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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Uma estratégia para o estudo de células linfoides produtoras de IL-9 no modelo de infecção por Nippostrongylus brasiliensis

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64075
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México
* These authors contributed equally

Summary

As células T e ILC2 que expressam IL-9 são induzidas durante a infecção por N. brasiliensis , mas sua caracterização tem sido amplamente negligenciada no intestino infectado devido à sua baixa frequência e cinética diferencial. Este protocolo descreve o isolamento dessas células de diferentes órgãos-alvo e a confirmação de sua identidade via citometria de fluxo em diferentes estágios de infecção.

Abstract

A IL-9 é uma citocina pleiotrópica associada a vários processos, incluindo imunidade antitumoral, indução de patologias alérgicas e resposta imune contra infecções por helmintos, onde desempenha um papel importante na expulsão do parasita. Em um modelo murino de infecção por Nippostrongylus brasiliensis, a IL-9 é produzida principalmente por linfócitos T CD4+ e células linfoides inatas encontradas no pulmão, intestino delgado e linfonodos drenantes. Dadas as dificuldades técnicas envolvidas na coloração intracelular da IL-9, bem como a complexidade de isolar células hematopoiéticas do intestino delgado após a infecção, há uma necessidade premente de um protocolo abrangente, mas direto, para analisar a expressão de IL-9 em diferentes tecidos linfoides e não linfoides neste modelo. O protocolo aqui descrito descreve a cinética da IL-9 produzida pelas células T CD4+ e pelas células linfoides inatas no pulmão e intestino delgado, os principais órgãos visados pelo N. brasiliensis, bem como nos linfonodos mediastinais e mesentéricos, durante toda a infecção. Além disso, detalha o número de larvas necessárias para a infecção, dependendo do tipo de célula e órgão de interesse. Este protocolo tem como objetivo auxiliar na padronização de ensaios para economizar tempo e recursos, oferecendo a oportunidade de focar nas células, órgãos e estágios específicos da doença de interesse no modelo de infecção por N. brasiliensis.

Introduction

Os ancilostomídeos são parasitas intestinais que infectam aproximadamente 700 milhões de pessoas em todo o mundo, principalmente em áreas tropicais em países subdesenvolvidos. Infecções de alta intensidade por Ancylostoma duodenale e Necator americanus, os parasitas ancilostomídeos mais comuns em humanos, causam anemia e deficiência proteica que podem resultar em atraso no crescimento e desenvolvimento mental1. N. americanus e o parasita roedor Nippostrongylus brasiliensis induzem uma resposta imune prototípica tipo 2 em seu hospedeiro e compartilham semelhanças em seu ciclo de vida. Assim, a infecção de camundongos com N. brasiliensis é o modelo mais comumente utilizado para infecções por ancilostomídeos humanos. Larvas infecciosas de N. brasiliensis em estágio 3 (L3) movem-se da pele para o pulmão nas primeiras horas pós-infecção. Uma vez no pulmão, eles se tornam L4 e migram para cima da traqueia para serem engolidos, passam pelo estômago e atingem o intestino para se tornarem adultos (L5) dentro de 4-5 dias. No intestino, os vermes L5 põem ovos que são excretados nas fezes para reiniciar o ciclo de vida do parasita2.

A resposta imune induzida por N. brasiliensis é caracterizada por um aumento em várias citocinas tipo 2, incluindo IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13, juntamente com eosinofilia, basofilia, hiperplasia caliciforme e mastócitos e aumento da produção de IgG1 e IgE. A maioria dos estudos que tentam identificar e definir as respostas imunes provocadas na infecção por N. brasiliensis está centrada no papel da IL-4 ou IL-13 nesse modelo3. No entanto, a identificação e caracterização de células que expressam IL-9 e a função desta citocina foram amplamente negligenciadas, até que Licona-Limón et al. publicaram o primeiro estudo demonstrando um papel crítico para a IL-9 na resposta imune contra N. brasiliensis. Usando camundongos repórteres, este estudo descreveu as células T (principalmente o T helper 9) e as células linfoides inatas do tipo 2 (ILC2s) como os principais subconjuntos celulares que expressam IL-9 após a infecção4.

O isolamento e a caracterização de células imunes de pulmões infectados por helmintos são viáveis e têm sido amplamente relatados 3,4. No entanto, devido ao inerente remodelamento tecidual e à produção de muco, fazê-lo no intestino infectado mostrou-se um desafio técnico, até a recente publicação de Ferrer-Font et al.5. O grupo delineou um protocolo para isolar e analisar suspensões unicelulares de subconjuntos imunológicos de intestinos murinos infectados por Heligmosomoides polygyrus. Com base nisso, padronizamos agora um protocolo para isolamento e análise citométrica de células linfoides expressas de IL-9 do intestino infectado por N. brasiliensis. Além disso, estabelecemos a cinética da IL-9 a partir de diferentes fontes celulares e locais anatômicos durante toda a infecção.

Caracterizar as distintas populações celulares envolvidas nesta infecção é vital para uma compreensão mais ampla da resposta imune ao parasita e sua interação com o hospedeiro. Este protocolo abrangente fornece uma rota clara para isolar e analisar células produtoras de IL-9 dos órgãos desejados em estágios de doença de interesse, permitindo uma melhoria acentuada do conhecimento sobre o papel dessas células na infecção por N. brasiliensis e infecções parasitárias em geral.

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Protocol

Todos os experimentos em animais aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Interno de Manejo Animal (CICUAL) do Instituto de Fisiologia Celular da Universidade Nacional Autônoma do México.

