Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Стратегия изучения IL-9-продуцирующих лимфоидных клеток в модели инфекции Nippostrongylus brasiliensis

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64075
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México
* These authors contributed equally

Summary

IL-9-экспрессирующие Т- и ILC2-клетки индуцируются во время инфекции N. brasiliensis , однако их характеристика в значительной степени упускается из виду в инфицированном кишечнике из-за их низкой частоты и дифференциальной кинетики. Этот протокол описывает выделение этих клеток из разных органов-мишеней и подтверждение их идентичности с помощью проточной цитометрии на разных стадиях инфекции.

Abstract

IL-9 представляет собой плейотропный цитокин, связанный с различными процессами, включая противоопухолевый иммунитет, индукцию аллергических патологий и иммунный ответ против гельминтозных инфекций, где он играет важную роль в изгнании паразита. В мышиной модели инфекции Nippostrongylus brasiliensis IL-9 продуцируется в основном CD4+ Т-лимфоцитами и врожденными лимфоидными клетками, обнаруженными в легких, тонкой кишке и дренирующих лимфатических узлах. Учитывая технические трудности, связанные с внутриклеточным окрашиванием IL-9, а также сложность выделения гемопоэтических клеток из тонкой кишки при инфекции, существует острая необходимость во всеобъемлющем, но простом протоколе для анализа экспрессии IL-9 в различных лимфоидных и нелимфоидных тканях в этой модели. Описанный здесь протокол описывает кинетику IL-9, продуцируемого CD4+ Т-клетками и врожденными лимфоидными клетками в легких и тонкой кишке, основных органах, на которые нацелен N. brasiliensis, а также в средостении и брыжеечных лимфатических узлах, на протяжении всей инфекции. Кроме того, в нем подробно описывается количество личинок, необходимых для заражения, в зависимости от типа клеток и интересующего органа. Этот протокол направлен на то, чтобы помочь в стандартизации анализов, чтобы сэкономить время и ресурсы, предлагая возможность сосредоточиться на конкретных клетках, органах и стадиях заболевания, представляющих интерес в модели инфекции N. brasiliensis.

Introduction

Анкилостомы — это кишечные паразиты, которые заражают около 700 миллионов человек во всем мире, в основном в тропических районах слаборазвитых стран. Инфекции высокой интенсивности, вызванные анкилостомой двенадцатиперстной кишки и Necator americanus, наиболее распространенными паразитами анкилостомы у людей, вызывают анемию и дефицит белка, что может привести к задержке роста и умственного развития1. N. americanus и паразит грызунов Nippostrongylus brasiliensis индуцируют прототип иммунного ответа типа 2 у своего хозяина и имеют сходство в своем жизненном цикле. Следовательно, заражение мышей N. brasiliensis является наиболее часто используемой моделью для инфекций анкилостомы человека. Стадия 3 (L3): Инфекционные личинки N. brasiliensis перемещаются из кожи в легкие в первые несколько часов после заражения. Попав в легкое, они становятся L4 и мигрируют вверх по трахее, чтобы проглотиться, пройти через желудок и достичь кишечника, чтобы стать взрослыми (L5) в течение 4-5 дней. В кишечнике черви L5 откладывают яйца, которые выделяются с фекалиями, чтобы перезапустить жизненный циклпаразита 2.

Иммунный ответ, индуцированный N. brasiliensis , характеризуется увеличением нескольких цитокинов типа 2, включая IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 и IL-13, наряду с эозинофилией, базофилией, гиперплазией бокаловидных и тучных клеток, а также повышенной продукцией IgG1 и IgE. Большинство исследований, пытающихся идентифицировать и определить иммунные реакции, вызванные инфекцией N. brasiliensis, сосредоточены на роли IL-4 или IL-13 в этой модели3. Тем не менее, идентификация и характеристика клеток, экспрессирующих IL-9, и функция этого цитокина были в значительной степени упущены из виду, пока Licona-Limón et al. не опубликовали первое исследование, демонстрирующее критическую роль IL-9 в иммунном ответе против N. brasiliensis. Используя репортерных мышей, это исследование описало Т-клетки (в основном Т-хелперы 9) и врожденные лимфоидные клетки 2 типа (ILC2) в качестве основных клеточных подмножеств, экспрессирующих IL-9 при инфекции4.

Выделение и характеристика иммунных клеток из легких, инфицированных гельминтами, возможны, и об этом широко сообщалось 3,4. Однако из-за присущего ремоделирования тканей и производства слизи сделать это в инфицированном кишечнике оказалось технической проблемой до недавней публикации Ferrer-Font et al.5. Группа изложила протокол для выделения и анализа одноклеточных суспензий иммунных подмножеств из кишечника мышей, инфицированных Heligmosomoides polygyrus. На его основе мы стандартизировали протокол выделения и цитометрического анализа IL-9-экспрессирующих лимфоидных клеток из кишечника, инфицированного N. brasiliensis. Кроме того, мы установили кинетику IL-9 из различных клеточных источников и анатомических мест на протяжении всей инфекции.

Характеристика различных клеточных популяций, участвующих в этой инфекции, жизненно важна для более широкого понимания иммунного ответа на паразита и его взаимодействия с хозяином. Этот всеобъемлющий протокол обеспечивает четкий путь для выделения и анализа клеток, продуцирующих IL-9, из желаемых органов на интересующих стадиях заболевания, что позволяет значительно улучшить знания о роли этих клеток в инфекции N. brasiliensis и паразитарных инфекциях в целом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты на животных, описанные здесь, были одобрены Внутренним комитетом по обращению с животными (CICUAL) Института клеточной физиологии Национального автономного университета Мексики.

ПРИМЕЧАНИЕ: Блок-схема всего протокола показана на рисунке 1.

1. Содержание мышей

  1. Используйте 8-10-недельные группы мышей, самок или самцов, размещенных в помещениях для животных с постоянной температурой и влажностью в 12-часовых циклах света/темноты, с свободным доступом к воде и пище.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется репортерный штамм мыши IL-9 на фоне C57BL/6, как описаноранее 4; однако можно было использовать другие репортерные штаммы IL-9 6,7,8, а также внутриклеточное окрашивание IL-9 с вариабельными результатами 9.

2. Заражение мышей

  1. Побрейте спину мышей от середины тела до основания хвоста за 1 день до заражения. Использование анестетиков не является обязательным.
  2. Подкожно инокулируют каждой мыши 200 жизнеспособных личинок N. brasiliensis третьей стадии (L3) в 100 мкл фосфатного солевого буфера (PBS)10 в нижней части спины, как описано ранее2,11, или вводят 100 мкл только PBS в качестве контроля. Принесите животных в жертву на 4-й, 7-й или 10-й день после заражения.

3. Выделение легких, тонкой кишки, средостения и брыжеечных лимфатических узлов

  1. Усыпить мышь вывихом шейки матки. Положите мышь на спину и сбрызните ее 70% этанолом. Сделайте разрез по средней линии с помощью ножниц и откройте кожу, чтобы обнажить брюшную и грудную области.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изофлуран может быть использован в качестве альтернативного метода эвтаназии12. Камеры с углекислым газом не рекомендуются, так как CO2 приводит к повреждению легочной ткани и кровоизлиянию13.
  2. Выделение лимфатических узлов средостения и легких
    1. Сделайте разрез на грудине и разрез в форме буквы «V», чтобы удалить ребра и грудные мышцы. После того, как грудная полость обнажена, найдите лимфатические узлы средостения рядом с пищеводом, ниже сердца (см. дополнительный рисунок 1).
    2. Извлеките лимфатические узлы средостения и соберите их в 1 мл среды R-10 (таблица 1) в 12-луночную культуральную пластину. Хранить на льду, защищенном от света до момента обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны быть защищены от света, чтобы избежать снижения флуоресцентного сигнала от мышей-репортеров, используемых в этих экспериментах.
    3. Извлеките легкие и соберите их в 1 мл среды R-10 в 12-луночную культуральную пластину на мышь. Хранить на льду, защищенном от света до момента обработки.
  3. Выделение цепей брыжеечных лимфатических узлов и тонкой кишки
    1. Обнажите брюшную полость и осторожно переместите тонкую кишку вправо, чтобы обнажить цепь брыжеечных лимфатических узлов (MLN) вдоль толстой кишки.
    2. С помощью щипцов извлеките MLN, аккуратно раскатайте его на бумажном полотенце и стяните жир.
    3. Переведите MLN в 1 мл среды R-10 в 12-луночную культуральную пластину. Хранить на льду, защищенном от света до момента обработки.
    4. Разрежьте тонкую кишку чуть ниже пилорического сфинктера и над слепой кишкой. Медленно вытащите кишечник с помощью щипцов, удалив прикрепленную брыжейку и жировую ткань.
    5. Положите тонкую кишку на бумажное полотенце и щедро смочите ее PBS. Удалите пейеровы пятна из тонкой кишки ножницами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сохранить жизнеспособность, удалите оставшуюся жировую ткань и держите тонкую кишку влажной с помощью PBS в течение всего процесса.
    6. Разрежьте тонкую кишку продольно с помощью ножниц и аккуратно проведите щипцами по открытой кишке, чтобы удалить содержимое кала и слизь.
    7. Держите тонкую кишку щипцами и промойте ее в 5 мл PBS на льду, осторожно погрузив ее несколько раз. Повторите дважды.
    8. Разрежьте тонкую кишку на короткие кусочки (примерно 5 мм) и соберите их в коническую пробирку объемом 50 мл с 10 мл HBSS14 с 2% FBS (таблица 1). Немедленно продолжают выделять интраэпителиальные и собственные клетки пластинки.

4. Приготовление одноклеточных суспензий из тонкой кишки, легких и лимфатических узлов

ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезвычайно важно обрабатывать не более шести мышей на человека при приготовлении одноклеточных суспензий из тонкого кишечника, так как жизнеспособность клеток значительно снижается с более длительными периодами обработки. Этот метод был адаптирован из мышиной модели5 с инфекцией Heligmosomoides polygyrus.

  1. Предварительно прогрейте встряхивающий инкубатор, среду R-20, HBSS и HBSS-2 мМ ЭДТА (таблица 1) при 37 °C.
  2. Приготовьте 10 мл среды для переваривания тонкой кишки (таблица 1) на образец.
  3. Энергично встряхните кусочки кишечника из шага 3.3.8 рукой.
  4. Отфильтруйте каждый образец через нейлоновую сетку (примерно 10 см x 10 см) над стеклянной воронкой. Промойте образец, добавив 10 мл предварительно нагретого HBSS поверх сетки, и выбросьте проточный. Повторите еще раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте новую сетку для каждого образца и повторно используйте ее на протяжении всей процедуры.
  5. Извлеките сетку из воронки и соберите образец из сетки в коническую пробирку объемом 50 мл с 10 мл теплого HBSS-2 мМ ЭДТА (шаг 4.1). Инкубировать 10 мин при 37 °C, встряхивая при 200 об/мин.
  6. Вихревая в течение 10 с на максимальной скорости (3 200 об/мин) и фильтруйте образец с сеткой над стеклянной воронкой, восстанавливая поток в конической пробирке объемом 50 мл.
  7. Повторите шаги 4.5 и 4.6 дважды, восстанавливая проток в той же конической пробирке объемом 50 мл. Интраэпителиальные клетки расположены в этой фракции 30 мл. Сохраните оставшуюся ткань.
  8. Препарат одноклеточной суспензии из интраэпителиальных клеток
    1. Центрифугируют 30 мл клеточной суспензии, извлеченной на стадии 4.7, в концентрации 450 x g в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Откажитесь от надосадочной жидкости.
    2. Добавьте 5 мл PBS и центрифугу при 450 x g в течение 5 мин при ЛТ. Выбросьте надосадочную жидкость.
    3. Ресуспендируют клеточную гранулу в 3 мл RPMI 10% FBS-20 мкг / мл ДНКазы (таблица 1). Держать на льду, защищенном от света до окрашивания клеток.
  9. Препарат одноклеточной суспензии из собственных клеток пластинки
    1. Промойте оставшуюся ткань тонкой кишки с шага 4.7, налив более 10 мл теплого HBSS через сетку над воронкой. Повторите стирку. Соберите ткань из сетки в коническую пробирку объемом 50 мл с 10 мл среды для переваривания тонкой кишки.
    2. Выдерживать 30 мин при 37 °C, встряхивая при 200 об/мин. Вихрь на максимальной скорости в течение 10 с каждые 5 мин.
    3. Добавьте 10 мл буфера FACS-EDTA (таблица 1), чтобы остановить реакцию пищеварения, и поместите его на лед.
    4. Фильтруйте каждый образец через клеточный фильтр размером 100 мкм с помощью серологической пипетки, восстанавливая суспензию в конической пробирке объемом 50 мл, помещенной на лед.
    5. Центрифуга при 600 x g в течение 6 мин при 4 °C.
    6. Откажитесь от надосадочной жидкости. Промыть гранулы клетки 5 мл PBS и центрифугировать при 600 x g в течение 6 мин при 4 ° C.
    7. Откажитесь от надосадочной жидкости и ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл RPMI 10% FBS-20 мкг / мл ДНКазы. Держать на льду, защищенном от света до окрашивания клеток.
  10. Препарат одноклеточной суспензии из легких
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое легкое и тонкая кишка должны обрабатываться параллельно двумя людьми, чтобы избежать длительного времени обработки, что приводит к низкой жизнеспособности клеток.
    1. Приготовьте 4 мл среды для пищеварения легких (таблица 1) на обработанный образец.
    2. Удалите среду RPMI из лунки, содержащей легкие, из шага 3.2.3. Нарежьте легкое мелкими ножницами на мелкие кусочки.
    3. Перенесите кусочки легких в коническую трубку объемом 15 мл с помощью шпателя. Добавьте 4 мл среды для пищеварения легких (таблица 1).
    4. Инкубировать 30 мин при 37 °C, встряхивая при 250 об/мин. Когда закончите, держите на льду, пока каждый образец не будет обработан.
    5. Отфильтруйте каждый образец через клеточный сетчатый фильтр размером 100 мкм, расположенный в одной лунке 6-луночной культуральной пластины. Диссоциируйте ткань с помощью поршня шприца.
    6. Извлекают каждый образец в коническую пробирку объемом 15 мл и добавляют 4 мл среды R-2 (таблица 1). Держите на льду, пока обрабатываются другие образцы.
    7. Центрифуга при 600 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл среды R-5 (таблица 1).
    8. Во время центрифугирования готовят 4 мл 27,5% раствора с градиентом плотности (табл. 1) на пробу для обогащения фракции гемопоэтических клеток15,16. Эта стратегия разделения отдельных ячеек является более эффективной, экономичной и менее токсичной по сравнению с другими аналогичными средами с градиентомплотности 17.
    9. Добавьте 4 мл 27,5% раствора с градиентом плотности к 1 мл клеточной суспензии с шага 4.10.7 и энергично встряхните.
    10. Медленно добавьте 1 мл среды R-5 (таблица 1) поверх смешанной суспензии, чтобы создать две фазы.
    11. Центрифуга при 1 500 x g в течение 20 мин при RT, с низким ускорением и выключенным тормозом. Обратите внимание на кольцо, образованное между двумя фазами.
    12. Восстановите кольцо, образованное между двумя фазами, с помощью микропипетки объемом 1 мл и ресуспендируйте в 4 мл среды R-2.
    13. Центрифуга при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C. Откажитесь от надосадочной жидкости. Ресуспендировать клеточную гранулу в 1 мл буфера ACK (таблица 1) и инкубировать в течение 1 мин при ЛТ.
    14. Добавьте 4 мл среды R-5 и центрифугу при 450 x g в течение 5 мин при 4 ° C. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл среды R-10. Хранить на льду, защищенном от света, до окрашивания для проточной цитометрии.
  11. Препарат одноклеточной суспензии из лимфатических узлов
    1. Поместите лимфатические узлы из этапов 3.2.2 или 3.3.3 между двумя кусками сетки в лунку из 6-луночной культуральной пластины и диссоциируйте с помощью поршня шприца.
    2. Восстановите клеточную суспензию в конической пробирке объемом 1,5 мл и центрифуге при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C.
    3. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл среды R-10. Хранить на льду, защищенном от света, до окрашивания для проточной цитометрии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если видны скопления, отфильтруйте образец через сетчатый фильтр 100 мкм.

5. Окрашивание клеток для проточной цитометрии (рис. 2 и рис. 3)

ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугируйте суспензию клеток лимфатических узлов с этапа 4.11.3 при 450 x g в течение 5 мин при 4 ° C и ресуспендируйте клеточную гранулу в 500 мкл буфера FACS (таблица 1).

  1. Окрашивание клеток для идентификации ILC2 (рис. 3 и дополнительный рис. 2)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура окрашивания специфична для идентификации IL-9-экспрессирующих клеток ILC2.
    1. Планшет 150 мкл на образец легкого (приблизительно 1,8 х 10 6 клеток) со стадии 4.10.14 и 50 мкл на образец лимфатического узла с этапа 4.11.3 (приблизительно 0,7 х 10 6 и 2,2 х 106 клеток для образцов средостения и брыжеечных лимфатических узлов соответственно) в 96-луночной конической нижней культуральной пластине. Добавьте 100 мкл буфера FACS и центрифугу при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C.
    2. Планшет 100 мкл на образец тонкой кишки (приблизительно 2,7 х 10 6 и 0,6 х 106 клеток для интраэпителиальных образцов и образцов собственной пластинки, соответственно) из этапов 4.8.3 и 4.9.7 в 96-луночной конической нижней культуральной пластине. Добавьте 150 мкл буфера FACS и центрифугу при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C.
    3. Откажитесь от надосадочной жидкости и ресуспендируйте каждую клеточную гранулу в 50 мкл коктейля биотинилированных антител (таблица 2), разбавленного в буфере FACS. Инкубировать 30 мин при температуре 4 °C в защищенном от света месте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте буфер FACS с ДНКазой 20 мкг/мл для образцов интраэпителия и собственной пластинки.
    4. Добавьте 150 мкл буфера FACS. Центрифуга при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C.
    5. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 200 мкл буфера FACS. Снова центрифугу и выбросьте надосадочную жидкость.
    6. Ресуспендировать клеточную гранулу в 50 мкл коктейля антитело/краситель (таблица 2) и инкубировать в течение 30 мин при 4 ° C в защищенном от света месте.
    7. Добавьте 150 мкл буфера FACS. Центрифуга при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C.
    8. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 200 мкл буфера FACS. Снова центрифугу и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите промывку (этап 5.1.7) и выбросьте надосадочную жидкость.
    9. Ресуспендируют клеточную гранулу в 300 мкл буфера FACS и анализируют с помощью проточной цитометрии.
    10. Для образцов тонкой кишки и легких используйте стратегию стробирования: лимфоциты, отдельные клетки, живые клетки, гемопоэтические клетки, клетки CD90 + линии, ST2 + клетки и клетки IL-9 + (рис. 3A, B и дополнительный рисунок 2A). Для образцов лимфатических узлов используйте стратегию стробирования: живые клетки, одиночные клетки, клетки линии CD90+, клетки ST2+ и клетки IL-9+ (дополнительный рисунок 2B, C).
  2. Клеточное окрашивание для идентификации IL-9-продуцирующих лимфоцитов (рис. 2 и дополнительный рис. 3)
    1. Перенос 800 мкл на образец легкого с этапа 4.10.14 в пробирку объемом 1,5 мл (приблизительно 14,6 х 106 клеток ). Центрифуга при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C. Откажитесь от надосадочной жидкости.
    2. Для образцов лимфатических узлов планшет 400 мкл клеточной суспензии со стадии 4.11.3 (приблизительно 5,6 x 10 6 и 17,5 x 106 клеток для образцов средостения и брыжеечных лимфатических узлов соответственно) в 96-луночную коническую нижнюю пластину в два этапа.
      1. Сначала перенесите 200 мкл, центрифугу при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
      2. Переведите еще 200 мкл в соответствующую лунку. Центрифугу при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
    3. Ресуспендировать клеточную гранулу в 50-400 мкл коктейля антитело/краситель (таблица 3) и инкубировать в течение 30 мин при 4 ° C в защищенном от света месте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы легких следует ресуспендировать в 400 мкл, образцы лимфатических узлов средостения - в 50 мкл и образцы брыжеечных лимфатических узлов - в 100 мкл окрашивающего коктейля.
    4. Добавьте 150 мкл буфера FACS к образцам лимфатических узлов средостения и 100 мкл к образцам брыжеечных лимфатических узлов. Центрифугу при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
    5. Промойте образцы легких и лимфатических узлов, ресуспендируя гранулы в 1 мл и 200 мкл буфера FACS соответственно. Центрифуга при 450 xg в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторите стирку.
    6. Ресуспендируют образцы легких в 600 мкл буфера FACS и анализируют их с помощью проточной цитометрии. Используйте стратегию стробирования: лимфоциты, отдельные клетки, живые клетки, гемопоэтические клетки, клетки CD4+TCRβ+ и клетки IL-9+ (рис. 2A).
    7. Ресуспендируют образцы лимфатических узлов в 300 мкл буфера FACS и анализируют с помощью проточной цитометрии. Используйте стратегию стробирования: лимфоциты, отдельные клетки, живые клетки, клетки CD4+ TCRβ+ и клетки IL-9+ (рис. 2B и дополнительный рис. 3A).

6. Определение абсолютного числа клеток в одноклеточных суспензиях

  1. Разбавляют образцы из этапов выделения 4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 и 4.11.3 PBS в соотношении 1:20 (10 мкл образца + 190 мкл PBS).
  2. Смешайте 10 мкл каждого разбавленного образца из шага 6.1 с 10 мкл трипанового синего. Загрузите 10 мкл в гемоцитометр и подсчитайте живые клетки, учитывая каждое разведение.
  3. Получите абсолютное количество клеток, умножив процент интересующей популяции из живых клеток, определенный с помощью проточной цитометрии (жизнеспособность красителей, отрицательных клеток), на общее количество живых клеток в одноклеточной суспензии после выделения и разделив это число на 100 (дополнительный рисунок 4, дополнительный рисунок 5 и дополнительный рисунок 6).
    Абсолютное число = (Процент интересующей популяции из живых клеток, определенный с помощью проточной цитометрии x Общее количество живых клеток в одноклеточной суспензии)/100

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мышам подкожно вводили 200 личинок L3 стадии N. brasiliensis или PBS для фиктивного контроля. Количество личинок, используемых в этом протоколе, было скорректировано, чтобы изолировать жизнеспособные клетки из легких, лимфоидной ткани и тонкой кишки, в отличие от предыдущих отчетов, где более высокие нагрузки червей использовались для обнаружения клеток в лимфоидных тканях и легких только4. Легкие, лимфатические узлы средостения, брыжеечные лимфатические узлы и тонкую кишку собирали на 0, 4, 7 и 10 дни после инфекции для выделения лимфоцитов и характеристики популяций, продуцирующих IL-9. В общей сложности 27 мышей были использованы в двух или более независимых экспериментах, в том числе девять контрольных и от четырех до шести мышей, инфицированных N. brasiliensis, за анализируемый момент времени. Фиктивно инфицированные контрольные группы были включены в каждый эксперимент для получения базальных чисел. Используя этот протокол, IL-9-продуцирующие CD4+ Т-клетки (в основном клетки Th9 в этой модели) могут быть выделены из легочных, брыжеечных и средостенных лимфатических узлов для количественной оценки и дальнейшего анализа.

После естественного течения инфекции мы сначала оценили частоту IL-9-продуцирующих CD4+ Т-лимфоцитов (Th9), присутствующих в легких и лимфатических узлах средостения (стратегия стробирования показана на рисунке 2A и дополнительном рисунке 3A). В обоих органах частота Th9 увеличилась, начиная с 4-го дня, и достигла пика на 7-й день после заражения (рис. 2C), приращение, которое также наблюдалось в абсолютных числах Th9 (дополнительный рисунок 4A, B). В брыжеечных лимфатических узлах (стратегия стробирования, показанная на рисунке 2B) наблюдалось значительное увеличение как частоты, так и абсолютного количества клеток Th9 на 7-й и 10-й день после инфекции (рис. 2C и дополнительный рисунок 4C) в соответствии с предыдущими отчетами4. Наличие Т-клеток и ILC2 было подтверждено в интраэпителиальных образцах и образцах собственной пластинки; однако на протяжении всей инфекции в этих кишечных компартментах не наблюдалось клеток Th9 (дополнительный рисунок 3B, C).

Затем мы оценили IL-9-экспрессирующие клетки ILC2 в лимфоидных и нелимфоидных тканях инфицированных мышей (стратегия стробирования показана на рисунке 3A, B и дополнительном рисунке 2). Мы наблюдали значительное увеличение частоты ST2+ IL-9- и ST2+ IL-9+, экспрессирующих ILC2 в легких на 7-й день после инфекции (рис. 3C). В то же время анализ абсолютных цифр выявил статистически значимое увеличение только в популяции ST2+ IL-9+ на 7-й день после заражения (дополнительный рисунок 5A). В лимфатических узлах средостения (стратегия стробирования, показанная на дополнительном рисунке 2B) количество IL-9-экспрессирующих клеток ILC2 (ST2+ IL-9+) значительно увеличилось на 10-й день после заражения, в то время как абсолютное количество ST2+ клеток показало тенденцию к увеличению, начиная с 7-го дня и продолжаясь до 10-го дня после заражения (дополнительный рисунок 6A, C).

Клетки IL-9+ ILC2 также были обнаружены в собственной пластинке и интраэпителиальных компартментах тонкой кишки (стратегия стробирования показана на рисунке 3B и дополнительном рисунке 2A). Инфекция N. brasiliensis приводила к статистически значимому увеличению частоты ST2+ клеток IL-9+ на 4-й день и популяций ST2-IL-9+ на 7-й и 10-й дни в собственной пластинке. В интраэпителиальном компартменте также наблюдалось значительное изменение частот клеток ST2+ IL9+ и ST2-IL-9+ на 7-й и 10-й день после инфекции соответственно (рис. 3C). Важно отметить, что даже при относительно небольшом количестве личиночной нагрузки заражение паразитом вызывало обширные повреждения тонкой кишки; следовательно, анализ абсолютных чисел ILC2, экспрессирующих IL-9, технически невозможен, что затрудняет точную количественную оценку этой популяции из-за низкого выхода живых клеток (дополнительный рисунок 5B, C). С другой стороны, анализ брыжеечных лимфатических узлов (стратегия стробирования, показанная на дополнительном рисунке 2C) выявил значительное увеличение абсолютного количества клеток ST2+ IL-9-, ST2+ IL-9+ и ST2-IL-9+ ILC2 на 10-й день после заражения (дополнительный рисунок 6D), как сообщалось ранее4. Между тем, не наблюдалось никакой разницы в частоте этих групп населения на протяжении всей инфекции (дополнительный рисунок 6B). Эти разнообразные подмножества ST2 и IL-9-экспрессирующих клеток представляют собой интригующие популяции с потенциально дифференцированными ролями in vivo и могут соответствовать естественным и воспалительным ILC2, как недавно описано 18,19,20,21. Однако этот вопрос необходимо рассмотреть в будущих исследованиях.

Таким образом, мы скорректировали этот протокол для восстановления клеток, экспрессирующих IL-9, из кишечника, инфицированного N. brasiliensis, сохраняя при этом возможность обнаруживать их в легких и лимфоидной ткани. Извлечение иммунных клеток из зараженных паразитами кишок оказалось технически сложным. Здесь скорректированное количество личинок, используемых для инфекции, привело к улучшению целостности кишечной ткани, что позволило восстановить популяцию IL-9+. Насколько нам известно, это первый протокол, разработанный специально для анализа IL-9-экспрессирующих клеток в кишечнике во время инфекции N. brasiliensis. Тем не менее, другие иммунные клетки также могут быть выделены после этих шагов. Представленные здесь данные показывают, что большинство тканевых резидентных IL-9-экспрессирующих клеток в тонком кишечнике являются ILC2.

Figure 1
Рисунок 1: Блок-схема описанного протокола. Принципиальная схема с основными этапами, используемыми для обработки различных органов, и ожидаемыми подмножествами клеток, экспрессирующих IL-9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Клетки Th9 обнаруживаются в легких, средостении и брыжеечных лимфатических узлах при инфекции N. brasiliensis. Репрезентативный анализ проточной цитометрии и стратегия стробирования, используемые для идентификации клеток Th9 из (A) легких и (B) брыжеечных лимфатических узлов. Одноклеточные суспензии из каждого органа окрашивали фиксируемым красителем, флуоресцентно меченным анти-CD45 для идентификации гемопоэтических клеток, а также анти-Т-клеточным рецептором (TCR) β и анти-CD4 для идентификации CD4+ Т-лимфоцитов. Сигнал GFP+ указывает процент присутствующих клеток Th9. Первый затвор демонстрирует свойства бокового рассеяния (SSC)-A/прямого рассеяния (FSC)-A с классической морфологией лимфоидных клеток. Были выбраны одноклеточные события, за которыми следовали живые клетки, а затем клетки CD45+. В этой популяции мы сосредоточились на двойных положительных клетках TCR-β и CD4, из которых клетки GFP+ были идентифицированы как клетки Th9. Окрашивание лимфатических узлов не включало антитела против CD45, поскольку ожидается, что вся популяция будет положительной. (C) Частоты клеток Th9, обнаруженных в легких, средостении и брыжеечных лимфатических узлах в указанное время после заражения. Данные представляют собой среднюю ± SEM одной или двух мышей, проанализированных в группе, из трех независимых экспериментов за определенный момент времени; Непарный Т-критерий; *≤ 0,05, **≤ 0,001, ***≤ 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: IL-9-продуцирующие клетки ILC2 обнаружены в нелимфоидных органах. Репрезентативный анализ проточной цитометрии и стратегия стробирования, используемые для идентификации клеток IL-9+ ILC2 из (A) легких и (B) собственной пластинки тонкой кишки. Одноклеточные суспензии из каждого органа были помечены биотинилированными антителами для идентификации клеток линии (анти-B220, анти-CD11b, анти-FcεRI, анти-TCR-β, анти-TCR-γδ, анти-Siglec F, анти-CD4, анти-CD11c, анти-Gr-1, анти-CD8, анти-CD19, анти-NK1.1 и анти-Ter119) и Fc-Block. Затем клеточные суспензии окрашивали фиксируемым красителем, меченным флуорохромом стрептавидином, анти-CD45 для идентификации гемопоэтических клеток и анти-CD90 для идентификации клеток ILC2. Первый затвор демонстрирует свойства рассеяния (SSC)-A/бокового рассеяния (FSC)-A с классической морфологией лимфоидных клеток. Были выбраны одноклеточные события, за которыми следовали живые клетки, а затем клетки CD45+. В этой популяции мы сосредоточились на лин-клетках CD90+; в этой группе мы оценивали экспрессию ST2 и GFP для идентификации клеток IL-9+ ILC2. (C) Частота клеток ILC2, обнаруженных в легких, собственной пластинке и интраэпителиальном клеточном компартменте в указанные моменты времени после заражения. Данные представляют собой среднюю ± SEM одной или двух мышей, проанализированных в группе, из трех независимых экспериментов за определенный момент времени; непарный Т-критерий; *p ≤ 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Перечень химических растворов и их составы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Коктейль антител для идентификации IL-9-продуцирующих клеток ILC2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 3: Коктейль антител для идентификации IL-9-продуцирующих Т-лимфоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительный рисунок 1: Схематическое изображение расположения лимфатических узлов средостения. Создано в BioRender.com Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Репрезентативная проточная цитометрия и стратегия стробирования, используемые для идентификации IL-9+ ILC2 в интраэпителиальных клетках тонкой кишки и лимфатических узлов. (A) Одноклеточные суспензии из интраэпителиальных клеток тонкой кишки сначала инкубировали с меченными биотином антителами для отбора клеток линии (анти-B220, анти-CD11b, анти-FcεRI, анти-TCR-β, анти-TCR-γδ, анти-Siglec F, анти-CD4, анти-CD11c, анти-Gr-1, анти-CD8, анти-CD19, анти-NK1.1 и анти-Ter119) и Fc-Block. Затем следовало окрашивание корректируемым красителем, меченным флуорохромом стрептавидином, анти-CD45 для идентификации гемопоэтических клеток и анти-CD90 для идентификации клеток ILC2. Первый затвор демонстрирует свойства бокового рассеяния (SSC)-A/прямого рассеяния (FSC)-A с классической морфологией лимфоидных клеток. Были выбраны одноклеточные события, за которыми следовали живые клетки, а затем клетки CD45+. В этой популяции мы сосредоточились на лин-клетках CD90+; из этой группы клетки GFP+ были идентифицированы как клетки IL-9+ ILC2. (В,В) Репрезентативная проточная цитометрия и стратегия стробирования для (B) лимфатических узлов средостения и (C) брыжеечных лимфатических узлов для идентификации клеток IL-9+ ILC2. Окрашивание лимфатических узлов не включало антитела против CD45, так как ожидалось, что вся популяция будет положительной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Репрезентативный анализ проточной цитометрии и стратегия стробирования, используемые для идентификации клеток Th9 в лимфатических узлах средостения и тонкой кишке. Одноклеточные суспензии из лимфатических узлов средостения (А) окрашивали корректируемым жизнеспособным красителем и флуоресцентно меченными антителами против TCR-β и против CD4. Первый затвор демонстрирует свойства бокового рассеяния (SSC)-A/прямого рассеяния (FSC)-A с классической морфологией лимфоидных клеток. Были выбраны одноклеточные события, за которыми следовали живые клетки, а затем двойные положительные клетки TCR-β и CD4; из этой группы клетки GFP+ были идентифицированы как клетки Th9. Аналогичная стратегия проточной цитометрии была использована для (B) собственной пластинки и (C) интраэпителиальных клеток тонкой кишки, за исключением того, что клетки CD45+ были отобраны после живых клеток, за которыми следовали двойные положительные клетки TCR-β и CD4, откуда клетки GFP+ были идентифицированы как клетки Th9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 4: Абсолютное количество клеток Th9 значительно изменяется на протяжении всей инфекции. Абсолютное количество клеток IL-9+ из двойных положительных клеток TCR-β и CD4 определяли на 0, 4, 7 и 10 дни после инфекции в (А) легких, (В) лимфатических узлах средостения и (С) брыжеечных лимфатических узлах. Данные представляют собой среднюю ± SEM одной или двух мышей, проанализированных в группе, из трех независимых экспериментов за определенный момент времени; непарный Т-критерий *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,001, ***P ≤ 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 5: Абсолютное количество клеток IL-9+ ILC2 различается на протяжении всей инфекции. Абсолютное количество клеток IL-9+ ILC2 из популяции lin-CD90+ на 0, 4, 7 и 10 дни после инфекции определяли в (А) легких, (В) собственной пластинке и (С) интраэпителиальных клетках тонкой кишки. Данные представляют собой среднюю ± SEM одной или двух мышей, проанализированных в группе, из трех независимых экспериментов за определенный момент времени; непарный Т-критерий *p ≤ 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 6: Частота и абсолютное количество клеток IL-9+ ILC2 в лимфатических узлах значительно увеличиваются во время инфекции. (A) Частота и (C) абсолютное количество клеток IL-9+ ILC2 из лимфатических узлов средостения. (B) Частота и (D) абсолютное количество клеток IL-9+ ILC2 из брыжеечных лимфатических узлов. Значения определяли как клетки IL-9+ ILC2 в популяции lin-CD90+ на 0, 4, 7 и 10 дни после заражения. Данные представляют собой среднюю ± SEM одной или двух мышей, проанализированных в группе, из трех независимых экспериментов за определенный момент времени; непарный T-критерий *p ≤ 0,05, ***p ≤ 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 7: Проточный цитометрический анализ клеток IL-9, экспрессирующих ILC2, из кишечника, инфицированного N. brasiliensis. Репрезентативные графики клеток ILC2, выделенных из кишечника мышей-репортеров IL-9 на 7-й день после заражения. Экспрессию IL-9 оценивали в клетках ILC2, только что выделенных из интраэпителиальных или собственных пластинчатых компартментов инфицированных репортерных мышей (IL-9 REP) по сравнению с ранее описанным протоколом внутриклеточного окрашивания IL-99 (IL-9 AB, с использованием клона антитела IL-9 RM9A4, BioLegend). Для идентификации IL-9-экспрессирующих ILC2 одноклеточные суспензии сначала инкубировали с мечеными биотином антителами для отбора клеток линии (анти-B220, анти-CD11b, анти-FcεRI, анти-TCR-β, анти-TCR-γδ, анти-Siglec F, анти-CD4, анти-CD11c, анти-Gr-1, анти-CD8, анти-CD19, анти-NK1.1 и анти-Ter119) и Fc-Block с последующим окрашиванием гибким жизнеспособным красителем, меченным флуорохромом стрептавидином, анти-CD45 и анти-CD90. На графиках показаны IL-9-экспрессирующие клетки ILC2, закрытые популяцией lin-CD45 + CD90+, присутствующие в интраэпителиальных (A, B) и собственных пластинчатых (C, D) компартментах, обнаруженные с помощью репортерного сигнала от свежевыделенных клеток (A, C) или после внутриклеточного окрашивания IL-9 (B, D). Контрольным мышам вводили PBS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Полное понимание взаимодействия кишечного паразита и хозяина и иммунных реакций на гельминтную инфекцию требует идентификации и анализа различных клеточных популяций и эффекторных молекул, которые являются ключевыми для индукции ремоделирования тканей и изгнания червя. Гельминтозы, передающиеся через почву, представляют собой большую проблему в развивающихся странах во всем мире. Однако до недавнего времени протокол, который позволял бы анализировать популяции редких клеток, присутствующих в тонком кишечнике, основном органе, пораженном этой инфекцией, не был доступен5. Этот протокол охватывает ранее описанные методы, которые позволяют проводить проточный цитометрический анализ IL-9-экспрессирующих лимфоидных клеток в легких, средостении и брыжеечных лимфатических узлах во время инфекции N. brasiliensis , с дополнительным преимуществом идентификации этой популяции впервые в тонком кишечнике.

Успех этого протокола сильно зависит от времени обработки тканей. Крайне важно обрабатывать не более шести образцов тонкой кишки на человека одновременно. Если необходимо обработать разные органы, мы рекомендуем сделать это параллельно другому человеку. Используя относительно низкую паразитарную нагрузку (200 личинок L3), этот протокол позволяет изолировать лимфоидные клетки из кишечника, инфицированного N. brasiliensis, сохраняя при этом способность изолировать эти клетки от других органов. Использование более высоких паразитарных нагрузок ставит под угрозу качество и количество клеток, выделенных из тонкой кишки (данные не показаны); однако это может привести к значительному увеличению IL-9-экспрессирующих лимфоидных клеток в других органах4. При обработке кишечника и брыжеечных лимфатических узлов очень важно удалить прилипшую жировую ткань, так как невыполнение этого требования приводит к усилению гибели клеток. Данные подтверждают наблюдение, что естественное течение инфекции отрицательно влияет на абсолютное количество лимфоидных клеток, извлеченных из тонкой кишки. В исследованиях, описанных здесь, частоты клеток IL-9+ ILC2 остаются неизменными, в то время как абсолютные цифры показывают высокую вариабельность в каждом независимом эксперименте. Следовательно, выводы, сделанные на основе абсолютных чисел, могут быть неточными и их следует избегать. Кроме того, учитывая низкую частоту IL-9-экспрессирующих Т-клеток в тканях, рекомендуется приобретение и окрашивание максимально возможного количества клеток.

