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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Eine Strategie für die Untersuchung von IL-9-produzierenden lymphatischen Zellen im Nippostrongylus brasiliensis-Infektionsmodell

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64075
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México
* These authors contributed equally

Summary

IL-9-exprimierende T- und ILC2-Zellen werden während einer N. brasiliensis-Infektion induziert, ihre Charakterisierung wurde jedoch im infizierten Darm aufgrund ihrer geringen Häufigkeit und differentiellen Kinetik weitgehend übersehen. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung dieser Zellen aus verschiedenen Zielorganen und die Bestätigung ihrer Identität mittels Durchflusszytometrie in verschiedenen Infektionsstadien.

Abstract

IL-9 ist ein pleiotropes Zytokin, das mit verschiedenen Prozessen assoziiert ist, einschließlich der Antitumorimmunität, der Induktion allergischer Pathologien und der Immunantwort gegen Helmintheninfektionen, wo es eine wichtige Rolle bei der Vertreibung des Parasiten spielt. In einem murinen Modell der Nippostrongylus brasiliensis-Infektion wird IL-9 hauptsächlich von CD4+ T-Lymphozyten und angeborenen lymphatischen Zellen produziert, die in der Lunge, im Dünndarm und in drainierenden Lymphknoten vorkommen. Angesichts der technischen Schwierigkeiten, die mit der intrazellulären Färbung von IL-9 verbunden sind, sowie der Komplexität der Isolierung hämatopoetischer Zellen aus dem Dünndarm nach einer Infektion besteht ein dringender Bedarf an einem umfassenden, aber unkomplizierten Protokoll zur Analyse der Expression von IL-9 in verschiedenen lymphatischen und nicht-lymphatischen Geweben in diesem Modell. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Kinetik von IL-9, die von CD4+ T-Zellen und angeborenen lymphatischen Zellen in der Lunge und im Dünndarm, den Hauptorganen, auf die N. brasiliensis abzielt, sowie in den mediastinalen und mesenterialen Lymphknoten während der gesamten Infektion produziert wird. Darüber hinaus gibt es die Anzahl der Larven an, die für die Infektion benötigt werden, abhängig vom Zelltyp und dem interessierenden Organ. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Standardisierung von Assays zu unterstützen, um Zeit und Ressourcen zu sparen, indem es die Möglichkeit bietet, sich auf die spezifischen Zellen, Organe und Krankheitsstadien zu konzentrieren, die im N. brasiliensis-Infektionsmodell von Interesse sind.

Introduction

Hakenwürmer sind Darmparasiten, die weltweit etwa 700 Millionen Menschen infizieren, meist in tropischen Gebieten in unterentwickelten Ländern. Hochintensive Infektionen mit Ancylostoma duodenale und Necator americanus, den häufigsten Hakenwurmparasiten beim Menschen, verursachen Anämie und Proteinmangel, die zu verzögertem Wachstum und geistiger Entwicklung führen können1. N. americanus und der Nagetierparasit Nippostrongylus brasiliensis induzieren in ihrem Wirt eine prototypische Typ-2-Immunantwort und weisen Ähnlichkeiten in ihrem Lebenszyklus auf. Daher ist die Infektion von Mäusen mit N. brasiliensis das am häufigsten verwendete Modell für menschliche Hakenwurminfektionen. Stadium 3 (L3) infektiöse Larven von N. brasiliensis wandern in den ersten Stunden nach der Infektion von der Haut in die Lunge. Sobald sie in der Lunge sind, werden sie zu L4 und wandern die Luftröhre hinauf, um verschluckt zu werden, den Magen zu passieren und den Darm zu erreichen, um innerhalb von 4-5 Tagen erwachsen zu werden (L5). Im Darm legen L5-Würmer Eier, die mit dem Kot ausgeschieden werden, um den Lebenszyklus des Parasiten neu zu starten2.

Die durch N. brasiliensis induzierte Immunantwort ist gekennzeichnet durch einen Anstieg mehrerer Typ-2-Zytokine, darunter IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 und IL-13, zusammen mit Eosinophilie, Basophilie, Becher- und Mastzellhyperplasie und erhöhter IgG1- und IgE-Produktion. Die meisten Studien, die versuchen, die Immunantworten zu identifizieren und zu definieren, die bei einer Infektion mit N. brasiliensis ausgelöst werden, konzentrieren sich auf die Rolle von IL-4 oder IL-13 in diesem Modell3. Die Identifizierung und Charakterisierung von IL-9-exprimierenden Zellen und die Funktion dieses Zytokins wurden jedoch weitgehend übersehen, bis Licona-Limón et al. die erste Studie veröffentlichten, die eine entscheidende Rolle von IL-9 bei der Immunantwort gegen N. brasiliensis zeigte. Unter Verwendung von Reportermäusen wurden in dieser Studie T-Zellen (meist T-Helfer 9) und angeborene lymphatische Typ-2-Zellen (ILC2s) als die wichtigsten zellulären Untergruppen beschrieben, die IL-9 bei einer Infektion exprimieren4.

Die Isolierung und Charakterisierung von Immunzellen aus Helminthen-infizierten Lungen ist machbar und wurde ausführlich beschrieben 3,4. Aufgrund des inhärenten Gewebeumbaus und der Schleimproduktion erwies sich dies im infizierten Darm jedoch als technische Herausforderung, bis zur jüngsten Veröffentlichung von Ferrer-Font et al.5. Die Gruppe skizzierte ein Protokoll zur Isolierung und Analyse von Einzelzellsuspensionen von Immununtergruppen aus Heligmosomoides polygyrus-infizierten murinen Därmen. Darauf aufbauend haben wir nun ein Protokoll zur Isolierung und zytometrischen Analyse von IL-9-exprimierenden lymphatischen Zellen aus dem mit N. brasiliensis infizierten Darm standardisiert. Darüber hinaus haben wir die IL-9-Kinetik aus verschiedenen zellulären Quellen und anatomischen Lokalisationen während der gesamten Infektion festgestellt.

Die Charakterisierung der verschiedenen Zellpopulationen, die an dieser Infektion beteiligt sind, ist entscheidend für ein breiteres Verständnis der Immunantwort auf den Parasiten und seiner Interaktion mit dem Wirt. Dieses umfassende Protokoll bietet einen klaren Weg zur Isolierung und Analyse von IL-9-produzierenden Zellen aus gewünschten Organen in interessierenden Krankheitsstadien, was eine deutliche Verbesserung des Wissens über die Rolle dieser Zellen bei N. brasiliensis-Infektionen und Parasiteninfektionen im Allgemeinen ermöglicht.

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Protocol

Alle hier beschriebenen Tierversuche wurden vom Internal Committee for Animal Handling (CICUAL) des Instituts für Zellphysiologie der Nationalen Autonomen Universität von Mexiko genehmigt.

HINWEIS: Ein Flussdiagramm des gesamten Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Unterbringung von Mäusen

  1. Verwenden Sie 8-10 Wochen alte, weibliche oder männliche Gruppen von Mäusen, die in Tiereinrichtungen mit konstanter Temperatur und Luftfeuchtigkeit in 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklen untergebracht sind und ad libitum Zugang zu Wasser und Futter haben.
    HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet einen IL-9-Reportermausstamm im C57BL/6-Hintergrund, wie zuvor beschrieben4; Es konnten jedoch auch andere IL-9-Reporterstämme verwendet werden 6,7,8 sowie intrazelluläre IL-9-Färbungen mit unterschiedlichen Ergebnissen9.

2. Infektion von Mäusen

  1. Rasieren Sie den Rücken der Mäuse 1 Tag vor der Infektion von der Körpermitte bis in die Nähe des Schwanzansatzes. Die Verwendung von Anästhetika ist nicht unbedingt erforderlich.
  2. Impfen Sie jede Maus subkutan mit 200 lebensfähigen N. brasiliensis-Larven (L3) im dritten Stadium in 100 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)10 im unteren Rückenbereich, wie zuvor beschrieben2,11, oder injizieren Sie 100 μl PBS allein als Kontrolle. Opfern Sie die Tiere an Tag 4, Tag 7 oder Tag 10 nach der Infektion.

3. Isolierung von Lungen-, Dünndarm-, mediastinalen und mesenterialen Lymphknoten

  1. Euthanasieren Sie die Maus durch Zervixluxation. Legen Sie die Maus auf den Rücken und besprühen Sie sie mit 70% Ethanol. Machen Sie mit einer Schere einen Mittellinienschnitt und öffnen Sie die Haut, um den Bauch- und Brustbereich freizulegen.
    HINWEIS: Isofluran kann als alternative Euthanasiemethodeverwendet werden 12. Kohlendioxidkammern werden nicht empfohlen, da CO2 zu Schädigungen des Lungengewebes und Blutungen führt13.
  2. Isolierung von mediastinalen Lymphknoten und Lungen
    1. Machen Sie einen Einschnitt am Brustbein und schneiden Sie in eine "V" -Form, um die Rippen und Brustmuskeln zu entfernen. Sobald die Brusthöhle freigelegt ist, lokalisieren Sie die mediastinalen Lymphknoten neben der Speiseröhre unterhalb des Herzens (siehe ergänzende Abbildung 1).
    2. Extrahieren Sie die mediastinalen Lymphknoten und sammeln Sie sie in 1 ml R-10-Medium (Tabelle 1) in einer 12-Well-Kulturplatte. Bis zur Verarbeitung lichtgeschützt auf Eis aufbewahren.
      HINWEIS: Die Proben sollten vor Licht geschützt werden, um zu vermeiden, dass das Fluoreszenzsignal der in diesen Experimenten verwendeten Reportermäuse verringert wird.
    3. Extrahieren Sie die Lunge und sammeln Sie sie in 1 ml R-10-Medium in einer 12-Well-Kulturplatte pro Maus. Bis zur Verarbeitung lichtgeschützt auf Eis aufbewahren.
  3. Isolierung von mesenterialen Lymphknotenketten und Dünndarm
    1. Legen Sie die Bauchhöhle frei und bewegen Sie den Dünndarm vorsichtig nach rechts, um die mesenteriale Lymphknotenkette (MLN) entlang des Dickdarms freizulegen.
    2. Entfernen Sie die MLN mit einer Pinzette, rollen Sie sie vorsichtig auf ein Papiertuch und ziehen Sie das Fett ab.
    3. Übertragen Sie die MLN auf 1 ml R-10-Medium in einer 12-Well-Kulturplatte. Bis zur Verarbeitung lichtgeschützt auf Eis aufbewahren.
    4. Schneiden Sie den Dünndarm direkt unter dem Pylorusschließmuskel und über dem Blinddarm. Ziehen Sie den Darm langsam mit Hilfe einer Pinzette heraus und entfernen Sie das anhaftende Mesenterium und Fettgewebe.
    5. Legen Sie den Dünndarm auf ein Papiertuch und befeuchten Sie ihn großzügig mit PBS. Entfernen Sie die Peyer-Flecken mit einer Schere aus dem Dünndarm.
      HINWEIS: Um die Lebensfähigkeit zu erhalten, entfernen Sie das restliche Fettgewebe und halten Sie den Dünndarm während des gesamten Prozesses mit PBS feucht.
    6. Schneiden Sie den Dünndarm mit einer Schere in Längsrichtung ab und schieben Sie die Pinzette vorsichtig über den offenen Darm, um den Kotinhalt und den Schleim zu entfernen.
    7. Halten Sie den Dünndarm mit einer Pinzette fest und waschen Sie ihn in 5 ml PBS auf Eis, indem Sie ihn einige Male vorsichtig untertauchen. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal.
    8. Schneiden Sie den Dünndarm in kurze Stücke (ca. 5 mm) und sammeln Sie sie in einem konischen 50-ml-Röhrchen mit 10 ml HBSS14 mit 2% FBS (Tabelle 1). Isolieren Sie sofort intraepitheliale und Lamina propria-Zellen.

4. Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus Dünndarm, Lunge und Lymphknoten

HINWEIS: Bei der Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus dem Dünndarm ist es äußerst wichtig, maximal sechs Mäuse pro Person zu verarbeiten, da die Zelllebensfähigkeit mit längeren Verarbeitungszeiten signifikant abnimmt. Diese Methode wurde aus dem Heligmosomoides polygyrus infection mouse model5 adaptiert.

  1. Der Schüttelinkubator, R-20-Medium, HBSS und HBSS-2 mM EDTA (Tabelle 1) werden bei 37 °C vorgewärmt.
  2. Bereiten Sie 10 ml Dünndarmverdauungsmedium (Tabelle 1) pro Probe vor.
  3. Schütteln Sie die Darmstücke aus Schritt 3.3.8 kräftig von Hand.
  4. Filtern Sie jede Probe durch ein Nylonnetz (ca. 10 cm x 10 cm) über einen Glastrichter. Waschen Sie die Probe, indem Sie 10 ml vorgewärmtes HBSS über das Netz geben und den Durchfluss verwerfen. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal.
    HINWEIS: Verwenden Sie für jede Probe ein neues Netz und verwenden Sie es während des gesamten Verfahrens wieder.
  5. Entfernen Sie das Netz aus dem Trichter und entnehmen Sie die Probe aus dem Netz in einem konischen 50-ml-Röhrchen mit 10 ml warmem HBSS-2 mM EDTA (Schritt 4.1). 10 min bei 37 °C inkubieren, bei 200 U/min schütteln.
  6. Wirbeln Sie 10 s lang bei maximaler Geschwindigkeit (3.200 U/min) und filtrieren Sie die Probe mit dem Netz über einen Glastrichter, wobei der Durchfluss in einem konischen 50-ml-Röhrchen zurückgewonnen wird.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 4.5 und 4.6 zweimal, wobei der Durchfluss im selben konischen 50-ml-Röhrchen wiederhergestellt wird. Die intraepithelialen Zellen befinden sich in dieser 30-ml-Fraktion. Bewahren Sie das restliche Gewebe auf.
  8. Einzelzell-Suspensionspräparat aus intraepithelialen Zellen
    1. Zentrifugieren Sie die 30 ml Zellsuspension, die in Schritt 4.7 gewonnen wurde, bei 450 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT). Verwerfen Sie den Überstand.
    2. 5 ml PBS zugeben und bei 450 x g 5 min bei RT zentrifugieren.
    3. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 3 ml RPMI 10% FBS-20 μg/ml DNase (Tabelle 1). Auf Eis aufbewahren, vor Licht geschützt, bis sich die Zellen verfärben.
  9. Einzellige Suspensionszubereitung aus Lamina-propria-Zellen
    1. Waschen Sie das restliche Dünndarmgewebe aus Schritt 4.7, indem Sie über 10 ml warmes HBSS durch das Netz über den Trichter gießen. Wiederholen Sie den Waschvorgang. Sammeln Sie das Gewebe aus dem Netz in einem konischen 50-ml-Röhrchen mit 10 ml Dünndarm-Verdauungsmedium.
    2. 30 min bei 37 °C inkubieren, bei 200 U/min schütteln. Wirbel mit maximaler Geschwindigkeit für 10 s alle 5 Minuten.
    3. Fügen Sie 10 ml FACS-EDTA-Puffer (Tabelle 1) hinzu, um die Verdauungsreaktion zu stoppen, und legen Sie ihn auf Eis.
    4. Jede Probe wird mit einer serologischen Pipette durch ein 100-μm-Zellsieb filtriert, wobei die Suspension in einem konischen 50-ml-Röhrchen auf Eis zurückgewonnen wird.
    5. Zentrifugieren bei 600 x g für 6 min bei 4 °C.
    6. Verwerfen Sie den Überstand. Das Zellpellet wird mit 5 ml PBS gewaschen und bei 600 x g 6 min bei 4 °C zentrifugiert.
    7. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml RPMI 10% FBS-20 μg/ml DNase. Auf Eis aufbewahren, vor Licht geschützt, bis sich die Zellen verfärben.
  10. Einzelzell-Suspensionspräparat aus der Lunge
    HINWEIS: Jede Lunge und jeder Dünndarm sollten parallel von zwei Personen bearbeitet werden, um längere Bearbeitungszeiten zu vermeiden, die zu einer geringen Zelllebensfähigkeit führen.
    1. Bereiten Sie 4 ml Lungenverdauungsmedium (Tabelle 1) pro verarbeiteter Probe vor.
    2. Entfernen Sie das RPMI-Medium aus der Vertiefung, die die Lunge aus Schritt 3.2.3 enthält. Schneiden Sie die Lunge mit einer feinen Schere in kleine Stücke.
    3. Übertragen Sie die Lungenstücke mit einem Spatel in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Fügen Sie 4 ml Lungenverdauungsmedium hinzu (Tabelle 1).
    4. 30 min bei 37 °C inkubieren, bei 250 U/min schütteln. Wenn Sie fertig sind, halten Sie es auf Eis, bis jede Probe verarbeitet ist.
    5. Filtern Sie jede Probe durch ein 100-μm-Zellsieb, das in einer einzigen Vertiefung einer 6-Well-Kulturplatte positioniert ist. Dissoziieren Sie das Gewebe mit einem Spritzenkolben.
    6. Jede Probe wird in einem konischen 15-ml-Röhrchen entnommen und 4 ml R-2-Medium hinzugefügt (Tabelle 1). Bleiben Sie auf Eis, während die anderen Proben verarbeitet werden.
    7. Zentrifugieren bei 600 x g für 5 min bei 4 °C. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet in 1 ml R-5-Medium resuspendiert (Tabelle 1).
    8. Während des Zentrifugierens werden 4 ml 27,5%ige Dichtegradientenlösung (Tabelle 1) pro Probe hergestellt, um die hämatopoetische Zellfraktion15,16 anzureichern. Diese Strategie zur Einzelzelltrennung ist im Vergleich zu anderen ähnlichen Dichtegradientenmedien effizienter, kostengünstiger und weniger toxisch17.
    9. Zu der 1 ml Zellsuspension aus Schritt 4.10.7 werden 4 ml 27,5%ige Dichtegradientenlösung gegeben und kräftig geschüttelt.
    10. Fügen Sie langsam 1 ml R-5-Medium (Tabelle 1) auf die gemischte Suspension hinzu, um zwei Phasen zu erzeugen.
    11. Zentrifugieren bei 1.500 x g für 20 min bei RT, mit geringer Beschleunigung und ausgeschalteter Bremse. Beobachten Sie den Ring, der sich zwischen den beiden Phasen gebildet hat.
    12. Der zwischen den beiden Phasen gebildete Ring wird mit einer 1-ml-Mikropipette zurückgewonnen und in 4 ml R-2-Medium resuspendiert.
    13. Zentrifugieren bei 450 x g für 5 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml ACK-Puffer (Tabelle 1) und inkubieren Sie es 1 Minute lang bei RT.
    14. 4 ml R-5-Medium zugeben und bei 450 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml R-10-Medium. Bis zur Färbung für die Durchflusszytometrie lichtgeschützt auf Eis aufbewahren.
  11. Einzelzell-Suspensionspräparat aus Lymphknoten
    1. Platzieren Sie die Lymphknoten aus den Schritten 3.2.2 oder 3.3.3 zwischen zwei Netzstücken in einer Vertiefung aus einer 6-Well-Kulturplatte und dissoziieren Sie sie mit einem Spritzenkolben.
    2. Die Zellsuspension wird in einem konischen 1,5-ml-Röhrchen gewonnen und bei 450 x g 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
    3. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml R-10-Medium. Bis zur Färbung für die Durchflusszytometrie lichtgeschützt auf Eis aufbewahren.
      HINWEIS: Wenn Klumpen sichtbar sind, filtern Sie die Probe durch ein 100-μm-Zellsieb.

5. Zellfärbung für die Durchflusszytometrie (Abbildung 2 und Abbildung 3)

ANMERKUNG: Zentrifugieren Sie die Lymphknotenzellsuspensionen aus Schritt 4.11.3 bei 450 x g für 5 min bei 4 °C und resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 μl FACS-Puffer (Tabelle 1).

  1. Zellfärbung zur Identifizierung von ILC2s (Abbildung 3 und ergänzende Abbildung 2)
    HINWEIS: Dieses Färbeverfahren ist spezifisch für die Identifizierung von IL-9-exprimierenden ILC2-Zellen.
    1. Platte 150 μl pro Lungenprobe (ca. 1,8 x 10 6 Zellen) aus Schritt 4.10.14 und 50 μl pro Lymphknotenprobe aus Schritt 4.11.3 (ca. 0,7 x 10 6 bzw. 2,2 x 106 Zellen für mediastinale bzw. mesenteriale Lymphknotenproben) in einer konischen 96-Well-Bodenkulturplatte. 100 μl FACS-Puffer zugeben und bei 450 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
    2. Platte 100 μl pro Dünndarmprobe (ca. 2,7 x 10 6 bzw. 0,6 x 106 Zellen für intraepitheliale bzw. Lamina propria-Proben) aus den Schritten 4.8.3 und 4.9.7 in einer konischen 96-Well-Bodenkulturplatte. 150 μl FACS-Puffer zugeben und bei 450 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
    3. Der Überstand wird verworfen und jedes Zellpellet in 50 μl des biotinylierten Antikörpercocktails (Tabelle 2), verdünnt in FACS-Puffer, resuspendiert. 30 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren.
      HINWEIS: Verwenden Sie FACS-Puffer mit 20 μg/ml DNase für intraepitheliale und Lamina-propria-Proben.
    4. Fügen Sie 150 μl FACS-Puffer hinzu. Zentrifugieren bei 450 x g für 5 min bei 4 °C.
    5. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet in 200 μl FACS-Puffer resuspendiert. Erneut zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
    6. Das Zellpellet wird in 50 μl des Antikörper-Färbungs-Cocktails (Tabelle 2) resuspendiert und 30 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubiert.
    7. Fügen Sie 150 μl FACS-Puffer hinzu. Zentrifugieren bei 450 x g für 5 min bei 4 °C.
    8. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet in 200 μl FACS-Puffer resuspendiert. Erneut zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie den Waschvorgang (Schritt 5.1.7) und entsorgen Sie den Überstand.
    9. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 300 μl FACS-Puffer und analysieren Sie es mittels Durchflusszytometrie.
    10. Verwenden Sie für die Dünndarm- und Lungenproben die Gating-Strategie: Lymphozyten, Einzelzellen, lebende Zellen, hämatopoetische Zellen, CD90+Lineage-Zellen, ST2+-Zellen und IL-9+-Zellen (Abbildung 3A, B und ergänzende Abbildung 2A). Verwenden Sie für die Lymphknotenproben die Gating-Strategie: lebende Zellen, Einzelzellen, CD90+-Linienzellen, ST2+-Zellen und IL-9+-Zellen (ergänzende Abbildung 2B, C).
  2. Zellfärbung zur Identifizierung von IL-9-produzierenden Lymphozyten (Abbildung 2 und ergänzende Abbildung 3)
    1. Transfer von 800 μl pro Lungenprobe aus Schritt 4.10.14 in ein 1,5-ml-Röhrchen (ca. 14,6 x 106 Zellen). Zentrifugieren bei 450 x g für 5 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand.
    2. Für Lymphknotenproben werden 400 μl der Zellsuspension aus Schritt 4.11.3 (ca. 5,6 x 10 6 bzw. 17,5 x 106 Zellen für mediastinale bzw. mesenteriale Lymphknotenproben) in zwei Schritten in eine konische Bodenplatte mit 96 Vertiefungen gegeben.
      1. Zuerst 200 μl umfüllen, bei 450 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
      2. Weitere 200 μl in die entsprechende Vertiefung geben. Bei 450 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
    3. Das Zellpellet wird in 50-400 μl des Antikörper-Färbe-Cocktails resuspendiert (Tabelle 3) und 30 Minuten bei 4 °C lichtgeschützt inkubiert.
      HINWEIS: Lungenproben sollten in 400 μl, mediastinale Lymphknotenproben in 50 μl und mesenteriale Lymphknotenproben in 100 μl des Färbecocktails resuspendiert werden.
    4. Fügen Sie 150 μl FACS-Puffer zu den mediastinalen Lymphknotenproben und 100 μl zu den mesenterialen Lymphknotenproben hinzu. Bei 450 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
    5. Waschen Sie die Lungen- und Lymphknotenproben, indem Sie die Pellets in 1 ml bzw. 200 μl FACS-Puffer resuspendieren. Zentrifugieren bei 450 xg für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie den Waschvorgang.
    6. Resuspendieren Sie die Lungenproben in 600 μl FACS-Puffer und analysieren Sie sie mittels Durchflusszytometrie. Verwenden Sie die Gating-Strategie: Lymphozyten, Einzelzellen, lebende Zellen, hämatopoetische Zellen, CD4+TCRβ+-Zellen und IL-9+-Zellen (Abbildung 2A).
    7. Resuspendieren Sie die Lymphknotenproben in 300 μl FACS-Puffer und analysieren Sie sie mittels Durchflusszytometrie. Verwenden Sie die Gating-Strategie: Lymphozyten, Einzelzellen, lebende Zellen, CD4+ TCRβ+-Zellen und IL-9+-Zellen (Abbildung 2B und ergänzende Abbildung 3A).

6. Bestimmung der absoluten Anzahl von Zellen in Einzelzellsuspensionen

  1. Die Proben aus den Isolierschritten 4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 und 4.11.3 werden mit PBS im Verhältnis 1:20 verdünnt (10 μl Probe + 190 μl PBS).
  2. Mischen Sie 10 μl jeder verdünnten Probe aus Schritt 6.1 mit 10 μl Trypanblau. Laden Sie 10 μl in ein Hämozytometer und zählen Sie die lebenden Zellen unter Berücksichtigung jeder Verdünnung.
  3. Man erhält die absolute Anzahl der Zellen, indem man den Prozentsatz der interessierenden Population lebender Zellen, der durch Durchflusszytometrie bestimmt wird (Viabilitätsfarbstoff-negative Zellen), mit der Gesamtzahl der lebenden Zellen in der Einzelzellsuspension nach der Isolierung multipliziert und diese Zahl durch 100 dividiert (Ergänzende Abbildung 4, Ergänzende Abbildung 5 und Ergänzende Abbildung 6).
    Absolute Zahl = (Prozentsatz der interessierenden Population aus lebenden Zellen, bestimmt durch Durchflusszytometrie x Gesamtzahl der lebenden Zellen in der Einzelzellsuspension)/100

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Representative Results

Mäusen wurden subkutan 200 L3-Larven im Stadium N. brasiliensis oder PBS zur Scheinkontrolle injiziert. Die Anzahl der Larven, die in diesem Protokoll verwendet wurden, wurde angepasst, um lebensfähige Zellen aus der Lunge, dem lymphatischen Gewebe und dem Dünndarm zu isolieren, im Gegensatz zu früheren Berichten, in denen nur höhere Würmer zum Nachweis von Zellen in lymphatischen Geweben und Lungen verwendet wurden4. Lunge, mediastinale Lymphknoten, mesenteriale Lymphknoten und der Dünndarm wurden an den Tagen 0, 4, 7 und 10 nach der Infektion zur Lymphozytenisolierung und Charakterisierung von IL-9-produzierenden Populationen entnommen. Insgesamt wurden 27 Mäuse in zwei oder mehr unabhängigen Experimenten verwendet, darunter neun Kontrollen und vier bis sechs N. brasiliensis-infizierte Mäuse pro analysiertem Zeitpunkt. Sham-infizierte Kontrollen wurden in jedes Experiment einbezogen, um Basalzahlen zu erhalten. Mit diesem Protokoll können IL-9-produzierende CD4+ T-Zellen (in diesem Modell hauptsächlich Th9-Zellen) aus Lungen-, Mesenterial- und Mediastinallymphknoten zur Quantifizierung und weiteren Analyse isoliert werden.

Nach dem natürlichen Verlauf der Infektion untersuchten wir zunächst die Häufigkeit von IL-9-produzierenden CD4+ T-Lymphozyten (Th9), die in der Lunge und den mediastinalen Lymphknoten vorhanden sind (Gating-Strategie in Abbildung 2A und ergänzende Abbildung 3A). In beiden Organen nahmen die Th9-Frequenzen ab Tag 4 zu und erreichten am Tag 7 nach der Infektion einen Höhepunkt (Abbildung 2C), ein Anstieg, der auch bei den absoluten Th9-Zahlen beobachtet wurde (Ergänzende Abbildung 4A, B). In den mesenterialen Lymphknoten (Gating-Strategie in Abbildung 2B gezeigt) gab es einen signifikanten Anstieg sowohl der Häufigkeiten als auch der absoluten Anzahl von Th9-Zellen an den Tagen 7 und 10 nach der Infektion (Abbildung 2C und ergänzende Abbildung 4C), in Übereinstimmung mit früheren Berichten4. Das Vorhandensein von T-Zellen und ILC2s wurde in den intraepithelialen und Lamina propria-Proben bestätigt; In diesen Darmkompartimenten wurden jedoch während der gesamten Infektion keine Th9-Zellen beobachtet (ergänzende Abbildung 3B, C).

Anschließend untersuchten wir IL-9-exprimierende ILC2-Zellen in lymphatischen und nicht-lymphatischen Geweben infizierter Mäuse (Gating-Strategie in Abbildung 3A, B und ergänzende Abbildung 2). Wir beobachteten einen signifikanten Anstieg der Häufigkeiten von ST2+ IL-9- und ST2+ IL-9+, die ILC2s in der Lunge exprimieren, am Tag 7 nach der Infektion (Abbildung 3C). Gleichzeitig ergab die Analyse der absoluten Zahlen einen statistisch signifikanten Anstieg nur in der ST2+ IL-9+-Population am Tag 7 nach der Infektion (Ergänzende Abbildung 5A). In den mediastinalen Lymphknoten (Gating-Strategie in ergänzender Abbildung 2B dargestellt) stieg die Anzahl der IL-9-exprimierenden ILC2-Zellen (ST2+ IL-9+) am Tag 10 nach der Infektion signifikant an, während die absolute Anzahl der ST2+-Zellen einen Trend zum Anstieg zeigte, beginnend am Tag 7 und bis zum Tag 10 nach der Infektion (ergänzende Abbildung 6A, C).

IL-9+ ILC2-Zellen wurden auch in der Lamina propria und den intraepithelialen Kompartimenten des Dünndarms gefunden (Gating-Strategie in Abbildung 3B und ergänzende Abbildung 2A). Eine Infektion mit N. brasiliensis führte zu einem statistisch signifikanten Anstieg der Häufigkeiten von ST2+ IL-9+-Zellen an Tag 4 und ST2-IL-9+-Populationen an den Tagen 7 und 10 in der Lamina propria. Im intraepithelialen Kompartiment wurde auch eine signifikante Veränderung der Häufigkeiten von ST2+ IL9+- und ST2-IL-9+-Zellen am Tag 7 bzw. Tag 10 nach der Infektion beobachtet (Abbildung 3C). Wichtig ist, dass selbst bei einer relativ geringen Anzahl von Larven die Infektion mit dem Parasiten den Dünndarm stark schädigt. Daher ist die Analyse der absoluten ILC2-Zahlen von IL-9-exprimieren technisch nicht durchführbar, was die genaue Quantifizierung dieser Population aufgrund der geringen Ausbeute an lebenden Zellen behindert (Ergänzende Abbildung 5B, C). Auf der anderen Seite zeigte die Analyse der mesenterialen Lymphknoten (Gating-Strategie in ergänzender Abbildung 2C gezeigt) einen signifikanten Anstieg der absoluten Zahlen von ST2+ IL-9-, ST2+ IL-9+ und ST2-IL-9+ ILC2-Zellen am Tag 10 nach der Infektion (ergänzende Abbildung 6D), wie bereits berichtet4. In der Zwischenzeit wurde während der gesamten Infektion kein Unterschied in den Häufigkeiten dieser Populationen beobachtet (ergänzende Abbildung 6B). Diese verschiedenen Untergruppen von ST2- und IL-9-exprimierenden Zellen sind faszinierende Populationen mit potenziell unterschiedlichen Rollen in vivo und könnten natürlichen versus inflammatorischen ILC2s entsprechen, wie kürzlich beschrieben 18,19,20,21. Dies muss jedoch in zukünftigen Studien berücksichtigt werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir dieses Protokoll für die Gewinnung von IL-9-exprimierenden Zellen aus dem mit N. brasiliensis infizierten Darm angepasst haben, während wir sie weiterhin in der Lunge und im lymphatischen Gewebe nachweisen konnten. Die Gewinnung von Immunzellen aus parasiteninfizierten Eingeweiden hat sich als technisch schwierig erwiesen. Hier führte eine angepasste Anzahl von Larven, die für die Infektion verwendet wurden, zu einer verbesserten Integrität des Darmgewebes, was die Erholung einer IL-9+-Population ermöglichte. Unseres Wissens ist dies das erste Protokoll, das speziell für die Analyse von IL-9-exprimierenden Zellen im Darm während einer N. brasiliensis-Infektion entwickelt wurde. Dennoch können nach diesen Schritten auch andere Immunzellen isoliert werden. Die hier vorgestellten Daten zeigen, dass die meisten geweberesidenten IL-9-exprimierenden Zellen im Dünndarm ILC2s sind.

Figure 1
Abbildung 1: Flussdiagramm des beschriebenen Protokolls. Schematische Darstellung mit den wichtigsten Schritten, die zur Verarbeitung verschiedener Organe verwendet werden, und den erwarteten IL-9-exprimierenden Zelluntergruppen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Th9-Zellen finden sich in Lunge, mediastinalen und mesenterialen Lymphknoten während der gesamten N. brasiliensis-Infektion. Repräsentative Durchflusszytometrie-Analyse und Gating-Strategie zur Identifizierung von Th9-Zellen aus (A) Lungen und (B) mesenterialen Lymphknoten. Einzelzellsuspensionen aus jedem Organ wurden mit einem fixierbaren Viabilitätsfarbstoff, fluoreszenzmarkiertem Anti-CD45 zur Identifizierung hämatopoetischer Zellen und Anti-T-Zell-Rezeptor (TCR) β und Anti-CD4 zur Identifizierung von CD4+ T-Lymphozyten gefärbt. Das GFP+-Signal gibt den Prozentsatz der vorhandenen Th9-Zellen an. Das erste Gate zeigt Side Scatter (SSC)-A/Forward Scatter (FSC)-A Eigenschaften mit der klassischen Morphologie lymphatischer Zellen. Einzelzellereignisse wurden ausgewählt, gefolgt von lebenden Zellen und dann CD45+-Zellen. Innerhalb dieser Population konzentrierten wir uns auf TCR-β- und CD4-Doppel-positive Zellen, von denen GFP+-Zellen als Th9-Zellen identifiziert wurden. Die Färbung der Lymphknoten enthielt den Anti-CD45-Antikörper nicht, da erwartet wird, dass die gesamte Population positiv ist. (C) Häufigkeiten von Th9-Zellen, die in Lunge, mediastinalen und mesenterialen Lymphknoten zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Infektion gefunden wurden. Die Daten stellen den mittleren ± SEM von ein oder zwei Mäusen dar, die pro Gruppe aus drei unabhängigen Experimenten pro Zeitpunkt analysiert wurden. Ungepaarter T-Test; *p≤ 0,05, **p≤ 0,001, ***p≤ 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: IL-9-produzierende ILC2-Zellen kommen in nicht-lymphatischen Organen vor. Repräsentative Durchflusszytometrie-Analyse und Gating-Strategie zur Identifizierung von IL-9+ ILC2-Zellen aus (A) Lunge und (B) Dünndarmlamina propria. Einzelzellsuspensionen aus jedem Organ wurden mit biotinylierten Antikörpern markiert, um Linienzellen zu identifizieren (Anti-B220, Anti-CD11b, Anti-FcεRI, Anti-TCR-β, Anti-TCR-γδ, Anti-Siglec F, Anti-CD4, Anti-CD11c, Anti-Gr-1, Anti-CD8, Anti-CD19, Anti-NK1.1 und Anti-Ter119) und Fc-Block. Die Zellsuspensionen wurden dann mit fixierbarem Viabilitätsfarbstoff, fluorochrommarkiertem Streptavidin, Anti-CD45 zur Identifizierung hämatopoetischer Zellen und Anti-CD90 zur Identifizierung von ILC2-Zellen gefärbt. Das erste Gate zeigt Scatter (SSC)-A/Side Scatter (FSC)-A Eigenschaften mit der klassischen Morphologie lymphatischer Zellen. Einzelzellereignisse wurden ausgewählt, gefolgt von lebenden Zellen und dann CD45+-Zellen. Innerhalb dieser Population konzentrierten wir uns auf CD90+ Linzellen; Aus dieser Gruppe untersuchten wir die ST2- und GFP-Expression, um IL-9+ ILC2-Zellen zu identifizieren. (C) Häufigkeiten von ILC2-Zellen, die in der Lunge, der Lamina propria und dem intraepithelialen Zellkompartiment zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Infektion gefunden wurden. Die Daten stellen den mittleren ± SEM von ein oder zwei Mäusen dar, die pro Gruppe aus drei unabhängigen Experimenten pro Zeitpunkt analysiert wurden. ungepaarter T-Test; *p ≤ 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Liste der chemischen Lösungen und ihrer Zusammensetzung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Antikörpercocktail zur Identifizierung von IL-9-produzierenden ILC2-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Antikörpercocktail zur Identifizierung von IL-9-produzierenden T-Lymphozyten. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 1: Schematische Darstellung der Lage des mediastinalen Lymphknotens. Erstellt in BioRender.com Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Repräsentative Durchflusszytometrie und Gating-Strategie zur Identifizierung von IL-9+ ILC2s in intraepithelialen Zellen aus dem Dünndarm und den Lymphknoten . (A) Einzelzellsuspensionen aus intraepithelialen Dünndarmzellen wurden zunächst mit Biotin-markierten Antikörpern inkubiert, um Linienzellen auszuwählen (Anti-B220, Anti-CD11b, Anti-FcεRI, Anti-TCR-β, Anti-TCR-γδ, Anti-Siglec F, Anti-CD4, Anti-CD11c, Anti-Gr-1, Anti-CD8, Anti-CD19, Anti-NK1.1 und Anti-Ter119) und Fc-Block. Es folgte die Färbung mit einem fixierbaren Viabilitätsfarbstoff, fluorochrommarkiertem Streptavidin, Anti-CD45 zur Identifizierung hämatopoetischer Zellen und Anti-CD90 zur Identifizierung von ILC2-Zellen. Das erste Gate zeigt Side Scatter (SSC)-A/Forward Scatter (FSC)-A Eigenschaften mit der klassischen Morphologie lymphatischer Zellen. Einzelzellereignisse wurden ausgewählt, gefolgt von lebenden Zellen und dann CD45+-Zellen. Innerhalb dieser Population konzentrierten wir uns auf CD90+ Linzellen; Aus dieser Gruppe wurden GFP+-Zellen als IL-9+ ILC2-Zellen identifiziert. (B,C) Repräsentative Durchflusszytometrie und Gating-Strategie für (B) mediastinale Lymphknoten und (C) mesenteriale Lymphknoten zur Identifizierung von IL-9+ ILC2-Zellen. Die Färbung der Lymphknoten enthielt nicht den Anti-CD45-Antikörper, da erwartet wurde, dass die gesamte Population positiv war. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Repräsentative Durchflusszytometrie-Analyse und Gating-Strategie zur Identifizierung von Th9-Zellen in mediastinalen Lymphknoten und im Dünndarm. Einzelzellsuspensionen aus (A) mediastinalen Lymphknoten wurden mit einem fixierbaren Viabilitätsfarbstoff und fluoreszenzmarkierten Anti-TCR-β- und Anti-CD4-Antikörpern gefärbt. Das erste Gate zeigt Side Scatter (SSC)-A/Forward Scatter (FSC)-A Eigenschaften mit der klassischen Morphologie lymphatischer Zellen. Einzelzellereignisse wurden ausgewählt, gefolgt von lebenden Zellen und dann TCR-β- und CD4-Doppel-positiven Zellen; Aus dieser Gruppe wurden GFP+-Zellen als Th9-Zellen identifiziert. Eine ähnliche Durchflusszytometrie-Strategie wurde für (B) Lamina propria und (C) intraepitheliale Zellen aus dem Dünndarm verwendet, mit der Ausnahme, dass CD45+-Zellen nach den lebenden Zellen selektiert wurden, gefolgt von TCR-β- und CD4-Doppel-positiven Zellen, von denen GFP+-Zellen als Th9-Zellen identifiziert wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Die absolute Anzahl der Th9-Zellen ändert sich signifikant während der Infektion. Die absolute Anzahl von IL-9+-Zellen aus TCR-β- und CD4-Doppel-positiven Zellen wurde an den Tagen 0, 4, 7 und 10 nach der Infektion in (A) Lunge, (B) mediastinalen Lymphknoten und (C) mesenterialen Lymphknoten bestimmt. Die Daten stellen den mittleren ± SEM von ein oder zwei Mäusen dar, die pro Gruppe aus drei unabhängigen Experimenten pro Zeitpunkt analysiert wurden. ungepaarter T-Test *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,001, ***P ≤ 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 5: Die absolute Anzahl von IL-9+ ILC2-Zellen unterscheidet sich während der gesamten Infektion. Die absolute Anzahl von IL-9+ ILC2-Zellen aus der lin-CD90+-Population an den Tagen 0, 4, 7 und 10 nach der Infektion wurde in (A) Lunge, (B) Lamina propria und (C) intraepithelialen Zellen aus dem Dünndarm bestimmt. Die Daten stellen den mittleren ± SEM von ein oder zwei Mäusen dar, die pro Gruppe aus drei unabhängigen Experimenten pro Zeitpunkt analysiert wurden. ungepaarter T-Test *p ≤ 0,05. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 6: Häufigkeiten und absolute Zahlen von IL-9+ ILC2-Zellen in Lymphknoten nehmen während der Infektion signifikant zu. (A) Häufigkeit und (C) absolute Anzahl von IL-9+ ILC2-Zellen aus mediastinalen Lymphknoten. (B) Häufigkeit und (D) absolute Anzahl von IL-9+ ILC2-Zellen aus mesenterialen Lymphknoten. Die Werte wurden als IL-9+ ILC2-Zellen innerhalb der lin-CD90+-Population an den Tagen 0, 4, 7 und 10 nach der Infektion bestimmt. Die Daten stellen den mittleren ± SEM von einer oder zwei Mäusen dar, die pro Gruppe aus drei unabhängigen Experimenten pro Zeitpunkt analysiert wurden; ungepaarter T-Test *p ≤ 0,05, ***p ≤ 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 7: Durchflusszytometrische Analyse von IL-9-exprimierenden ILC2-Zellen aus dem mit N. brasiliensis infizierten Darm. Repräsentative Diagramme von ILC2-Zellen, die am Tag 7 nach der Infektion aus dem Darm von IL-9-Reportermäusen isoliert wurden. Die IL-9-Expression wurde in ILC2-Zellen untersucht, die frisch aus den intraepithelialen oder Lamina-propria-Kompartimenten infizierter Reportermäuse (IL-9 REP) isoliert wurden, im Vergleich zum zuvor beschriebenen intrazellulären IL-9-Färbeprotokoll 9 (IL-9 AB, unter Verwendung eines IL-9-Antikörperklons RM9A4, BioLegend). Um IL-9-exprimierende ILC2s zu identifizieren, wurden zunächst Einzelzellsuspensionen mit Biotin-markierten Antikörpern inkubiert, um Linienzellen auszuwählen (Anti-B220, Anti-CD11b, Anti-FcεRI, Anti-TCR-β, Anti-TCR-γδ, Anti-Siglec F, Anti-CD4, Anti-CD11c, Anti-Gr-1, Anti-CD8, Anti-CD19, Anti-NK1.1 und Anti-Ter119) und Fc-Block, gefolgt von einer Färbung mit flexiblem Viabilitätsfarbstoff, Fluorochrom-markiertem Streptavidin, Anti-CD45 und Anti-CD90. Die Diagramme zeigen IL-9-exprimierende ILC2-Zellen, die auf der lin-CD45+CD90+-Population in den intraepithelialen (A,B) und Lamina propria (C,D) Kompartimenten vorhanden sind und über das Reportersignal von frisch isolierten Zellen (A,C) oder nach intrazellulärer Färbung von IL-9 (B,D) nachgewiesen werden. Kontrollmäusen wurde PBS injiziert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Ein vollständiges Verständnis der intestinalen Parasiten-Wirt-Interaktionen und Immunantworten auf Helmintheninfektionen erfordert die Identifizierung und Analyse der verschiedenen Zellpopulationen und Effektormoleküle, die für die Induktion des Gewebeumbaus und der Wurmvertreibung entscheidend sind. Bodenübertragene Helmintheninfektionen stellen in Entwicklungsländern auf der ganzen Welt ein großes Problem dar. Bis vor kurzem war jedoch kein Protokoll verfügbar, das die Analyse seltener Zellpopulationen im Dünndarm, dem von dieser Infektion betroffenen Hauptorgan, ermöglichte5. Dieses Protokoll deckt zuvor beschriebene Methoden ab, die die durchflusszytometrische Analyse von IL-9-exprimierenden lymphatischen Zellen in der Lunge, den mediastinalen und mesenterialen Lymphknoten während einer N. brasiliensis-Infektion ermöglichen, mit dem zusätzlichen Vorteil, dass diese Population erstmals im Dünndarm identifiziert werden kann.

Der Erfolg dieses Protokolls hängt stark von den Verarbeitungszeiten des Gewebes ab. Es ist unbedingt erforderlich, maximal sechs Dünndarmproben pro Person gleichzeitig zu verarbeiten. Wenn verschiedene Organe bearbeitet werden sollen, empfehlen wir, dies parallel von einer anderen Person durchführen zu lassen. Durch die Verwendung einer relativ geringen Parasitenlast (200 L3-Larven) ermöglicht dieses Protokoll die Isolierung von lymphatischen Zellen aus dem mit N. brasiliensis infizierten Darm unter Beibehaltung der Fähigkeit, diese Zellen von anderen Organen zu isolieren. Die Verwendung höherer Parasitenbelastungen gefährdet die Qualität und Quantität der aus dem Dünndarm isolierten Zellen (Daten nicht gezeigt); Es könnte jedoch zu einem signifikanten Anstieg der IL-9-exprimierenden lymphatischen Zellen in anderen Organen führen4. Bei der Verarbeitung des Darms und der mesenterialen Lymphknoten ist es wichtig, das anhaftende Fettgewebe zu entfernen, da dies zu einem erhöhten Zelltod führt. Die Daten stützen die Beobachtung, dass sich der natürliche Verlauf der Infektion negativ auf die absolute Anzahl der aus dem Dünndarm gewonnenen lymphatischen Zellen auswirkt. In den hier beschriebenen Studien bleiben die Häufigkeiten von IL-9+ ILC2-Zellen konstant, während die absoluten Zahlen in jedem unabhängigen Experiment eine hohe Variabilität aufweisen. Daher könnten Schlussfolgerungen, die aus absoluten Zahlen gezogen werden, ungenau sein und sollten vermieden werden. Darüber hinaus wird angesichts der geringen Häufigkeit von IL-9-exprimierenden T-Zellen in Geweben die Erfassung und Färbung einer möglichst hohen Anzahl von Zellen empfohlen.

Eine Einschränkung dieser ILC2-Analyse ist die Verwendung einer diskreten Kombination von Markern zur Definition dieser Population. Abhängig vom interessierenden Gewebe und der Phase der Infektion könnten zusätzliche Marker wie CD25, Klrg1 und ST2 für eine detailliertere phänotypische Charakterisierung von ILC2-Zellen verwendet werden22. Wir erkennen an, dass das hier vorgestellte Protokoll auf dem INFER-Reporter-Mausstamm4 basiert und einen Vorteil für die Identifizierung von IL-9-exprimierenden Zellen darstellen könnte. Wir erwarten jedoch, dass die hier gefundenen Ergebnisse mit alternativen Strategien erzielt werden können, einschließlich der Verwendung anderer Maus-Reporterstämme und der intrazellulären IL-9-Färbung 6,7,8,9. Es ist wichtig zu erwähnen, dass die Verwendung herkömmlicher Mäuse und die Durchführung einer intrazellulären Färbung von IL-9 in intraepithelialen und Lamina-propria-Zellen dazu führen kann, dass jedes nachweisbare Signal verloren geht und die erhaltenen Daten beeinträchtigt werden (ergänzende Abbildung 7). Dies könnte auf die langfristige Manipulation zurückzuführen sein, die erforderlich ist, um eine Teilmenge zu färben, die bereits schwer zu isolieren und ex vivo zu erhalten ist. Daher empfehlen wir die Verwendung von Reportermäusstämmen, um die Verarbeitungszeiten zu verkürzen und eine zuverlässige Analyse der IL-9-Expression in vivo zu gewährleisten. Wir erkennen auch die Tatsache an, dass Th9-Zellen nicht die einzigen T-Zellen sind, die IL-923 exprimieren; In diesem parasitären Modell würden wir jedoch nicht erwarten, dass andere Teilmengen es ausdrücken. Um jedoch das Vorhandensein anderer IL-9-exprimierender Untergruppen im beschriebenen Kontext zu verwerfen, ist eine vollständige Charakterisierung von Typ-2-Zytokinen zusammen mit der Verwendung von Transkriptionsmarkern möglich.

Die Quantifizierung von IL-9-exprimierenden lymphatischen Zellen vor Tag 5 nach der Infektion wurde bereits berichtet; Dies führt jedoch zu sehr niedrigen Zellfrequenzen4. Das Protokoll in dieser Studie deckt einen großen Teil der Kinetik der N. brasiliensis-Infektion bis zum Beginn der Parasitenbeseitigungab 2. Wir stellten jedoch fest, dass einige der Zellpopulationen in dieser Studie innerhalb des analysierten Zeitrahmens nicht auf das basale Niveau zurückkehrten, was darauf hindeutet, dass die Studie von verlängerten Zeitpunkten profitieren könnte, um eine vollständige Perspektive auf das Verhalten dieser Zellen in einem fortgeschritteneren Stadium der Infektion in vivo zu haben. Unabhängig davon glauben wir, dass die hier vorgestellte Arbeit als Nachschlagewerk für Forscher dienen könnte, die daran interessiert sind, IL-9-exprimierende lymphatische Zellen in Parasiteninfektionsmodellen zu untersuchen, so dass sie die ideale Phase der Infektion für den Nachweis der spezifischen Zelltypen aus Geweben von Interesse wählen können. Insgesamt werden die hier beschriebenen Methoden nützlich sein, um den Phänotyp und die Funktion von T-Lymphozyten und ILC2-Zellen, die IL-9 exprimieren, während eines physiologisch relevanten Modells der Parasiteninfektion zu bewerten, unser Wissen über diese Zellen zu erweitern und möglicherweise unser Verständnis von ihnen bei anderen pathologischen Zuständen zu verbessern.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Die Autoren danken José Luis Ramos-Balderas für seine technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch den folgenden Zuschuss an PLL von CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027) unterstützt. OM-P und EO-M erhielten ein Stipendium von CONACYT (736162 bzw. 481437). MCM-M erhielt ein Stipendium von CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK buffer Homemade
Attune Nxt cytometer Thermofisher
B220 Biolegend 103204
CD11b Biolegend 101204
CD11c  Biolegend 117304
CD19  Biolegend 115504
CD4 Biolegend 100404
CD4 (BV421) Biolegend 100443
CD45.2 Biolegend 109846
CD8  Biolegend 100703
CD90.2 Biolegend 105314
Collagenase D Roche 11088866001
DNAse I Invitrogen 18068015 Specific activity: ≥10 000 units/mg   
Facs ARIA II sorter BD Biosciences
FACS Melody cell sorter BD Biosciences
Fc-Block Biolegend 101320
FcεRI eBioscience 13589885
Fetal bovine serum Gibco 26140079
FlowJo FlowJo Flow cytometry analysis data software
Gr-1 Tonbo 305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Homemade
IL-9 biolegend 514103
NK1.1  Biolegend 108704
Nylon mesh  ‎ lba B07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556
Phosphate-buffered saline  Homemade
RPMI Gibco 11875093
Siglec F  Biolegend 155512
Streptavidin Biolegend 405206
TCR-β  Biolegend 109203
TCR-β (PE/Cy7) Biolegend 109222
TCR-γδ  Biolegend 118103
Ter119 Biolegend 116204
Tricine buffer  Homemade
Zombie Aqua Fixable Viability Dye Biolegend 423101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  23. Noelle, R. J., Nowark, E. C. Cellular sources and immune functions of interleukin-9. Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).

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Immunologie und Infektion Ausgabe 193 IL-9 Th9 ILC2 IL-9 lymphatische Zellen Parasit Dünndarm N. brasiliensis
Eine Strategie für die Untersuchung von IL-9-produzierenden lymphatischen Zellen im <em>Nippostrongylus brasiliensis-Infektionsmodell</em>
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Muñoz-Paleta, O., Olguín-Martínez, E., Ruiz-Medina, B. E., Alonso-Quintana, A., Marcial-Medina, M. C., Licona-Limón, P. A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model. J. Vis. Exp. (193), e64075, doi:10.3791/64075 (2023).

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