cilt dokusuna benzer şekilde tutulan kollajen liflerini gösterdi (Şekil 5H ve Şekil 5K). Son olarak, iskelet kasının enine görünümü, endomisyumun çevrelerinde bulunan çekirdek kaybını gösterdi. Miyofiber içeriği, desellülarizasyon sonrası ilgili fasiküller içinde tutulmaya devam etti (Şekil 5I ve Şekil 5L). Picogreen kullanılarak DNA nicelleştirmesi de gerçekleştirildi, burada DNA içeriği femur damarları, sinir, deri, kas ve kemik boyunca önemli ölçüde azaldı (Şekil 6).
Şekil 4: Yerli ve desellülarize sıçan arka bacaklarının brüt morfolojisi . (A) Tedarik sonrası 24 G anjiyokateter ile kanüle edilen doğal arka bacak femoral arteri. (B) %0.25 SDS ile 5 günlük desellülarizasyondan sonra arka bacak beyaz, yarı saydam görünümü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Sıçan arka bacak dokularının hematoksilin ve eozin kullanılarak histolojik boyanması. H&E boyalı doğal (üst panel) ve desellülarize (alt panel) (A, D) femoral ven ve (B, E) arter, (C, F) sinir, (G, J) kemik, (H, K) deri ve (I, L) kas. Tüm desellülarize numunelerde görülebilen çekirdek ve hücresel içerik kaybı. Ölçek çubukları = 200 μm (damarlar, sinir, kemik) ve 300 μm (cilt, kas). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Doğal ve desellülarize sıçan arka bacak dokularının DNA miktarı. DNA içeriği, ng/mg kuru ağırlık cinsinden eksprese edilen doğal ve desellülarize damarlar, sinir, kas, cilt ve kemik boyunca azalır. Dokular 65 ° C'de bir gecede papain'de kurutuldu ve sindirildi. DNA, PicoGreen kullanılarak floresan olarak tespit edildi. Birden fazla eşlenmemiş t-testi yapıldı. Veriler ortalama SD ± olarak sunulmuştur. **p 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 <. Kısaltmalar: N = yerli; D = hücresellikten arındırılmış. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sıçan arka bacakları VCA 5'te deneysel modeller olarakkullanışlıdır. Asellüler iskelelerin doku mühendisliği, VCA ile ilişkili uzun süreli immünsüpresyon rejimlerinin eksikliklerini ele almada ilk adımı temsil eder. Kompozit greftlerin kullanımı, her biri benzersiz fonksiyonel, immünojenik ve yapısal özelliklere sahip çoklu dokuların varlığı göz önüne alındığında ek bir zorluk oluşturmaktadır. Mevcut protokol, asellüler kompozit sıçan arka bacaklarının elde edilmesinde başarılı bir yöntem göstermektedir. Bu iskeleler daha da yeniden hücreselleştirilebilir ve VCA için bir kavram kanıtı modelini temsil eder.
Başarılı tedarik ve desellülarizasyonu sağlamak için, cerrahi ve desellülarizasyon aşamalarında çeşitli kritik adımlar vardır. Deterjan ve sterilant çözeltinin doğal vaskülatür boyunca sistemik dağılımını sağlamak için, kritik adımlar epigastrik damarların ligasyonunu ve femoral damarların bağlanmasından önce arteriyovenöz ağın bifurkasyon noktalarından yeterli mesafenin elde edilmesini içerir. Açıklanan sterilizasyon prosedürü, hücre bağlanması, hayatta kalma ve büyüme için steril bir ortamın gerekli olduğu hücreselleştirme deneyleri için biyoyükün azaltılmasına yardımcı olur6.
Ayrıca, desellülarizasyonu uygulamak için tasarlanmış bir perfüzyon biyoreaktör sistemi de sunuyoruz. Kritik bileşenler, peristaltik bir pompa kullanılarak sürekli perfüzyon kabiliyetini içerir ve deterjan ve sterilantın kanüllenmiş arter boyunca tek geçişli perfüzyonuna izin verir. Peristaltik pompa ayrıca fizyolojik koşullara benzer şekilde pulsatil bir akışa ayarlandı. Son olarak, arka bacağı dış ortama maruz bırakmadan biyoreaktördeki süspansiyon rezervuarını yenilemek için bir yenileme portu dahil edildi. Bu nedenle, bu biyoreaktör sistemi, bir sıçan arka bacağını ex vivo'yu kapalı sistemli, tek geçişli bir şekilde hücreselleştirebildiği ve sterilize edebildiği için avantajlıdır. Devrenin bileşenleri otoklavlanabilir ve her hücreselleştirme döngüsünden önce sterilize edilebilir. Arka bacaktaki kasın yoğunluğu ve nispeten büyük varlığı göz önüne alındığında, hem deterjan perfüzyonu hem de daldırma yöntemleri, kasın erişmesine ve hücresellikten arındırılmasına yardımcı olmak için bu ex vivo devrenin tasarımına dahil edilmiştir.