Ограничением этого анализа ILC2 является использование дискретной комбинации маркеров для определения этой популяции. В зависимости от интересующей ткани и фазы инфекции дополнительные маркеры, такие как CD25, Klrg1 и ST2 среди прочих, могут быть использованы для более детальной фенотипической характеристики клеток ILC222. Мы признаем, что представленный здесь протокол основан на репортерном штаммемыши INFER 4 и может представлять преимущество для идентификации клеток, экспрессирующих IL-9. Тем не менее, мы ожидаем, что результаты, найденные здесь, могут быть получены с использованием альтернативных стратегий, включая использование других репортерных штаммов мышей и внутриклеточное окрашивание IL-9 6,7,8,9. Важно отметить, что использование обычных мышей и внутриклеточное окрашивание IL-9 в интраэпителиальных клетках и клетках собственной пластинки может привести к потере любого обнаруживаемого сигнала и компрометации полученных данных (дополнительный рисунок 7). Это может быть связано с длительными манипуляциями, необходимыми для окрашивания подмножества, которое уже трудно изолировать и поддерживать ex vivo. Поэтому мы рекомендуем использовать репортерные штаммы мышей, чтобы сократить время обработки и обеспечить надежный анализ экспрессии IL-9 in vivo. Мы также признаем тот факт, что клетки Th9 не являются единственными Т-клетками, экспрессирующими IL-923; Однако в этой паразитной модели мы не ожидаем, что другие подмножества будут выражать его. Тем не менее, чтобы отбросить присутствие других подмножеств, экспрессирующих IL-9, в описанном контексте, возможна полная характеристика цитокинов 2-го типа наряду с использованием транскрипционных маркеров.

Ранее сообщалось о количественном определении лимфоидных клеток, экспрессирующих IL-9, до 5-го дня после заражения; Однако это приводит к очень низким частотам ячеек4. Протокол в этом исследовании охватывает большую часть кинетики инфекции N. brasiliensis до начала выведенияпаразита 2. Тем не менее, мы заметили, что некоторые клеточные популяции в этом исследовании не вернулись к базальным уровням в течение анализируемого периода времени, предполагая, что исследование может извлечь выгоду из длительных временных моментов, чтобы иметь полное представление о поведении этих клеток на более поздней стадии инфекции in vivo. Несмотря на это, мы считаем, что представленная здесь работа может служить справочным руководством для исследователей, заинтересованных в изучении лимфоидных клеток, экспрессирующих IL-9, в моделях паразитарной инфекции, позволяя им выбрать идеальную фазу инфекции для обнаружения конкретных типов клеток из интересующих тканей. В целом, методы, описанные здесь, будут полезны для оценки фенотипа и функции Т-лимфоцитов и клеток ILC2, которые экспрессируют IL-9 во время физиологически значимой модели паразитарной инфекции, расширяя наши знания об этих клетках и потенциально улучшая наше понимание их в других патологических состояниях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgments

Авторы выражают признательность Хосе Луису Рамосу-Бальдерасу за его техническую поддержку. Эта работа была поддержана следующим грантом PLL от CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P и EO-M получили стипендию от CONACYT (соответственно 736162 и 481437). MCM-M получил стипендию от CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK buffer Homemade
Attune Nxt cytometer Thermofisher
B220 Biolegend 103204
CD11b Biolegend 101204
CD11c  Biolegend 117304
CD19  Biolegend 115504
CD4 Biolegend 100404
CD4 (BV421) Biolegend 100443
CD45.2 Biolegend 109846
CD8  Biolegend 100703
CD90.2 Biolegend 105314
Collagenase D Roche 11088866001
DNAse I Invitrogen 18068015 Specific activity: ≥10 000 units/mg   
Facs ARIA II sorter BD Biosciences
FACS Melody cell sorter BD Biosciences
Fc-Block Biolegend 101320
FcεRI eBioscience 13589885
Fetal bovine serum Gibco 26140079
FlowJo FlowJo Flow cytometry analysis data software
Gr-1 Tonbo 305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Homemade
IL-9 biolegend 514103
NK1.1  Biolegend 108704
Nylon mesh  ‎ lba B07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556
Phosphate-buffered saline  Homemade
RPMI Gibco 11875093
Siglec F  Biolegend 155512
Streptavidin Biolegend 405206
TCR-β  Biolegend 109203
TCR-β (PE/Cy7) Biolegend 109222
TCR-γδ  Biolegend 118103
Ter119 Biolegend 116204
Tricine buffer  Homemade
Zombie Aqua Fixable Viability Dye Biolegend 423101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Centers for Disease Control and Prevention. Parasites - Hookworm. , (2022).
  2. Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , Chapter 19 (Unit 19.12) (2003).
  3. Mearns, H., et al. Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology. Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).
  4. Licona-Limon, P., et al. Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection. Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).
  5. Ferrer-Font, L., et al. High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection. Elife. 9, 51678 (2020).
  6. Kharwadkar, R., et al. Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage. Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).
  7. Wilhelm, C., et al. An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation. Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).
  8. Gerlach, K., et al. TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells. Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).
  9. Olson, M. R., et al. Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production. Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).
  10. Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  11. Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models. Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).
  12. Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice. International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).
  13. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).
  14. old Spring Harbor Protocols. Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red. Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  15. Bielecki, P., et al. Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state. Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).
  16. Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells. Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).
  17. Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension. Micromachines. 11 (1), 94 (2020).
  18. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
  19. Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
  20. Flamar, A. L., et al. Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity. Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).
  21. Olguín-Martínez, E., et al. IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2. Frontiers in Immunology. 13, 787713 (2022).
  22. Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells. Frontiers in Immunology. 12, 757967 (2021).
  23. Noelle, R. J., Nowark, E. C. Cellular sources and immune functions of interleukin-9. Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).

Tags

Иммунология и инфекция выпуск 193 IL-9 Th9 ILC2 IL-9 лимфоидные клетки паразит тонкая кишка N. brasiliensis
Стратегия изучения IL-9-продуцирующих лимфоидных клеток в модели инфекции <em>Nippostrongylus brasiliensis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Muñoz-Paleta, O.,… More

Muñoz-Paleta, O., Olguín-Martínez, E., Ruiz-Medina, B. E., Alonso-Quintana, A., Marcial-Medina, M. C., Licona-Limón, P. A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model. J. Vis. Exp. (193), e64075, doi:10.3791/64075 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter