Summary
IL-9発現TおよびILC2細胞は、 N. brasiliensis 感染中に誘導されますが、その特性評価は、その低頻度および異なる動態のために、感染した腸ではほとんど見過ごされてきました。このプロトコルは、異なる標的臓器からのこれらの細胞の単離と、異なる感染段階でのフローサイトメトリー による それらの同一性の確認について説明しています。
Abstract
IL-9は、抗腫瘍免疫、アレルギー病理の誘導、および寄生虫の排除に重要な役割を果たす蠕虫感染に対する免疫応答を含む様々な過程に関連する多面的サイトカインである。 ニッポストロンギルス・ブラジリエンシス 感染症のマウスモデルでは、IL-9は主に肺、小腸、排液リンパ節に見られるCD4+ Tリンパ球と自然リンパ球によって産生されます。IL-9の細胞内染色に伴う技術的な困難、および感染時に小腸から造血細胞を単離することの複雑さを考えると、このモデルの異なるリンパ組織および非リンパ組織におけるIL-9の発現を分析するための包括的で簡単なプロトコルが差し迫っています。ここで説明するプロトコルは、CD4+ T細胞と自然リンパ球細胞によって産生されるIL-9の動態を概説しています 肺と小腸、ブラ ジリエンシス菌の標的となる主な臓器、ならびに縦隔と腸間膜リンパ節で、感染全体を通して。さらに、細胞の種類と目的の臓器に応じて、感染に必要な幼虫の数を詳しく説明します。このプロトコルは、 N. brasiliensis 感染モデルで関心のある特定の細胞、臓器、および疾患段階に焦点を当てる機会を提供することにより、時間とリソースを節約するためのアッセイの標準化を支援することを目的としています。
Introduction
鉤虫は、主に発展途上国の熱帯地域で、世界中で約7億人に感染する腸内寄生虫です。ヒトで最も一般的な鉤虫寄生虫である 十二指腸下腺腫 と ネクターアメリカヌスによる高強度感染症は、貧血とタンパク質欠乏症を引き起こし、成長と精神発達の遅延を引き起こす可能性があります1。 N. americanus とげっ歯類の寄生虫 Nippostrongylus brasiliensis は、宿主にプロトタイプの2型免疫応答を誘導し、ライフサイクルの類似点を共有しています。したがって、 N.ブラジリエンシス によるマウスの感染は、ヒト鉤虫感染の最も一般的に使用されるモデルです。ステージ3(L3) N.ブラジリエンシス 感染性幼虫は、感染後最初の数時間で皮膚から肺に移動します。肺に入ると、L4になり、気管を上って飲み込み、胃を通過し、腸に到達して4〜5日以内に成人(L5)になります。腸内では、L5ワームが糞便中に排泄される卵を産み、寄生虫のライフサイクルを再開します2。
N. brasiliensisによって誘導される免疫応答は、好酸球増加症、好塩基球増加症、杯および肥満細胞の過形成、ならびにIgG1およびIgE産生の増加とともに、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、およびIL-13を含むいくつかのタイプ2サイトカインの増加によって特徴付けられる。N. brasiliensis感染時に誘発される免疫応答を特定および定義しようとする研究のほとんどは、このモデル3におけるIL-4またはIL-13の役割に集中しています。しかし、IL-9発現細胞の同定と特性評価、およびこのサイトカインの機能はほとんど見過ごされていましたが、Licona-Limónらは、N.ブラジリエンシスに対する免疫応答におけるIL-9の重要な役割を示す最初の研究を発表しました。レポーターマウスを用いて、この研究では、感染時にIL-9を発現する主要な細胞サブセットとして、T細胞(主にTヘルパー9)および2型自然リンパ系細胞(ILC2)について説明しました4。
蠕虫感染肺からの免疫細胞の単離と特性評価は実行可能であり、広く報告されています3,4。しかし、固有の組織リモデリングと粘液産生のために、感染した腸でそうすることは、Ferrer-Fontらの最近の発表まで技術的な課題であることが証明されました5。このグループは、ヘリグモソモイデスポリギラスに感染したマウス腸からの免疫サブセットの単一細胞懸濁液を単離および分析するためのプロトコルの概要を説明しました。それに基づいて、我々は現在、N. brasiliensis感染腸からのIL-9発現リンパ系細胞の単離およびサイトメトリー分析のためのプロトコルを標準化しました。さらに、感染中のさまざまな細胞源および解剖学的位置からのIL-9動態を確立しました。
この感染に関与する異なる細胞集団を特徴付けることは、寄生虫に対する免疫応答および宿主との相互作用をより広く理解するために不可欠です。この包括的なプロトコルは、目的の疾患段階で目的の臓器からIL-9産生細胞を分離および分析するための明確なルートを提供し、 ブラジリエンス菌 感染症および寄生虫感染全般におけるこれらの細胞の役割に関する知識の大幅な向上を可能にします。
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Protocol
ここに記載されているすべての動物実験は、メキシコ国立自治大学細胞生理学研究所の動物取り扱い内部委員会(CICUAL)によって承認されました。
メモ: プロトコル全体のフローチャートを 図1に示します。
1.マウスの飼育
- 8〜10週齢の雌または雄のマウス群を使用し、12時間の明暗サイクルで一定の温度と湿度の動物施設に収容し、水と食物に 自由 にアクセスできるようにします。
