Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En strategi for studier av IL-9-produserende lymfoide celler i Nippostrongylus brasiliensis-infeksjonsmodellen

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64075
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México
* These authors contributed equally

Summary

IL-9-uttrykkende T- og ILC2-celler induseres under N. brasiliensis-infeksjon , men deres karakterisering har i stor grad blitt oversett i infisert tarm på grunn av deres lave frekvens og differensialkinetikk. Denne protokollen beskriver isolering av disse cellene fra ulike målorganer og bekreftelse av deres identitet via flowcytometri ved ulike infeksjonsstadier.

Abstract

IL-9 er et pleiotropisk cytokin assosiert med ulike prosesser, inkludert antitumorimmunitet, induksjon av allergiske patologier og immunresponsen mot helminthinfeksjoner, der den spiller en viktig rolle i utvisningen av parasitten. I en murinmodell av Nippostrongylus brasiliensis-infeksjon produseres IL-9 hovedsakelig av CD4+ T-lymfocytter og medfødte lymfoide celler som finnes i lunge, tynntarm og drenerende lymfeknuter. Gitt de tekniske vanskelighetene som er involvert i den intracellulære fargingen av IL-9, samt kompleksiteten ved å isolere hematopoietiske celler fra tynntarmen ved infeksjon, er det et presserende behov for en omfattende, men grei protokoll for å analysere uttrykket av IL-9 i forskjellige lymfoide og ikke-lymfoide vev i denne modellen. Protokollen beskrevet her skisserer kinetikken til IL-9 produsert av CD4 + T-celler og medfødte lymfoide celler i lunge og tynntarm, hovedorganene målrettet av N. brasiliensis, samt i mediastinale og mesenteriske lymfeknuter, gjennom hele infeksjonen. I tillegg beskriver det antall larver som trengs for infeksjon, avhengig av celletype og organ av interesse. Denne protokollen tar sikte på å bistå i standardisering av analyser for å spare tid og ressurser ved å tilby muligheten til å fokusere på de spesifikke cellene, organene og sykdomsstadiene av interesse i N. brasiliensis-infeksjonsmodellen.

Introduction

Hakeorm er tarmparasitter som infiserer omtrent 700 millioner mennesker over hele verden, hovedsakelig i tropiske områder i underutviklede land. Høyintensitetsinfeksjoner med Ancylostoma duodenale og Necator americanus, de vanligste hookworm-parasittene hos mennesker, forårsaker anemi og proteinmangel som kan resultere i forsinket vekst og mental utvikling1. N. americanus og gnagerparasitten Nippostrongylus brasiliensis induserer en prototypisk type 2 immunrespons i verten og deler likheter i livssyklusen. Derfor er infeksjon av mus med N. brasiliensis den mest brukte modellen for humane hookworm-infeksjoner. Trinn 3 (L3) N. brasiliensis infeksiøse larver beveger seg fra huden til lungene i løpet av de første timene etter infeksjon. En gang i lungen blir de L4 og migrerer opp luftrøret for å bli svelget, passere gjennom magen og nå tarmen for å bli voksne (L5) innen 4-5 dager. I tarmen legger L5-ormer egg som skilles ut i avføringen for å starte parasittens livssyklus2.

Immunresponsen indusert av N. brasiliensis er preget av en økning i flere type 2 cytokiner, inkludert IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 og IL-13, sammen med eosinofili, basofili, beger- og mastcellehyperplasi og økt IgG1- og IgE-produksjon. De fleste studiene som forsøker å identifisere og definere immunresponsene fremkalt ved N. brasiliensis-infeksjon, er sentrert på rollen som IL-4 eller IL-13 i denne modellen3. Imidlertid hadde identifiseringen og karakteriseringen av IL-9-uttrykkende celler og funksjonen til dette cytokinet i stor grad blitt oversett, inntil Licona-Limón et al. publiserte den første studien som demonstrerte en kritisk rolle for IL-9 i immunresponsen mot N. brasiliensis. Ved hjelp av reportermus beskrev denne studien T-celler (for det meste T-hjelper 9) og type 2 medfødte lymfoide celler (ILC2s) som de viktigste cellulære undergruppene som uttrykker IL-9 ved infeksjon4.

Isolering og karakterisering av immunceller fra helminthinfiserte lunger er mulig, og er omfattende rapportert 3,4. På grunn av den iboende vevsremodelleringen og slimproduksjonen viste det seg imidlertid å være en teknisk utfordring å gjøre det i den infiserte tarmen, inntil den nylige publiseringen av Ferrer-Font et al.5. Gruppen skisserte en protokoll for å isolere og analysere enkeltcellede suspensjoner av immunundergrupper fra Heligmosomoides polygyrus-infiserte murine tarmer. Basert på det har vi nå standardisert en protokoll for isolering og cytometrisk analyse av IL-9-uttrykkende lymfoide celler fra N. brasiliensis-infisert tarm. I tillegg har vi etablert IL-9 kinetikk fra forskjellige cellulære kilder og anatomiske steder gjennom hele infeksjonen.

Karakterisering av de forskjellige cellepopulasjonene som er involvert i denne infeksjonen er avgjørende for en bredere forståelse av immunresponsen mot parasitten og dens interaksjon med verten. Denne omfattende protokollen gir en klar rute for å isolere og analysere IL-9-produserende celler fra ønskede organer i sykdomsstadier av interesse, noe som muliggjør en kraftig forbedring av kunnskapen om rollen til disse cellene i N. brasiliensis-infeksjon og parasittinfeksjoner generelt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk beskrevet her ble godkjent av den interne komiteen for dyrehåndtering (CICUAL) ved Institutt for cellulær fysiologi, National Autonomous University of Mexico.

MERK: Et flytskjema for hele protokollen er vist i figur 1.