NOTA: Um fluxograma de todo o protocolo é mostrado na Figura 1.

1. Alojamento de ratos

  1. Use grupos de camundongos de 8 a 10 semanas de idade, fêmeas ou machos, alojados em instalações para animais com temperatura e umidade constantes em ciclos claros/escuros de 12 h, com acesso ad libitum a água e alimentos.
    NOTA: Este protocolo utiliza uma estirpe de rato reportador IL-9 em fundo C57BL/6, conforme descrito anteriormente4; no entanto, outras cepas de IL-9 reportadoras poderiam ser utilizadas 6,7,8, bem como a coloração intracelular de IL-9, com resultados variáveis 9.

2. Infecção de camundongos

  1. Raspe as costas dos ratos do meio do corpo para perto da base da cauda 1 dia antes da infecção. O uso de anestésicos não é essencial.
  2. Inocular por via subcutânea cada camundongo com 200 larvas viáveis de N. brasiliensis (L3) de terceiro estágio em 100 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS)10 na parte inferior das costas, conforme descrito anteriormente 2,11, ou injetar 100 μL de PBS isoladamente como controle. Sacrifique os animais no dia 4, dia 7 ou dia 10 pós-infecção.

3. Isolamento dos linfonodos pulmonares, intestino delgado, mediastinal e mesentérico

  1. Eutanasiar o rato por luxação cervical. Coloque o rato de costas e pulverize-o com etanol a 70%. Faça uma incisão na linha média usando uma tesoura e abra a pele para expor as áreas abdominal e torácica.
    NOTA: O isoflurano pode ser utilizado como método alternativo de eutanásia12. Câmaras de dióxido de carbono não são recomendadas, pois o CO2 leva a danos nos tecidos pulmonares e hemorragia13.
  2. Isolamento de linfonodos mediastinais e pulmões
    1. Faça uma incisão no esterno e corte em forma de "V" para remover as costelas e os músculos torácicos. Uma vez que a cavidade torácica esteja exposta, localize os linfonodos mediastinais próximos ao esôfago, abaixo do coração (ver Figura 1 Suplementar).
    2. Extrair os linfonodos mediastinais e coletá-los em 1 mL de meio R-10 (Tabela 1) em placa de cultura de 12 poços. Manter no gelo, protegido da luz até o processamento.
      NOTA: As amostras devem ser protegidas da luz, para evitar diminuir o sinal fluorescente dos ratos repórteres usados nesses experimentos.
    3. Extraia os pulmões e colete-os em 1 mL de meio R-10 em uma placa de cultura de 12 poços por rato. Manter no gelo, protegido da luz até o processamento.
  3. Isolamento das cadeias linfonodais mesentéricas e do intestino delgado
    1. Exponha a cavidade peritoneal e mova cuidadosamente o intestino delgado para a direita para expor a cadeia do linfonodo mesentérico (MLN) ao longo do cólon.
    2. Usando fórceps, remova o MLN, enrole-o suavemente em uma toalha de papel e retire a gordura.
    3. Transfira o MLN para 1 mL de meio R-10 em uma placa de cultura de 12 poços. Manter no gelo, protegido da luz até o processamento.
    4. Corte o intestino delgado logo abaixo do esfíncter pilórico e acima do ceco. Puxe o intestino para fora lentamente com a ajuda de fórceps, removendo o mesentério e o tecido adiposo ligados.
    5. Coloque o intestino delgado em uma toalha de papel e umedeça-o generosamente com PBS. Remova as manchas de Peyer do intestino delgado com uma tesoura.
      NOTA: Para manter a viabilidade, remova o tecido adiposo restante e mantenha o intestino delgado úmido com PBS durante todo o processo.
    6. Corte o intestino delgado longitudinalmente usando uma tesoura e deslize suavemente a pinça sobre o intestino aberto para remover o conteúdo fecal e o muco.
    7. Segure o intestino delgado com fórceps e lave-o em 5 mL de PBS no gelo, submergindo-o cuidadosamente algumas vezes. Repita duas vezes.
    8. Cortar o intestino delgado em pedaços curtos (aproximadamente 5 mm) e coletá-los em tubo cônico de 50 mL com 10 mL de HBSS14 com FBS a 2% (Tabela 1). Imediatamente continuar a isolar células intraepiteliais e lâmina própria.

4. Preparação de suspensões unicelulares do intestino delgado, pulmão e gânglios linfáticos

NOTA: É extremamente importante processar um máximo de seis ratos por pessoa ao preparar suspensões unicelulares do intestino delgado, pois a viabilidade celular diminui significativamente com períodos de processamento mais longos. Este método foi adaptado do Heligmosomoides polygyrus infection mouse modelo5.

  1. Pré-aqueça a incubadora de agitação, o meio R-20, o HBSS e o HBSS-2 mM EDTA (Tabela 1) a 37 °C.
  2. Preparar 10 mL de meio de digestão do intestino delgado (Tabela 1) por amostra.
  3. Agitar vigorosamente os pedaços do intestino do passo 3.3.8 com a mão.
  4. Filtrar cada amostra através de uma malha de nylon (aproximadamente 10 cm x 10 cm) sobre uma ampola de vidro. Lave a amostra adicionando 10 mL de HBSS pré-aquecido sobre a malha e descarte o fluxo. Repita mais uma vez.
    NOTA: Use uma nova malha para cada amostra e reutilize-a durante todo o procedimento.
  5. Retirar a tela do funil e coletar a amostra da tela em um tubo cônico de 50 mL com 10 mL de EDTA quente HBSS-2 mM (etapa 4.1). Incubar durante 10 min a 37 °C, com agitação a 200 rpm.
  6. Vórtice por 10 s na velocidade máxima (3.200 rpm) e filtre a amostra com a malha sobre um funil de vidro, recuperando o fluxo em um tubo cônico de 50 mL.
  7. Repita as etapas 4.5 e 4.6 duas vezes, recuperando o fluxo no mesmo tubo cônico de 50 mL. As células intraepiteliais estão localizadas nesta fração de 30 mL. Salve o tecido restante.
  8. Preparação de suspensão unicelular a partir de células intraepiteliais
    1. Centrifugar os 30 mL de suspensão celular, recuperados na etapa 4.7, a 450 x g por 5 min à temperatura ambiente (RT). Descarte o sobrenadante.
    2. Adicionar 5 mL de PBS e centrifugar a 450 x g por 5 min no RT. Descarte o sobrenadante.
    3. Ressuspender o pellet celular em 3 mL de RPMI 10% FBS-20 μg/mL DNase (Tabela 1). Manter no gelo, protegido da luz até a coloração celular.
  9. Preparação de suspensão unicelular a partir de células de lâmina própria
    1. Lave o tecido restante do intestino delgado da etapa 4.7 derramando mais de 10 mL de HBSS quente através da malha sobre o funil. Repita a lavagem. Coletar o tecido da tela em um tubo cônico de 50 mL com 10 mL de meio de digestão do intestino delgado.
    2. Incubar durante 30 min a 37 °C, com agitação a 200 rpm. Vórtice na velocidade máxima por 10 s a cada 5 min.
    3. Adicione 10 mL de tampão FACS-EDTA (Tabela 1) para interromper a reação de digestão e coloque-a no gelo.
    4. Filtrar cada amostra através de um filtro celular de 100 μm utilizando uma pipeta serológica, recuperando a suspensão num tubo cónico de 50 ml colocado sobre gelo.
    5. Centrífuga a 600 x g durante 6 min a 4 °C.
    6. Descarte o sobrenadante. Lavar o pellet celular com 5 mL de PBS e centrifugar a 600 x g por 6 min a 4 °C.
    7. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de RPMI 10% FBS-20 μg/mL DNase. Manter no gelo, protegido da luz até a coloração celular.
  10. Preparação da suspensão unicelular a partir do pulmão
    NOTA: Cada pulmão e intestino delgado deve ser processado em paralelo por duas pessoas para evitar tempos de manuseio prolongados, o que resulta em baixa viabilidade celular.
    1. Preparar 4 mL de meio de digestão pulmonar (Tabela 1) por amostra processada.
    2. Remova o meio RPMI do poço que contém os pulmões a partir da etapa 3.2.3. Corte o pulmão em pedaços pequenos com uma tesoura fina.
    3. Transfira as peças pulmonares para um tubo cônico de 15 mL com uma espátula. Adicionar 4 mL de meio de digestão pulmonar (Tabela 1).
    4. Incubar durante 30 min a 37 °C, com agitação a 250 rpm. Quando terminar, mantenha-se no gelo até que cada amostra seja processada.
    5. Filtrar cada amostra através de um filtro celular de 100 μm, posicionado em um único poço de uma placa de cultura de 6 poços. Dissociar o tecido com um êmbolo de seringa.
    6. Recuperar cada amostra em tubo cônico de 15 mL e adicionar 4 mL de meio R-2 (Tabela 1). Mantenha-se no gelo enquanto as outras amostras são processadas.
    7. Centrífuga a 600 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio R-5 (Tabela 1).
    8. Durante a centrifugação, preparar 4 mL de solução de gradiente de densidade a 27,5% (Tabela 1) por amostra para enriquecer a fração de células hematopoiéticas15,16. Essa estratégia de separação unicelular é mais eficiente, econômica e menos tóxica em comparação com outros meios de gradiente de densidade semelhantes17.
    9. Adicionar 4 ml de solução de gradiente de densidade a 27,5% ao 1 ml de suspensão celular a partir da etapa 4.10.7 e agitar vigorosamente.
    10. Adicione lentamente 1 mL de meio R-5 (Tabela 1) em cima da suspensão mista para criar duas fases.
    11. Centrífuga a 1.500 x g por 20 min em RT, com baixa aceleração e freio desligado. Observe o anel formado entre as duas fases.
    12. Recuperar o anel formado entre as duas fases com uma micropipeta de 1 mL e ressuspender em 4 mL de meio R-2.
    13. Centrífuga a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante. Ressuspender o pellet celular em 1 mL de tampão ACK (Tabela 1) e incubar por 1 min no RT.
    14. Adicionar 4 mL de meio R-5 e centrifugar a 450 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio R-10. Manter no gelo, protegido da luz até a coloração para citometria de fluxo.
  11. Preparação da suspensão unicelular a partir dos gânglios linfáticos
    1. Colocar os gânglios linfáticos das etapas 3.2.2 ou 3.3.3 entre dois pedaços de malha num poço a partir de uma placa de cultura de 6 poços e dissociar com um êmbolo de seringa.
    2. Recuperar a suspensão celular num tubo cónico de 1,5 ml e centrífuga a 450 x g durante 5 min a 4 °C.
    3. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio R-10. Manter no gelo, protegido da luz até a coloração para citometria de fluxo.
      NOTA: Se os aglomerados estiverem visíveis, filtre a amostra através de um filtro celular de 100 μm.

5. Coloração celular para citometria de fluxo (Figura 2 e Figura 3)

NOTA: Centrifugar as suspensões de células linfonodais a partir do passo 4.11.3 a 450 x g durante 5 min a 4 °C e ressuspender o pellet celular em 500 μL de tampão FACS (Tabela 1).

  1. Coloração celular para identificação de ILC2s (Figura 3 e Figura 2 Suplementar)
    NOTA: Este procedimento de coloração é específico para a identificação de células ILC2 que expressam IL-9.
    1. Placa de 150 μL por amostra de pulmão (aproximadamente 1,8 x 10 6 células) da etapa 4.10.14 e 50 μL por amostra de linfonodo da etapa 4.11.3 (aproximadamente 0,7 x 10 6 e 2,2 x 106 células para amostras de linfonodos mediastinais e mesentéricos, respectivamente) em uma placa de cultura inferior cônica de 96 poços. Adicionar 100 μL de tampão FACS e centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C.
    2. Placa de 100 μL por amostra de intestino delgado (aproximadamente 2,7 x 10 6 e 0,6 x 106 células para amostras intraepiteliais e de lâmina própria, respectivamente) das etapas 4.8.3 e 4.9.7 em uma placa de cultura de fundo cônica de 96 poços. Adicionar 150 μL de tampão FACS e centrífuga a 450 x g durante 5 min a 4 °C.
    3. Descarte o sobrenadante e ressuspenda cada pellet celular em 50 μL do coquetel de anticorpos biotinilados (Tabela 2) diluído em tampão FACS. Incubar durante 30 min a 4 °C protegido da luz.
      NOTA: Use tampão FACS com 20 μg/mL de DNase para amostras intraepiteliais e lâmina própria.
    4. Adicione 150 μL de buffer FACS. Centrífuga a 450 x g durante 5 min a 4 °C.
    5. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 200 μL de tampão FACS. Centrifugar novamente e descartar o sobrenadante.
    6. Ressuspender o pellet celular em 50 μL do cocktail anticorpo/mancha (Tabela 2) e incubar durante 30 minutos a 4 °C protegido da luz.
    7. Adicione 150 μL de buffer FACS. Centrífuga a 450 x g durante 5 min a 4 °C.
    8. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 200 μL de tampão FACS. Centrifugar novamente e descartar o sobrenadante. Repetir a lavagem (passo 5.1.7) e eliminar o sobrenadante.
    9. Ressuscite o pellet celular em 300 μL de tampão FACS e analise por citometria de fluxo.
    10. Para as amostras de intestino delgado e pulmão, use a estratégia de bloqueio: linfócitos, células únicas, células vivas, células hematopoiéticas, células CD90+Linhagem, células ST2+ e células IL-9+ (Figura 3A,B e Figura 2A Suplementar). Para as amostras de linfonodos, use a estratégia de deformação: células vivas, células únicas, células CD90+ de linhagem, células ST2+ e células IL-9+ (Figura suplementar 2B,C).
  2. Coloração celular para identificação de linfócitos produtores de IL-9 (Figura 2 e Figura 3 Suplementar)
    1. Transfira 800 μL por amostra de pulmão da etapa 4.10.14 para um tubo de 1,5 mL (aproximadamente 14,6 x 106 células). Centrífuga a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
    2. Para amostras de linfonodos, placa de 400 μL da suspensão celular da etapa 4.11.3 (aproximadamente 5,6 x 10 6 e 17,5 x 106 células para amostras de linfonodos mediastinais e mesentéricos, respectivamente) em uma placa inferior cônica de 96 poços em duas etapas.
      1. Transferir primeiro 200 μL, centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C e eliminar o sobrenadante.
      2. Transfira mais 200 μL para o poço correspondente. Centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C e eliminar o sobrenadante.
    3. Ressuspender o pellet celular em 50-400 μL do cocktail anticorpo/mancha (Tabela 3) e incubar durante 30 minutos a 4 °C protegido da luz.
      NOTA: As amostras de pulmão devem ser ressuspensas em 400 μL, as amostras de linfonodos mediastinais em 50 μL e as amostras de linfonodos mesentéricos em 100 μL do coquetel de coloração.
    4. Adicionar 150 μL de tampão FACS às amostras de linfonodos mediastinais e 100 μL às amostras de linfonodos mesentéricos. Centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C e eliminar o sobrenadante.
    5. Lave as amostras de pulmão e linfonodos ressuspendendo os pellets em 1 mL e 200 μL de tampão FACS, respectivamente. Centrífuga a 450 xg durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e repita a lavagem.
    6. Ressuspender as amostras pulmonares em 600 μL de tampão FACS e analisá-las por citometria de fluxo. Use a estratégia de gating: linfócitos, células únicas, células vivas, células hematopoiéticas, células CD4+TCRβ+ e células IL-9+ (Figura 2A).
    7. Ressussuscite as amostras de linfonodos em 300 μL de tampão FACS e analise por citometria de fluxo. Use a estratégia de deformação: linfócitos, células únicas, células vivas, células CD4+ TCRβ+ e células IL-9+ (Figura 2B e Figura Suplementar 3A).

6. Determinação do número absoluto de células em suspensões unicelulares

  1. Diluir as amostras das etapas de isolamento 4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 e 4.11.3 com PBS na proporção de 1:20 (10 μL de amostra + 190 μL de PBS).
  2. Misturar 10 μL de cada amostra diluída da etapa 6.1 com 10 μL de azul de tripano. Carregar 10 μL em um hemocitômetro e contar as células vivas, considerando cada diluição.
  3. Obter o número absoluto de células multiplicando a porcentagem da população de interesse de células vivas determinada por citometria de fluxo (células negativas de corante de viabilidade) pelo número total de células vivas na suspensão unicelular após o isolamento e dividindo esse número por 100 (Figura Suplementar 4, Figura Suplementar 5 e Figura Suplementar 6).
    Número absoluto = (Percentagem da população de interesse de células vivas determinada por citometria de fluxo x Número total de células vivas na suspensão unicelular)/100

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Representative Results

Os camundongos foram injetados por via subcutânea com larvas de N. brasiliensis do estágio 200 L3 ou com PBS para controles simulados. O número de larvas utilizadas neste protocolo foi ajustado para isolar células viáveis dos pulmões, tecido linfoide e intestino delgado, ao contrário de relatos anteriores, onde cargas mais elevadas de vermes foram utilizadas para detectar células em tecidos linfoides e pulmões apenas4. Pulmões, linfonodos mediastinais, linfonodos mesentéricos e intestino delgado foram colhidos nos dias 0, 4, 7 e 10 pós-infecção para isolamento de linfócitos e caracterização das populações produtoras de IL-9. Um total de 27 camundongos foram utilizados em dois ou mais experimentos independentes, incluindo nove controles e quatro a seis camundongos infectados por N. brasiliensis por ponto de tempo analisado. Controles infectados por simulação foram incluídos em todos os experimentos para obter números basais. Usando este protocolo, as células T CD4+ produtoras de IL-9 (principalmente células Th9 neste modelo) podem ser isoladas de linfonodos pulmonares, mesentéricos e mediastinais para quantificação e análise posterior.

Após o curso natural da infecção, primeiramente avaliamos as frequências de linfócitos T CD4+ produtores de IL-9 (Th9) presentes nos pulmões e linfonodos mediastinais (estratégia de gating mostrada na Figura 2A e Figura 3A Suplementar). Em ambos os órgãos, as frequências de Th9 aumentaram, a partir do dia 4, e atingiram um pico no dia 7 pós-infecção (Figura 2C), incremento que também foi observado nos números absolutos de Th9 (Figura Suplementar 4A,B). Nos linfonodos mesentéricos (estratégia de gating mostrada na Figura 2B), houve um aumento significativo tanto nas frequências quanto no número absoluto de células Th9 nos dias 7 e 10 pós-infecção (Figura 2C e Figura 4C Suplementar), de acordo com relatos anteriores4. A presença de células T e ILC2s foi confirmada nas amostras intraepitelial e lâmina própria; no entanto, não foram observadas células Th9 nesses compartimentos intestinais durante toda a infecção (Figura suplementar 3B,C).

Em seguida, avaliamos as células ILC2 que expressam IL-9 em tecidos linfoides e não linfoides de camundongos infectados (estratégia de gating mostrada na Figura 3A, B e Figura 2 Suplementar). Observou-se um aumento significativo nas frequências de IL-9+ ST2+ e IL-9+ ST2+ expressando ILC2s nos pulmões no 7º dia pós-infecção (Figura 3C). Ao mesmo tempo, a análise dos números absolutos revelou um aumento estatisticamente significativo apenas na população ST2+ IL-9+ no 7º dia pós-infecção (Figura Suplementar 5A). Nos linfonodos mediastinais (estratégia de gating mostrada na Figura 2B Suplementar), o número de células ILC2 expressivas de IL-9 (ST2+ IL-9+) aumentou significativamente no 10º dia pós-infecção, enquanto o número absoluto de células ST2+ mostrou uma tendência a aumentar, começando no dia 7 e continuando até o dia 10 pós-infecção (Figura suplementar 6A,C).

Células IL-9+ ILC2 também foram encontradas na lâmina própria e nos compartimentos intraepiteliais do intestino delgado (estratégia de gating mostrada na Figura 3B e Figura 2A Suplementar). A infecção por N. brasiliensis resultou em um aumento estatisticamente significativo nas frequências de células ST2+ IL-9+ no dia 4 e das populações ST2-IL-9+ nos dias 7 e 10 na lâmina própria. No compartimento intraepitelial, também foi observada uma mudança significativa nas frequências das células ST2+ IL9+ e ST2- IL-9+ no dia 7 e no dia 10 pós-infecção, respectivamente (Figura 3C). É importante ressaltar que, mesmo com um número relativamente baixo de carga de larvas, a infecção pelo parasita causou danos extensos ao intestino delgado; portanto, a análise dos números absolutos de ILC2s expressando IL-9 é tecnicamente inviável, dificultando a quantificação precisa dessa população devido aos baixos rendimentos de células vivas (Figura Suplementar 5B,C). Por outro lado, a análise dos linfonodos mesentéricos (estratégia de gating mostrada na Figura 2C Suplementar) revelou um aumento significativo no número absoluto de células ST2+ IL-9-, ST2+ IL-9+ e ST2- IL-9+ ILC2 no 10º dia pós-infecção (Figura 6D Suplementar), conforme relatado anteriormente4. Enquanto isso, não foi observada diferença nas frequências dessas populações ao longo da infecção (Figura suplementar 6B). Esses diversos subconjuntos de células que expressam ST2 e IL-9 são populações intrigantes com papéis potencialmente diferenciais in vivo, e podem corresponder a ILC2s naturais versus inflamatórias, conforme descrito recentemente 18,19,20,21. No entanto, isso precisa ser abordado em estudos futuros.

Em resumo, ajustamos este protocolo para a recuperação de células expressas de IL-9 do intestino infectado por N. brasiliensis, enquanto ainda somos capazes de detectá-las no pulmão e no tecido linfoide. A recuperação de células imunes de intestinos infectados por parasitas provou ser tecnicamente difícil. Aqui, um número ajustado de larvas usadas para infecção resultou em melhoria da integridade do tecido intestinal, o que permitiu a recuperação de uma população de IL-9+. Até onde sabemos, este é o primeiro protocolo desenvolvido especificamente para a análise de células expressoras de IL-9 no intestino durante a infecção por N. brasiliensis. No entanto, outras células imunes também podem ser isoladas seguindo essas etapas. Os dados aqui apresentados mostram que a maioria das células que expressam IL-9 residentes no tecido no intestino delgado são ILC2s.

Figure 1
Figura 1: Fluxograma do protocolo descrito. Diagrama esquemático com as principais etapas utilizadas para processar diferentes órgãos e os subconjuntos celulares esperados de expressão de IL-9 obtidos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: As células Th9 são encontradas nos pulmões, linfonodos mediastinais e mesentéricos durante toda a infecção por N. brasiliensis. Análise de citometria de fluxo representativa e estratégia de gating utilizada para identificação de células Th9 de (A) pulmões e (B) linfonodos mesentéricos. As suspensões unicelulares de cada órgão foram coradas com corante de viabilidade fixável, marcado fluorescentemente com anti-CD45 para a identificação de células hematopoiéticas e anti-receptor de células T (TCR) β e anti-CD4 para identificação de linfócitos T CD4+. O sinal GFP+ indica a porcentagem de células Th9 presentes. A primeira porta mostra as propriedades de dispersão lateral (SSC)-A/forward scatter (FSC)-A com a morfologia clássica das células linfoides. Eventos unicelulares foram selecionados, seguidos por células vivas e, em seguida, células CD45+. Dentro dessa população, nos concentramos em células duplamente positivas β TCR e CD4, a partir das quais as células GFP+ foram identificadas como células Th9. A coloração dos linfonodos não incluiu o anticorpo anti-CD45, uma vez que se espera que toda a população seja positiva. (C) Frequências de células Th9 encontradas nos pulmões, linfonodos mediastinais e mesentéricos nos horários indicados pós-infecção. Os dados representam a média ± MEV de um ou dois camundongos analisados por grupo, a partir de três experimentos independentes, por ponto de tempo; Teste T não pareado; *p≤ 0,05, **p≤ 0,001, ***p≤ 0,0001. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: As células ILC2 produtoras de IL-9 são encontradas em órgãos não linfoides. Análise de citometria de fluxo representativa e estratégia de gating utilizada para a identificação de células IL-9+ ILC2 de (A) pulmão e (B) lâmina própria do intestino delgado. As suspensões unicelulares de cada órgão foram marcadas com anticorpos biotinilados para identificar células de linhagem (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 e anti-Ter119) e Fc-Block. As suspensões celulares foram então coradas com corante de viabilidade fixável, treptavidina marcada com fluorocromo, anti-CD45 para a identificação de células hematopoiéticas e anti-CD90 para a identificação de células ILC2. A primeira porta mostra propriedades de dispersão (SSC)-A/dispersão lateral (FSC)-A com a morfologia clássica das células linfoides. Eventos unicelulares foram selecionados, seguidos por células vivas e, em seguida, células CD45+. Dentro dessa população, nos concentramos nas células de lin- CD90+; deste grupo, avaliamos a expressão de ST2 e GFP para identificar células IL-9+ ILC2. (C) Frequências de células ILC2 encontradas nos pulmões, lâmina própria e compartimento celular intraepitelial nos momentos indicados pós-infecção. Os dados representam a média ± MEV de um ou dois camundongos analisados por grupo, a partir de três experimentos independentes, por ponto de tempo; teste T não pareado; *p ≤ 0,05. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Quadro 1: Lista das soluções químicas e respectivas composições. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2: Coquetel de anticorpos para identificar células ILC2 produtoras de IL-9. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 3: Coquetel de anticorpos para identificar linfócitos T produtores de IL-9. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Figura 1 Suplementar: Representação esquemática da localização dos linfonodos mediastinais. Criado em BioRender.com Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 2 Suplementar: Citometria de fluxo representativa e estratégia de gating usada para identificar IL-9+ ILC2s dentro de células intraepiteliais do intestino delgado e linfonodos. (A) Suspensões unicelulares de células intraepiteliais do intestino delgado foram incubadas pela primeira vez com anticorpos marcados com biotina para selecionar células de linhagem (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 e anti-Ter119) e Fc-Block. Isto foi seguido por coloração com um corante de viabilidade fixável, treptavidina marcada com fluorocromo, anti-CD45 para a identificação de células hematopoiéticas e anti-CD90 para a identificação de células ILC2. A primeira porta mostra as propriedades de dispersão lateral (SSC)-A/forward scatter (FSC)-A com a morfologia clássica das células linfoides. Eventos unicelulares foram selecionados, seguidos por células vivas e, em seguida, células CD45+. Dentro dessa população, nos concentramos nas células de lin- CD90+; deste grupo, as células GFP+ foram identificadas como células IL-9+ ILC2. (B,C) Citometria de fluxo representativa e estratégia de gating para (B) linfonodos mediastinais e (C) linfonodos mesentéricos para identificar células IL-9+ ILC2. A coloração dos gânglios linfáticos não incluiu o anticorpo anti-CD45, uma vez que se esperava que toda a população fosse positiva. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 3 Suplementar: Análise de citometria de fluxo representativa e estratégia de gating usada para identificar células Th9 em linfonodos mediastinais e intestino delgado. As suspensões unicelulares de linfonodos mediastinais (A) foram coradas com um corante de viabilidade fixável e marcadas fluorescentemente com anticorpos anti-TCR-β e anti-CD4. A primeira porta mostra as propriedades de dispersão lateral (SSC)-A/forward scatter (FSC)-A com a morfologia clássica das células linfoides. Foram selecionados eventos unicelulares, seguidos de células vivas e, em seguida, de células dupla-positivas TCR-β e CD4; deste grupo, as células GFP+ foram identificadas como células Th9. Uma estratégia semelhante de citometria de fluxo foi utilizada para (B) lâmina própria e (C) células intraepiteliais do intestino delgado, exceto que as células CD45+ foram selecionadas após as células vivas, seguidas por células TCR-β e CD4 duplamente positivas, de onde as células GFP+ foram identificadas como células Th9. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 4 suplementar: O número absoluto de células Th9 muda significativamente ao longo da infecção. O número absoluto de células IL-9+ de células dupla-positivas TCR-β e CD4 foi determinado nos dias 0, 4, 7 e 10 pós-infecção no pulmão (A), linfonodos mediastinais e (C) linfonodos mesentéricos. Os dados representam a média ± MEV de um ou dois camundongos analisados por grupo, a partir de três experimentos independentes, por ponto de tempo; teste T não pareado *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,001, ***P ≤ 0,0001. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 5 suplementar: O número absoluto de células IL-9+ ILC2 difere ao longo da infecção. O número absoluto de células IL-9+ ILC2 da população lin-CD90+ nos dias 0, 4, 7 e 10 pós-infecção foi determinado em (A) pulmão, (B) lâmina própria e (C) células intraepiteliais do intestino delgado. Os dados representam a média ± MEV de um ou dois camundongos analisados por grupo, a partir de três experimentos independentes, por ponto de tempo; teste T não pareado *p ≤ 0,05. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 6 suplementar: As frequências e o número absoluto de células IL-9+ ILC2 nos gânglios linfáticos aumentam significativamente durante a infecção. (A) Frequência e (C) números absolutos de células IL-9+ ILC2 de linfonodos mediastinais. (B) Frequência e (D) números absolutos de células IL-9+ ILC2 de linfonodos mesentéricos. Os valores foram determinados como células IL-9+ ILC2 dentro da população lin-CD90+ nos dias 0, 4, 7 e 10 pós-infecção. Os dados representam a média ± MEV de um ou dois camundongos analisados por grupo, de três experimentos independentes, por ponto de tempo;teste T não pareado *p ≤ 0,05, ***p ≤ 0,0001. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 7 Suplementar: Análise da citometria de fluxo de IL-9 expressando células ILC2 do intestino infectado por N. brasiliensis. Gráficos representativos de células ILC2 isoladas do intestino de camundongos IL-9-repórteres no dia 7 pós-infecção. A expressão de IL-9 foi avaliada em células de ILC2 recém-isoladas dos compartimentos intraepitelial ou lâmina própria de camundongos repórteres infectados (IL-9 REP) versus seguindo o protocolo de coloração intracelular IL-9 9 descrito anteriormente (IL-9 AB, usando um clone de anticorposIL-9 RM9A4, BioLegend). Para identificar ILC2s que expressam IL-9, as suspensões unicelulares foram primeiro incubadas com anticorpos marcados com biotina para selecionar células de linhagem (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 e anti-Ter119) e Fc-Block, seguido de coloração com corante de viabilidade flexível, estreptavidina marcada com fluorocromo, anti-CD45 e anti-CD90. Os gráficos mostram células ILC2 expressando IL-9 fechadas na população lin-CD45+CD90+ presente nos compartimentos intraepitelial (A,B) e lâmina própria (C,D), detectadas através do sinal do repórter de células recém-isoladas (A,C) ou após coloração intracelular de IL-9 (B,D). Os camundongos controle foram injetados com PBS. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Uma compreensão completa das interações parasita-hospedeiro intestinal e das respostas imunes à infecção por helmintos requer a identificação e análise das diferentes populações celulares e moléculas efetoras que são fundamentais para a indução da remodelação tecidual e expulsão de vermes. As infecções por helmintos transmitidas pelo solo representam um grande problema nos países em desenvolvimento em todo o mundo. No entanto, até recentemente, nãoestava disponível um protocolo que permitisse a análise de populações celulares raras presentes no intestino delgado, principal órgão afetado por essa infecção5. Este protocolo abrange métodos previamente descritos que permitem a análise citométrica de fluxo de células linfoides expressas de IL-9 nos linfonodos pulmonares, mediastinais e mesentéricos durante a infecção por N. brasiliensis, com a vantagem adicional da identificação dessa população pela primeira vez no intestino delgado.

O sucesso deste protocolo é altamente dependente dos tempos de processamento tecidual. É imperativo processar um máximo de seis amostras de intestino delgado, por pessoa, de uma só vez. Se diferentes órgãos devem ser processados, recomendamos que seja feito em paralelo por outra pessoa. Usando uma carga parasitária relativamente baixa (larvas de 200 L3), este protocolo permite o isolamento de células linfoides do intestino infectado por N. brasiliensis, mantendo a capacidade de isolar essas células de outros órgãos. O uso de cargas parasitárias mais elevadas compromete a qualidade e a quantidade de células isoladas do intestino delgado (dados não mostrados); no entanto, pode resultar em um aumento significativo de células linfoides expressas de IL-9 em outros órgãos4. Ao processar o intestino e os gânglios linfáticos mesentéricos, é fundamental remover o tecido adiposo aderido, pois a falha em fazê-lo resulta em aumento da morte celular. Os dados apoiam a observação de que o curso natural da infecção afeta negativamente o número absoluto de células linfoides recuperadas do intestino delgado. Nos estudos aqui descritos, as frequências das células IL-9+ ILC2 permanecem consistentes, enquanto os números absolutos mostram alta variabilidade em cada experimento independente. Assim, as conclusões tiradas de números absolutos podem ser imprecisas e devem ser evitadas. Além disso, dada a baixa frequência de células T expressivas de IL-9 nos tecidos, recomenda-se a aquisição e coloração do maior número possível de células.

Uma limitação dessa análise de ILC2 é o uso de uma combinação discreta de marcadores para definir essa população. Dependendo do tecido de interesse e da fase da infecção, marcadores adicionais, como CD25, Klrg1 e ST2, entre outros, poderiam ser utilizados para uma caracterização fenotípica mais detalhada das célulasILC22. Reconhecemos que o protocolo aqui apresentado é baseado na cepa4 do camundongo repórter INFER, e pode representar uma vantagem para a identificação de células expressoras de IL-9. No entanto, espera-se que os resultados aqui encontrados possam ser obtidos por meio de estratégias alternativas, incluindo o uso de outras cepas repórteres de camundongos e coloração intracelular de IL-9 6,7,8,9. É importante mencionar que o uso de camundongos convencionais e a realização de coloração intracelular de IL-9 em células intraepiteliais e lâmina própria podem resultar na perda de qualquer sinal detectável e comprometimento dos dados obtidos (Figura Suplementar 7). Isso pode ser devido à manipulação de longo prazo necessária para manchar um subconjunto que já é difícil de isolar e manter ex vivo. Portanto, recomendamos o uso de linhagens de camundongos repórteres para reduzir os tempos de processamento e garantir uma análise confiável da expressão de IL-9 in vivo. Também reconhecemos o fato de que as células Th9 não são as únicas células T que expressam IL-923; no entanto, neste modelo parasita, não esperaríamos que outros subconjuntos o expressassem. No entanto, para descartar a presença de outros subconjuntos expressores de IL-9 no contexto descrito, é viável uma caracterização completa das citocinas tipo 2, juntamente com o uso de marcadores transcricionais.

A quantificação de células linfoides expressas de IL-9 antes do 5º dia pós-infecção foi previamente relatada; no entanto, resulta em frequências celulares muito baixas4. O protocolo deste estudo abrange grande parte da cinética da infecção por N. brasiliensis até o início da depuração do parasita2. No entanto, notamos que algumas das populações celulares deste estudo não retornaram aos níveis basais dentro do período de tempo analisado, sugerindo que o estudo poderia se beneficiar de longos períodos de tempo para ter uma perspectiva completa sobre o comportamento dessas células em um estágio mais avançado da infecção in vivo. Independentemente disso, acreditamos que o trabalho aqui apresentado poderia servir de guia de referência para pesquisadores interessados em estudar células linfoides expressas de IL-9 em modelos de infecção parasitária, permitindo-lhes escolher a fase ideal de infecção para detecção dos tipos celulares específicos a partir de tecidos de interesse. Em conjunto, os métodos aqui descritos serão úteis para avaliar o fenótipo e a função dos linfócitos T e das células ILC2 que expressam IL-9 durante um modelo fisiologicamente relevante de infecção parasitária, ampliando nosso conhecimento dessas células e potencialmente melhorando nossa compreensão delas em outras condições patológicas.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores agradecem a José Luis Ramos-Balderas pelo seu apoio técnico. Este trabalho foi apoiado pela seguinte subvenção à PLL da CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P e EO-M receberam uma bolsa da CONACYT (736162 e 481437, respectivamente). MCM-M recebeu uma bolsa da CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK buffer Homemade
Attune Nxt cytometer Thermofisher
B220 Biolegend 103204
CD11b Biolegend 101204
CD11c  Biolegend 117304
CD19  Biolegend 115504
CD4 Biolegend 100404
CD4 (BV421) Biolegend 100443
CD45.2 Biolegend 109846
CD8  Biolegend 100703
CD90.2 Biolegend 105314
Collagenase D Roche 11088866001
DNAse I Invitrogen 18068015 Specific activity: ≥10 000 units/mg   
Facs ARIA II sorter BD Biosciences
FACS Melody cell sorter BD Biosciences
Fc-Block Biolegend 101320
FcεRI eBioscience 13589885
Fetal bovine serum Gibco 26140079
FlowJo FlowJo Flow cytometry analysis data software
Gr-1 Tonbo 305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Homemade
IL-9 biolegend 514103
NK1.1  Biolegend 108704
Nylon mesh  ‎ lba B07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556
Phosphate-buffered saline  Homemade
RPMI Gibco 11875093
Siglec F  Biolegend 155512
Streptavidin Biolegend 405206
TCR-β  Biolegend 109203
TCR-β (PE/Cy7) Biolegend 109222
TCR-γδ  Biolegend 118103
Ter119 Biolegend 116204
Tricine buffer  Homemade
Zombie Aqua Fixable Viability Dye Biolegend 423101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Uma estratégia para o estudo de células linfoides produtoras de IL-9 no modelo de infecção por <em>Nippostrongylus brasiliensis</em>
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Muñoz-Paleta, O., Olguín-Martínez, E., Ruiz-Medina, B. E., Alonso-Quintana, A., Marcial-Medina, M. C., Licona-Limón, P. A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model. J. Vis. Exp. (193), e64075, doi:10.3791/64075 (2023).

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