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Immunology and Infection

निप्पोस्ट्रोगिलस ब्रासिलिएंसिस संक्रमण मॉडल में आईएल -9-उत्पादक लिम्फोइड कोशिकाओं के अध्ययन के लिए एक रणनीति

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64075
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México
* These authors contributed equally

Summary

आईएल -9-व्यक्त टी और आईएलसी 2 कोशिकाएं एन ब्रासिलेंसिस संक्रमण के दौरान प्रेरित होती हैं, फिर भी उनकी कम आवृत्ति और अंतर कैनेटीक्स के कारण संक्रमित आंत में उनके लक्षण वर्णन को काफी हद तक अनदेखा किया गया है। यह प्रोटोकॉल विभिन्न लक्षित अंगों से इन कोशिकाओं के अलगाव और विभिन्न संक्रमण चरणों में प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से उनकी पहचान की पुष्टि का वर्णन करता है।

Abstract

आईएल -9 एक प्लियोट्रोपिक साइटोकिन है जो विभिन्न प्रक्रियाओं से जुड़ा हुआ है, जिसमें एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा, एलर्जी विकृति का प्रेरण और हेल्मिन्थ संक्रमण के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया शामिल है, जहां यह परजीवी के निष्कासन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। निपोस्ट्रोगिलस ब्रासिलेंसिस संक्रमण के एक मुराइन मॉडल में, आईएल -9 मुख्य रूप से सीडी 4 + टी लिम्फोसाइटों और जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं द्वारा निर्मित होता है जो फेफड़ों, छोटी आंत और निकास लिम्फ नोड्स में पाए जाते हैं। आईएल -9 के इंट्रासेल्युलर धुंधलापन में शामिल तकनीकी कठिनाइयों को देखते हुए, साथ ही संक्रमण पर छोटी आंत से हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं को अलग करने की जटिलता को देखते हुए, इस मॉडल में विभिन्न लिम्फोइड और गैर-लिम्फोइड ऊतकों में आईएल -9 की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए एक व्यापक लेकिन सीधा प्रोटोकॉल की आवश्यकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल सीडी 4 + टी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित आईएल -9 के कैनेटीक्स और फेफड़ों और छोटी आंत में जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं को रेखांकित करता है, एन ब्रासिलेंसिस द्वारा लक्षित मुख्य अंग, साथ ही साथ संक्रमण के दौरान मीडियास्टिनल और मेसेंटेरिक लिम्फ नोड्स में। इसके अलावा, यह सेल प्रकार और रुचि के अंग के आधार पर संक्रमण के लिए आवश्यक लार्वा की संख्या का विवरण देता है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एन ब्रासिलेंसिस संक्रमण मॉडल में रुचि के विशिष्ट कोशिकाओं, अंगों और रोग चरणों पर ध्यान केंद्रित करने का अवसर प्रदान करके समय और संसाधनों को बचाने के लिए परख के मानकीकरण में सहायता करना है।

Introduction

हुकवर्म आंतों के परजीवी हैं जो दुनिया भर में लगभग 700 मिलियन लोगों को संक्रमित करते हैं, ज्यादातर अविकसित देशों में उष्णकटिबंधीय क्षेत्रों में। मनुष्यों में सबसे आम हुकवर्म परजीवी एन्सिलोस्टोमा डुओडेनल और नेकेटर अमेरिकनस के साथ उच्च तीव्रता वाले संक्रमण, एनीमिया और प्रोटीन की कमी का कारण बनते हैं जिसके परिणामस्वरूप विकास औरमानसिक विकास में देरी हो सकती है। एन अमेरिकनस और कृंतक परजीवी निप्पोस्ट्रोगिलस ब्रासिलेंसिस अपने मेजबान में प्रोटोटाइप टाइप 2 प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित करते हैं और उनके जीवन चक्र में समानताएं साझा करते हैं। इसलिए, एन ब्रासिलिएंसिस के साथ चूहों का संक्रमण मानव हुकवर्म संक्रमण के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल है। स्टेज 3 (एल 3) एन ब्रासिलिएन्सिस संक्रामक लार्वा संक्रमण के बाद पहले कुछ घंटों में त्वचा से फेफड़ों में चले जाते हैं। एक बार फेफड़े में, वे एल 4 बन जाते हैं और निगलने के लिए श्वासनली को स्थानांतरित करते हैं, पेट से गुजरते हैं, और 4-5 दिनों के भीतर वयस्क (एल 5) बनने के लिए आंत तक पहुंचते हैं। आंत में, एल 5 कीड़े अंडे देते हैं जो परजीवी जीवन चक्र2 को फिर से शुरू करने के लिए मल में उत्सर्जित होते हैं।

ब्रासिलिएंसिस द्वारा प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को आईएल -4, आईएल -5, आईएल -9, आईएल -10 और आईएल -13 सहित कई प्रकार के साइटोकिन्स में वृद्धि की विशेषता है, साथ ही ईोसिनोफिलिया, बेसोफिलिया, गोब्लेट और मस्तूल सेल हाइपरप्लासिया, और आईजीजी 1 और आईजीई उत्पादन में वृद्धि हुई है। ब्रासिलिएंसिस संक्रमण पर प्राप्त प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को पहचानने और परिभाषित करने की कोशिश करने वाले अधिकांश अध्ययन इस मॉडल3 में आईएल -4 या आईएल -13 की भूमिका पर केंद्रित हैं। हालांकि, आईएल -9-व्यक्त कोशिकाओं की पहचान और लक्षण वर्णन और इस साइटोकिन के कार्य को काफी हद तक अनदेखा कर दिया गया था, जब तक कि लिकोना-लिमोन एट अल ने एन ब्रासिलेंसिस के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में आईएल -9 के लिए महत्वपूर्ण भूमिका का प्रदर्शन करने वाला पहला अध्ययन प्रकाशित नहीं किया। रिपोर्टर चूहों का उपयोग करते हुए, इस अध्ययन ने टी कोशिकाओं (ज्यादातर टी हेल्पर 9) और टाइप 2 जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं (आईएलसी 2) को संक्रमण4 पर आईएल -9 व्यक्त करने वाले मुख्य सेलुलर उपसमुच्चय के रूप में वर्णित किया।

हेल्मिन्थ-संक्रमित फेफड़ों से प्रतिरक्षा कोशिकाओं का अलगाव और लक्षण वर्णन संभव है, और बड़े पैमाने पर 3,4 की सूचना दी गई है। हालांकि, अंतर्निहित ऊतक रीमॉडेलिंग और बलगम उत्पादन के कारण, संक्रमित आंत में ऐसा करना एक तकनीकी चुनौती साबित हुई, जब तक कि फेरर-फ़ॉन्ट एट अल.5 का हालिया प्रकाशन नहीं हुआ। समूह ने हेलिग्मोसोमाइड्स पॉलीगिरस-संक्रमित मुराइन आंतों से प्रतिरक्षा उपसमुच्चय के एकल-कोशिका निलंबन को अलग करने और विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल को रेखांकित किया। इसके आधार पर, हमने अब एन ब्रासिलेंसिस संक्रमित आंत से आईएल -9-व्यक्त लिम्फोइड कोशिकाओं के अलगाव और साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल मानकीकृत किया है। इसके अलावा, हमने संक्रमण के दौरान विभिन्न सेलुलर स्रोतों और शारीरिक स्थानों से आईएल -9 कैनेटीक्स की स्थापना की है।

इस संक्रमण में शामिल विशिष्ट कोशिका आबादी को चिह्नित करना परजीवी के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और मेजबान के साथ इसकी बातचीत की व्यापक समझ के लिए महत्वपूर्ण है। यह व्यापक प्रोटोकॉल रुचि के रोग चरणों में वांछित अंगों से आईएल -9-उत्पादक कोशिकाओं को अलग करने और विश्लेषण करने के लिए एक स्पष्ट मार्ग प्रदान करता है, जिससे सामान्य रूप से एन ब्रासिलिएंसिस संक्रमण और परजीवी संक्रमण में इन कोशिकाओं की भूमिका के बारे में ज्ञान में तेज सुधार की अनुमति मिलती है।

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Protocol

यहां वर्णित सभी पशु प्रयोगों को सेलुलर फिजियोलॉजी संस्थान, मैक्सिको के राष्ट्रीय स्वायत्त विश्वविद्यालय की पशु हैंडलिंग के लिए आंतरिक समिति (सीआईसीयूएएल) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

नोट: पूरे प्रोटोकॉल का एक फ़्लोचार्ट चित्रा 1 में दिखाया गया है।

1. चूहों का आवास

  1. चूहों के 8-10 सप्ताह के, महिला या पुरुष समूहों का उपयोग करें, जिन्हें 12 घंटे के प्रकाश / अंधेरे चक्रों में निरंतर तापमान और आर्द्रता के साथ जानवरों की सुविधाओं में रखा गया है, जिसमें पानी और भोजन तक सीमित लिबिटम पहुंच है ।
    नोट: यह प्रोटोकॉल सी 57बीएल / 6 पृष्ठभूमि में एक आईएल -9 रिपोर्टर माउस तनाव का उपयोग करता है, जैसा कि पहले वर्णित4; हालांकि, अन्य आईएल -9 रिपोर्टर उपभेदों का उपयोग 6,7,8, साथ ही इंट्रासेल्युलर आईएल -9 धुंधला किया जा सकता है, जिसमें परिवर्तनीय परिणाम9 हैं।

2. चूहों का संक्रमण

  1. संक्रमण से 1 दिन पहले शरीर के मध्य से पूंछ के आधार के पास तक चूहों की पीठ को शेव करें। एनेस्थेटिक्स का उपयोग आवश्यक नहीं है।
  2. चमड़े के नीचे प्रत्येक माउस को पीठ के निचले हिस्से में फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) 10 के 100 μL में 200 व्यवहार्य तीसरे चरण के एन ब्रासिलेंसिस लार्वा (एल 3) के साथ टीका लगाया जाता है, जैसा कि पहले 2,11 वर्णित किया गया था, या अकेले पीबीएस के 100 μL को नियंत्रण के रूप में इंजेक्ट करें। संक्रमण के बाद दिन 4, दिन 7, या दिन 10 पर जानवरों की बलि दें।

3. फेफड़े, छोटी आंत, मीडियास्टिनल और मेसेंटेरिक लिम्फ नोड्स का अलगाव

  1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा माउस को इच्छामृत्यु करें। माउस को इसकी पीठ पर रखें और इसे 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें। कैंची का उपयोग करके एक मध्य रेखा चीरा बनाएं और पेट और वक्ष क्षेत्रों को उजागर करने के लिए त्वचा को खोलें।
    नोट: आइसोफ्लुरेन का उपयोग वैकल्पिक इच्छामृत्यु विधि12 के रूप में किया जा सकता है। कार्बन डाइऑक्साइड कक्षों की सिफारिश नहीं की जाती है, क्योंकि सीओ2 फेफड़ों के ऊतकों को नुकसान पहुंचाता है और रक्तस्राव13 की ओर जाता है।
  2. मीडियास्टिनल लिम्फ नोड्स और फेफड़ों का अलगाव
    1. उरोस्थि पर एक चीरा लगाएं और पसलियों और वक्ष की मांसपेशियों को हटाने के लिए "वी" आकार में काट लें। एक बार वक्ष गुहा उजागर होने के बाद, हृदय के नीचे अन्नप्रणाली के बगल में मीडियास्टिनल लिम्फ नोड्स का पता लगाएं ( पूरक चित्र 1 देखें)।
    2. मीडियास्टिनल लिम्फ नोड्स को निकालें और उन्हें 12-वेल कल्चर प्लेट में आर -10 माध्यम (तालिका 1) के 1 एमएल में एकत्र करें। प्रसंस्करण तक प्रकाश से सुरक्षित बर्फ पर रखें।
      नोट: इन प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले रिपोर्टर चूहों से फ्लोरोसेंट सिग्नल को कम करने से बचने के लिए नमूनों को प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए।
    3. फेफड़ों को निकालें और उन्हें प्रति माउस 12-वेल कल्चर प्लेट में आर -10 माध्यम के 1 एमएल में इकट्ठा करें। प्रसंस्करण तक प्रकाश से सुरक्षित बर्फ पर रखें।
  3. मेसेंटेरिक लिम्फ नोड श्रृंखलाओं और छोटी आंतों का अलगाव
    1. पेरिटोनियल गुहा को उजागर करें, और बृहदान्त्र के साथ मेसेंटेरिक लिम्फ नोड (एमएलएन) श्रृंखला को उजागर करने के लिए छोटी आंत को दाईं ओर सावधानीपूर्वक ले जाएं।
    2. फोर्सप्स का उपयोग करके, एमएलएन को हटा दें, इसे पेपर टॉवल पर धीरे से रोल करें, और वसा को खींचें।
    3. एमएलएन को 12-वेल कल्चर प्लेट में आर -10 माध्यम के 1 एमएल में स्थानांतरित करें। प्रसंस्करण तक प्रकाश से सुरक्षित बर्फ पर रखें।
    4. छोटी आंत को पाइलोरिक स्फिंक्टर के ठीक नीचे और सेकुम के ऊपर काटें। संलग्न मेसेंटरी और वसा ऊतक को हटाते हुए, बल की मदद से आंत को धीरे-धीरे बाहर निकालें।
    5. छोटी आंत को एक पेपर तौलिया पर रखें और उदारता से इसे पीबीएस के साथ नम करें। कैंची के साथ छोटी आंत से पियर के पैच निकालें।
      ध्यान दें: व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए, शेष वसा ऊतक को हटा दें, और पूरी प्रक्रिया के दौरान पीबीएस के साथ छोटी आंत को नम रखें।
    6. कैंची का उपयोग करके छोटी आंत को अनुदैर्ध्य रूप से काटें, और फेकल सामग्री और बलगम को हटाने के लिए खुली आंत पर धीरे से बल को स्लाइड करें।
    7. छोटी आंत को बल के साथ पकड़ें, और इसे बर्फ पर पीबीएस के 5 एमएल में सावधानीपूर्वक कुछ बार डुबोकर धो लें। दो बार दोहराएं।
    8. छोटी आंत को छोटे टुकड़ों (लगभग 5 मिमी) में काटें, और उन्हें 2% एफबीएस के साथ 10 एमएल एचबीएसएस14 के साथ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें (तालिका 1)। तुरंत इंट्राएपिथेलियल और लैमिना प्रोप्रिया कोशिकाओं को अलग करना जारी रखें।

4. छोटी आंत, फेफड़े और लिम्फ नोड्स से एकल-कोशिका निलंबन की तैयारी

नोट: छोटी आंतों से एकल-कोशिका निलंबन तैयार करते समय प्रति व्यक्ति अधिकतम छह चूहों को संसाधित करना बेहद महत्वपूर्ण है, क्योंकि लंबी प्रसंस्करण अवधि के साथ सेल व्यवहार्यता काफी कम हो जाती है। इस विधि को हेलिग्मोसोमाइड्स पॉलीजाइरस संक्रमण माउस मॉडल5 से अनुकूलित किया गया था।

  1. हिलने वाले इनक्यूबेटर, आर -20 माध्यम, एचबीएसएस, और एचबीएसएस -2 एमएम ईडीटीए (तालिका 1) को 37 डिग्री सेल्सियस पर प्री-वार्म करें।
  2. प्रति नमूना 10 एमएल छोटी आंत पाचन माध्यम (तालिका 1) तैयार करें।
  3. चरण 3.3.8 से आंत के टुकड़ों को हाथ से जोर से हिलाएं।
  4. ग्लास फ़नल पर नायलॉन जाल (लगभग 10 सेमी x 10 सेमी) के माध्यम से प्रत्येक नमूने को फ़िल्टर करें। जाल पर 10 एमएल पूर्व-गर्म एचबीएसएस जोड़कर नमूने को धोएं और प्रवाह-माध्यम को छोड़ दें। एक बार और दोहराएं।
    नोट: प्रत्येक नमूने के लिए एक नई जाली का उपयोग करें और पूरी प्रक्रिया में इसका पुन: उपयोग करें।
  5. फ़नल से जाल निकालें, और जाल से नमूने को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 10 एमएल गर्म एचबीएसएस -2 एमएम ईडीटीए (चरण 4.1) के साथ एकत्र करें। 200 आरपीएम पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. अधिकतम गति (3,200 आरपीएम) पर 10 सेकंड के लिए भंवर और ग्लास फ़नल पर जाल के साथ नमूने को फ़िल्टर करें, 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में प्रवाह-माध्यम से पुनर्प्राप्त करें।
  7. चरण 4.5 और 4.6 को दो बार दोहराएं, एक ही 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में प्रवाह-थ्रू को पुनर्प्राप्त करें। इंट्राएपिथेलियल कोशिकाएं इस 30 एमएल अंश में स्थित हैं। शेष ऊतक को बचाएं।
  8. इंट्राएपिथेलियल कोशिकाओं से एकल-सेल निलंबन तैयारी
    1. कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 450 x g पर चरण 4.7 में बरामद 30 एमएल सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज किया गया। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
    2. RT पर 5 मिनट के लिए 450 x g पर 5 mL PBS और सेंट्रीफ्यूज जोड़ें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
    3. सेल पेलेट को आरपीएमआई के 3 एमएल में 10% एफबीएस -20 μg / mL DNase में पुन: निलंबित करें (तालिका 1)। बर्फ पर रखें, सेल धुंधला होने तक प्रकाश से सुरक्षित रहें।
  9. लैमिना प्रोप्रिया कोशिकाओं से एकल-सेल निलंबन तैयारी
    1. शेष छोटी आंत के ऊतकों को चरण 4.7 से फ़नल पर जाल के माध्यम से 10 एमएल से अधिक गर्म एचबीएसएस डालकर धोएं। धोने को दोहराएं। छोटी आंत पाचन माध्यम के 10 एमएल के साथ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में जाल से ऊतक एकत्र करें।
    2. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 200 आरपीएम पर हिलने के साथ। हर 5 मिनट में 10 सेकंड के लिए अधिकतम गति पर भंवर।
    3. पाचन प्रतिक्रिया को रोकने के लिए एफएसीएस-ईडीटीए बफर (तालिका 1) के 10 एमएल जोड़ें, और इसे बर्फ पर रखें।
    4. प्रत्येक नमूने को सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके 100 μm सेल छन्नी के माध्यम से फ़िल्टर करें, बर्फ पर रखी 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में निलंबन को पुनर्प्राप्त करें।
    5. सेंट्रीफ्यूज 600 x g पर 6 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    6. सतह पर तैरने वाले को त्याग दें। सेल पेलेट को 5 एमएल पीबीएस और सेंट्रीफ्यूज के साथ 600 x g पर 6 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर धोएं।
    7. सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, और सेल पेलेट को 1 एमएल आरपीएमआई 10% एफबीएस -20 μg / mL DNase में पुन: निलंबित करें। बर्फ पर रखें, सेल धुंधला होने तक प्रकाश से सुरक्षित रहें।
  10. फेफड़ों से एकल-कोशिका निलंबन तैयारी
    नोट: प्रत्येक फेफड़े और छोटी आंत को विस्तारित हैंडलिंग समय से बचने के लिए दो लोगों द्वारा समानांतर में संसाधित किया जाना चाहिए, जिसके परिणामस्वरूप सेल व्यवहार्यता कम होती है।
    1. संसाधित नमूने के प्रति 4 एमएल फेफड़े के पाचन माध्यम (तालिका 1) तैयार करें।
    2. चरण 3.2.3 से फेफड़ों वाले कुएं से आरपीएमआई माध्यम को हटा दें। फेफड़ों को बारीक कैंची से छोटे टुकड़ों में काट लें।
    3. फेफड़ों के टुकड़ों को स्पैटुला के साथ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। फेफड़ों के पाचन माध्यम के 4 एमएल जोड़ें (तालिका 1)।
    4. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 250 आरपीएम पर हिलने के साथ। समाप्त होने पर, प्रत्येक नमूने को संसाधित होने तक बर्फ पर रखें।
    5. प्रत्येक नमूने को 100 μm सेल छन्नी के माध्यम से फ़िल्टर करें, जो 6-वेल कल्चर प्लेट के एकल कुएं में स्थित है। एक सिरिंज प्लंजर के साथ ऊतक को अलग करें।
    6. प्रत्येक नमूने को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पुनर्प्राप्त करें, और आर -2 माध्यम के 4 एमएल जोड़ें (तालिका 1)। बर्फ पर रखें जबकि अन्य नमूने संसाधित किए जाते हैं।
    7. सेंट्रीफ्यूज 600 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और सेल पेलेट को आर -5 माध्यम के 1 एमएल में पुन: निलंबित करें (तालिका 1)।
    8. सेंट्रीफ्यूजिंग करते समय, हेमटोपोइएटिक सेल अंश 15,16 को समृद्ध करने के लिए प्रति नमूना 27.5% घनत्व-ढाल समाधान (तालिका1) का 4 एमएल तैयार करें। एकल-कोशिका पृथक्करण के लिए यह रणनीति अन्य समान घनत्व ढाल मीडिया17 की तुलना में अधिक कुशल, लागत प्रभावी और कम विषाक्त है।
    9. चरण 4.10.7 से सेल निलंबन के 1 एमएल में 27.5% घनत्व-ढाल समाधान का 4 एमएल जोड़ें, और जोर से हिलाएं।
    10. दो चरण बनाने के लिए मिश्रित निलंबन के शीर्ष पर धीरे-धीरे 1 एमएल आर -5 माध्यम (तालिका 1) जोड़ें।
    11. आरटी में 20 मिनट के लिए 1,500 x g पर सेंट्रीफ्यूज, कम त्वरण और ब्रेक ऑफ के साथ। दो चरणों के बीच बनने वाली अंगूठी का निरीक्षण करें।
    12. 1 एमएल माइक्रोपिपेट के साथ दो चरणों के बीच बनाई गई अंगूठी को पुनर्प्राप्त करें, और आर -2 माध्यम के 4 एमएल में पुन: निलंबित करें।
    13. सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 450 x g पर। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें। एसीके बफर (तालिका 1) के 1 एमएल में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें, और आरटी पर 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    14. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए आर -5 मध्यम और सेंट्रीफ्यूज 450 x g पर 4 एमएल जोड़ें। सतह पर तैरने वाला छोड़ दें और सेल पेलेट को आर -10 माध्यम के 1 एमएल में पुन: निलंबित करें। बर्फ पर रखें, प्रवाह साइटोमेट्री के लिए धुंधला होने तक प्रकाश से संरक्षित रहें।
  11. लिम्फ नोड्स से एकल-सेल निलंबन तैयारी
    1. चरण 3.2.2 या 3.3.3 से लिम्फ नोड्स को 6-वेल कल्चर प्लेट से एक कुएं में जाल के दो टुकड़ों के बीच रखें, और सिरिंज प्लंजर के साथ अलग करें।
    2. सेल निलंबन को 1.5 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पुनर्प्राप्त करें और सेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 450 x g पर पुनर्प्राप्त करें।
    3. सतह पर तैरने वाला छोड़ दें, और सेल पेलेट को आर -10 माध्यम के 1 एमएल में पुन: निलंबित करें। बर्फ पर रखें, प्रवाह साइटोमेट्री के लिए धुंधला होने तक प्रकाश से संरक्षित रहें।
      नोट: यदि झुरमुट दिखाई दे रहे हैं, तो नमूने को 100 μm सेल छन्नी के माध्यम से फ़िल्टर करें।

5. फ्लो साइटोमेट्री के लिए सेल धुंधला (चित्रा 2 और चित्रा 3)

नोट: लिम्फ नोड सेल निलंबन चरण 4.11.3 से 450 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करता है, और सेल पेलेट को एफएसीएस बफर के 500 μL में पुन: निलंबित करता है (तालिका 1)।

  1. आईएलसी 2 की पहचान के लिए सेल धुंधला होना (चित्रा 3 और पूरक चित्रा 2)
    नोट: यह धुंधला प्रक्रिया आईएल -9-व्यक्त आईएलसी 2 कोशिकाओं की पहचान के लिए विशिष्ट है।
    1. चरण 4.10.14 से प्लेट 150 μL प्रति फेफड़े का नमूना (लगभग 1.8 x 106 कोशिकाएं), और चरण 4.11.3 (मीडियास्टिनल और मेसेंटेरिक लिम्फ नोड नमूनों के लिए क्रमशः 0.7 x 106 और 2.2 x 10 6 कोशिकाओं) से 50 μL प्रति लिम्फ नोड नमूना,96-अच्छी तरह से शंक्वाकार बॉटम कल्चर प्लेट में। एफएसीएस बफर के 100 μL जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 450 x g पर सेंट्रीफ्यूज जोड़ें।
    2. प्लेट 100 μL प्रति छोटी आंत के नमूने (इंट्राएपिथेलियलऔर लैमिना प्रोप्रिया नमूनों के लिए क्रमशः लगभग 2.7 x 10 6 और 0.6 x 106 कोशिकाएं) 96-अच्छी तरह से शंक्वाकार बॉटम कल्चर प्लेट में चरण 4.8.3 और 4.9.7 से। 150 μL FACS बफर जोड़ें और 4 °C पर 5 मिनट के लिए 450 x g पर सेंट्रीफ्यूज जोड़ें।
    3. सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, और एफएसीएस बफर में पतला बायोटिनिलेटेड एंटीबॉडी कॉकटेल (तालिका 2) के 50 μL में प्रत्येक सेल गोली को फिर से निलंबित करें। प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: इंट्राएपिथेलियल और लैमिना प्रोप्रिया नमूनों के लिए 20 μg / mL DNase के साथ FACS बफर का उपयोग करें।
    4. FACS बफर के 150 μL जोड़ें। सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 450 x g पर।
    5. सतह पर तैरने वाला छोड़ दें, और सेल पेलेट को एफएसीएस बफर के 200 μL में पुन: निलंबित करें। सेंट्रीफ्यूज फिर से और सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
    6. सेल पेलेट को एंटीबॉडी/स्टेन कॉकटेल (तालिका 2) के 50 μL में पुन: निलंबित करें, और प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    7. FACS बफर के 150 μL जोड़ें। सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 450 x g पर।
    8. सतह पर तैरने वाला छोड़ दें, और सेल पेलेट को एफएसीएस बफर के 200 μL में पुन: निलंबित करें। सेंट्रीफ्यूज फिर से और सुपरनैटेंट को छोड़ दें। धोने (चरण 5.1.7) को दोहराएं, और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
    9. एफएसीएस बफर के 300 μL में सेल गोली को पुन: निलंबित करें, और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण करें।
    10. छोटी आंत और फेफड़ों के नमूनों के लिए, गेटिंग रणनीति का उपयोग करें: लिम्फोसाइट्स, एकल कोशिकाएं, जीवित कोशिकाएं, हेमटोपोइएटिक कोशिकाएं, सीडी 90 + वंश- कोशिकाएं, एसटी 2 + कोशिकाएं, और आईएल -9 + कोशिकाएं (चित्रा 3 ए, बी और पूरक चित्रा 2 ए)। लिम्फ नोड नमूनों के लिए, गेटिंग रणनीति का उपयोग करें: जीवित कोशिकाएं, एकल कोशिकाएं, सीडी 90 + वंश- कोशिकाएं, एसटी 2 + कोशिकाएं, और आईएल -9 + कोशिकाएं (पूरक चित्रा 2 बी, सी)।
  2. आईएल -9-उत्पादक लिम्फोसाइटों की पहचान के लिए सेल धुंधला (चित्रा 2 और पूरक चित्रा 3)
    1. चरण 4.10.14 से 1.5 एमएल ट्यूब (लगभग 14.6 x 106 कोशिकाओं ) में प्रति फेफड़े के नमूने में 800 μL स्थानांतरित करें। सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 450 x g पर। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
    2. लिम्फ नोड नमूनों के लिए, चरण 4.11.3 (मीडियास्टिनल और मेसेंटेरिक लिम्फ नोड नमूनों के लिए क्रमशः लगभग 5.6 x 106 और 17.5 x 106 कोशिकाओं) से सेल निलंबन की प्लेट 400 μL दो चरणों में 96-अच्छी तरह से शंक्वाकार निचली प्लेट में होती है।
      1. पहले 200 μL स्थानांतरित करें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 450 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
      2. संबंधित कुएं में एक और 200 μL स्थानांतरित करें। सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 450 x g पर, और सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
    3. सेल पेलेट को एंटीबॉडी/स्टेन कॉकटेल (तालिका 3) के 50-400 μL में पुन: निलंबित करें, और प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: फेफड़ों के नमूनों को 400 μL में, मीडियास्टिनल लिम्फ नोड नमूनों को 50 μL में, और मेसेन्टेरिक लिम्फ नोड नमूनों को धुंधला कॉकटेल के 100 μL में पुन: निलंबित किया जाना चाहिए।
    4. मीडियास्टिनल लिम्फ नोड नमूनों में एफएसीएस बफर के 150 μL और मेसेंटेरिक लिम्फ नोड नमूनों में 100 μL जोड़ें। सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 450 x g पर, और सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
    5. एफएसीएस बफर के क्रमशः 1 एमएल और 200 μL में छर्रों को पुन: निलंबित करके फेफड़े और लिम्फ नोड के नमूनों को धोएं। सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्रीसेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 450 x g पर। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें और धोने को दोहराएं।
    6. एफएसीएस बफर के 600 μL में फेफड़ों के नमूनों को पुन: निलंबित करें, और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा उनका विश्लेषण करें। गेटिंग रणनीति का उपयोग करें: लिम्फोसाइट्स, एकल कोशिकाएं, जीवित कोशिकाएं, हेमटोपोइएटिक कोशिकाएं, सीडी 4 + टीसीआर + कोशिकाएं, और आईएल -9 + कोशिकाएं (चित्रा 2 ए)।
    7. एफएसीएस बफर के 300 μL में लिम्फ नोड नमूनों को पुन: निलंबित करें, और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण करें। गेटिंग रणनीति का उपयोग करें: लिम्फोसाइट्स, एकल कोशिकाएं, जीवित कोशिकाएं, सीडी 4 + टीसीआर + कोशिकाएं, और आईएल -9 + कोशिकाएं (चित्रा 2 बी और पूरक चित्रा 3 ए)।

6. एकल-कोशिका निलंबन में कोशिकाओं की पूर्ण संख्या का निर्धारण

  1. चरण 4.8.3, 4.9.7, 4.10.14, और 4.11.3 को अलग करने वाले नमूनों को 1:20 अनुपात (नमूना का 10 μL + 190 μL PBS) पर पीबीएस के साथ पतला करें।
  2. चरण 6.1 से प्रत्येक पतला नमूने के 10 μL को ट्रिपैन ब्लू के 10 μL के साथ मिलाएं। एक हेमोसाइटोमीटर में 10 μL लोड करें और प्रत्येक कमजोर पड़ने पर विचार करते हुए जीवित कोशिकाओं की गणना करें।
  3. अलगाव के बाद एकल-कोशिका निलंबन में जीवित कोशिकाओं की कुल संख्या से प्रवाह साइटोमेट्री (व्यवहार्यता डाई नकारात्मक कोशिकाओं) द्वारा निर्धारित जीवित कोशिकाओं से रुचि की आबादी के प्रतिशत को गुणा करके कोशिकाओं की पूर्ण संख्या प्राप्त करें, और इस संख्या को 100 से विभाजित करें (पूरक चित्र 4, पूरक चित्र 5, और पूरक चित्र 6)।
    पूर्ण संख्या = (फ्लो साइटोमेट्री द्वारा निर्धारित जीवित कोशिकाओं से रुचि की आबादी का प्रतिशत x एकल-कोशिका निलंबन में जीवित कोशिकाओं की कुल संख्या)/100

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Representative Results

चूहों को चमड़े के नीचे 200 एल 3 स्टेज एन ब्रासिलेंसिस लार्वा के साथ इंजेक्ट किया गया था, या शाम नियंत्रण के लिए पीबीएस के साथ। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले लार्वा की संख्या को फेफड़ों, लिम्फोइड ऊतक और छोटी आंत से व्यवहार्य कोशिकाओं को अलग करने के लिए समायोजित किया गया था, पिछली रिपोर्टों के विपरीत जहां लिम्फोइड ऊतकों और फेफड़ों में कोशिकाओं का पता लगाने के लिए कीड़े के उच्च भार का उपयोग किया गयाथा। फेफड़े, मीडियास्टिनल लिम्फ नोड्स, मेसेंटेरिक लिम्फ नोड्स और छोटी आंत को लिम्फोसाइट अलगाव और आईएल -9 उत्पादक आबादी के लक्षण वर्णन के लिए संक्रमण के बाद 0, 4, 7 और 10 दिनों में काटा गया था। दो या दो से अधिक स्वतंत्र प्रयोगों में कुल 27 चूहों का उपयोग किया गया था, जिसमें नौ नियंत्रण और प्रति समय बिंदु चार से छह एन ब्रासिलेंसिस-संक्रमित चूहे शामिल थे। बेसल संख्या प्राप्त करने के लिए हर प्रयोग में शाम-संक्रमित नियंत्रण शामिल किए गए थे। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, आईएल -9-उत्पादक सीडी 4 + टी कोशिकाओं (इस मॉडल में ज्यादातर टीएच 9 कोशिकाओं) को परिमाणीकरण और आगे के विश्लेषण के लिए फेफड़ों, मेसेन्टेरिक और मीडियास्टिनल लिम्फ नोड्स से अलग किया जा सकता है।

संक्रमण के प्राकृतिक पाठ्यक्रम के बाद, हमने पहले फेफड़ों और मीडियास्टिनल लिम्फ नोड्स में मौजूद आईएल -9-उत्पादक सीडी 4 + टी लिम्फोसाइट्स (टीएच 9) की आवृत्तियों का आकलन किया (चित्रा 2 ए और पूरक चित्रा 3 ए में दिखाई गई गेटिंग रणनीति)। दोनों अंगों में, Th9 आवृत्तियों में वृद्धि हुई, जो दिन 4 से शुरू हुई, और संक्रमण के बाद 7 वें दिन चरम पर पहुंच गई (चित्रा 2C), एक वृद्धि जो Th9 निरपेक्ष संख्या (पूरक चित्रा 4A, B) में भी देखी गई थी। मेसेंटेरिक लिम्फ नोड्स (चित्रा 2 बी में दिखाए गए गेटिंग रणनीति) में, पिछलीरिपोर्ट 4 के अनुसार संक्रमण के बाद 7 और 10 दिनों (चित्रा 2 सी और पूरक चित्रा 4 सी) में टीएच 9 कोशिकाओं की आवृत्तियों और पूर्ण संख्या दोनों में उल्लेखनीय वृद्धि हुई थी। इंट्राएपिथेलियल और लैमिना प्रोप्रिया नमूनों में टी कोशिकाओं और आईएलसी 2 की उपस्थिति की पुष्टि की गई थी; हालांकि, संक्रमण के दौरान इन आंतों के डिब्बों में कोई टीएच 9 कोशिकाएं नहीं देखी गईं (पूरक चित्रा 3 बी, सी)।

फिर हमने संक्रमित चूहों के लिम्फोइड और गैर-लिम्फोइड ऊतकों में आईएल -9-व्यक्त आईएलसी 2 कोशिकाओं का मूल्यांकन किया ( चित्र 3 ए, बी और पूरक चित्रा 2 में दिखाई गई गेटिंग रणनीति)। हमने संक्रमण के बाद 7 वें दिन फेफड़ों में आईएलसी 2 व्यक्त करने वाले एसटी 2 + आईएल -9- और एसटी 2 + आईएल -9 + की आवृत्तियों में उल्लेखनीय वृद्धि देखी (चित्रा 3 सी)। इसी समय, पूर्ण संख्याओं के विश्लेषण से संक्रमण के बाद 7 वें दिन केवल एसटी 2 + आईएल -9 + आबादी में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि का पता चला (पूरक चित्रा 5 ए)। मीडियास्टिनल लिम्फ नोड्स ( पूरक चित्र 2 बी में दिखाए गए गेटिंग रणनीति) में, आईएल -9-व्यक्त आईएलसी 2 कोशिकाओं (एसटी 2 + आईएल -9 +) की संख्या में संक्रमण के बाद 10 वें दिन में काफी वृद्धि हुई, जबकि एसटी 2 + कोशिकाओं की पूर्ण संख्या में वृद्धि की प्रवृत्ति दिखाई दी, जो दिन 7 से शुरू हुई और संक्रमण के बाद 10 दिन तक जारी रही (पूरक चित्रा 6 ए, सी)।

आईएल -9 + आईएलसी 2 कोशिकाएं छोटी आंत के लैमिना प्रोप्रिया और इंट्राएपिथेलियल डिब्बों में भी पाई गईं (चित्र 3 बी और पूरक चित्रा 2 ए में दिखाई गई गेटिंग रणनीति)। ब्रासिलिएंसिस संक्रमण के परिणामस्वरूप दिन 4 में एसटी 2 + आईएल -9 + कोशिकाओं की आवृत्तियों में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि हुई, और लैमिना प्रोप्रिया में 7 और 10 दिनों में एसटी 2- आईएल -9 + आबादी में वृद्धि हुई। इंट्राएपिथेलियल कम्पार्टमेंट में, संक्रमण के बाद क्रमशः दिन 7 और दिन 10 में एसटी 2 + आईएल 9 + और एसटी 2- आईएल -9 + कोशिकाओं की आवृत्तियों में एक महत्वपूर्ण परिवर्तन देखा गया (चित्रा 3 सी)। महत्वपूर्ण रूप से, लार्वा भार की अपेक्षाकृत कम संख्या के साथ भी, परजीवी के संक्रमण ने छोटी आंत को व्यापक नुकसान पहुंचाया; इसलिए, आईएल -9-व्यक्त आईएलसी 2 की पूर्ण संख्याओं का विश्लेषण तकनीकी रूप से अव्यावहारिक है, जो जीवित कोशिकाओं की कम पैदावार के कारण इस आबादी की सटीक मात्रा में बाधा डालता है (पूरक चित्रा 5 बी, सी)। दूसरी ओर, मेसेंटेरिक लिम्फ नोड्स (पूरक चित्रा 2 सी में दिखाए गए गेटिंग रणनीति) के विश्लेषण ने संक्रमण के बाद 10 वें दिन एसटी 2 + आईएल -9-, एसटी 2 + आईएल -9 + और एसटी 2- आईएल -9 + आईएलसी 2 कोशिकाओं की पूर्ण संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि का खुलासा किया (पूरक चित्रा 6 डी), जैसा कि पहले बताया गयाथा। इस बीच, संक्रमण के दौरान इन आबादी की आवृत्तियों में कोई अंतर नहीं देखा गया (पूरक चित्रा 6 बी)। एसटी 2 और आईएल -9-व्यक्त कोशिकाओं के ये विविध उपसमुच्चय विवो में संभावित अंतर भूमिकाओं के साथ पेचीदा आबादी हैं, और प्राकृतिक बनाम भड़काऊ आईएलसी 2 के अनुरूप हो सकते हैं जैसा कि हाल ही में वर्णित 18,19,20,21 है। हालांकि, भविष्य के अध्ययनों में इसे संबोधित करने की आवश्यकता है।

सारांश में, हमने एन ब्रासिलिएंसिस-संक्रमित आंत से आईएल -9-व्यक्त कोशिकाओं की वसूली के लिए इस प्रोटोकॉल को समायोजित किया, जबकि अभी भी फेफड़ों और लिम्फोइड ऊतक में उनका पता लगाने में सक्षम हैं। परजीवी-संक्रमित आंत से प्रतिरक्षा कोशिकाओं को पुनः प्राप्त करना तकनीकी रूप से मुश्किल साबित हुआ है। यहां, संक्रमण के लिए उपयोग किए जाने वाले लार्वा की एक समायोजित संख्या के परिणामस्वरूप आंतों के ऊतक अखंडता में सुधार हुआ, जिसने आईएल -9 + आबादी की वसूली की अनुमति दी। हमारे ज्ञान के लिए, यह विशेष रूप से एन ब्रासिलिएंसिस संक्रमण के दौरान आंत में आईएल -9-व्यक्त कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए विकसित पहला प्रोटोकॉल है। फिर भी, इन चरणों के बाद अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं को भी अलग किया जा सकता है। यहां प्रस्तुत आंकड़ों से पता चलता है कि छोटी आंत में अधिकांश ऊतक निवासी आईएल -9-व्यक्त करने वाली कोशिकाएं आईएलसी 2 हैं।

Figure 1
चित्रा 1: वर्णित प्रोटोकॉल का फ़्लोचार्ट। विभिन्न अंगों को संसाधित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मुख्य चरणों के साथ योजनाबद्ध आरेख और अपेक्षित आईएल -9-व्यक्त सेल उपसमुच्चय प्राप्त करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: टीएच 9 कोशिकाएं फेफड़ों, मीडियास्टिनल और मेसेंटेरिक लिम्फ नोड्स में पाए जाते हैं । प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण और गेटिंग रणनीति (ए) फेफड़ों और (बी) मेसेंटेरिक लिम्फ नोड्स से टीएच 9 सेल पहचान के लिए उपयोग की जाती है। प्रत्येक अंग से एकल-कोशिका निलंबन को एक निश्चित व्यवहार्यता डाई, हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं की पहचान के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल एंटी-सीडी 45, और सीडी 4 + टी लिम्फोसाइटों की पहचान के लिए एंटी-टी-सेल रिसेप्टर (टीसीआर) β और एंटी-सीडी 4 के साथ दाग दिया गया था। जीएफपी + सिग्नल मौजूद टीएच 9 कोशिकाओं के प्रतिशत को इंगित करता है। पहला गेट लिम्फोइड कोशिकाओं के शास्त्रीय आकृति विज्ञान के साथ साइड स्कैटर (एसएससी)-ए/फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी)-ए गुणों को दर्शाता है। एकल-सेल घटनाओं का चयन किया गया था, इसके बाद जीवित कोशिकाएं और फिर सीडी 45+ कोशिकाएं थीं। इस आबादी के भीतर, हमने टीसीआर-β और सीडी 4 डबल-पॉजिटिव कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित किया, जिसमें से जीएफपी + कोशिकाओं को टीएच 9 कोशिकाओं के रूप में पहचाना गया था। लिम्फ नोड्स के धुंधला होने में एंटी-सीडी 45 एंटीबॉडी शामिल नहीं था, क्योंकि पूरी आबादी सकारात्मक होने की उम्मीद है। (सी) संक्रमण के बाद संकेतित समय पर फेफड़ों, मीडियास्टिनल और मेसेंटेरिक लिम्फ नोड्स में पाए जाने वाले टीएच 9 कोशिकाओं की आवृत्तियों। डेटा प्रति समूह, प्रति समय बिंदु, तीन स्वतंत्र प्रयोगों से विश्लेषण किए गए एक या दो चूहों के औसत ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करता है; अप्रकाशित टी-टेस्ट; *p≤ 0.05, **p≤ 0.001, ***p≤ 0.0001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: आईएल -9-उत्पादक आईएलसी 2 कोशिकाएं गैर-लिम्फोइड अंगों में पाई जाती हैं। (ए) फेफड़े और (बी) छोटी आंत लैमिना प्रोप्रिया से आईएल -9 + आईएलसी 2 कोशिकाओं की पहचान के लिए उपयोग की जाने वाली प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण और गेटिंग रणनीति। प्रत्येक अंग से एकल-कोशिका निलंबन को वंश कोशिकाओं (एंटी-बी 220, एंटी-सीडी 11 बी, एंटी-एफसीआरआई, एंटी-टीसीआर-β, एंटी-टीसीआर-ओ, एंटी-सिगलेक एफ, एंटी-सीडी 4, एंटी-सीडी 11 सी, एंटी-जीआर -1, एंटी-सीडी 8, एंटी-सीडी 19, एंटी-एनके 1.1, और एंटी-ईटी 119) की पहचान करने के लिए बायोटिनिलेटेड एंटीबॉडी के साथ चिह्नित किया गया था। सेल सस्पेंशन को तब फिक्सेबल वायबिलिटी डाई, फ्लोरोक्रोम-लेबल स्ट्रेप्टाविडिन, हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं की पहचान के लिए एंटी-सीडी 45 और आईएलसी 2 कोशिकाओं की पहचान के लिए एंटी-सीडी 90 के साथ दाग दिया गया था। पहला गेट लिम्फोइड कोशिकाओं के शास्त्रीय आकृति विज्ञान के साथ स्कैटर (एसएससी)-ए/साइड स्कैटर (एफएससी)-ए गुणों को दर्शाता है। एकल-सेल घटनाओं का चयन किया गया था, इसके बाद जीवित कोशिकाएं और फिर सीडी 45+ कोशिकाएं थीं। इस आबादी के भीतर, हमने सीडी 90 + लिन-कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित किया; इस समूह से, हमने आईएल -9 + आईएलसी 2 कोशिकाओं की पहचान करने के लिए एसटी 2 और जीएफपी अभिव्यक्ति का मूल्यांकन किया। (सी) फेफड़ों, लैमिना प्रोप्रिया और इंट्राएपिथेलियल सेल कम्पार्टमेंट में पाए जाने वाले आईएलसी 2 कोशिकाओं की आवृत्तियों संक्रमण के बाद संकेतित समय बिंदुओं पर। डेटा प्रति समूह, प्रति समय बिंदु, तीन स्वतंत्र प्रयोगों से विश्लेषण किए गए एक या दो चूहों के औसत ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करता है; अप्रकाशित टी-टेस्ट; * पी ≤ 0.05. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: रासायनिक समाधानों और उनकी रचनाओं की सूची। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: आईएल -9-उत्पादक आईएलसी 2 कोशिकाओं की पहचान करने के लिए एंटीबॉडी कॉकटेल। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 3: आईएल -9-उत्पादक टी लिम्फोसाइटों की पहचान करने के लिए एंटीबॉडी कॉकटेल। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 1: मीडियास्टिनल लिम्फ नोड स्थान का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। BioRender.com में बनाया गया कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री और गेटिंग रणनीति का उपयोग छोटी आंत और लिम्फ नोड्स से इंट्राएपिथेलियल कोशिकाओं के भीतर आईएल -9 + आईएलसी 2 की पहचान करने के लिए किया जाता है। (क) छोटी आंत ों के इंट्राएपिथेलियल कोशिकाओं से एकल-कोशिका निलंबन को सबसे पहले बायोटिन-लेबल एंटीबॉडी के साथ वंश कोशिकाओं (एंटी-बी220, एंटी-सीडी11बी, एंटी-एफसीआरआई, एंटी-टीसीआर-β, एंटी-टीसीआर-1, एंटी-सिगलेक एफ, एंटी-सीडी4, एंटी-सीडी11सी, एंटी-जीआर-1, एंटी-सीडी8, एंटी-सीडी19, एंटी-एनके11, और एंटी-टर119) का चयन करने के लिए इनक्यूबेट किया गया था। इसके बाद एक फिक्सेबल व्यवहार्यता डाई, फ्लोरोक्रोम-लेबल स्ट्रेप्टाविडिन, हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं की पहचान के लिए एंटी-सीडी 45 और आईएलसी 2 कोशिकाओं की पहचान के लिए एंटी-सीडी 90 के साथ धुंधला किया गया था। पहला गेट लिम्फोइड कोशिकाओं के शास्त्रीय आकृति विज्ञान के साथ साइड स्कैटर (एसएससी)-ए/फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी)-ए गुणों को दर्शाता है। एकल-सेल घटनाओं का चयन किया गया था, इसके बाद जीवित कोशिकाएं और फिर सीडी 45+ कोशिकाएं थीं। इस आबादी के भीतर, हमने सीडी 90 + लिन-कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित किया; इस समूह से, जीएफपी + कोशिकाओं को आईएल -9 + आईएलसी 2 कोशिकाओं के रूप में पहचाना गया था। (बी, सी) आईएल -9 + आईएलसी 2 कोशिकाओं की पहचान करने के लिए (बी) मीडियास्टिनल लिम्फ नोड्स और (सी) मेसेंटेरिक लिम्फ नोड्स के लिए प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री और गेटिंग रणनीति। लिम्फ नोड्स के धुंधला होने में एंटी-सीडी 45 एंटीबॉडी शामिल नहीं था, क्योंकि पूरी आबादी को सकारात्मक होने की उम्मीद थी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 3: प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण और गेटिंग रणनीति का उपयोग मीडियास्टिनल लिम्फ नोड्स और छोटी आंत में टीएच 9 कोशिकाओं की पहचान करने के लिए किया जाता है। (ए) मीडियास्टिनल लिम्फ नोड्स से एकल-सेल निलंबन को एक निश्चित व्यवहार्यता डाई और फ्लोरोसेंटली लेबल एंटी-टीसीआर-β और एंटी-सीडी 4 एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था। पहला गेट लिम्फोइड कोशिकाओं के शास्त्रीय आकृति विज्ञान के साथ साइड स्कैटर (एसएससी)-ए/फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी)-ए गुणों को दर्शाता है। एकल-सेल घटनाओं का चयन किया गया, इसके बाद जीवित कोशिकाओं और फिर टीसीआर-β और सीडी 4 डबल-पॉजिटिव कोशिकाओं का चयन किया गया; इस समूह से, जीएफपी + कोशिकाओं को टीएच 9 कोशिकाओं के रूप में पहचाना गया था। छोटी आंत से (बी) लैमिना प्रोप्रिया और (सी) इंट्राएपिथेलियल कोशिकाओं के लिए एक समान प्रवाह साइटोमेट्री रणनीति का उपयोग किया गया था, सिवाय इसके कि सीडी 45+ कोशिकाओं को जीवित कोशिकाओं के बाद चुना गया था, इसके बाद टीसीआर-β और सीडी 4 डबल-पॉजिटिव कोशिकाएं थीं, जहां से जीएफपी + कोशिकाओं को टीएच 9 कोशिकाओं के रूप में पहचाना गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 4: पूरे संक्रमण के दौरान Th9 कोशिकाओं की पूर्ण संख्या में काफी बदलाव होता है। टीसीआर-β और सीडी 4 डबल-पॉजिटिव कोशिकाओं से आईएल -9 + कोशिकाओं की पूर्ण संख्या (ए) फेफड़े, (बी) मीडियास्टिनल लिम्फ नोड्स और (सी) मेसेंटेरिक लिम्फ नोड्स में संक्रमण के बाद 0, 4, 7 और 10 दिनों में निर्धारित की गई थी। डेटा प्रति समूह, प्रति समय बिंदु, तीन स्वतंत्र प्रयोगों से विश्लेषण किए गए एक या दो चूहों के औसत ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करता है; अप्रकाशित टी-टेस्ट * पी ≤ 0.05, ** पी ≤ 0.001, *** पी ≤ 0.0001। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 5: आईएल -9 + आईएलसी 2 कोशिकाओं की पूर्ण संख्या पूरे संक्रमण में भिन्न होती है। संक्रमण के बाद 0, 4, 7 और 10 दिनों में लिन-सीडी 90 + आबादी से आईएल -9 + आईएलसी 2 कोशिकाओं की पूर्ण संख्या (ए) फेफड़े, (बी) लैमिना प्रोप्रिया, और (सी) छोटी आंत से इंट्राएपिथेलियल कोशिकाओं में निर्धारित की गई थी। डेटा प्रति समूह, प्रति समय बिंदु, तीन स्वतंत्र प्रयोगों से विश्लेषण किए गए एक या दो चूहों के औसत ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करता है; अप्रकाशित टी-टेस्ट * पी ≤ 0.05। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 6: संक्रमण के दौरान लिम्फ नोड्स में आईएल -9 + आईएलसी 2 कोशिकाओं की आवृत्तियों और पूर्ण संख्या में काफी वृद्धि होती है। (ए) मीडियास्टिनल लिम्फ नोड्स से आईएल -9 + आईएलसी 2 कोशिकाओं की आवृत्ति और (सी) पूर्ण संख्या। (बी) मेसेन्टेरिक लिम्फ नोड्स से आईएल -9 + आईएलसी 2 कोशिकाओं की आवृत्ति और (डी) पूर्ण संख्या। संक्रमण के बाद 0, 4, 7 और 10 दिनों में लिन-सीडी 90 + आबादी के भीतर आईएल -9 + आईएलसी 2 कोशिकाओं के रूप में मूल्य निर्धारित किए गए थे। डेटा प्रति समूह विश्लेषण किए गए एक या दो चूहों के औसत ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करता है, तीन स्वतंत्र प्रयोगों से, प्रति समय बिंदु; अप्रकाशित टी-टेस्ट * पी ≤ 0.05, *** पी ≤ 0.0001। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 7: आईएल -9 का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण जो एन ब्रासिलेंसिस संक्रमित आंत से आईएलसी 2 कोशिकाओं को व्यक्त करता है। संक्रमण के बाद 7 वें दिन आईएल -9-रिपोर्टर चूहों की आंत से अलग आईएलसी 2 कोशिकाओं के प्रतिनिधि भूखंड। आईएल -9 अभिव्यक्ति का मूल्यांकन आईएलसी 2 कोशिकाओं में किया गया था, जो संक्रमित रिपोर्टर चूहों (आईएल -9 आरईपी) के इंट्राएपिथेलियल या लैमिना प्रोप्रिया डिब्बों से ताजा पृथक थे, जबकि पहले वर्णित आईएल -9 इंट्रासेल्युलर स्टेनिंग प्रोटोकॉल9 (आईएल -9 एबी, आईएल -9 एंटीबॉडी क्लोन आरएम 9 ए 4, बायोलेजेंड का उपयोग करके)। आईएल-9-व्यक्त करने वाले आईएलसी 2 की पहचान करने के लिए, एकल सेल निलंबन को सबसे पहले बायोटिन लेबल एंटीबॉडी के साथ वंश कोशिकाओं (एंटी-बी 220, एंटी-सीडी 11 बी, एंटी-एफसीआरआई, एंटी-टीसीआर-β, एंटी-टीसीआर-1, एंटी-सिगलेक एफ, एंटी-सीडी 4, एंटी-सीडी 11 सी, एंटी-जीआर-1, एंटी-सीडी 8, एंटी-सीडी 19, एंटी-एनके 1.1, और एंटी-टीआर 119, एंटी-टीआर119 और एंटी-टीआर119) का चयन करने के लिए इनक्यूबेट किया गया था। प्लॉट ्स में आईएल-9-व्यक्त करने वाली आईएलसी2 कोशिकाओं को इंट्राएपिथेलियल (ए, बी) और लैमिना प्रोप्रिया (सी, डी) डिब्बों में मौजूद लिन-सीडी 45 + सीडी 90+ आबादी पर गेट किया गया है, जो ताजा पृथक कोशिकाओं (ए, सी) से रिपोर्टर सिग्नल के माध्यम से या आईएल -9 (बी, डी) के इंट्रासेल्युलर धुंधलापन के बाद पता लगाया गया है। नियंत्रण चूहों को पीबीएस के साथ इंजेक्शन दिया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

आंतों के परजीवी-मेजबान इंटरैक्शन और हेल्मिन्थ संक्रमण के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की पूरी समझ के लिए विभिन्न सेल आबादी और प्रभावकारक अणुओं की पहचान और विश्लेषण की आवश्यकता होती है जो ऊतक रीमॉडेलिंग और कृमि निष्कासन के प्रेरण के लिए महत्वपूर्ण हैं। मिट्टी-संचारित हेल्मिन्थ संक्रमण दुनिया भर के विकासशील देशों में एक बड़ी समस्या का प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, हाल ही में, एक प्रोटोकॉल जो इस संक्रमण से प्रभावित मुख्य अंग छोटी आंत में मौजूद दुर्लभ कोशिका आबादी के विश्लेषण की अनुमति देता था, उपलब्ध नहीं था। इस प्रोटोकॉल में पहले वर्णित तरीकों को शामिल किया गया है जो एन ब्रासिलेंसिस संक्रमण के दौरान फेफड़ों, मीडियास्टिनल और मेसेंटेरिक लिम्फ नोड्स में आईएल -9-व्यक्त लिम्फोइड कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण की अनुमति देता है, छोटी आंत में पहली बार इस आबादी की पहचान के अतिरिक्त लाभ के साथ।

इस प्रोटोकॉल की सफलता ऊतक प्रसंस्करण समय पर अत्यधिक निर्भर है। एक बार में प्रति व्यक्ति अधिकतम छह छोटी आंत के नमूनों को संसाधित करना अनिवार्य है। यदि विभिन्न अंगों को संसाधित किया जाना है, तो हम इसे किसी अन्य व्यक्ति द्वारा समानांतर में करने की सलाह देते हैं। अपेक्षाकृत कम परजीवी भार (200 एल 3 लार्वा) का उपयोग करके, यह प्रोटोकॉल एन ब्रासिलेंसिस संक्रमित आंत से लिम्फोइड कोशिकाओं के अलगाव की अनुमति देता है, जबकि इन कोशिकाओं को अन्य अंगों से अलग करने की क्षमता बनाए रखता है। उच्च परजीवी भार का उपयोग छोटी आंत से अलग कोशिकाओं की गुणवत्ता और मात्रा को खतरे में डालता है (डेटा नहीं दिखाया गया है); हालांकि, इसके परिणामस्वरूप अन्य अंगों में आईएल -9-व्यक्त लिम्फोइड कोशिकाओं की महत्वपूर्ण वृद्धि हो सकतीहै। आंत और मेसेंटेरिक लिम्फ नोड्स को संसाधित करते समय, पालन किए गए वसा ऊतक को हटाना महत्वपूर्ण है, क्योंकि ऐसा करने में विफलता के परिणामस्वरूप कोशिका मृत्यु में वृद्धि होती है। डेटा इस अवलोकन का समर्थन करता है कि संक्रमण का प्राकृतिक पाठ्यक्रम छोटी आंत से बरामद लिम्फोइड कोशिकाओं की पूर्ण संख्या को नकारात्मक रूप से प्रभावित करता है। यहां वर्णित अध्ययनों में, आईएल -9 + आईएलसी 2 कोशिकाओं की आवृत्तियों सुसंगत रहती हैं, जबकि पूर्ण संख्या प्रत्येक स्वतंत्र प्रयोग में उच्च परिवर्तनशीलता दिखाती है। इसलिए, पूर्ण संख्याओं से निकाले गए निष्कर्ष गलत हो सकते हैं और इससे बचा जाना चाहिए। इसके अलावा, ऊतकों में आईएल -9-व्यक्त टी कोशिकाओं की कम आवृत्ति को देखते हुए, कोशिकाओं की उच्चतम संभव संख्या के अधिग्रहण और धुंधला होने की सिफारिश की जाती है।

इस आईएलसी 2 विश्लेषण की एक सीमा इस आबादी को परिभाषित करने के लिए मार्करों के असतत संयोजन का उपयोग है। रुचि के ऊतक और संक्रमण के चरण के आधार पर, अतिरिक्त मार्कर, जैसे सीडी 25, केएलआरजी 1, और एसटी 2, का उपयोग आईएलसी2 कोशिकाओं 22 के अधिक विस्तृत फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन के लिए किया जा सकता है। हम स्वीकार करते हैं कि यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल आईएनएफईआर रिपोर्टर माउस स्ट्रेन4 पर आधारित है, और आईएल -9-व्यक्त कोशिकाओं की पहचान के लिए एक लाभ का प्रतिनिधित्व कर सकता है। हालांकि, हम उम्मीद करते हैं कि यहां पाए गए परिणाम वैकल्पिक रणनीतियों का उपयोग करके प्राप्त किए जा सकते हैं, जिसमें अन्य माउस रिपोर्टर उपभेदों और इंट्रासेल्युलर आईएल -9 स्टेनिंग 6,7,8,9 का उपयोग शामिल है। यह उल्लेख करना महत्वपूर्ण है कि पारंपरिक चूहों का उपयोग करने और इंट्राएपिथेलियल और लैमिना प्रोप्रिया कोशिकाओं में आईएल -9 के इंट्रासेल्युलर धुंधलापन करने से किसी भी पता लगाने योग्य संकेत खो सकता है और प्राप्त डेटा से समझौता हो सकता है (पूरक चित्रा 7)। यह एक उप-समूह को दागने के लिए आवश्यक दीर्घकालिक हेरफेर के कारण हो सकता है जो पहले से ही पूर्व विवो को अलग करने और बनाए रखने के लिए कठिन है। इसलिए, हम प्रसंस्करण समय को कम करने और विवो में आईएल -9 अभिव्यक्ति का विश्वसनीय विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए रिपोर्टर चूहों के उपभेदों के उपयोग की सलाह देते हैं। हम इस तथ्य को भी स्वीकार करते हैं कि टीएच 9 कोशिकाएं आईएल -923 को व्यक्त करने वाली एकमात्र टी कोशिकाएं नहीं हैं; हालांकि, इस परजीवी मॉडल में, हम इसे व्यक्त करने के लिए अन्य उपसमुच्चय की उम्मीद नहीं करेंगे। फिर भी, वर्णित संदर्भ में अन्य आईएल -9-व्यक्त उपसमुच्चय की उपस्थिति को त्यागने के लिए, ट्रांसक्रिप्शनल मार्करों के उपयोग के साथ टाइप 2 साइटोकिन्स का एक पूर्ण लक्षण वर्णन संभव है।

संक्रमण के बाद 5 दिन से पहले आईएल -9-व्यक्त लिम्फोइड कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव पहले रिपोर्ट किया गया है; हालांकि, इसके परिणामस्वरूप बहुत कम सेल आवृत्तियों4 होती हैं। इस अध्ययन में प्रोटोकॉल परजीवी निकासी2 की शुरुआत तक एन ब्रासिलिएंसिस संक्रमण कैनेटीक्स के एक बड़े हिस्से को कवर करता है। हालांकि, हमने देखा कि इस अध्ययन में कुछ सेल आबादी विश्लेषण की गई समय सीमा के भीतर बेसल स्तरों पर वापस नहीं आई, यह सुझाव देते हुए कि अध्ययन विवो में संक्रमण के अधिक उन्नत चरण में इन कोशिकाओं के व्यवहार पर पूर्ण परिप्रेक्ष्य रखने के लिए विस्तारित समय बिंदुओं से लाभ उठा सकता है। भले ही, हम मानते हैं कि यहां प्रस्तुत काम परजीवी संक्रमण मॉडल में आईएल -9-व्यक्त लिम्फोइड कोशिकाओं का अध्ययन करने में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए एक संदर्भ मार्गदर्शिका के रूप में काम कर सकता है, जिससे उन्हें रुचि के ऊतकों से विशिष्ट सेल प्रकारों का पता लगाने के लिए संक्रमण के आदर्श चरण का चयन करने की अनुमति मिलती है। कुल मिलाकर, यहां वर्णित विधियां टी लिम्फोसाइटों और आईएलसी 2 कोशिकाओं के फेनोटाइप और कार्य का आकलन करने के लिए उपयोगी होंगी जो परजीवी संक्रमण के शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल के दौरान आईएल -9 को व्यक्त करती हैं, इन कोशिकाओं के बारे में हमारे ज्ञान को चौड़ा करती हैं और संभावित रूप से अन्य रोग स्थितियों में उनके बारे में हमारी समझ में सुधार करती हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक अपने तकनीकी समर्थन के लिए जोस लुइस रामोस-बाल्डेरास को स्वीकार करना चाहते हैं। इस काम को CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027) से PLL को निम्नलिखित अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। ओएम-पी और ईओ-एम को कोनासाइट (क्रमशः 736162 और 481437) से फैलोशिप मिली। एमसीएम-एम को CONACYT से फैलोशिप प्राप्त हुई (एस्टेंसियास पॉसडॉक्टरेल्स पोर मेक्सिको 2022 (3))।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK buffer Homemade
Attune Nxt cytometer Thermofisher
B220 Biolegend 103204
CD11b Biolegend 101204
CD11c  Biolegend 117304
CD19  Biolegend 115504
CD4 Biolegend 100404
CD4 (BV421) Biolegend 100443
CD45.2 Biolegend 109846
CD8  Biolegend 100703
CD90.2 Biolegend 105314
Collagenase D Roche 11088866001
DNAse I Invitrogen 18068015 Specific activity: ≥10 000 units/mg   
Facs ARIA II sorter BD Biosciences
FACS Melody cell sorter BD Biosciences
Fc-Block Biolegend 101320
FcεRI eBioscience 13589885
Fetal bovine serum Gibco 26140079
FlowJo FlowJo Flow cytometry analysis data software
Gr-1 Tonbo 305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Homemade
IL-9 biolegend 514103
NK1.1  Biolegend 108704
Nylon mesh  ‎ lba B07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556
Phosphate-buffered saline  Homemade
RPMI Gibco 11875093
Siglec F  Biolegend 155512
Streptavidin Biolegend 405206
TCR-β  Biolegend 109203
TCR-β (PE/Cy7) Biolegend 109222
TCR-γδ  Biolegend 118103
Ter119 Biolegend 116204
Tricine buffer  Homemade
Zombie Aqua Fixable Viability Dye Biolegend 423101

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 193 आईएल -9 टीएच 9 आईएलसी 2 आईएल -9 लिम्फोइड कोशिकाएं परजीवी छोटी आंत एन।
<em>निप्पोस्ट्रोगिलस ब्रासिलिएंसिस</em> संक्रमण मॉडल में आईएल -9-उत्पादक लिम्फोइड कोशिकाओं के अध्ययन के लिए एक रणनीति
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Muñoz-Paleta, O., Olguín-Martínez, E., Ruiz-Medina, B. E., Alonso-Quintana, A., Marcial-Medina, M. C., Licona-Limón, P. A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model. J. Vis. Exp. (193), e64075, doi:10.3791/64075 (2023).

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