Biyoreaktör odası ve desellülarizasyon devresi dikkatlice tasarlanmış ve sıçan arka bacağına göre uyarlanmış olmasına rağmen, bu protokolü diğer dokular için uyarlarken değiştirilebilen tekrarlanabilir bir tasarıma sahiptir. Ek modifikasyonlar, hava kabarcıkları 7,8 nedeniyle akış hızının bozulmamasını sağlamak için perfüzyon devresine bir kabarcık tuzağının dahil edilmesini içerebilir. Ayrıca, desellülarizasyon süresi boyunca perfüzyon basıncını izlemek için bir basınç izleme sistemi dahil etmedik. Perfüzyon basınçlarının intraluminal hücresel enkaz nedeniyle dalgalanması mümkündür. Son zamanlarda, Cohen ve ark., SDS perfüzyonu sırasında, sıçan arka bacağında vasküler kimerizm üretmek için bir yaklaşımda, 1-2 mL / dak'lık benzer bir hedef akış hızı kullanarak perfüzyon basıncında geçici dalgalanmalar bildirmişlerdir. Perfüzyon basıncı potansiyel tıkanmalar için tedaviyi takiben stabilize edildi9. Mevcut protokol için gelecekteki perfüzyon sistemi tasarım modifikasyonları için, bir basınç monitörünün dahil edilmesi, herhangi bir intraluminal tıkanıklık hakkında bilgilendirici olabilir ve vaskülatüre zarar gelmesini önlemeye yardımcı olmak için tedaviye duyulan ihtiyacı gösterebilir.
Bu modelde, desellülarizasyon sırasında ve sonrasında çıkış gözlenmiştir. İskelelerin yaşayabilirliğini ve işlevselliğini sağlamak için, kompozit greft10'da oksijen ve besin maddelerinin farklı dokulara verilmesi için vasküler açıklık gereklidir. Bu desellülarizasyon protokolünün potansiyelinin daha ileri resellülarizasyon çalışmalarına genişletilmesi ile, çıkışın gözlemlenmesi kritik öneme sahiptir, böylece desellülarize vasküler ağaç recellularizasyon sırasında yeniden doldurulabilir ve yeniden işlevselleştirilebilir. Vasküler görüntüleme, vasküler açıklığı doğrulamak için desellülarizasyon sonrası kullanılabilir.
Bugüne kadar, sıçan arka bacağındaki desellülarizasyon üzerine az sayıda çalışma yapılmıştır ve doku bölmelerinin her birinde başarı konusunda sınırlı sonuçlar elde edilmiştir 9,11. Bu çalışmadaki temsili sonuçlar, desellülarizasyonun arka bacakta bulunan tüm doku bölmeleri üzerindeki etkisini göstermektedir. Cerrahi yöntem ayrıca seri olarak biyopsi yapılabilen ve daha ileri analizler için kullanılabilen büyük miktarda kas ve cildi korur. Ek olarak, bu protokol, kompozit ve izole dokular için desellülarizasyon protokollerinde tipik olarak kullanılandan daha düşük bir SDS konsantrasyonu kullanarak daha az toksik bir desellülarizasyon yaklaşımı önermektedir12. Önerilen ex vivo biyoreaktör sistemi diğer dokular ve modeller için de uyarlanabilir.
Sonuç olarak, önerilen protokol, ex vivo makine perfüzyon sistemi kullanılarak sıçan arka bacakları için güvenilir ve tekrarlanabilir bir cerrahi teknik ve desellülarizasyon yöntemi sunmaktadır. Gelecekteki uygulamalar arasında bu iskelenin dokuya özgü hücrelerle yeniden doldurulması ve kemik, kas ve sinir gibi dokulardaki fonksiyonel kapasitenin yenilenmesi için yolların incelenmesi yer almaktadır. Gelecekteki çalışmalar ayrıca hücre dışı matrisi, doğal vaskülatür tutulmasını ve biyokimyasal özellikleri karakterize edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Şekil 3A, BioRender.com yılında oluşturulmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL | Baxter Corporation | JB1308M | |
| 1 mL Disposable Serological Pipets | VWR | 75816-102 | |
| 10 cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 3-way Stopcock | Obtained from Research Institution | ||
| 5cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 70% Isopropyl Alcohol | Obtained from Research Institution | ||
| Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm | VWR | CA28143-310 | |
| Adson Forceps, Straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”) | VWR | 38112 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL | Multicell | 450-115-EL | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 12029-12 | |
| Connectors for 1/16" to 1/8" Tubes | McMasterCarr | 5117K52 | |
| Female Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K328 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Fine Forceps with Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL | LEO Pharma Inc. | 006174-09 | |
| Male Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K322 | |
| Micro Needle Holder | WLorenz | 04-4125 | |
| Microscissors | WLorenz | SP-4506 | |
| Peracetic Acid | Sigma Aldrich | 269336-100ML | |
| Peristaltic Pump, 3-Channel | Cole Parmer | RK-78001-68 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL | Wisent | 311-425-CL | |
| Povidone Surgical Scrub Solution | Obtained from Research Institution | ||
| Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL | Cole Parmer | RK-96450-40 | |
| Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone | Cole Parmer | RK-96410-16 | |
| Scalpel Blade - #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg | Bioshop | SDS003.1 | |
| Surgical Suture #6-0 | Covidien | VS889 |
References
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
- Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
- Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016 (10), 1-16 (2016).
- Fleissig, Y. Y., Beare, J. E., LeBlanc, A. J., Kaufman, C. L. Evolution of the rat hind limb transplant as an experimental model of vascularized composite allotransplantation: Approaches and advantages. SAGE Open Medicine. 8, 205031212096871 (2020).
- Tao, M., et al. Sterilization and disinfection methods for decellularized matrix materials: Review, consideration and proposal. Bioactive Materials. 6 (9), 2927-2945 (2021).
- Chen, Y., Geerts, S., Jaramillo, M., Uygun, B. E. Preparation of decellularized liver scaffolds and recellularized liver grafts. Methods in Molecular Biology. 1577, 255-270 (2018).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Cohen, S., et al. Generation of vascular chimerism within donor organs. Scientific Reports. 11 (1), 13437 (2021).
- Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).
- Urciuolo, A., et al. Decellularised skeletal muscles allow functional muscle regeneration by promoting host cell migration. Scientific Reports. 8 (1), 8398 (2018).
- Jank, B. J., et al. Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft. Biomaterials. 61, 246-256 (2015).
