Summary
IL-9 발현 T 및 ILC2 세포는 N. brasiliensis 감염 동안 유도되지만, 이들의 특성화는 낮은 빈도 및 차등 동역학으로 인해 감염된 장에서 크게 간과되었습니다. 이 프로토콜은 서로 다른 표적 기관에서 이러한 세포를 분리하고 서로 다른 감염 단계에서 유세포 분석을 통해 신원을 확인하는 방법을 설명합니다.
Abstract
IL-9는 항 종양 면역, 알레르기 병리의 유도 및 기생충 감염에 대한 면역 반응을 포함한 다양한 과정과 관련된 다면발현 사이토 카인으로 기생충 퇴학에 중요한 역할을합니다. Nippostrongylus brasiliensis 감염의 쥐 모델에서 IL-9는 주로 폐, 소장 및 배액 림프절에서 발견되는 CD4+ T 림프구 및 선천성 림프 세포에 의해 생성됩니다. IL-9의 세포내 염색과 관련된 기술적 어려움과 감염 시 소장에서 조혈 세포를 분리하는 복잡성을 감안할 때, 이 모델의 다양한 림프 및 비림프 조직에서 IL-9의 발현을 분석하기 위한 포괄적이지만 간단한 프로토콜이 절실히 필요합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 감염 전반에 걸쳐 종격동 및 장간막 림프절뿐만 아니라 N. brasiliensis가 표적으로 하는 주요 기관인 폐 및 소장에서 CD4+ T 세포와 선천성 림프 세포에 의해 생성되는 IL-9의 동역학을 설명합니다. 또한 관심 있는 세포 유형과 기관에 따라 감염에 필요한 유충의 수를 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 N. brasiliensis 감염 모델에서 관심 있는 특정 세포, 기관 및 질병 단계에 집중할 수 있는 기회를 제공함으로써 시간과 자원을 절약하기 위한 분석의 표준화를 지원하는 것을 목표로 합니다.
Introduction
십이지장충은 전 세계적으로 약 7억 명의 사람들을 감염시키는 장내 기생충으로, 주로 저개발국의 열대 지역에서 발생합니다. 인간에게 가장 흔한 십이지장충 기생충인 십이지장 충 및 Necator americanus에 의한 고강도 감염은 빈혈과 단백질 결핍을 유발하여 성장과 정신 발달을 지연시킬 수 있습니다1. N. americanus 와 설치류 기생충 Nippostrongylus brasiliensis 는 숙주에서 원형의 제2형 면역 반응을 유도하고 수명 주기에서 유사성을 공유합니다. 따라서 N. brasiliensis 에 의한 생쥐의 감염은 인간 십이지장충 감염에 가장 일반적으로 사용되는 모델입니다. 3 단계 (L3) N. brasiliensis 감염성 유충은 감염 후 처음 몇 시간 동안 피부에서 폐로 이동합니다. 일단 폐에 들어가면 L4가 되어 기관을 따라 이동하여 삼키고 위를 통과하여 장에 도달하여 4-5일 이내에 성인(L5)이 됩니다. 장에서 L5 벌레는 기생충 수명 주기2를 다시 시작하기 위해 대변으로 배설되는 알을 낳습니다.
N. brasiliensis에 의해 유도된 면역 반응은 호산구 증가증, 호염구증, 잔 및 비만 세포 증식증과 함께 IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 및 IL-13을 포함한 여러 제2형 사이토카인의 증가, IgG1 및 IgE 생산 증가를 특징으로 합니다. N. brasiliensis 감염에 대한 면역 반응을 확인하고 정의하려는 대부분의 연구는 이 모델3에서 IL-4 또는 IL-13의 역할에 중점을 두고 있습니다. 그러나 IL-9 발현 세포의 식별 및 특성화와 이 사이토카인의 기능은 Licona-Limón et al. N. brasiliensis에 대한 면역 반응에서 IL-9의 중요한 역할을 입증하는 첫 번째 연구를 발표했습니다. 이 연구는 리포터 마우스를 사용하여 T 세포(대부분 T 헬퍼 9)와 제2형 선천성 림프 세포(ILC2s)를 감염 시 IL-9를 발현하는 주요 세포 하위 집합으로 설명했습니다4.
기생충에 감염된 폐에서 면역 세포의 분리 및 특성화가 가능하며 광범위하게 보고되었습니다 3,4. 그러나 내재된 조직 리모델링 및 점액 생성으로 인해 감염된 장에서 그렇게 하는 것은 Ferrer-Font et al.5의 최근 발표까지 기술적인 도전으로 판명되었습니다. 이 그룹은 Heligmosomoides polygyrus에 감염된 쥐 내장에서 면역 하위 집합의 단일 세포 현탁액을 분리하고 분석하는 프로토콜을 설명했습니다. 이를 기반으로 우리는 이제 N. brasiliensis에 감염된 장에서 IL-9 발현 림프 세포의 분리 및 세포 분석을 위한 프로토콜을 표준화했습니다. 또한, 우리는 감염 전반에 걸쳐 다양한 세포 소스와 해부학적 위치에서 IL-9 동역학을 확립했습니다.
이 감염과 관련된 뚜렷한 세포 집단을 특성화하는 것은 기생충에 대한 면역 반응과 숙주와의 상호 작용에 대한 더 넓은 이해에 매우 중요합니다. 이 포괄적인 프로토콜은 관심 질병 단계에서 원하는 기관에서 IL-9 생성 세포를 분리하고 분석하는 명확한 경로를 제공하여 N. brasiliensis 감염 및 일반적으로 기생충 감염에서 이러한 세포의 역할에 대한 지식을 급격히 향상시킬 수 있습니다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 동물 실험은 멕시코 국립 자치 대학교 세포 생리학 연구소의 내부 동물 취급위원회 (CICUAL)의 승인을 받았습니다.
참고: 전체 프로토콜의 순서도는 그림 1에 나와 있습니다.
1. 생쥐의 주거
- 8-10주령의 암컷 또는 수컷 생쥐를 12시간 명암 주기로 일정한 온도와 습도를 가진 동물 시설에 수용하고 물과 음식에 임의 로 접근할 수 있습니다.
참고: 이 프로토콜은 이전에 설명한 대로 C57BL/6 배경에서 IL-9 리포터 마우스 균주를 사용합니다4; 그러나, 다른 IL-9 리포터 균주(reporter strain 6,7,8)와 세포내 IL-9 염색(intracellular IL-9 staining)을 사용할 수 있으며, 다양한 결과가 나온다9.
2. 생쥐 감염
- 감염 1 일 전에 몸의 중앙에서 꼬리 기저부 근처까지 생쥐의 등을 면도하십시오. 마취제의 사용은 필수적이지 않습니다.
- 앞서설명한 바와 같이 허리에 100μL의 인산염 완충 식염수(PBS)10에 200마리의 생존 가능한 3기 N. brasiliensis 유충(L3)을 각 마우스에 피하 접종하거나, 대조군으로 PBS 단독으로 100μL를 주사합니다. 감염 후 4일째, 7일째 또는 10일째에 동물을 희생합니다.
3. 폐, 소장, 종격동 및 장간막 림프절의 분리
- 자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시킵니다. 마우스를 등에 대고 70% 에탄올을 뿌립니다. 가위로 정중선을 절개하고 피부를 열어 복부와 흉부 부위를 노출시킵니다.
참고: 이소플루란은 대체 안락사 방법으로 사용할 수 있습니다12. 이산화탄소 챔버는CO2 가 폐 조직 손상과 출혈을 유발하므로 권장하지 않는다13. - 종격동 림프절과 폐의 분리
- 흉골을 절개하고 "V"자 모양으로 잘라 갈비뼈와 흉부 근육을 제거합니다. 흉강이 노출되면 심장 아래 식도 옆에 있는 종격동 림프절을 찾습니다( 보충 그림 1 참조).
- 종격동 림프절을 추출하여 12웰 배양 플레이트의 R-10 배지(표 1) 1mL에 수집합니다. 처리 될 때까지 빛으로부터 보호 된 얼음 위에 보관하십시오.
참고: 샘플은 이 실험에 사용된 리포터 마우스의 형광 신호가 감소하지 않도록 빛으로부터 보호되어야 합니다. - 폐를 추출하고 마우스당 12웰 배양 플레이트의 R-10 배지 1mL에 수집합니다. 처리 될 때까지 빛으로부터 보호 된 얼음 위에 보관하십시오.
- 장간막 림프절 사슬과 소장의 분리
- 복강을 노출시키고 소장을 오른쪽으로 조심스럽게 움직여 결장을 따라 장간막 림프절(MLN) 사슬을 노출시킵니다.
- 집게를 사용하여 MLN을 제거하고 종이 타월로 부드럽게 굴려서 지방을 빼냅니다.
- MLN을 12-웰 배양 플레이트에서 1mL의 R-10 배지로 옮깁니다. 처리 될 때까지 빛으로부터 보호 된 얼음 위에 보관하십시오.
- 유문 괄약근 바로 아래와 맹장 위의 소장을 자릅니다. 집게를 사용하여 장을 천천히 당겨 부착 된 장간막과 지방 조직을 제거하십시오.
- 소장을 종이 타월에 놓고 PBS로 충분히 적시십시오. 가위로 소장에서 Peyer의 패치를 제거하십시오.
알림: 생존력을 유지하려면 남은 지방 조직을 제거하고 전체 과정에서 PBS로 소장을 촉촉하게 유지하십시오. - 가위를 사용하여 소장을 세로로 자르고 집게를 열린 장 위로 부드럽게 밀어 배설물과 점액을 제거합니다.
- 겸자로 소장을 잡고 얼음 위에 PBS 5mL로 몇 번 조심스럽게 담그고 씻습니다. 두 번 반복하십시오.
- 소장을 짧은 조각(약 5mm)으로 자르고 2% FBS가 포함된 10mL의 HBSS14 가 있는 50mL 원뿔형 튜브에 수집합니다(표 1). 즉시 상피내 및 고유판 세포를 계속 분리하십시오.
4. 소장, 폐 및 림프절에서 단세포 현탁액의 제조
참고: 소장에서 단세포 현탁액을 준비할 때 1인당 최대 6마리의 마우스를 처리하는 것이 매우 중요한데, 이는 처리 기간이 길어질수록 세포 생존력이 크게 감소하기 때문입니다. 이 방법은 Heligmosomoides polygyrus 감염 마우스 모델5에서 채택되었습니다.
- 진탕 배양기, R-20 배지, HBSS, 및 HBSS-2 mM EDTA(표 1)를 37°C에서 예열하였다.
- 시료당 10mL의 소장 소화 배지(표 1)를 준비합니다.
- 3.3.8 단계의 내장 조각을 손으로 세게 흔듭니다.
- 유리 깔때기 위의 나일론 메쉬(약 10cm x 10cm)를 통해 각 샘플을 여과합니다. 메쉬 위에 예열된 HBSS 10mL를 추가하여 샘플을 세척하고 플로우 스루를 버립니다. 한 번 더 반복하십시오.
알림: 각 샘플에 새 메쉬를 사용하고 절차 전반에 걸쳐 재사용하십시오. - 깔때기에서 메쉬를 제거하고 50mL의 따뜻한 HBSS-10mM EDTA가 있는 2mL 원뿔형 튜브의 메쉬에서 샘플을 수집합니다(4.1단계). 37°C에서 10분 동안 인큐베이션하고 200rpm으로 진탕합니다.
- 최대 속도(3,200rpm)로 10초 동안 소용돌이치고 유리 깔때기 위에 메쉬로 샘플을 여과하여 50mL 원뿔형 튜브에서 유동을 회수합니다.
- 4.5단계와 4.6단계를 두 번 반복하여 동일한 50mL 원뿔형 튜브에서 플로우 스루를 회수합니다. 상피내 세포는 이 30mL 분획에 있습니다. 나머지 조직을 저장하십시오.
- 상피내 세포로부터의 단세포 현탁액 제제
- 4.7단계에서 회수한 30mL의 세포 현탁액을 실온(RT)에서 5분 동안 450 x g 에서 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오.
- 5mL의 PBS를 첨가하고 RT에서 5분 동안 450 x g 에서 원심분리합니다.
- 세포 펠릿을 RPMI 10% FBS-20μg/mL DNase 3mL에 재현탁합니다(표 1). 세포가 염색 될 때까지 빛으로부터 보호 된 얼음 위에 보관하십시오.
- 고유판 세포로부터의 단일 세포 현탁액 제조
- 깔때기 위의 메쉬를 통해 따뜻한 HBSS 10mL 이상을 부어 4.7단계에서 남은 소장 조직을 세척합니다. 세탁을 반복하십시오. 10mL의 소장 소화 배지가 있는 50mL 원뿔형 튜브의 메쉬에서 조직을 수집합니다.
- 37°C에서 30분 동안 인큐베이션하고 200rpm으로 진탕합니다. 5분마다 최대 속도로 10초 동안 소용돌이칩니다.
- 10mL의 FACS-EDTA 완충액(표 1)을 첨가하여 소화 반응을 중지하고 얼음 위에 올려 놓는다.
- 혈청학적 피펫을 사용하여 100μm 세포 여과기를 통해 각 샘플을 여과하고 얼음 위에 놓인 50mL 원뿔형 튜브에서 현탁액을 회수합니다.
- 4 °C에서 600 x g 로 6분 동안 원심분리합니다.
- 상청액을 버리십시오. 세포 펠릿을 5 mL의 PBS로 세척하고, 4°C에서 6분 동안 600 x g 에서 원심분리하였다.
- 상층액을 버리고 세포 펠릿을 RPMI 10% FBS-20μg/mL DNase 1mL에 재현탁합니다. 세포가 염색 될 때까지 빛으로부터 보호 된 얼음 위에 보관하십시오.
- 폐에서 단일 세포 현탁액 준비
참고: 각 폐와 소장은 세포 생존율이 낮은 취급 시간이 연장되는 것을 방지하기 위해 두 사람이 병렬로 처리해야 합니다.- 처리된 샘플당 4mL의 폐 소화 배지(표 1)를 준비합니다.
- 단계 3.2.3에서 폐를 함유하는 웰로부터 RPMI 배지를 제거한다. 가는 가위로 폐를 작은 조각으로 자릅니다.
- 주걱을 사용하여 폐 조각을 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 4mL의 폐 소화 배지를 추가합니다(표 1).
- 37°C에서 30분 동안 인큐베이션하고 250rpm에서 진탕합니다. 완료되면 각 샘플이 처리될 때까지 얼음에 보관하십시오.
- 6웰 배양 플레이트의 단일 웰에 위치한 100μm 세포 여과기를 통해 각 샘플을 여과합니다. 주사기 플런저로 조직을 분리하십시오.
- 각 샘플을 15mL 원뿔형 튜브에서 회수하고 4mL의 R-2 배지를 추가합니다(표 1). 다른 샘플이 처리되는 동안 얼음 위에 보관하십시오.
- 4 °C에서 5분 동안 600 x g 로 원심분리합니다. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 1mL의 R-5 배지에 재현탁합니다(표 1).
- 원심분리하는 동안, 조혈 세포 분획15,16을 농축하기 위해 시료 당 4 mL의 27.5% 밀도-구배 용액(표 1)을 준비한다. 단세포 분리를 위한 이러한 전략은 다른 유사한 밀도 구배 배지에 비해 더 효율적이고 비용 효율적이며 독성이 적다(17).
- 4.10.7 단계의 세포 현탁액 1 mL에 27.5 % 밀도 구배 용액 4 mL를 넣고 세게 흔든다.
- 혼합 현탁액 위에 R-5 배지 (표 1)를 천천히 추가하여 두 개의 상을 만듭니다.
- RT에서 1,500 x g 에서 20분 동안 원심분리기를 사용하고 가속을 낮추고 브레이크를 끕니다. 두 위상 사이에 형성된 고리를 관찰하십시오.
- 1mL 마이크로피펫으로 두 상 사이에 형성된 링을 회수하고 4mL의 R-2 배지에 재현탁합니다.
- 4 °C에서 5분 동안 450 x g 로 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오. 세포 펠릿을 1mL의 ACK 완충액에 재현탁하고(표 1), RT에서 1분 동안 인큐베이션합니다.
- 4 mL의 R-5 배지를 첨가하고 4 °C에서 5 분 동안 450 x g 에서 원심 분리합니다. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 1mL의 R-10 배지에 재현탁합니다. 유세포 분석을 위해 염색될 때까지 빛으로부터 보호되는 얼음 위에 보관하십시오.
- 림프절에서 단일 세포 현탁액 준비
- 3.2.2 또는 3.3.3 단계의 림프절을 6-웰 배양 플레이트의 웰에 있는 두 개의 메쉬 조각 사이에 놓고 주사기 플런저로 해리합니다.
- 세포 현탁액을 1.5 mL 원뿔형 튜브에서 회수하고, 4°C에서 5분 동안 450 x g 에서 원심분리하였다.
- 상층액을 버리고 세포 펠릿을 R-10 배지 1mL에 재현탁합니다. 유세포 분석을 위해 염색될 때까지 빛으로부터 보호되는 얼음 위에 보관하십시오.
알림: 덩어리가 보이면 s를 걸러냅니다.amp100μm 셀 스트레이너를 통해 s.
5. 유세포 분석을 위한 세포 염색(그림 2 및 그림 3)
참고: 4°C에서 5분 동안 450 x g 에서 단계 4.11.3의 림프절 세포 현탁액을 원심분리하고, 세포 펠릿을 500 μL의 FACS 완충액에 재현탁시킨다(표 1).
- ILC2s 식별을 위한 세포 염색(그림 3 및 보충 그림 2)
참고: 이 염색 절차는 IL-9 발현 ILC2 세포의 식별에 특이적입니다.- 플레이트 4.10.14 단계로부터의 폐 샘플 당 150 μL (대략 1.8 x 10 6 세포) 및 단계 4.11.3으로부터의 림프절 샘플 당 50 μL (종격동 및 장간막 림프절 샘플에 대해 각각 대략 0.7 x 10 6 및 2.2 x 106 세포) 96 웰 원뿔형 바닥 배양 플레이트에서. 100 μL의 FACS 완충액을 첨가하고, 4°C에서 5분 동안 450 x g에서 원심분리한다.
- 96웰 원뿔형 바닥 배양 플레이트에서 4.8.3 및 4.9.7 단계로부터의 소장 샘플(상피내 및 고유판 샘플의 경우 각각 약 2.7 x 10 6 및0.6 x 106 세포)당 100 μL를 플레이트에 넣는다. 150 μL의 FACS 완충액을 첨가하고 4°C에서 5분 동안 450 x g 에서 원심분리합니다.
- 상청액을 버리고, FACS 완충액에 희석된 비오티닐화 항체 칵테일(표 2)의 50 μL에 각각의 세포 펠렛을 재현탁시켰다. 빛으로부터 보호되는 4°C에서 30분 동안 배양한다.
참고: 상피내 및 고유판에 대해 20μg/mL DNase와 함께 FACS 버퍼를 사용하십시오.amp르. - 150 μL의 FACS 버퍼를 추가합니다. 4 °C에서 5분 동안 450 x g 로 원심분리합니다.
- 상청액을 버리고, 세포 펠릿을 200 μL의 FACS 완충액에 재현탁시킨다. 다시 원심분리하고 상층액을 버립니다.
- 세포 펠릿을 항체/염색 칵테일 50μL에 재현탁하고(표 2), 빛으로부터 보호되는 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 150 μL의 FACS 버퍼를 추가합니다. 4 °C에서 5분 동안 450 x g 로 원심분리합니다.
- 상청액을 버리고, 세포 펠릿을 200 μL의 FACS 완충액에 재현탁시킨다. 다시 원심분리하고 상층액을 버립니다. 세척 (5.1.7 단계)을 반복하고 상청액을 버립니다.
- 300 μL의 FACS 완충액에 세포 펠릿을 재현탁하고, 유세포 분석에 의해 분석한다.
- 소장 및 폐 샘플의 경우 림프구, 단일 세포, 살아있는 세포, 조혈 세포, CD90+계통 세포, ST2+ 세포 및 IL-9+ 세포와 같은 게이팅 전략을 사용합니다(그림 3A, B 및 보충 그림 2A). 림프절 샘플의 경우 살아있는 세포, 단일 세포, CD90+ 계통 세포, ST2+ 세포 및 IL-9+ 세포와 같은 게이팅 전략을 사용합니다(보충 그림 2B, C).
- IL-9 생성 림프구의 동정을 위한 세포 염색(그림 2 및 보충 그림 3)
- 폐 샘플당 800μL를 4.10.14단계에서 1.5mL 튜브(약 14.6 x 106 세포)로 옮깁니다. 4 °C에서 5분 동안 450 x g 로 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오.
- 림프절 샘플의 경우, 400 μL의 세포 현탁액을 단계 4.11.3 (종격동 및 장간막 림프절 샘플에 대해 각각 대략 5.6 x 106 및 17.5 x 10 6 세포)을 96-웰 원뿔형 바닥 플레이트에 2단계로 플레이트한다.
- 먼저 200 μL를 옮기고, 4°C에서 5분 동안 450 x g 에서 원심분리하고, 상청액을 버린다.
- 또 다른 200 μL를 해당 웰로 옮깁니다. 4°C에서 5분 동안 450 x g 로 원심분리하고, 상청액을 버린다.
- 세포 펠릿을 항체/염색 칵테일 50-400μL에 재현탁하고(표 3), 빛으로부터 보호된 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
참고: 폐 샘플은 400μL, 종격동 림프절 샘플은 50μL, 장간막 림프절 샘플은 염색 칵테일 100μL에 재현탁해야 합니다. - 150 μL의 FACS 완충액을 종격동 림프절 샘플에 추가하고 100 μL의 장간막 림프절 샘플을 추가합니다. 4°C에서 5분 동안 450 x g 로 원심분리하고, 상청액을 버린다.
- 펠릿을 각각 1 mL 및 200 μL의 FACS 완충액에 재현탁하여 폐 및 림프절 샘플을 세척한다. 4 °C에서 5분 동안 450 xg 로 원심분리합니다. 상청액을 버리고 세척을 반복하십시오.
- 폐 샘플을 600μL의 FACS 완충액에 재현탁하고 유세포 분석으로 분석합니다. 림프구, 단세포, 살아있는 세포, 조혈 세포, CD4+TCRβ+ 세포 및 IL-9+ 세포와 같은 게이팅 전략을 사용합니다(그림 2A).
- 림프절 샘플을 300μL의 FACS 완충액에 재현탁하고 유세포 분석으로 분석합니다. 림프구, 단일 세포, 살아있는 세포, CD4+ TCRβ+ 세포 및 IL-9+ 세포와 같은 게이팅 전략을 사용합니다(그림 2B 및 보충 그림 3A).
6. 단세포 현탁액에서 세포의 절대 수 측정
- 4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 및 4.11.3 분리 단계의 샘플을 PBS로 1:20 비율로 희석합니다(샘플 10μL + PBS 190μL).
- 6.1단계에서 희석된 각 샘플 10μL를 트리판 블루 10μL와 혼합합니다. 혈구계에 10 μL를 넣고 각 희석을 고려하여 살아있는 세포를 계수합니다.
- 유세포 분석에 의해 결정된 살아있는 세포(생존율 염료 음성 세포)로부터 관심 대상 집단의 백분율에 분리 후 단세포 현탁액의 총 살아있는 세포 수를 곱하고, 이 수를 100으로 나누어 세포의 절대 개수를 구한다(보충도 4, 보충도 5 및 보충도 6).
절대 수 = (유세포 분석에 의해 결정된 살아있는 세포에서 관심 모집단의 백분율 x 단일 세포 현탁액의 총 살아있는 세포 수)/100
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Representative Results
마우스에 200 L3 단계 N. brasiliensis 유충 또는 가짜 대조군을 위한 PBS를 피하 주사했습니다. 이 프로토콜에 사용된 유충의 수는 림프 조직과 폐의 세포를 검출하는 데 더 많은 양의 벌레가 사용된 이전 보고서와 달리 폐, 림프 조직 및 소장에서 생존 가능한 세포를 분리하기 위해 조정되었습니다. 폐, 종격동 림프절, 장간막 림프절 및 소장을 감염 후 0, 4, 7 및 10일에 채취하여 림프구 분리 및 IL-9 생산 집단의 특성화를 수행했습니다. 총 27마리의 마우스를 분석된 시점 당 9개의 대조군 및 4 내지 6개의 N. 브라질리엔시스-감염된 마우스를 포함하는 2개 이상의 독립적인 실험에 사용하였다. 가짜 감염 대조군은 기저 수를 얻기 위해 모든 실험에 포함되었습니다. 이 프로토콜을 사용하여 IL-9 생성 CD4+ T 세포(이 모델의 대부분 Th9 세포)를 정량화 및 추가 분석을 위해 폐, 장간막 및 종격동 림프절에서 분리할 수 있습니다.
자연적인 감염 과정에 따라 먼저 폐와 종격동 림프절에 존재하는 IL-9 생성 CD4+ T 림프구(Th9)의 빈도를 평가했습니다(게이팅 전략은 그림 2A 및 보충 그림 3A에 표시됨). 두 기관 모두에서 Th9 빈도는 4일째부터 증가하여 감염 후 7일째에 정점에 도달했으며(그림 2C), Th9 절대수에서도 관찰된 증가입니다(보충 그림 4A,B). 장간막 림프절(게이팅 전략)에서 감염 후 7일과 10일에 Th9 세포의 빈도와 절대 수가 크게 증가했습니다(그림 2C 및 보충 그림 4C), 이전 보고서4에 따라. T 세포 및 ILC2s의 존재는 상피내 및 고유판 샘플에서 확인되었습니다. 그러나 감염 기간 동안 이러한 장 구획에서 Th9 세포가 관찰되지 않았습니다(보충 그림 3B, C).
그런 다음 감염된 마우스의 림프 및 비림프 조직에서 IL-9 발현 ILC2 세포를 평가했습니다(게이팅 전략은 그림 3A, B 및 보충 그림 2에 표시됨). 감염 후 7일째에 폐에서 ILC2s를 발현하는 ST2+ IL-9- 및 ST2+ IL-9+의 빈도가 크게 증가하는 것을 관찰했습니다(그림 3C). 동시에, 절대 수치를 분석한 결과, 감염 후 7일째에 ST2+ IL-9+ 개체군에서만 통계적으로 유의미한 증가가 나타났습니다(보충 그림 5A). 종격동 림프절( 보충 그림 2B에 나타난 게이팅 전략)에서 IL-9 발현 ILC2 세포(ST2+ IL-9+)의 수는 감염 후 10일째에 유의하게 증가한 반면, ST2+ 세포의 절대 수는 감염 후 7일째부터 시작하여 감염 후 10일째까지 증가하는 경향을 보였습니다(보충 그림 6A, C).
IL-9+ ILC2 세포는 또한 소장의 고유판 및 상피내 구획에서 발견되었습니다(게이팅 전략은 그림 3B 및 보충 그림 2A에 표시됨). N. brasiliensis 감염은 고유판에서 4일째에 ST2+ IL-9+ 세포의 빈도를 통계적으로 유의하게 증가시켰고, 고유판에서 7일째 및 10일째에 ST2-IL-9+ 개체군을 초래했습니다. 상피내 구획에서, 감염 후 각각 7일째 및 10일째에 ST2+ IL9+ 및 ST2-IL-9+ 세포의 빈도에서도 유의한 변화가 관찰되었다(도 3C). 중요한 것은 상대적으로 적은 수의 유충 부하에도 불구하고 기생충 감염은 소장에 광범위한 손상을 일으켰다는 것입니다. 따라서 IL-9 발현 ILC2s 절대 수의 분석은 기술적으로 불가능하며 살아있는 세포의 낮은 수율로 인해 이 집단의 정확한 정량화를 방해합니다(보충 그림 5B, C). 한편, 장간막 림프절의 분석(보충 그림 2C에 표시된 게이팅 전략)은 감염 후 10일째에 ST2+ IL-9-, ST2+ IL-9+ 및 ST2-IL-9+ ILC2 세포의 절대 수가 유의하게 증가한 것으로 나타났으며(보충 그림 6D), 이전에 보고된 바와 같이 4. 한편, 감염 전반에 걸쳐 이들 집단의 빈도에는 차이가 관찰되지 않았습니다(보충 그림 6B). ST2 및 IL-9 발현 세포의 이러한 다양한 하위 집합은 생체 내에서 잠재적으로 차별적인 역할을 하는 흥미로운 집단이며, 최근에 기술된 바와 같이 자연 ILC2 대 염증성 ILC2에 해당할 수 있다 18,19,20,21. 그러나 이것은 향후 연구에서 다루어져야 합니다.
요약하면, 우리는 N. brasiliensis에 감염된 장에서 IL-9 발현 세포의 회수를 위해 이 프로토콜을 조정하면서 폐 및 림프 조직에서 여전히 검출할 수 있었습니다. 기생충에 감염된 내장에서 면역 세포를 회수하는 것은 기술적으로 어려운 것으로 입증되었습니다. 여기에서 감염에 사용된 유충의 수를 조정하면 장 조직 무결성이 개선되어 IL-9+ 개체군이 회복될 수 있었습니다. 우리가 아는 한, 이것은 N. brasiliensis 감염 동안 장에서 IL-9 발현 세포를 분석하기 위해 특별히 개발된 최초의 프로토콜입니다. 그럼에도 불구하고 다른 면역 세포도 이러한 단계에 따라 분리될 수 있습니다. 여기에 제시된 데이터는 소장에 상주하는 대부분의 조직 상주 IL-9 발현 세포가 ILC2임을 보여줍니다.
그림 1: 설명된 프로토콜의 흐름도. 다른 기관을 처리하는 데 사용되는 주요 단계와 얻은 예상 IL-9 발현 세포 하위 집합이 포함된 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Th9 세포는 N. brasiliensis 감염 전반에 걸쳐 폐, 종격동 및 장간막 림프절에서 발견됩니다. (A) 폐 및 (B) 장간막 림프절에서 Th9 세포 식별에 사용되는 대표적인 유세포 분석 및 게이팅 전략. 각 장기의 단일 세포 현탁액을 고정 가능한 생존 염료, 조혈 세포 식별을 위한 형광 표지 항-CD45, CD4+ T 림프구 식별을 위한 항-T 세포 수용체(TCR) β 및 항-CD4로 염색했습니다. GFP+ 신호는 존재하는 Th9 세포의 백분율을 나타냅니다. 첫 번째 게이트는 림프 세포의 고전적인 형태와 함께 측면 산란(SSC)-A/전방 산란(FSC)-A 특성을 보여줍니다. 단일 세포 이벤트를 선택한 다음 살아있는 세포와 CD45+ 세포를 선택했습니다. 이 집단 내에서 우리는 TCR-β 및 CD4 이중 양성 세포에 초점을 맞추었고, 이로부터 GFP+ 세포가 Th9 세포로 확인되었습니다. 림프절의 염색은 항-CD45 항체를 포함하지 않았는데, 이는 전체 집단이 양성일 것으로 예상되기 때문이다. (C) 감염 후 표시된 시간에 폐, 종격동 및 장간막 림프절에서 발견되는 Th9 세포의 빈도. 데이터는 3개의 독립적인 실험으로부터 그룹당 분석된 1개 또는 2개의 마우스의 평균 ± SEM을 시점별로 나타내고; 짝을 이루지 않은 T-검정; *p≤ 0.05, **p≤ 0.001, ***p≤ 0.0001입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: IL-9 생성 ILC2 세포는 비림프성 기관에서 발견됩니다. (A) 폐 및 (B) 소장 고유판에서 IL-9+ ILC2 세포를 식별하는 데 사용되는 대표적인 유세포 분석 및 게이팅 전략. 각 기관의 단일 세포 현탁액을 비오티닐화 항체로 표시하여 계통 세포(항-B220, 항-CD11b, 항-FcεRI, 항-TCR-β, 항-TCR-γδ, 항-Siglec F, 항-CD4, 항-CD11c, 항-Gr-1, 항-CD8, 항-CD19, 항-NK1.1 및 항-Ter119) 및 Fc-블록. 이어서, 세포 현탁액을 고정성 생존도 염료, 형광색소 표지된 스트렙타비딘, 조혈 세포의 식별을 위한 항-CD45 및 ILC2 세포의 식별을 위한 항-CD90으로 염색하였다. 첫 번째 게이트는 림프 세포의 고전적인 형태와 함께 산란(SSC)-A/측면 산란(FSC)-A 특성을 보여줍니다. 단일 세포 이벤트를 선택한 다음 살아있는 세포와 CD45+ 세포를 선택했습니다. 이 집단 내에서 우리는 CD90+ lin- 세포에 초점을 맞췄습니다. 이 그룹에서 ST2 및 GFP 발현을 평가하여 IL-9+ ILC2 세포를 확인했습니다. (C) 감염 후 표시된 시점에서 폐, 고유판 및 상피내 세포 구획에서 발견되는 ILC2 세포의 빈도. 데이터는 3개의 독립적인 실험으로부터 그룹당 분석된 1개 또는 2개의 마우스의 평균 ± SEM을 시점별로 나타내고; 짝을 이루지 않은 T-검정; *p ≤ 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : 화학 용액 및 그 조성 목록. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: IL-9 생성 ILC2 세포를 확인하기 위한 항체 칵테일. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: IL-9-생성 T 림프구를 확인하기 위한 항체 칵테일. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 종격동 림프절 위치의 개략도. 만든 BioRender.com 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 소장 및 림프절의 상피내 세포 내에서 IL-9+ ILC2를 식별하는 데 사용되는 대표적인 유세포 분석 및 게이팅 전략. (A) 소장 상피내 세포의 단세포 현탁액을 먼저 비오틴 표지 항체와 함께 배양하여 계통 세포(항-B220, 항-CD11b, 항-FcεRI, 항-TCR-β, 항-TCR-γδ, 항-Siglec F, 항-CD4, 항-CD11c, 항-Gr-1, 항-CD8, 항-CD19, 항-NK1.1 및 항-Ter119) 및 Fc-차단. 이어서, 고정 가능한 생존도 염료, 형광색소 표지 스트렙타비딘, 조혈 세포 식별을 위한 항-CD45 및 ILC2 세포 식별을 위한 항-CD90으로 염색했습니다. 첫 번째 게이트는 림프 세포의 고전적인 형태와 함께 측면 산란(SSC)-A/전방 산란(FSC)-A 특성을 보여줍니다. 단일 세포 이벤트를 선택한 다음 살아있는 세포와 CD45+ 세포를 선택했습니다. 이 집단 내에서 우리는 CD90+ lin- 세포에 초점을 맞췄습니다. 이 그룹에서 GFP+ 세포는 IL-9+ ILC2 세포로 확인되었습니다. (나,씨) IL-9+ ILC2 세포를 식별하기 위한 (B) 종격동 림프절 및 (C) 장간막 림프절에 대한 대표적인 유세포 분석 및 게이팅 전략. 림프절의 염색은 항-CD45 항체를 포함하지 않았는데, 이는 전체 집단이 양성일 것으로 예상되었기 때문이다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3: 종격동 림프절 및 소장에서 Th9 세포를 식별하는 데 사용되는 대표적인 유세포 분석 및 게이팅 전략. (A) 종격동 림프절로부터의 단세포 현탁액을 고정 가능한 생존성 염료 및 형광 표지된 항-TCR-β 및 항-CD4 항체로 염색하였다. 첫 번째 게이트는 림프 세포의 고전적인 형태와 함께 측면 산란(SSC)-A/전방 산란(FSC)-A 특성을 보여줍니다. 단일 세포 이벤트를 선택한 다음 살아있는 세포와 TCR-β 및 CD4 이중 양성 세포를 선택했습니다. 이 그룹에서 GFP+ 세포는 Th9 세포로 확인되었습니다. CD45+ 세포가 살아있는 세포 다음에 선택되고 TCR-β 및 CD4 이중 양성 세포가 뒤따르는 것을 제외하고는 소장에서 (B) 고유판 및 (C) 상피내 세포에 대해 유사한 유세포 분석 전략이 사용되었으며, 여기서 GFP+ 세포는 Th9 세포로 식별되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 4: Th9 세포의 절대 수는 감염 전반에 걸쳐 크게 변합니다. TCR-β 및 CD4 이중 양성 세포로부터의 IL-9+ 세포의 절대 수는 (A) 폐, (B) 종격동 림프절 및 (C) 장간막 림프절에서 감염 후 0, 4, 7 및 10일에 결정되었습니다. 데이터는 3개의 독립적인 실험으로부터 그룹당 분석된 1개 또는 2개의 마우스의 평균 ± SEM을 시점별로 나타내고; 짝을 이루지 않은 T-검정 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.001, ***P ≤ 0.0001. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 5: IL-9+ ILC2 세포의 절대 수는 감염 전반에 걸쳐 다릅니다. 감염 후 0일, 4일, 7일 및 10일에 lin-CD90+ 집단에서 IL-9+ ILC2 세포의 절대 수를 (A) 폐, (B) 고유판 및 (C) 소장에서 상피내 세포에서 측정했습니다. 데이터는 3개의 독립적인 실험으로부터 그룹당 분석된 1개 또는 2개의 마우스의 평균 ± SEM을 시점별로 나타내고; 짝을 이루지 않은 T-검정 *p ≤ 0.05. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 6: 림프절에서 IL-9+ ILC2 세포의 빈도 및 절대 수는 감염 동안 유의하게 증가합니다. (A) 종격동 림프절에서 IL-9+ ILC2 세포의 빈도 및 (C) 절대 수. (B) 장간막 림프절에서 IL-9+ ILC2 세포의 빈도 및 (D) 절대 수. 값은 감염 후 0일, 4일, 7일 및 10일에 lin-CD90+ 집단 내에서 IL-9+ ILC2 세포로 결정되었습니다. 데이터는 3개의 독립적인 실험에서 그룹당 분석된 1개 또는 2개의 마우스의 평균 SEM± 나타내며, 짝을 이루지 않은 T-검정 *p ≤ 0.05, ***p ≤ 0.0001입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 7: N. brasiliensis에 감염된 장에서 ILC2를 발현하는 IL-9 세포의 유세포 분석. 감염 후 7일째에 IL-9-리포터 마우스의 장에서 분리된 ILC2 세포의 대표적인 플롯. IL-9 발현은 감염된 리포터 마우스의 상피내 또는 고유판 구획으로부터 갓 분리된 ILC2 세포에서 이전에 기술된 IL-9 세포내 염색 프로토콜 9 (IL-9 AB, IL-9 항체 클론 RM9A4, BioLegend를 사용하여)에 따라 평가하였다. IL-9 발현 ILC2s를 확인하기 위해, 단일 세포 현탁액을 먼저 비오틴 표지 항체와 함께 배양하여 계통 세포(항-B220, 항-CD11b, 항-FcεRI, 항-TCR-β, 항-TCR-γδ, 항-Siglec F, 항-CD4, 항-CD11c, 항-Gr-1, 항-CD8, 항-CD19, 항-NK1.1 및 항-Ter119) 및 Fc-Block으로 염색한 다음, 유연한 생존도 염료, 형광색소 표지된 스트렙타비딘, 항-CD45 및 항-CD90으로 염색하였다. 플롯은 상피내(A,B) 및 고유판(C,D) 구획에 존재하는 lin-CD45+CD90+ 집단에서 게이트된 IL-9 발현 ILC2 세포를 보여주며, 새로 분리된 세포(A,C)의 리포터 신호를 통해 또는 IL-9의 세포내 염색(B,D). 대조군 마우스에 PBS를 주사하였다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
장내 기생충-숙주 상호 작용 및 기생충 감염에 대한 면역 반응에 대한 완전한 이해는 조직 리모델링 및 벌레 퇴학 유도에 핵심적인 다양한 세포 집단 및 이펙터 분자의 식별 및 분석이 필요합니다. 토양 매개 기생충 감염은 전 세계 개발 도상국에서 큰 문제입니다. 그러나 최근까지 이 감염의 영향을 받는 주요 기관인 소장에 존재하는 희귀 세포 집단을 분석할 수 있는 프로토콜은 사용할 수 없었습니다5. 이 프로토콜은 N. brasiliensis 감염 동안 폐, 종격동 및 장간막 림프절에서 IL-9 발현 림프 세포의 유세포 분석을 허용하는 이전에 설명한 방법을 다루며, 소장에서 처음으로 이 집단을 식별하는 추가 이점이 있습니다.
이 프로토콜의 성공 여부는 조직 처리 시간에 크게 좌우됩니다. 한 사람당 최대 6 개의 소장 샘플을 한 번에 처리하는 것이 필수적입니다. 다른 장기를 처리해야 하는 경우 다른 사람이 병행하여 처리하는 것이 좋습니다. 상대적으로 낮은 기생충 부하(200 L3 유충)를 사용함으로써 이 프로토콜은 N. brasiliensis에 감염된 장에서 림프 세포를 분리하는 동시에 이러한 세포를 다른 장기에서 분리하는 능력을 유지합니다. 더 높은 기생충 부하의 사용은 소장에서 분리된 세포의 질과 양을 위태롭게 합니다(데이터는 표시되지 않음). 그러나 다른 장기에서 IL-9 발현 림프 세포가 크게 증가할 수 있다4. 장과 장간막 림프절을 처리할 때 부착된 지방 조직을 제거하지 않으면 세포 사멸이 증가하기 때문에 제거하는 것이 중요합니다. 이 데이터는 자연적인 감염 과정이 소장에서 회수 된 림프 세포의 절대 수에 부정적인 영향을 미친다는 관찰을 뒷받침합니다. 여기에 설명된 연구에서 IL-9+ ILC2 세포의 빈도는 일정하게 유지되는 반면 절대 수치는 각 독립 실험에서 높은 변동성을 나타냅니다. 따라서 절대적인 숫자에서 도출된 결론은 부정확할 수 있으므로 피해야 합니다. 또한, 조직에서 IL-9 발현 T 세포의 빈도가 낮기 때문에 가능한 한 많은 수의 세포를 획득하고 염색하는 것이 좋습니다.
이 ILC2 분석의 한계는 이 모집단을 정의하기 위해 이산 마커 조합을 사용한다는 것입니다. 관심 조직 및 감염 단계에 따라, CD25, Klrg1 및 ST2와 같은 추가 마커를 ILC2 세포의 보다 상세한 표현형 특성화에 사용할 수 있다22. 우리는 여기에 제시된 프로토콜이 INFER 리포터 마우스 균주4를 기반으로 하며 IL-9 발현 세포의 식별에 이점을 나타낼 수 있음을 인정합니다. 그러나, 여기에서 발견된 결과는 다른 마우스 리포터 균주의 사용 및 세포내 IL-9 염색 6,7,8,9를 포함한 대체 전략을 사용하여 얻을 수 있을 것으로 기대합니다. 기존의 마우스를 사용하고 상피내 및 고유판 세포에서 IL-9의 세포내 염색을 수행하면 검출 가능한 신호가 손실되고 얻은 데이터가 손상될 수 있음을 언급하는 것이 중요합니다(보충 그림 7). 이는 이미 생체 외에서 분리 및 유지하기 어려운 하위 집합을 염색하는 데 필요한 장기적인 조작 때문일 수 있습니다. 따라서 처리 시간을 줄이고 생체 내에서 IL-9 발현의 신뢰할 수 있는 분석을 보장하기 위해 리포터 마우스 균주를 사용하는 것이 좋습니다. 우리는 또한 Th9 세포가 IL-923을 발현하는 유일한 T 세포가 아니라는 사실을 인정합니다. 그러나 이 기생 모델에서는 다른 하위 집합이 이를 표현할 것으로 기대하지 않습니다. 그럼에도 불구하고, 기술된 맥락에서 다른 IL-9-발현 하위세트의 존재를 버리기 위해, 전사 마커의 사용과 함께 제2형 사이토카인의 완전한 특성화가 가능하다.
감염 후 5일 이전에 IL-9 발현 림프 세포의 정량화가 이전에 보고되었습니다. 그러나 셀 주파수가 매우 낮아집니다4. 이 연구의 프로토콜은 기생충 제거가 시작될 때까지 N. brasiliensis 감염 동역학의 상당 부분을 다룹니다2. 그러나 우리는 이 연구의 일부 세포 집단이 분석된 기간 내에 기저 수준으로 돌아가지 않았다는 것을 알아차렸으며, 이는 연구가 생체 내 감염의 보다 발전된 단계에서 이러한 세포의 행동에 대한 완전한 관점을 갖기 위해 연장된 시점으로부터 이점을 얻을 수 있음을 시사합니다. 그럼에도 불구하고, 우리는 여기에 제시된 연구가 기생충 감염 모델에서 IL-9 발현 림프 세포를 연구하는 데 관심이 있는 연구자들을 위한 참조 가이드 역할을 할 수 있으며, 이를 통해 관심 조직에서 특정 세포 유형을 검출하기 위한 이상적인 감염 단계를 선택할 수 있다고 믿습니다. 전체적으로, 여기에 설명된 방법은 생리학적으로 관련된 기생충 감염 모델 동안 IL-9를 발현하는 T 림프구 및 ILC2 세포의 표현형 및 기능을 평가하고, 이러한 세포에 대한 지식을 넓히고, 잠재적으로 다른 병리학적 조건에서 이들에 대한 이해를 향상시키는 데 유용할 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 José Luis Ramos-Balderas의 기술 지원에 감사드립니다. 이 작업은 CONACYT(FORDECYT-PRONACE-303027)에서 PLL에 대한 다음 보조금으로 지원되었습니다. OM-P와 EO-M은 CONACYT(각각 736162 및 481437)로부터 펠로우십을 받았습니다. MCM-M은 CONACYT(Estancias Posdoctorales por México 2022(3))로부터 펠로우십을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK buffer | Homemade | ||
| Attune Nxt cytometer | Thermofisher | ||
| B220 | Biolegend | 103204 | |
| CD11b | Biolegend | 101204 | |
| CD11c | Biolegend | 117304 | |
| CD19 | Biolegend | 115504 | |
| CD4 | Biolegend | 100404 | |
| CD4 (BV421) | Biolegend | 100443 | |
| CD45.2 | Biolegend | 109846 | |
| CD8 | Biolegend | 100703 | |
| CD90.2 | Biolegend | 105314 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNAse I | Invitrogen | 18068015 | Specific activity: ≥10 000 units/mg |
| Facs ARIA II sorter | BD Biosciences | ||
| FACS Melody cell sorter | BD Biosciences | ||
| Fc-Block | Biolegend | 101320 | |
| FcεRI | eBioscience | 13589885 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| FlowJo | FlowJo | Flow cytometry analysis data software | |
| Gr-1 | Tonbo | 305931 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Homemade | ||
| IL-9 | biolegend | 514103 | |
| NK1.1 | Biolegend | 108704 | |
| Nylon mesh | lba | B07HYHHX5V | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Phosphate-buffered saline | Homemade | ||
| RPMI | Gibco | 11875093 | |
| Siglec F | Biolegend | 155512 | |
| Streptavidin | Biolegend | 405206 | |
| TCR-β | Biolegend | 109203 | |
| TCR-β (PE/Cy7) | Biolegend | 109222 | |
| TCR-γδ | Biolegend | 118103 | |
| Ter119 | Biolegend | 116204 | |
| Tricine buffer | Homemade | ||
| Zombie Aqua Fixable Viability Dye | Biolegend | 423101 |
References
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