1. Bolig av mus

  1. Bruk 8-10 uker gamle, kvinnelige eller mannlige grupper av mus, plassert i dyrefasiliteter med konstant temperatur og fuktighet i 12 timers lyse / mørke sykluser, med ad libitum tilgang til vann og mat.
    MERK: Denne protokollen bruker en IL-9 reporter-musestamme i C57BL/6-bakgrunn, som tidligere beskrevet4; Imidlertid kan andre IL-9 reporterstammer brukes 6,7,8, samt intracellulær IL-9-farging, med variable resultater9.

2. Infeksjon av mus

  1. Barber baksiden av musene fra midten av kroppen til nær bunnen av halen 1 dag før infeksjon. Bruk av bedøvelse er ikke avgjørende.
  2. Inokuler hver mus subkutant med 200 levedyktige tredjetrinns N. brasiliensis-larver (L3) i 100 μL fosfatbufret saltvann (PBS)10 i korsryggen, som tidligere beskrevet2,11, eller injiser 100 μL PBS alene som en kontroll. Ofre dyrene på dag 4, dag 7 eller dag 10 etter infeksjon.

3. Isolering av lunge, tynntarm, mediastinal og mesenteriske lymfeknuter

  1. Euthanize musen ved cervical dislokasjon. Plasser musen på ryggen og spray den med 70% etanol. Lag et midtlinjesnitt ved hjelp av saks og åpne huden for å eksponere buk- og thoraxområdene.
    MERK: Isofluran kan brukes som alternativ eutanasimetode12. Karbondioksidkamre anbefales ikke, da CO2 fører til skade på lungevev og blødning13.
  2. Isolering av mediastinale lymfeknuter og lunger
    1. Lag et snitt på brystbenet og kutt i en "V" -form for å fjerne ribbeina og thoraxmusklene. Når brysthulen er eksponert, lokaliserer du mediastinale lymfeknuter ved siden av spiserøret, under hjertet (se tilleggsfigur 1).
    2. Trekk ut mediastinale lymfeknuter og samle dem i 1 ml R-10 medium (tabell 1) i en 12-brønns kulturplate. Oppbevares på is, beskyttet mot lys til behandling.
      MERK: Prøvene skal beskyttes mot lys, for å unngå å redusere det fluorescerende signalet fra reportermusene som ble brukt i disse forsøkene.
    3. Trekk ut lungene og samle dem i 1 ml R-10 medium i en 12-brønns kulturplate per mus. Oppbevares på is, beskyttet mot lys til behandling.
  3. Isolering av mesenteriske lymfeknutekjeder og tynntarm
    1. Utsett bukhulen, og flytt tynntarmen forsiktig til høyre for å eksponere mesenterisk lymfeknute (MLN) kjeden langs tykktarmen.
    2. Bruk tang, fjern MLN, rull den forsiktig på et papirhåndkle og trekk fettet av.
    3. Overfør MLN til 1 ml R-10 medium i en 12-brønns kulturplate. Oppbevares på is, beskyttet mot lys til behandling.
    4. Klipp tynntarmen like under pylorisk sphincter og over cecum. Trekk tarmen sakte ut ved hjelp av tang, fjern vedlagt mesenteri og fettvev.
    5. Legg tynntarmen på et papirhåndkle og fukt det sjenerøst med PBS. Fjern Peyers flekker fra tynntarmen med saks.
      MERK: For å opprettholde levedyktigheten, fjern det gjenværende fettvevet, og hold tynntarmen fuktig med PBS under hele prosessen.
    6. Klipp tynntarmen i lengderetningen ved hjelp av saks, og skyv forsiktig tangen over tykktarmen for å fjerne fekalinnholdet og slimet.
    7. Hold tynntarmen med tang, og vask den i 5 ml PBS på is ved å senke den forsiktig et par ganger. Gjenta to ganger.
    8. Skjær tynntarmen i korte biter (ca. 5 mm), og samle dem i et 50 ml konisk rør med 10 ml HBSS14 med 2% FBS (tabell 1). Fortsett umiddelbart å isolere intraepitel- og lamina propriaceller.

4. Fremstilling av encellede suspensjoner fra tynntarm, lunge og lymfeknuter

MERK: Det er ekstremt viktig å behandle maksimalt seks mus per person når du forbereder encellede suspensjoner fra tynntarmen, da cellens levedyktighet reduseres betydelig med lengre behandlingsperioder. Denne metoden ble tilpasset fra Heligmosomoides polygyrus infeksjon musemodell5.