注:このプロトコルは、前述のように、C57BL / 6バックグラウンドのIL-9レポーターマウス系統を使用します4;しかしながら、他のIL−9レポーター株は、6、7、8、ならびに細胞内IL−9染色を使用することができ、結果は変動した9であった。
2.マウスの感染
- 感染の1日前にマウスの背中を体の中央から尾の付け根近くまで剃ります。麻酔薬の使用は必須ではありません。
- 前述のように、各マウスに200匹の生存可能な第3段階のN.ブラジリエンシス幼虫(L3)を腰部に100 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)10で接種するか、対照として100 μLのPBSを単独で注射します。感染後4日目、7日目、または10日目に動物を犠牲にします。
3.肺、小腸、縦隔、腸間膜リンパ節の分離
- 頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。マウスを背中に置き、70%エタノールをスプレーします。ハサミを使用して正中切開を行い、皮膚を開いて腹部と胸部を露出させます。
注:イソフルランは代替の安楽死方法として使用できます12。二酸化炭素室は、CO2 が肺組織の損傷や出血を引き起こすため、推奨されません13。 - 縦隔リンパ節および肺の分離
- 胸骨を切開し、「V」字型にカットして肋骨と胸筋を取り除きます。胸腔が露出したら、心臓の下の食道の隣に縦隔リンパ節を配置します( 補足図1を参照)。
- 縦隔リンパ節を抽出し、12ウェル培養プレート内の1 mLのR-10培地(表1)に回収します。処理するまで光から保護された氷の上に保管してください。
注:これらの実験で使用したレポーターマウスからの蛍光シグナルが減少しないように、サンプルを光から保護する必要があります。 - 肺を抽出し、マウス1匹あたり12ウェル培養プレートに1 mLのR-10培地で採取します。処理するまで光から保護された氷の上に保管してください。
- 腸間膜リンパ節鎖および小腸の分離
- 腹膜腔を露出させ、小腸を慎重に右に動かして、結腸に沿って腸間膜リンパ節(MLN)鎖を露出させます。
- 鉗子を使用して、MLNを取り外し、ペーパータオルでそっと転がし、脂肪を引き抜きます。
- MLNを12ウェル培養プレート内の1 mLのR-10培地に移します。処理するまで光から保護された氷の上に保管してください。
- 幽門括約筋のすぐ下と盲腸の上の小腸を切断します。鉗子の助けを借りて腸をゆっくりと引き出し、付着した腸間膜と脂肪組織を取り除きます。
- 小腸をペーパータオルの上に置き、PBSでたっぷりと湿らせます。ハサミで小腸からパイエル板を取り除きます。
注意: 生存率を維持するために、残りの脂肪組織を取り除き、プロセス全体を通して小腸をPBSで湿らせてください。 - ハサミを使って小腸を縦方向に切り、開いた腸の上に鉗子をそっとスライドさせて糞便と粘液を取り除きます。
- 小腸を鉗子で保持し、氷上で5 mLのPBSで数回注意深く沈めて洗浄します。2回繰り返します。
- 小腸を短い断片(約5 mm)に切断し、2%FBSを含む10 mLのHBSS14 を含む50 mLの円錐管に収集します(表1)。直ちに上皮内および固有層細胞を単離し続ける。
4.小腸、肺、リンパ節からの単一細胞懸濁液の調製
注:小腸から単一細胞懸濁液を調製する場合、処理期間が長くなると細胞の生存率が大幅に低下するため、1人あたり最大6匹のマウスを処理することが非常に重要です。この方法は、 ヘリグモソモイデス・ポリギラス 感染マウスモデル5から適応した。
- 振とうインキュベーター、R-20培地、HBSS、およびHBSS-2 mM EDTA(表1)を37°Cで予熱します。
- サンプルあたり10 mLの小腸消化培地(表1)を調製します。
- ステップ3.3.8の腸片を手で激しく振る。
- 各サンプルをガラス漏斗上のナイロンメッシュ(約10 cm x 10 cm)でろ過します。メッシュ上に10 mLの予熱したHBSSを加えてサンプルを洗浄し、フロースルーを廃棄します。もう一度繰り返します。
注:サンプルごとに新しいメッシュを使用し、手順全体で再利用します。 - 漏斗からメッシュを取り外し、10 mLの温かいHBSS-2 mM EDTAを含む50 mLのコニカルチューブでメッシュからサンプルを収集します(ステップ4.1)。200rpmで振とうしながら、37°Cで10分間インキュベートします。
- 最高速度(3,200 rpm)で10秒間ボルテックスし、ガラス漏斗上でメッシュでサンプルをろ過し、50 mLのコニカルチューブでフロースルーを回収します。
- 手順4.5と4.6を2回繰り返し、同じ50 mLコニカルチューブでフロースルーを回収します。上皮内細胞はこの30mL画分に位置する。残りの組織を保存します。
- 上皮内細胞からの単一細胞懸濁液調製
- ステップ4.7で回収した30 mLの細胞懸濁液を遠心分離し、室温(RT)で5分間450 x g で回収します。上澄み液を捨てる。
- 5 mLのPBSを加え、450 x g でRTで5分間遠心分離します。 上清を捨てます。
- 細胞ペレットを3 mLのRPMI 10%FBS-20 μg/mL DNaseに再懸濁します(表1)。細胞染色まで光から保護された氷上に保管してください。
- 固有層細胞からの単一細胞懸濁液調製
- ステップ4.7の残りの小腸組織を、漏斗のメッシュを通して10mL以上の温かいHBSSを注ぐことによって洗浄します。洗浄を繰り返します。10 mLの小腸消化培地を含む50 mLのコニカルチューブのメッシュから組織を収集します。
- 200 rpmで振とうしながら、37°Cで30分間インキュベートします。5分ごとに10秒間最高速度で渦を巻きます。
- 10 mLのFACS-EDTAバッファー(表1)を加えて消化反応を停止し、氷上に置きます。
- 血清学的ピペットを使用して100 μmセルストレーナーを通して各サンプルをろ過し、氷上に置かれた50 mLコニカルチューブで懸濁液を回収します。
- 600 x g で4°Cで6分間遠心分離します。
- 上澄み液を捨てる。細胞ペレットを5 mLのPBSで洗浄し、600 x g で4°Cで6分間遠心分離します。
- 上清を廃棄し、細胞ペレットを1 mLのRPMI 10%FBS-20 μg/mL DNaseに再懸濁します。細胞染色まで光から保護された氷上に保管してください。
- 肺からの単一細胞懸濁液の調製
注:各肺と小腸は、細胞の生存率が低くなる処理時間の延長を避けるために、2人で並行して処理する必要があります。- 処理したサンプルごとに4 mLの肺消化培地(表1)を準備します。
- ステップ3.2.3の肺を含むウェルからRPMI培地を取り除きます。細かいハサミで肺を細かく切ります。
- 肺片をスパチュラ付きの15mLコニカルチューブに移します。4 mLの肺消化培地を追加します(表1)。
- 250 rpmで振とうしながら、37°Cで30分間インキュベートします。終了したら、各サンプルが処理されるまで氷上に保ちます。
- 各サンプルを100 μmのセルストレーナーでろ過し、6ウェル培養プレートの単一ウェルに配置します。シリンジプランジャーで組織を解離します。
- 各サンプルを15 mLのコニカルチューブに回収し、4 mLのR-2培地を加えます(表1)。他のサンプルが処理されている間、氷上に保管してください。
- 600 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を捨て、細胞ペレットを1 mLのR-5培地に再懸濁します(表1)。
- 遠心分離しながら、造血細胞画分15、16を富化するために、サンプルあたり4mLの27.5%密度勾配溶液(表1)を調製する。単一細胞分離のためのこの戦略は、他の同様の密度勾配媒体17と比較して、より効率的で、費用効果が高く、毒性が低い。
- ステップ4.10.7の細胞懸濁液1 mLに4 mLの27.5%密度勾配溶液を加え、激しく振とうします。
- 混合懸濁液の上に1 mLのR-5培地(表1)をゆっくりと加え、2つの相を作ります。
- 1,500 x g でRTで20分間遠心分離し、低加速でブレーキをオフにします。2つの相の間に形成されたリングを観察します。
- 1 mLマイクロピペットで2つの相の間に形成されたリングを回収し、4 mLのR-2培地に再懸濁します。
- 450 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上澄み液を捨てる。細胞ペレットを1mLのACK緩衝液(表1)に再懸濁し、RTで1分間インキュベートします。
- 4 mLのR-5培地を加え、450 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を捨て、細胞ペレットを1 mLのR-10培地に再懸濁します。フローサイトメトリーで染色するまで光から保護された氷上に保管してください。
- リンパ節からの単一細胞懸濁液調製
- ステップ3.2.2または3.3.3のリンパ節を6ウェル培養プレートのウェル内の2つのメッシュの間に置き、シリンジプランジャーで解離します。
- 細胞懸濁液を 1.5 mL コニカルチューブで回収し、450 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。
- 上清を捨て、細胞ペレットを1 mLのR-10培地に再懸濁する。フローサイトメトリーで染色するまで光から保護された氷上に保管してください。
注:塊が見える場合は、100 μmのセルストレーナーでサンプルをろ過します。
5. フローサイトメトリーのための細胞染色(図2および図3)
注:ステップ4.11.3のリンパ節細胞懸濁液を450 x g で4°Cで5分間遠心分離し、細胞ペレットを500 μLのFACSバッファーに再懸濁します(表1)。
- ILC2の同定のための細胞染色(図3 および 補足図2)
注:この染色手順は、IL-9発現ILC2細胞の同定に特異的です。- ステップ4.10.14の肺サンプルあたり150 μL(約1.8 x 10 6細胞)、およびステップ4.11.3のリンパ節サンプルあたり50 μL(縦隔および腸間膜リンパ節サンプルの場合はそれぞれ約0.7 x 10 6および2.2 x 106細胞)を96ウェル円錐形底部培養プレートにプレートします。100 μLのFACSバッファーを加え、450 x gで4°Cで5分間遠心分離します。
- 小腸サンプルあたり100 μL(上皮内および固有層サンプルの場合はそれぞれ約2.7 x 10 6および0.6 x 106細胞)をステップ4.8.3および4.9.7から96ウェル円錐形底部培養プレートにプレートします。150 μLのFACSバッファーを加え、450 x gで4°Cで5分間遠心分離します。
- 上清を捨て、各細胞ペレットをFACS緩衝液で希釈した50 μLのビオチン化抗体カクテル(表2)に再懸濁した。光から保護された4°Cで30分間インキュベートします。
注:上皮内および固有層サンプルには、20 μg/mL DNaseを含むFACSバッファーを使用してください。 - 150 μLのFACSバッファーを加えます。450 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 上清を捨て、細胞ペレットを200 μLのFACSバッファーに再懸濁します。再度遠心分離し、上清を廃棄する。
- 細胞ペレットを50 μLの抗体/染色カクテル(表2)に再懸濁し、光から保護された4°Cで30分間インキュベートします。
- 150 μLのFACSバッファーを加えます。450 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 上清を捨て、細胞ペレットを200 μLのFACSバッファーに再懸濁します。再度遠心分離し、上清を廃棄する。洗浄を繰り返し(ステップ5.1.7)、上清を廃棄します。
- 細胞ペレットを300 μLのFACSバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーで分析します。
- 小腸および肺のサンプルについては、リンパ球、単一細胞、生細胞、造血細胞、CD90+系統細胞、ST2+細胞、およびIL-9+細胞(図3A、Bおよび補足図2A)のゲーティング戦略を使用します。リンパ節サンプルには、生細胞、単一細胞、CD90+系統細胞、ST2+細胞、およびIL-9+細胞というゲーティング戦略を使用します(補足図2B、C)。
- IL-9産生リンパ球の同定のための細胞染色(図2 および 補足図3)
- ステップ4.10.14から肺あたり800 μLのサンプルを1.5 mLチューブ(約14.6 x 106 細胞)に移します。450 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上澄み液を捨てる。
- リンパ節サンプルの場合、ステップ4.11.3からの細胞懸濁液400 μL(縦隔リンパ節および腸間膜リンパ節サンプルの場合はそれぞれ約5.6 x 10 6および17.5 x 106細胞)を96ウェル円錐ボトムプレートに2段階でプレートします。
- まず200 μLを移し、450 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
- さらに200 μLを対応するウェルに移します。450 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
- 細胞ペレットを50-400 μLの抗体/染色カクテル(表3)に再懸濁し、光から保護された4°Cで30分間インキュベートします。
注:肺サンプルは400 μL、縦隔リンパ節サンプルは50 μL、腸間膜リンパ節サンプルは100 μLの染色カクテルに再懸濁する必要があります。 - 縦隔リンパ節サンプルに150 μL、腸間膜リンパ節サンプルに100 μLのFACSバッファーを追加します。450 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
- ペレットをそれぞれ1 mLおよび200 μLのFACSバッファーに再懸濁することにより、肺およびリンパ節サンプルを洗浄します。450 xg で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を捨てて洗浄を繰り返します。
- 肺サンプルを600 μLのFACSバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーで分析します。ゲーティング戦略を使用します:リンパ球、単一細胞、生細胞、造血細胞、CD4+TCRβ+細胞、およびIL-9+細胞(図2A)。
- リンパ節サンプルを300 μLのFACSバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーで分析します。ゲーティング戦略を使用します:リンパ球、単一細胞、生細胞、CD4+ TCRβ+細胞、およびIL-9+細胞(図2B および 補足図3A)。
6. シングルセル懸濁液中の細胞の絶対数の決定
- 分離ステップ4.8.3、4.9.7、4.10.14、および4.11.3のサンプルをPBSで1:20の比率で希釈します(サンプル10 μL+ PBS190 μL)。
- ステップ6.1で希釈した各サンプル10 μLをトリパンブルー10 μLと混合します。10 μLを血球計算盤にロードし、各希釈を考慮して生細胞をカウントします。
- フローサイトメトリーで求めた生細胞(生残色素陰性細胞)由来の目的集団の割合に単離後の単一細胞懸濁液中の生細胞の総数を乗じ、この数を100で割ることにより、細胞の絶対数を求めます(補足図4、補足図5、および補足図6)。
絶対数 = (フローサイトメトリーで測定した生細胞由来の関心集団の割合 x 単一細胞懸濁液中の生細胞の総数)/100
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Representative Results
マウスに200匹のL3ステージ のN.ブラジリエンシス 幼虫、または偽対照用のPBSを皮下注射しました。このプロトコルで使用される幼虫の数は、リンパ組織および肺の細胞を検出するために高負荷のワームが使用された以前の報告とは異なり、肺、リンパ組織、および小腸から生細胞を分離するために調整されました4。肺、縦隔リンパ節、腸間膜リンパ節、および小腸は、リンパ球の単離とIL-9産生集団の特性評価のために、感染後0、4、7、および10日目に採取されました。分析された時点ごとに9匹の対照および4〜6匹の N.ブラジリエンシス感染マウスを含む、合計27匹のマウスを2つ以上の独立した実験に使用した。偽感染対照は、基礎数を得るためにすべての実験に含まれていました。このプロトコルを使用して、IL-9産生CD4+ T細胞(このモデルでは主にTh9細胞)を肺、腸間膜、縦隔リンパ節から単離して、定量化とさらなる分析を行うことができます。
自然な感染過程に続いて、最初に肺と縦隔リンパ節に存在するIL-9産生CD4+ Tリンパ球(Th9)の頻度を評価しました(図2Aおよび補足図3Aに示すゲーティング戦略)。両臓器において、Th9頻度は4日目から増加し、感染後7日目にピークに達し(図2C)、Th9絶対数でも観察された増加(補足図4A、B)。腸間膜リンパ節(図2Bに示すゲーティング戦略)では、以前の報告4に従って、感染後7日目と10日目にTh9細胞の頻度と絶対数の両方に有意な増加がありました(図2Cおよび補足図4C)。T細胞およびILC2の存在は、上皮内および固有層サンプルで確認されました。しかし、感染全体を通してこれらの腸コンパートメントにTh9細胞は観察されませんでした(補足図3B、C)。
次に、感染マウスのリンパ組織および非リンパ組織におけるIL-9発現ILC2細胞を評価しました(図3A、Bおよび補足図2に示すゲーティング戦略)。感染後7日目に、肺でILC2を発現するST2+ IL-9-およびST2+ IL-9+の頻度が有意に増加しました(図3C)。同時に、絶対数の分析により、感染後7日目のST2+ IL-9+集団でのみ統計的に有意な増加が明らかになりました(補足図5A)。縦隔リンパ節(補足図2Bに示すゲーティング戦略)では、IL-9発現ILC2細胞(ST2+ IL-9+)の数は感染後10日目に有意に増加し、ST2+細胞の絶対数は感染後7日目から感染後10日目まで増加する傾向を示しました(補足図6A、C)。
IL-9+ ILC2細胞は、小腸の固有層および上皮内区画にも見られました(図3Bおよび補足図2Aに示すゲーティング戦略)。N. brasiliensis感染は、固有層においてST2+ IL-9+細胞の頻度を4日目に、ST2- IL-9+集団の頻度を7日目および10日目に統計的に有意に増加させた。上皮内コンパートメントでは、感染後7日目と10日目にそれぞれST2+ IL9+およびST2-IL-9+細胞の頻度にも有意な変化が観察されました(図3C)。重要なことに、幼虫の負荷が比較的少ない場合でも、寄生虫の感染は小腸に広範な損傷を引き起こしました。したがって、IL-9発現ILC2の絶対数の解析は技術的に不可能であり、生細胞の収量が低いため、この集団の正確な定量が妨げられています(補足図5B、C)。一方、腸間膜リンパ節の解析(補足図2Cに示すゲーティング戦略)では、以前に報告されたように、感染後10日目にST2+ IL-9-、ST2+ IL-9+、およびST2- IL-9+ ILC2細胞の絶対数が有意に増加していることが明らかになりました(補足図6D)。一方、感染全体を通してこれらの集団の頻度に差は観察されなかった(補足図6B)。ST2およびIL-9発現細胞のこれらの多様なサブセットは、in vivoで潜在的に異なる役割を有する興味深い集団であり、最近記載されたように、天然のILC2と炎症性のILC2に対応する可能性がある18,19,20,21。ただし、これは将来の研究で対処する必要があります。
要約すると、このプロトコルを調整して、肺およびリンパ組織でそれらを検出しながら、N .ブラジリエンシス感染腸からのIL-9発現細胞を回収しました。寄生虫に感染した腸から免疫細胞を回収することは、技術的に困難であることが証明されています。ここでは、感染に使用される幼虫の数を調整すると、腸組織の完全性が改善され、IL-9+集団の回復が可能になりました。私たちの知る限り、これは 、ブラジリエンシス菌 感染中の腸内のIL-9発現細胞の分析のために特別に開発された最初のプロトコルです。それにもかかわらず、他の免疫細胞もこれらのステップに従って単離することができる。ここに提示されたデータは、小腸のほとんどの組織常在IL-9発現細胞がILC2であることを示しています。
図1:説明されているプロトコルのフローチャート。 得られた異なる器官および予想されるIL−9発現細胞サブセットを処理するために使用される主なステップを含む概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:Th9細胞は、ブラジリエンシス菌感染中の肺、縦隔、腸間膜リンパ節に見られます。 (A)肺および(B)腸間膜リンパ節からのTh9細胞同定に使用される代表的なフローサイトメトリー分析およびゲーティング戦略。各臓器からの単一細胞懸濁液を、固定可能な生存率色素、造血細胞の同定のための蛍光標識抗CD45、およびCD4+ Tリンパ球の同定のための抗T細胞受容体(TCR)βおよび抗CD4で染色しました。GFP +シグナルは、存在するTh9細胞の割合を示します。最初のゲートは、リンパ系の古典的な形態を持つ側方散乱(SSC)-A/前方散乱(FSC)-A特性を示しています。単一細胞イベントを選択し、続いて生細胞、次にCD45+細胞を選択しました。この集団の中で、TCR-βおよびCD4ダブルポジティブ細胞に焦点を当て、そこからGFP+細胞がTh9細胞として同定されました。リンパ節の染色には、集団全体が陽性であると予想されるため、抗CD45抗体は含まれていませんでした。(C)感染後の指示された時間に肺、縦隔、腸間膜リンパ節に見られるTh9細胞の頻度。データは、グループごとに分析された1匹または2匹のマウスの平均±SEMを表し、3つの独立した実験から、時点ごとに;対応のないT検定;*p≤ 0.05, **p≤ 0.001, ***p≤ 0.0001.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:IL-9産生ILC2細胞は非リンパ器官に見られる。 (A)肺および(B)小腸固有層からのIL-9+ ILC2細胞の同定に使用される代表的なフローサイトメトリー分析およびゲーティング戦略。各臓器からの単一細胞懸濁液にビオチン化抗体をマークして、系統細胞(抗B220、抗CD11b、抗FcεRI、抗TCR-β、抗TCR-γδ、抗シグレックF、抗CD4、抗CD11c、抗Gr-1、抗CD8、抗CD19、抗NK1.1、および抗Ter119)、およびFc-Blockを同定しました。次に、細胞懸濁液を、固定可能な生存率色素、蛍光色素標識ストレプトアビジン、造血細胞の同定のための抗CD45、およびILC2細胞の同定のための抗CD90で染色しました。最初のゲートは、リンパ系の細胞の古典的な形態を持つ散乱(SSC)-A/側方散乱(FSC)-A特性を示します。単一細胞イベントを選択し、続いて生細胞、次にCD45+細胞を選択しました。この集団の中で、CD90+リン細胞に焦点を当てました。このグループから、ST2およびGFP発現を評価して、IL-9+ ILC2細胞を同定しました。(C)感染後の指示された時点での肺、固有層、および上皮内細胞コンパートメントに見られるILC2細胞の頻度。データは、グループごとに分析された1匹または2匹のマウスの平均±SEMを表し、3つの独立した実験から、時点ごとに;対応のないT検定; *p ≤ 0.05. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:化学溶液とその組成のリスト。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:IL-9産生ILC2細胞を同定するための抗体カクテル。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:IL-9産生Tリンパ球を同定するための抗体カクテル。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図1:縦隔リンパ節位置の模式図。 で作成されました BioRender.com このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:小腸およびリンパ節から上皮内細胞内のIL-9+ ILC2を同定するために使用される代表的なフローサイトメトリーおよびゲーティング戦略。 (A)小腸内上皮細胞からの単一細胞懸濁液を、最初にビオチン標識抗体とともにインキュベートして、選択した系統細胞(抗B220、抗CD11b、抗FcεRI、抗TCR-β、抗TCR-γδ、抗シグレックF、抗CD4、抗CD11c、抗Gr-1、抗CD8、抗CD19、抗NK1.1、および抗Ter119)、およびFc-Block。これに続いて、固定可能な生存率色素、蛍光色素標識ストレプトアビジン、造血細胞の同定のための抗CD45、およびILC2細胞の同定のための抗CD90による染色を行った。最初のゲートは、リンパ系の古典的な形態を持つ側方散乱(SSC)-A/前方散乱(FSC)-A特性を示しています。単一細胞イベントを選択し、続いて生細胞、次にCD45+細胞を選択しました。この集団の中で、CD90+リン細胞に焦点を当てました。このグループから、GFP+細胞はIL-9+ ILC2細胞として同定された。(B,C)IL-9+ ILC2細胞を同定するための(B)縦隔リンパ節および(C)腸間膜リンパ節の代表的なフローサイトメトリーおよびゲーティング戦略。リンパ節の染色には、集団全体が陽性であると予想されたため、抗CD45抗体は含まれていませんでした。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:縦隔リンパ節および小腸のTh9細胞を同定するために使用される代表的なフローサイトメトリー分析およびゲーティング戦略。 (A)縦隔リンパ節からの単一細胞懸濁液を、固定可能な生存率色素および蛍光標識抗TCR−βおよび抗CD4抗体で染色した。最初のゲートは、リンパ系の古典的な形態を持つ側方散乱(SSC)-A/前方散乱(FSC)-A特性を示しています。シングルセルイベントを選択し、続いて生細胞を選択し、次にTCR-βおよびCD4ダブルポジティブ細胞を選択しました。このグループから、GFP+細胞はTh9細胞として同定された。同様のフローサイトメトリー戦略を小腸の固有層および(C)上皮内細胞に用いたが、生細胞の後にCD45+細胞を選択し、続いてTCR-βおよびCD4ダブルポジティブ細胞を選択し、そこからGFP+細胞をTh9細胞として同定した。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図4:Th9細胞の絶対数は感染を通じて有意に変化します。 TCR-βおよびCD4ダブルポジティブ細胞由来のIL-9+細胞の絶対数は、(A)肺、(B)縦隔リンパ節、および(C)腸間膜リンパ節における感染後0、4、7、および10日目に決定されました。データは、グループごとに分析された1匹または2匹のマウスの平均±SEMを表し、3つの独立した実験から、時点ごとに;対応のない T 検定 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.001, ***P ≤ 0.0001. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図5:IL-9+ ILC2細胞の絶対数は感染全体で異なります。 感染後0、4、7、および10日目のlin-CD90+集団からのIL-9+ ILC2細胞の絶対数は、(A)肺、(B)固有層、および(C)小腸の上皮内細胞で決定されました。データは、グループごとに分析された1匹または2匹のマウスの平均±SEMを表し、3つの独立した実験から、時点ごとに;対応のないT検定*p ≤ 0.05。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図6:リンパ節のIL-9+ ILC2細胞の頻度と絶対数は、感染中に有意に増加します。 (A)縦隔リンパ節由来のIL-9+ ILC2細胞の頻度および(C)絶対数。(B)腸間膜リンパ節由来のIL-9+ ILC2細胞の頻度および(D)絶対数。値は、感染後0、4、7、および10日目にlin-CD90+集団内のIL-9+ ILC2細胞として決定されました。データは、1群ごとに分析された1匹または2匹のマウスの平均±SEMを表し、3つの独立した実験から、時点ごとに;対応のないT検定*p ≤ 0.05、***p ≤ 0.0001。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図7:N.ブラジリエンシス感染腸からのILC2細胞を発現するIL-9のフローサイトメトリー分析。感染後7日目にIL-9-レポーターマウスの腸から単離されたILC2細胞の代表的なプロット。IL−9発現は、感染したレポーターマウスの上皮内または固有層区画から新たに単離されたILC2細胞(IL−9 REP)対、前述のIL−9細胞内染色プロトコル9(IL−9 AB、IL−9抗体クローンRM9A4、BioLegendを使用)に従って評価した。IL-9発現ILC2を同定するために、まず単一細胞懸濁液をビオチン標識抗体とともにインキュベートして、系統細胞(抗B220、抗CD11b、抗FcεRI、抗TCR-β、抗TCR-γδ、抗シグレックF、抗CD4、抗CD11c、抗Gr-1、抗CD8、抗CD19、抗NK1.1、および抗Ter119)およびFc-Blockを選択し、続いて柔軟な生存率色素、蛍光色素標識ストレプトアビジン、抗CD45および抗CD90で染色しました。プロットは、上皮内(A、B)および固有層(C、D)コンパートメントに存在するlin-CD45+CD90+集団上にゲートされたIL-9発現ILC2細胞を示し、新たに単離された細胞(A、C)からのレポーターシグナルを介して、またはIL-9の細胞内染色(B、D)後に検出されます。対照マウスにPBSを注射した。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
腸の寄生虫と宿主の相互作用と蠕虫感染に対する免疫応答を完全に理解するには、組織のリモデリングと線虫の排出の誘導に鍵となるさまざまな細胞集団とエフェクター分子の同定と分析が必要です。土壌伝染性蠕虫感染症は、世界中の発展途上国で大きな問題となっています。しかし、最近まで、この感染症の影響を受ける主な臓器である小腸に存在する希少細胞集団の分析を可能にするプロトコルは利用できませんでした5。このプロトコルは、 N. brasiliensis 感染中の肺、縦隔、および腸間膜リンパ節におけるIL-9発現リンパ系細胞のフローサイトメトリー分析を可能にする前述の方法をカバーしており、小腸で初めてこの集団を同定するという追加の利点があります。
このプロトコルの成功は、組織処理時間に大きく依存します。一人当たり最大6個の小腸サンプルを一度に処理することが不可欠です。異なる臓器を処理する場合は、他の人が並行して処理することをお勧めします。比較的低い寄生虫負荷(200匹のL3幼虫)を使用することにより、このプロトコルは、他の臓器からこれらの細胞を分離する能力を維持しながら、 N.brasiliensis感染腸からのリンパ系細胞の分離を可能にします。より高い寄生虫負荷の使用は、小腸から単離された細胞の質と量を危険にさらします(データは示されていません)。しかし、それは他の臓器におけるIL-9発現リンパ系細胞の有意な増加をもたらす可能性がある4。腸や腸間膜リンパ節を処理する場合、そうしないと細胞死が増加するため、付着した脂肪組織を取り除くことが重要です。データは、感染の自然な経過が小腸から回収されたリンパ系細胞の絶対数に悪影響を与えるという観察を裏付けています。ここで説明する研究では、IL-9 + ILC2細胞の頻度は一貫していますが、絶対数は各独立した実験で高い変動性を示しています。したがって、絶対数から導き出された結論は不正確である可能性があり、避ける必要があります。さらに、組織中のIL-9発現T細胞の頻度が低いことを考えると、可能な限り多くの細胞の取得と染色が推奨されます。
このILC2分析の制限は、この母集団を定義するためにマーカーの離散的な組み合わせを使用することです。関心のある組織および感染の段階に応じて、とりわけCD25、Klrg1、およびST2などの追加のマーカーを、ILC2細胞のより詳細な表現型の特徴付けに使用することができる22。ここで提示されたプロトコルは、INFERレポーターマウス系統4に基づいており、IL-9発現細胞の同定に有利である可能性があることを認めます。しかし、ここで見つかった結果は、他のマウスレポーター株の使用や細胞内IL-9染色6,7,8,9などの代替戦略を使用して得られると期待しています。従来のマウスを使用し、上皮内および固有層細胞でIL-9の細胞内染色を行うと、検出可能なシグナルが失われ、得られたデータが損なわれる可能性があることに言及することが重要です(補足図7)。これは、ex vivoで分離および維持することがすでに困難なサブセットを染色するために必要な長期的な操作が原因である可能性があります。したがって、処理時間を短縮し、in vivoでのIL-9発現の信頼性の高い分析を確実にするために、レポーターマウス系統の使用をお勧めします。また、Th9細胞がIL-923を発現する唯一のT細胞ではないという事実も認めています。ただし、この寄生モデルでは、他のサブセットがそれを表現することは期待できません。それにもかかわらず、記載された文脈における他のIL−9発現サブセットの存在を破棄するために、転写マーカーの使用と共に2型サイトカインの完全な特徴付けが実行可能である。
感染後5日目までのIL-9発現リンパ系細胞の定量は以前に報告されています。ただし、セル周波数が非常に低くなります4。この研究のプロトコルは、寄生虫クリアランスの開始までの N.ブラジリエンシス 感染動態の大部分をカバーしています2。しかし、この研究の細胞集団の一部は、分析された時間枠内に基礎レベルに戻らなかったことに気づき、in vivoでの感染のより進行した段階でこれらの細胞の挙動を完全に把握するために、この研究が延長された時点の恩恵を受けることができることを示唆しています。いずれにしても、ここで紹介した研究は、寄生虫感染モデルにおけるIL-9発現リンパ系細胞の研究に関心のある研究者にとって、目的の組織から特定の細胞型を検出するための理想的な感染段階を選択できるようにするリファレンスガイドとして役立つと考えています。全体として、ここで説明する方法は、寄生虫感染の生理学的に関連するモデル中にIL-9を発現するTリンパ球およびILC2細胞の表現型と機能を評価するのに役立ち、これらの細胞に関する知識を広げ、他の病理学的状態におけるそれらの理解を向上させる可能性があります。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者は、ホセ・ルイス・ラモス・バルデラスの技術サポートに感謝したいと思います。この研究は、CONACYTからPLLへの以下の助成金(FORDECYT-PRONACE-303027)によってサポートされました。OM-PとEO-MはCONACYTからフェローシップを受けました(それぞれ736162と481437)。MCM-MはCONACYTからフェローシップを受けました(Estancias Posdoctorales por México 2022 (3))。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK buffer | Homemade | ||
| Attune Nxt cytometer | Thermofisher | ||
| B220 | Biolegend | 103204 | |
| CD11b | Biolegend | 101204 | |
| CD11c | Biolegend | 117304 | |
| CD19 | Biolegend | 115504 | |
| CD4 | Biolegend | 100404 | |
| CD4 (BV421) | Biolegend | 100443 | |
| CD45.2 | Biolegend | 109846 | |
| CD8 | Biolegend | 100703 | |
| CD90.2 | Biolegend | 105314 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNAse I | Invitrogen | 18068015 | Specific activity: ≥10 000 units/mg |
| Facs ARIA II sorter | BD Biosciences | ||
| FACS Melody cell sorter | BD Biosciences | ||
| Fc-Block | Biolegend | 101320 | |
| FcεRI | eBioscience | 13589885 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| FlowJo | FlowJo | Flow cytometry analysis data software | |
| Gr-1 | Tonbo | 305931 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Homemade | ||
| IL-9 | biolegend | 514103 | |
| NK1.1 | Biolegend | 108704 | |
| Nylon mesh | lba | B07HYHHX5V | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Phosphate-buffered saline | Homemade | ||
| RPMI | Gibco | 11875093 | |
| Siglec F | Biolegend | 155512 | |
| Streptavidin | Biolegend | 405206 | |
| TCR-β | Biolegend | 109203 | |
| TCR-β (PE/Cy7) | Biolegend | 109222 | |
| TCR-γδ | Biolegend | 118103 | |
| Ter119 | Biolegend | 116204 | |
| Tricine buffer | Homemade | ||
| Zombie Aqua Fixable Viability Dye | Biolegend | 423101 |
References
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