  1. Forvarm risteinkubatoren, R-20 medium, HBSS og HBSS-2 mM EDTA (tabell 1) ved 37 °C.
  2. Tilbered 10 ml tynntarms fordøyelsesmedium (tabell 1) per prøve.
  3. Rist tarmbitene fra trinn 3.3.8 kraftig for hånd.
  4. Filtrer hver prøve gjennom et nylonnett (ca. 10 cm x 10 cm) over en glasstrakt. Vask prøven ved å tilsette 10 ml forvarmet HBSS over nettet og kast gjennomstrømningen. Gjenta en gang til.
    MERK: Bruk et nytt nett for hver prøve og bruk det på nytt gjennom hele prosedyren.
  5. Fjern nettet fra trakten, og samle prøven fra nettet i et 50 ml konisk rør med 10 ml varm HBSS-2 mM EDTA (trinn 4.1). Inkuber i 10 minutter ved 37 °C, med risting ved 200 o / min.
  6. Vortex i 10 s ved maksimal hastighet (3,200 o / min) og filtrer prøven med nettet over en glasstrakt, og gjenvinn gjennomstrømningen i et 50 ml konisk rør.
  7. Gjenta trinn 4,5 og 4,6 to ganger, og gjenopprett gjennomstrømningen i det samme 50 ml koniske røret. De intraepitelceller er lokalisert i denne 30 ml fraksjonen. Lagre det gjenværende vevet.
  8. Enkeltcelle suspensjonspreparat fra intraepitelceller
    1. Sentrifuger 30 ml cellesuspensjon, gjenfunnet i trinn 4,7, ved 450 x g i 5 minutter ved romtemperatur (RT). Kast supernatanten.
    2. Tilsett 5 ml PBS og sentrifuge ved 450 x g i 5 minutter ved RT. Kast supernatanten.
    3. Resuspender cellepelleten i 3 ml RPMI 10% FBS-20 μg / ml DNase (tabell 1). Oppbevares på is, beskyttet mot lys inntil cellefarging.
  9. Enkeltcelle suspensjonspreparat fra lamina propria-celler
    1. Vask det gjenværende tynntarmsvevet fra trinn 4.7 ved å helle over 10 ml varm HBSS gjennom nettet over trakten. Gjenta vasken. Samle vevet fra nettet i et 50 ml konisk rør med 10 ml tynntarm fordøyelsesmedium.
    2. Inkuber i 30 minutter ved 37 °C, med risting ved 200 o / min. Vortex med maksimal hastighet i 10 s hvert 5. minutt.
    3. Tilsett 10 ml FACS-EDTA-buffer (tabell 1) for å stoppe fordøyelsesreaksjonen, og legg den på is.
    4. Filtrer hver prøve gjennom en 100 μm cellesil ved hjelp av en serologisk pipette, og gjenvinn suspensjonen i et 50 ml konisk rør plassert på is.
    5. Sentrifuge ved 600 x g i 6 minutter ved 4 °C.
    6. Kast supernatanten. Vask cellepelleten med 5 ml PBS og sentrifuge ved 600 x g i 6 minutter ved 4 °C.
    7. Kast supernatanten og resuspender cellepelleten i 1 ml RPMI 10% FBS-20 μg / ml DNase. Oppbevares på is, beskyttet mot lys inntil cellefarging.
  10. Enkeltcelle suspensjonspreparat fra lunge
    MERK: Hver lunge og tynntarm skal behandles parallelt av to personer for å unngå lengre håndteringstider, noe som resulterer i lav celle levedyktighet.
    1. Klargjør 4 ml lungefordøyelsesmedium (tabell 1) per behandlede prøve.
    2. Fjern RPMI-mediet fra brønnen som inneholder lungene fra trinn 3.2.3. Klipp lungen i små biter med fin saks.
    3. Overfør lungebitene til et 15 ml konisk rør med en slikkepott. Tilsett 4 ml lungefordøyelsesmedium (tabell 1).
    4. Inkuber i 30 minutter ved 37 °C, med risting ved 250 o / min. Når du er ferdig, hold på is til hver prøve er behandlet.
    5. Filtrer hver prøve gjennom en 100 μm cellesil, plassert i en enkelt brønn på en 6-brønns kulturplate. Dissociere vevet med et sprøytestempel.
    6. Gjenopprett hver prøve i et 15 ml konisk rør, og tilsett 4 ml R-2 medium (tabell 1). Holdes på is mens de andre prøvene behandles.
    7. Sentrifuge ved 600 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten og resuspender cellepelleten i 1 ml R-5 medium (tabell 1).
    8. Mens sentrifugering, lag 4 ml 27,5% tetthetsgradientløsning (tabell 1) per prøve for å berike den hematopoietiske cellefraksjonen15,16. Denne strategien for enkeltcelleseparasjon er mer effektiv, kostnadseffektiv og mindre giftig sammenlignet med andre lignende tetthetsgradientmedier17.
    9. Tilsett 4 ml med 27,5 % tetthetsgradientoppløsning til 1 ml cellesuspensjon fra trinn 4.10.7, og rist kraftig.
    10. Tilsett sakte 1 ml R-5 medium (tabell 1) på toppen av den blandede suspensjonen for å lage to faser.
    11. Sentrifuge ved 1.500 x g i 20 min ved RT, med lav akselerasjon og bremsen av. Vær oppmerksom på ringen som dannes mellom de to fasene.
    12. Gjenopprett ringen dannet mellom de to fasene med en 1 ml mikropipette, og resuspender i 4 ml R-2 medium.
    13. Sentrifuge ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten. Resuspender cellepelleten i 1 ml ACK-buffer (tabell 1), og inkuber i 1 min ved RT.
    14. Tilsett 4 ml R-5 medium og sentrifuge ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten og resuspender cellepelleten i 1 ml R-10 medium. Oppbevares på is, beskyttet mot lys inntil farging for flowcytometri.
  11. Enkeltcelle suspensjonspreparat fra lymfeknuter
    1. Plasser lymfeknutene fra trinn 3.2.2 eller 3.3.3 mellom to nettstykker i en brønn fra en 6-brønns kulturplate, og dissosiere med et sprøytestempel.
    2. Gjenvinn cellesuspensjonen i et 1,5 ml konisk rør og sentrifuge ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    3. Kast supernatanten, og resuspender cellepelleten i 1 ml R-10 medium. Oppbevares på is, beskyttet mot lys inntil farging for flowcytometri.
      MERK: Hvis klumper er synlige, filtrer prøven gjennom en 100 μm cellesil.

5. Cellefarging for flowcytometri (figur 2 og figur 3)

MERK: Sentrifuger lymfeknutecellesuspensjonene fra trinn 4.11.3 ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C, og resuspender cellepelleten i 500 μL FACS-buffer (tabell 1).

  1. Cellefarging for identifisering av ILC2 (figur 3 og tilleggsfigur 2)
    MERK: Denne fargeprosedyren er spesifikk for identifisering av IL-9-uttrykkende ILC2-celler.
    1. Plate 150 μL per lungeprøve (ca. 1,8 x 10 6 celler) fra trinn 4.10.14, og 50 μL per lymfeknuteprøve fra trinn 4.11.3 (ca. 0,7 x 10 6 og 2,2 x 10 6 celler for mediastinale og mesenteriske lymfeknuteprøver) i en 96-brønns konisk bunnkulturplate. Tilsett 100 μL FACS-buffer og sentrifuge ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    2. Plate 100 μL per tynntarmsprøve (ca. 2,7 x 106 og 0,6 x 106 celler for henholdsvis intraepitel- og lamina propriaprøver) fra trinn 4.8.3 og 4.9.7 i en 96-brønns konisk bunnkulturplate. Tilsett 150 μL FACS-buffer og sentrifuge ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    3. Kast supernatanten og resuspender hver cellepellet i 50 mikrol av den biotinylerte antistoffcocktailen (tabell 2) fortynnet i FACS-buffer. Inkuber i 30 minutter ved 4 °C, beskyttet mot lys.
      MERK: Bruk FACS-buffer med 20 μg / ml DNase for intraepitel- og lamina propriaprøver.
    4. Legg til 150 μL FACS-buffer. Sentrifuge ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    5. Kast supernatanten, og resuspender cellepelleten i 200 mikrol FACS-buffer. Sentrifuge igjen og kast supernatanten.
    6. Resuspender cellepelleten i 50 μL av antistoffet/flekkcocktailen (tabell 2), og inkuber i 30 minutter ved 4 °C beskyttet mot lys.
    7. Legg til 150 μL FACS-buffer. Sentrifuge ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    8. Kast supernatanten, og resuspender cellepelleten i 200 mikrol FACS-buffer. Sentrifuge igjen og kast supernatanten. Gjenta vasken (trinn 5.1.7), og kast supernatanten.
    9. Resuspender cellepelleten i 300 μL FACS-buffer, og analyser ved flowcytometri.
    10. For tynntarm og lungeprøver, bruk gating-strategien: lymfocytter, enkeltceller, levende celler, hematopoietiske celler, CD90+Lineage-celler, ST2+-celler og IL-9+-celler (figur 3A,B og tilleggsfigur 2A). For lymfeknuteprøvene, bruk gating-strategien: levende celler, enkeltceller, CD90+ Lineage-celler, ST2+-celler og IL-9+-celler (tilleggsfigur 2B,C).
  2. Cellefarging for identifisering av IL-9-produserende lymfocytter (figur 2 og tilleggsfigur 3)
    1. Overfør 800 μL per lungeprøve fra trinn 4.10.14 til et 1,5 ml rør (ca. 14,6 x 106 celler). Sentrifuge ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten.
    2. For lymfeknuteprøver, plate 400 μL av cellesuspensjonen fra trinn 4.11.3 (ca. 5,6 x 10 6 og 17,5 x 106 celler for mediastinale og mesenteriske lymfeknuteprøver, henholdsvis) i en 96-brønns konisk bunnplate i to trinn.
      1. Overfør 200 μL først, sentrifuge ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C, og kast supernatanten.
      2. Overfør ytterligere 200 μL til den tilsvarende brønnen. Sentrifuger ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C, og kast supernatanten.
    3. Resuspender cellepelleten i 50-400 μL av antistoffet/flekkcocktailen (tabell 3), og inkuber i 30 minutter ved 4 °C beskyttet mot lys.
      MERK: Lungeprøver skal resuspenderes i 400 μL, mediastinale lymfeknuteprøver i 50 μL og mesenteriske lymfeknuteprøver i 100 μL av fargecocktailen.
    4. Legg til 150 μL FACS-buffer til mediastinale lymfeknuteprøver og 100 μL til mesenteriske lymfeknuteprøver. Sentrifuger ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C, og kast supernatanten.
    5. Vask lunge- og lymfeknuteprøvene ved å resuspendere pellets i henholdsvis 1 ml og 200 μL FACS-buffer. Sentrifuge ved 450 xg i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten og gjenta vasken.
    6. Resuspender lungeprøvene i 600 μL FACS-buffer, og analyser dem ved flowcytometri. Bruk gating-strategien: lymfocytter, enkeltceller, levende celler, hematopoietiske celler, CD4+TCRβ+-celler og IL-9+-celler (figur 2A).
    7. Resuspender lymfeknuteprøvene i 300 μL FACS-buffer, og analyser ved flowcytometri. Bruk gating-strategien: lymfocytter, enkeltceller, levende celler, CD4+ TCRβ+-celler og IL-9+-celler (figur 2B og tilleggsfigur 3A).

6. Bestemmelse av absolutt antall celler i enkeltcellesuspensjoner

  1. Fortynn prøvene fra isolerende trinn 4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 og 4.11.3 med PBS i forholdet 1:20 (10 μL prøve + 190 μL PBS).
  2. Bland 10 mikrol av hver fortynnede prøve fra trinn 6.1 med 10 mikrol trypanblått. Legg 10 μL inn i et hemocytometer og telle de levende cellene, vurderer hver fortynning.
  3. Oppnå det absolutte antall celler ved å multiplisere prosentandelen av populasjonen av interesse fra levende celler bestemt ved flowcytometri (levedyktig fargestoff negative celler) med det totale antall levende celler i enkeltcellesuspensjonen etter isolasjon, og dividere dette tallet med 100 (tilleggsfigur 4, tilleggsfigur 5 og tilleggsfigur 6).
    Absolutt antall = (Prosentandel av populasjonen av interesse fra levende celler bestemt ved flowcytometri x Totalt antall levende celler i encellesuspensjonen)/100

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mus ble subkutant injisert med 200 L3 stadium N. brasiliensis larver, eller med PBS for narrekontroll. Antall larver som ble brukt i denne protokollen ble justert for å isolere levedyktige celler fra lungene, lymfoidvevet og tynntarmen, i motsetning til tidligere rapporter hvor høyere belastninger av ormer ble brukt til å oppdage celler i lymfoide vev og lunger bare4. Lunger, mediastinale lymfeknuter, mesenteriske lymfeknuter og tynntarm ble høstet på dag 0, 4, 7 og 10 etter infeksjon for lymfocyttisolering og karakterisering av IL-9-produserende populasjoner. Totalt 27 mus ble brukt i to eller flere uavhengige eksperimenter, inkludert ni kontroller og fire til seks N. brasiliensis-infiserte mus per analysert tidspunkt. Humbuginfiserte kontroller ble inkludert i hvert eksperiment for å oppnå basaltall. Ved hjelp av denne protokollen kan IL-9-produserende CD4 + T-celler (for det meste Th9-celler i denne modellen) isoleres fra lunge-, mesenteriske og mediastinale lymfeknuter for kvantifisering og videre analyse.

Etter det naturlige infeksjonsforløpet vurderte vi først frekvensen av IL-9-produserende CD4+ T-lymfocytter (Th9) i lunger og mediastinale lymfeknuter (gatingstrategi vist i figur 2A og tilleggsfigur 3A). I begge organer økte Th9-frekvensene fra dag 4 og nådde en topp ved dag 7 etter infeksjon (figur 2C), en økning som også ble observert i absolutte tall for Th9 (tilleggsfigur 4A,B). I mesenteriske lymfeknuter (gatingstrategi vist i figur 2B) var det en signifikant økning i både frekvens og absolutt antall Th9-celler ved dag 7 og 10 etter infeksjon (figur 2C og tilleggsfigur 4C), i henhold til tidligere rapporter4. Tilstedeværelsen av T-celler og ILC2 ble bekreftet i intraepitel- og lamina propria-prøvene; Det ble imidlertid ikke observert noen Th9-celler i disse tarmrommene under hele infeksjonen (tilleggsfigur 3B,C).

Deretter evaluerte vi IL-9-uttrykkende ILC2-celler i lymfoide og ikke-lymfoide vev hos infiserte mus (gatingstrategi vist i figur 3A,B og tilleggsfigur 2). Vi observerte en signifikant økning i frekvensene av ST2+ IL-9- og ST2+ IL-9+ som uttrykker ILC2 i lungene ved dag 7 etter infeksjon (figur 3C). Samtidig viste analyse av absolutte tall en statistisk signifikant økning kun i ST2+ IL-9+-populasjonen ved dag 7 etter infeksjon (tilleggsfigur 5A). I mediastinale lymfeknuter (gatingstrategi vist i tilleggsfigur 2B) økte antallet IL-9-uttrykkende ILC2-celler (ST2+ IL-9+) signifikant ved dag 10 etter infeksjon, mens absolutt antall ST2+-celler viste en tendens til å øke, fra dag 7 og fortsatte til dag 10 etter infeksjon (tilleggsfigur 6A,C).

IL-9+ ILC2-celler ble også funnet i lamina propria og intraepitelale rom i tynntarmen (gatingstrategi vist i figur 3B og tilleggsfigur 2A). N. brasiliensis-infeksjon resulterte i en statistisk signifikant økning i frekvensen av ST2+ IL-9+ celler ved dag 4, og ST2-IL-9+ populasjoner ved dag 7 og 10 i lamina propria. I det intraepiteliale rommet ble det også observert en signifikant endring i frekvensene til ST2+ IL9+- og ST2-IL-9+-celler ved henholdsvis dag 7 og dag 10 etter infeksjon (figur 3C). Viktigere, selv med et relativt lavt antall larverbelastning, forårsaket infeksjon med parasitten omfattende skade på tynntarmen; Derfor er analysen av IL-9-uttrykkende ILC2s absolutte tall teknisk umulig, noe som hindrer nøyaktig kvantifisering av denne populasjonen på grunn av lave utbytter av levende celler (tilleggsfigur 5B, C). På den annen side viste analysen av mesenteriske lymfeknuter (gatingstrategi vist i tilleggsfigur 2C) en signifikant økning i absolutt antall ST2+ IL-9-, ST2+ IL-9+- og ST2-IL-9+ ILC2-celler ved dag 10 etter infeksjon (tilleggsfigur 6D), som tidligere rapportert4. Samtidig ble det ikke observert noen forskjell i frekvensen av disse populasjonene gjennom hele infeksjonen (tilleggsfigur 6B). Disse forskjellige undergruppene av ST2- og IL-9-uttrykkende celler er spennende populasjoner med potensielt differensielle roller in vivo, og kan korrespondere med naturlige versus inflammatoriske ILC2s som nylig beskrevet 18,19,20,21. Dette må imidlertid tas opp i fremtidige studier.

Oppsummert justerte vi denne protokollen for utvinning av IL-9-uttrykkende celler fra N. brasiliensis-infisert tarm, mens vi fortsatt kunne oppdage dem i lunge og lymfoid vev. Å hente immunceller fra parasittinfisert tarm har vist seg å være teknisk vanskelig. Her resulterte et justert antall larver brukt til infeksjon i forbedret integritet i tarmvev, noe som gjorde det mulig å gjenopprette en IL-9+ populasjon. Så vidt vi vet, er dette den første protokollen utviklet spesielt for analyse av IL-9-uttrykkende celler i tarmen under N. brasiliensis-infeksjon. Likevel kan andre immunceller også isoleres etter disse trinnene. Dataene som presenteres her viser at de fleste vevsbosatte IL-9-uttrykkende celler i tynntarmen er ILC2s.

Figure 1
Figur 1: Flytskjema for den beskrevne protokollen. Skjematisk diagram med hovedtrinnene som brukes til å behandle forskjellige organer og de forventede IL-9-uttrykkende celleundergruppene som er oppnådd. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Th9-celler finnes i lunger, mediastinale og mesenteriske lymfeknuter gjennom hele N. brasiliensis-infeksjonen. Representativ flowcytometrianalyse og gatingstrategi brukt for Th9-celleidentifikasjon fra (A) lunger og (B) mesenteriske lymfeknuter. Enkeltcellede suspensjoner fra hvert organ ble farget med et fikserbart levedyktighetsfargestoff, fluorescerende merket anti-CD45 for identifisering av hematopoietiske celler og anti-T-cellereseptor (TCR) β og anti-CD4 for identifisering av CD4 + T-lymfocytter. GFP + -signalet indikerer prosentandelen av Th9-celler tilstede. Den første porten viser sidespredning (SSC)-A/fremoverspredning (FSC)-A-egenskaper med lymfoide cellers klassiske morfologi. Enkeltcellehendelser ble valgt, etterfulgt av levende celler og deretter CD45+-celler. Innenfor denne populasjonen fokuserte vi på TCR-β og CD4 dobbeltpositive celler, hvorfra GFP + -celler ble identifisert som Th9-celler. Farging av lymfeknuter inkluderte ikke anti-CD45-antistoffet, siden hele populasjonen forventes å være positiv. (C) Frekvenser av Th9-celler funnet i lunger, mediastinale og mesenteriske lymfeknuter på de angitte tidspunktene etter infeksjon. Data representerer gjennomsnittet ± SEM av en eller to mus analysert per gruppe, fra tre uavhengige eksperimenter, per tidspunkt; Uparet T-test; *p≤ 0,05, **p≤ 0,001, ***p≤ 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: IL-9-produserende ILC2-celler finnes i ikke-lymfoide organer. Representativ flowcytometrianalyse og gatingstrategi brukt for identifisering av IL-9+ ILC2-celler fra (A) lunge- og (B) tynntarmlamina propria. Enkeltcellede suspensjoner fra hvert organ ble merket med biotinylerte antistoffer for å identifisere avstamningsceller (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 og anti-Ter119) og Fc-Block. Cellesuspensjoner ble deretter farget med fikserbart levedyktighetsfargestoff, fluorokrommerket streptapavidin, anti-CD45 for identifisering av hematopoietiske celler og anti-CD90 for identifisering av ILC2-celler. Den første porten viser spredning (SSC)-A/side scatter (FSC)-A egenskaper med den klassiske morfologien til lymfoide celler. Enkeltcellehendelser ble valgt, etterfulgt av levende celler og deretter CD45+-celler. Innenfor denne populasjonen fokuserte vi på CD90+ linceller; fra denne gruppen evaluerte vi ST2- og GFP-uttrykk for å identifisere IL-9+ ILC2-celler. (C) Frekvenser av ILC2-celler funnet i lunger, lamina propria og det intraepiteliale cellerommet ved de angitte tidspunktene etter infeksjon. Data representerer gjennomsnittet ± SEM av en eller to mus analysert per gruppe, fra tre uavhengige eksperimenter, per tidspunkt; uparret T-test; *p ≤ 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Liste over kjemiske løsninger og deres sammensetninger. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Antistoffcocktail for å identifisere IL-9-produserende ILC2-celler. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Antistoffcocktail for å identifisere IL-9-produserende T-lymfocytter. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende figur 1 Skjematisk fremstilling av mediastinal lymfeknutelokalisasjon. Opprettet i BioRender.com Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 2: Representativ flowcytometri og gatingstrategi brukt for å identifisere IL-9+ ILC2 i intraepitelceller fra tynntarm og lymfeknuter. (A) Enkeltcellesuspensjoner fra tynntarmens intraepitelceller ble først inkubert med biotinmerkede antistoffer for å velge avstamningsceller (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 og anti-Ter119) og Fc-blokk. Dette ble etterfulgt av farging med et fikserbart levedyktighetsfargestoff, fluorokrommerket streptavidin, anti-CD45 for identifisering av hematopoietiske celler og anti-CD90 for identifisering av ILC2-celler. Den første porten viser sidespredning (SSC)-A/fremoverspredning (FSC)-A-egenskaper med lymfoide cellers klassiske morfologi. Enkeltcellehendelser ble valgt, etterfulgt av levende celler og deretter CD45+-celler. Innenfor denne populasjonen fokuserte vi på CD90+ linceller; fra denne gruppen ble GFP + -celler identifisert som IL-9 + ILC2-celler. (B,C) Representativ flowcytometri og gatingstrategi for (B) mediastinale lymfeknuter og (C) mesenteriske lymfeknuter for å identifisere IL-9+ ILC2-celler. Farging av lymfeknuter inkluderte ikke anti-CD45-antistoffet, da hele populasjonen var forventet å være positiv. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 3: Representativ flowcytometrianalyse og gatingstrategi brukt for å identifisere Th9-celler i mediastinale lymfeknuter og tynntarm. Encellede suspensjoner fra (A) mediastinale lymfeknuter ble farget med et fikserbart levedyktighetsfargestoff og fluorescerende merket anti-TCR-β og anti-CD4 antistoffer. Den første porten viser sidespredning (SSC)-A/fremoverspredning (FSC)-A-egenskaper med lymfoide cellers klassiske morfologi. Enkeltcellehendelser ble selektert, etterfulgt av levende celler og deretter TCR-β og CD4 dobbeltpositive celler; fra denne gruppen ble GFP + -celler identifisert som Th9-celler. En lignende flowcytometristrategi ble brukt for (B) lamina propria og (C) intraepitelceller fra tynntarmen, bortsett fra at CD45+-celler ble selektert etter de levende cellene, etterfulgt av TCR-β og CD4 dobbeltpositive celler, hvorfra GFP+-celler ble identifisert som Th9-celler. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 4: Absolutte tall av Th9-celler endres signifikant gjennom infeksjonen. Absolutt antall IL-9+ celler fra TCR-β og CD4 dobbeltpositive celler ble bestemt på dag 0, 4, 7 og 10 etter infeksjon i (A) lunge, (B) mediastinale lymfeknuter og (C) mesenteriske lymfeknuter. Data representerer gjennomsnittet ± SEM av en eller to mus analysert per gruppe, fra tre uavhengige eksperimenter, per tidspunkt; uparet T-test *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,001, ***P ≤ 0,0001. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 5: Absolutt antall IL-9+ ILC2-celler varierer gjennom infeksjonen. Absolutte antall IL-9+ ILC2-celler fra lin-CD90+-populasjonen ved dag 0, 4, 7 og 10 etter infeksjon ble bestemt i (A) lunge, (B) lamina propria og (C) intraepitelceller fra tynntarmen. Data representerer gjennomsnittet ± SEM av en eller to mus analysert per gruppe, fra tre uavhengige eksperimenter, per tidspunkt; uparet T-test *p ≤ 0,05. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 6: Frekvenser og absolutte tall av IL-9+ ILC2-celler i lymfeknuter øker signifikant under infeksjon. (A) Frekvens og (C) absolutt antall IL-9+ ILC2-celler fra mediastinale lymfeknuter. (B) Frekvens og (D) absolutt antall IL-9+ ILC2-celler fra mesenteriske lymfeknuter. Verdiene ble bestemt som IL-9+ ILC2-celler i lin-CD90+-populasjonen ved dag 0, 4, 7 og 10 etter infeksjon. Data representerer gjennomsnittet ± SEM av en eller to mus analysert per gruppe, fra tre uavhengige eksperimenter, per tidspunkt; uparret T-test *p ≤ 0,05, ***p ≤ 0,0001. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 7: Flowcytometrianalyse av IL-9 som uttrykker ILC2-celler fra N. brasiliensis-infisert tarm. Representative plott av ILC2-celler isolert fra tarmen til IL-9-reportermus på dag 7 etter infeksjon. IL-9-ekspresjon ble vurdert i ILC2-celler nylig isolert fra intraepitel- eller lamina propria-rommene til infiserte reportermus (IL-9 REP) versus etter den tidligere beskrevne IL-9 intracellulære fargeprotokollen 9 (IL-9 AB, ved bruk av enIL-9 antistoffklon RM9A4, BioLegend). For å identifisere IL-9-uttrykkende ILC2 ble enkeltcellesuspensjoner først inkubert med biotinmerkede antistoffer for å velge avstamningsceller (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 og anti-Ter119) og Fc-Block, etterfulgt av farging med fleksibelt levedyktighetsfargestoff, fluorokrommerket streptavidin, anti-CD45 og anti-CD90. Plottene viser IL-9-uttrykkende ILC2-celler gated på lin-CD45 + CD90 + populasjonen tilstede i intraepitelial (A, B) og lamina propria (C, D) rom, oppdaget via reportersignalet fra ferskt isolerte celler (A, C) eller etter intracellulær farging av IL-9 (B, D). Kontrollmus ble injisert med PBS. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En fullstendig forståelse av intestinale parasitt-vert-interaksjoner og immunresponser mot helminthinfeksjon krever identifisering og analyse av de forskjellige cellepopulasjonene og effektormolekylene som er nøkkelen til induksjon av vevsremodellering og ormutvisning. Jordoverførte helminthinfeksjoner representerer et stort problem i utviklingsland over hele verden. Inntil nylig var imidlertid en protokoll som tillot analyse av sjeldne cellepopulasjoner tilstede i tynntarmen, hovedorganet som er berørt av denne infeksjonen, ikke tilgjengelig5. Denne protokollen dekker tidligere beskrevne metoder som tillater flowcytometrisk analyse av IL-9-uttrykkende lymfoide celler i lunge-, mediastinal- og mesenteriske lymfeknuter under N. brasiliensis-infeksjon , med den ekstra fordelen av identifiseringen av denne populasjonen for første gang i tynntarmen.

Suksessen til denne protokollen er svært avhengig av vevsbehandlingstider. Det er viktig å behandle maksimalt seks tynntarmsprøver, per person, samtidig. Hvis forskjellige organer skal behandles, anbefaler vi at det gjøres parallelt av en annen person. Ved å bruke en relativt lav parasittbelastning (200 L3 larver), tillater denne protokollen isolering av lymfoide celler fra N. brasiliensis-infisert tarm samtidig som evnen til å isolere disse cellene fra andre organer opprettholdes. Bruken av høyere parasittbelastning truer kvaliteten og mengden av celler isolert fra tynntarmen (data ikke vist); Det kan imidlertid resultere i en signifikant økning av IL-9-uttrykkende lymfoide celler i andre organer4. Ved behandling av tarm og mesenteriske lymfeknuter er det avgjørende å fjerne det festede fettvevet, da unnlatelse av å gjøre det resulterer i økt celledød. Dataene støtter observasjonen om at det naturlige infeksjonsforløpet negativt påvirker det absolutte antall lymfoide celler som gjenvinnes fra tynntarmen. I studiene beskrevet her forblir frekvensene til IL-9+ ILC2-celler konsistente, mens absolutte tall viser høy variabilitet i hvert uavhengige eksperiment. Derfor kan konklusjoner trukket fra absolutte tall være unøyaktige og bør unngås. I tillegg, gitt den lave frekvensen av IL-9-uttrykkende T-celler i vev, anbefales oppkjøp og farging av høyest mulig antall celler.

En begrensning ved denne ILC2-analysen er bruken av en diskret kombinasjon av markører for å definere denne populasjonen. Avhengig av vev av interesse og infeksjonsfase, kan ytterligere markører, som blant annet CD25, Klrg1 og ST2, brukes til en mer detaljert fenotypisk karakterisering av ILC2-celler22. Vi erkjenner at protokollen som presenteres her er basert på INFER reporter-musestamme4, og kan representere en fordel for identifisering av IL-9-uttrykkende celler. Vi forventer imidlertid at resultatene som er funnet her, kan oppnås ved hjelp av alternative strategier, inkludert bruk av andre musereporterstammer og intracellulær IL-9-farging 6,7,8,9. Det er viktig å nevne at bruk av konvensjonelle mus og utførelse av intracellulær farging av IL-9 i intraepitel- og lamina propria-celler kan føre til at man mister ethvert detekterbart signal og kompromitterer dataene som er oppnådd (tilleggsfigur 7). Dette kan skyldes den langsiktige manipulasjonen som kreves for å flekke en delmengde som allerede er vanskelig å isolere og opprettholde ex vivo. Derfor anbefaler vi bruk av reportermusstammer for å redusere behandlingstiden og sikre en pålitelig analyse av IL-9-uttrykk in vivo. Vi anerkjenner også det faktum at Th9-celler ikke er de eneste T-cellene som uttrykker IL-923; Men i denne parasittiske modellen ville vi ikke forvente at andre delmengder skulle uttrykke det. Likevel, for å forkaste tilstedeværelsen av andre IL-9-uttrykkende delmengder i den beskrevne sammenhengen, er en fullstendig karakterisering av type 2 cytokiner sammen med bruk av transkripsjonsmarkører mulig.

Kvantifisering av IL-9-uttrykkende lymfoide celler før dag 5 etter infeksjon er tidligere rapportert. Det resulterer imidlertid i svært lave cellefrekvenser4. Protokollen i denne studien dekker en stor del av N. brasiliensis-infeksjonskinetikken frem til begynnelsen av parasittclearance2. Vi la imidlertid merke til at noen av cellepopulasjonene i denne studien ikke kom tilbake til basale nivåer innen den analyserte tidsrammen, noe som tyder på at studien kan ha nytte av utvidede tidspunkter for å få et fullt perspektiv på oppførselen til disse cellene i et mer avansert stadium av infeksjonen in vivo. Uansett tror vi at arbeidet som presenteres her, kan tjene som en referanseguide for forskere som er interessert i å studere IL-9-uttrykkende lymfoide celler i parasittinfeksjonsmodeller, slik at de kan velge den ideelle infeksjonsfasen for påvisning av de spesifikke celletyper fra vev av interesse. Samlet sett vil metodene beskrevet her være nyttige for å vurdere fenotypen og funksjonen til T-lymfocytter og ILC2-celler som uttrykker IL-9 under en fysiologisk relevant modell for parasittinfeksjon, utvide vår kunnskap om disse cellene og potensielt forbedre vår forståelse av dem under andre patologiske forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å anerkjenne José Luis Ramos-Balderas for hans tekniske støtte. Dette arbeidet ble støttet av følgende tilskudd til PLL fra CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P og EO-M fikk stipend fra CONACYT (henholdsvis 736162 og 481437). MCM-M fikk stipend fra CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK buffer Homemade
Attune Nxt cytometer Thermofisher
B220 Biolegend 103204
CD11b Biolegend 101204
CD11c  Biolegend 117304
CD19  Biolegend 115504
CD4 Biolegend 100404
CD4 (BV421) Biolegend 100443
CD45.2 Biolegend 109846
CD8  Biolegend 100703
CD90.2 Biolegend 105314
Collagenase D Roche 11088866001
DNAse I Invitrogen 18068015 Specific activity: ≥10 000 units/mg   
Facs ARIA II sorter BD Biosciences
FACS Melody cell sorter BD Biosciences
Fc-Block Biolegend 101320
FcεRI eBioscience 13589885
Fetal bovine serum Gibco 26140079
FlowJo FlowJo Flow cytometry analysis data software
Gr-1 Tonbo 305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Homemade
IL-9 biolegend 514103
NK1.1  Biolegend 108704
Nylon mesh  ‎ lba B07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556
Phosphate-buffered saline  Homemade
RPMI Gibco 11875093
Siglec F  Biolegend 155512
Streptavidin Biolegend 405206
TCR-β  Biolegend 109203
TCR-β (PE/Cy7) Biolegend 109222
TCR-γδ  Biolegend 118103
Ter119 Biolegend 116204
Tricine buffer  Homemade
Zombie Aqua Fixable Viability Dye Biolegend 423101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Centers for Disease Control and Prevention. Parasites - Hookworm. , (2022).
  2. Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , Chapter 19 (Unit 19.12) (2003).
  3. Mearns, H., et al. Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology. Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).
  4. Licona-Limon, P., et al. Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection. Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).
  5. Ferrer-Font, L., et al. High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection. Elife. 9, 51678 (2020).
  6. Kharwadkar, R., et al. Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage. Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).
  7. Wilhelm, C., et al. An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation. Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).
  8. Gerlach, K., et al. TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells. Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).
  9. Olson, M. R., et al. Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production. Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).
  10. Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  11. Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models. Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).
  12. Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice. International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).
  13. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).
  14. old Spring Harbor Protocols. Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red. Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  15. Bielecki, P., et al. Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state. Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).
  16. Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells. Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).
  17. Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension. Micromachines. 11 (1), 94 (2020).
  18. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
  19. Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
  20. Flamar, A. L., et al. Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity. Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).
  21. Olguín-Martínez, E., et al. IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2. Frontiers in Immunology. 13, 787713 (2022).
  22. Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells. Frontiers in Immunology. 12, 757967 (2021).
  23. Noelle, R. J., Nowark, E. C. Cellular sources and immune functions of interleukin-9. Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 193 IL-9 Th9 ILC2 IL-9 lymfoide celler parasitt tynntarm N. brasiliensis
En strategi for studier av IL-9-produserende lymfoide celler i <em>Nippostrongylus brasiliensis-infeksjonsmodellen</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Muñoz-Paleta, O.,… More

Muñoz-Paleta, O., Olguín-Martínez, E., Ruiz-Medina, B. E., Alonso-Quintana, A., Marcial-Medina, M. C., Licona-Limón, P. A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model. J. Vis. Exp. (193), e64075, doi:10.3791/64075 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter