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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Una strategia per lo studio delle cellule linfoidi produttrici di IL-9 nel modello di infezione da Nippostrongylus brasiliensis

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64075
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México
* These authors contributed equally

Summary

Le cellule T e ILC2 che esprimono IL-9 sono indotte durante l'infezione da N. brasiliensis , ma la loro caratterizzazione è stata ampiamente trascurata nell'intestino infetto a causa della loro bassa frequenza e cinetica differenziale. Questo protocollo descrive l'isolamento di queste cellule da diversi organi bersaglio e la conferma della loro identità tramite citometria a flusso in diversi stadi di infezione.

Abstract

IL-9 è una citochina pleiotropica associata a vari processi, tra cui l'immunità antitumorale, l'induzione di patologie allergiche e la risposta immunitaria contro le infezioni da elminti, dove svolge un ruolo importante nell'espulsione del parassita. In un modello murino di infezione da Nippostrongylus brasiliensis, IL-9 è prodotta principalmente dai linfociti T CD4 + e dalle cellule linfoidi innate presenti nel polmone, nell'intestino tenue e nei linfonodi drenanti. Date le difficoltà tecniche coinvolte nella colorazione intracellulare di IL-9, così come la complessità di isolare le cellule ematopoietiche dall'intestino tenue dopo l'infezione, vi è una pressante necessità di un protocollo completo ma semplice per analizzare l'espressione di IL-9 in diversi tessuti linfoidi e non linfoidi in questo modello. Il protocollo qui descritto delinea la cinetica di IL-9 prodotta dalle cellule T CD4+ e dalle cellule linfoidi innate nel polmone e nell'intestino tenue, i principali organi bersaglio di N. brasiliensis, nonché nei linfonodi mediastinici e mesenterici, durante l'infezione. Inoltre, descrive in dettaglio il numero di larve necessarie per l'infezione, a seconda del tipo di cellula e dell'organo di interesse. Questo protocollo mira ad assistere nella standardizzazione dei saggi per risparmiare tempo e risorse offrendo l'opportunità di concentrarsi sulle cellule, gli organi e gli stadi specifici della malattia di interesse nel modello di infezione da N. brasiliensis.

Introduction

Gli anchilostomi sono parassiti intestinali che infettano circa 700 milioni di persone in tutto il mondo, soprattutto nelle aree tropicali dei paesi sottosviluppati. Le infezioni ad alta intensità da Ancylostoma duodenale e Necator americanus, i parassiti anchilostomi più comuni nell'uomo, causano anemia e carenza proteica che possono causare ritardo della crescita e dello sviluppo mentale1. N. americanus e il parassita dei roditori Nippostrongylus brasiliensis inducono una risposta immunitaria prototipica di tipo 2 nel loro ospite e condividono somiglianze nel loro ciclo vitale. Quindi, l'infezione dei topi con N. brasiliensis è il modello più comunemente usato per le infezioni da anchilostomi umani. Stadio 3 (L3) N. brasiliensis larve infettive si spostano dalla pelle al polmone nelle prime ore dopo l'infezione. Una volta nel polmone, diventano L4 e migrano lungo la trachea per essere inghiottiti, passare attraverso lo stomaco e raggiungere l'intestino per diventare adulti (L5) entro 4-5 giorni. Nell'intestino, i vermi L5 depongono le uova che vengono escrete nelle feci per riavviare il ciclo di vita del parassita2.

La risposta immunitaria indotta da N. brasiliensis è caratterizzata da un aumento di diverse citochine di tipo 2, tra cui IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13, insieme a eosinofilia, basofilia, iperplasia del calice e dei mastociti e aumento della produzione di IgG1 e IgE. La maggior parte degli studi che cercano di identificare e definire le risposte immunitarie suscitate dall'infezione da N. brasiliensis sono incentrati sul ruolo di IL-4 o IL-13 in questo modello3. Tuttavia, l'identificazione e la caratterizzazione delle cellule che esprimono IL-9 e la funzione di questa citochina erano state ampiamente trascurate, fino a quando Licona-Limón et al. hanno pubblicato il primo studio che dimostrava un ruolo critico per IL-9 nella risposta immunitaria contro N. brasiliensis. Utilizzando topi reporter, questo studio ha descritto le cellule T (principalmente T helper 9) e le cellule linfoidi innate di tipo 2 (ILC2) come i principali sottogruppi cellulari che esprimono IL-9 dopo l'infezione4.

L'isolamento e la caratterizzazione di cellule immunitarie da polmoni infetti da elminti è fattibile, ed è stato ampiamente riportato 3,4. Tuttavia, a causa del rimodellamento dei tessuti intrinseco e della produzione di muco, farlo nell'intestino infetto si è rivelata una sfida tecnica, fino alla recente pubblicazione di Ferrer-Font et al.5. Il gruppo ha delineato un protocollo per isolare e analizzare sospensioni a singola cellula di sottogruppi immunitari da intestini murini infetti da Heligmosomoides polygyrus. Sulla base di esso, abbiamo ora standardizzato un protocollo per l'isolamento e l'analisi citometrica delle cellule linfoidi che esprimono IL-9 dall'intestino infetto da N. brasiliensis. Inoltre, abbiamo stabilito la cinetica di IL-9 da diverse fonti cellulari e posizioni anatomiche durante l'infezione.

Caratterizzare le distinte popolazioni cellulari coinvolte in questa infezione è vitale per una più ampia comprensione della risposta immunitaria al parassita e della sua interazione con l'ospite. Questo protocollo completo fornisce un percorso chiaro per isolare e analizzare le cellule produttrici di IL-9 dagli organi desiderati nelle fasi della malattia di interesse, consentendo un netto miglioramento delle conoscenze sul ruolo di queste cellule nell'infezione da N. brasiliensis e nelle infezioni parassitarie in generale.

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Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali qui descritti sono stati approvati dal Comitato interno per la gestione degli animali (CICUAL) dell'Istituto di fisiologia cellulare, Università Nazionale Autonoma del Messico.

NOTA: nella Figura 1 è illustrato un diagramma di flusso dell'intero protocollo.

1. Alloggiamento dei topi

  1. Utilizzare gruppi di topi di 8-10 settimane, femmine o maschi, alloggiati in strutture per animali con temperatura e umidità costanti in cicli luce/buio di 12 ore, con accesso ad libitum ad acqua e cibo.
    NOTA: Questo protocollo utilizza un ceppo di topo reporter IL-9 in background C57BL/6, come descritto in precedenza4; tuttavia, altri ceppi reporter IL-9 potrebbero essere utilizzati 6,7,8, così come la colorazione intracellulare IL-9, con risultati variabili 9.

2. Infezione dei topi

  1. Radere la parte posteriore dei topi dal centro del corpo vicino alla base della coda 1 giorno prima dell'infezione. L'uso di anestetici non è essenziale.
  2. Inocula sottocutaneamente ogni topo con 200 larve vitali di N. brasiliensis di terzo stadio (L3) in 100 μL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS)10 nella parte bassa della schiena, come precedentemente descritto2,11, o iniettare 100 μL di PBS da solo come controllo. Sacrifica gli animali il giorno 4, il giorno 7 o il giorno 10 dopo l'infezione.

3. Isolamento dei linfonodi polmonari, dell'intestino tenue, del mediastino e mesenterico

  1. Eutanasia del topo per dislocazione cervicale. Posizionare il mouse sul dorso e spruzzarlo con etanolo al 70%. Fai un'incisione della linea mediana usando le forbici e apri la pelle per esporre le aree addominali e toraciche.
    NOTA: L'isoflurano può essere usato come metodo alternativo di eutanasia12. Le camere ad anidride carbonica non sono raccomandate, poiché la CO2 porta a danni ai tessuti polmonari ed emorragia13.
  2. Isolamento dei linfonodi mediastinici e dei polmoni
    1. Fare un'incisione allo sterno e tagliare a forma di "V" per rimuovere le costole e i muscoli toracici. Una volta esposta la cavità toracica, individuare i linfonodi mediastinici vicino all'esofago, sotto il cuore (vedere Figura supplementare 1).
    2. Estrarre i linfonodi mediastinici e raccoglierli in 1 ml di terreno R-10 (Tabella 1) in una piastra di coltura a 12 pozzetti. Conservare in ghiaccio, al riparo dalla luce fino alla lavorazione.
      NOTA: I campioni devono essere protetti dalla luce, per evitare di diminuire il segnale fluorescente dei topi reporter utilizzati in questi esperimenti.
    3. Estrarre i polmoni e raccoglierli in 1 ml di terreno R-10 in una piastra di coltura a 12 pozzetti per topo. Conservare in ghiaccio, al riparo dalla luce fino alla lavorazione.
  3. Isolamento delle catene linfonodali mesenteriche e dell'intestino tenue
    1. Esporre la cavità peritoneale e spostare con attenzione l'intestino tenue verso destra per esporre la catena linfonodale mesenterica (MLN) lungo il colon.
    2. Usando una pinza, rimuovere l'MLN, arrotolarlo delicatamente su un tovagliolo di carta e rimuovere il grasso.
    3. Trasferire l'MLN a 1 mL di terreno R-10 in una piastra di coltura a 12 pozzetti. Conservare in ghiaccio, al riparo dalla luce fino alla lavorazione.
    4. Tagliare l'intestino tenue appena sotto lo sfintere pilorico e sopra il cieco. Tirare fuori lentamente l'intestino con l'aiuto di una pinza, rimuovendo il mesentere attaccato e il tessuto adiposo.
    5. Posizionare l'intestino tenue su un tovagliolo di carta e inumidirlo generosamente con PBS. Rimuovere i cerotti di Peyer dall'intestino tenue con le forbici.
      NOTA: Per mantenere la vitalità, rimuovere il tessuto adiposo rimanente e mantenere l'intestino tenue umido con PBS durante l'intero processo.
    6. Tagliare l'intestino tenue longitudinalmente usando le forbici e far scorrere delicatamente la pinza sull'intestino aperto per rimuovere il contenuto fecale e il muco.
    7. Tenere l'intestino tenue con una pinza e lavarlo in 5 ml di PBS sul ghiaccio immergendolo accuratamente alcune volte. Ripeti due volte.
    8. Tagliare l'intestino tenue in pezzi corti (circa 5 mm) e raccoglierli in un tubo conico da 50 mL con 10 mL di HBSS14 con FBS al 2% (Tabella 1). Continuare immediatamente a isolare le cellule intraepiteliali e lamina propria.

4. Preparazione di sospensioni unicellulari dall'intestino tenue, dal polmone e dai linfonodi

NOTA: È estremamente importante elaborare un massimo di sei topi per persona quando si preparano sospensioni unicellulari dall'intestino tenue, poiché la vitalità cellulare diminuisce significativamente con periodi di elaborazione più lunghi. Questo metodo è stato adattato dal modello 5 del topo di infezione da Heligmosomoides polygyrus.

  1. Preriscaldare l'incubatore vibrante, il mezzo R-20, HBSS e HBSS-2 mM EDTA (Tabella 1) a 37 °C.
  2. Preparare 10 ml di terreno di digestione dell'intestino tenue (Tabella 1) per campione.
  3. Agitare vigorosamente a mano i pezzi dell'intestino dal punto 3.3.8.
  4. Filtrare ogni campione attraverso una rete di nylon (circa 10 cm x 10 cm) su un imbuto di vetro. Lavare il campione aggiungendo 10 ml di HBSS preriscaldato sulla rete ed eliminare il flusso continuo. Ripeti ancora una volta.
    NOTA: utilizzare una nuova mesh per ogni campione e riutilizzarla durante tutta la procedura.
  5. Rimuovere la maglia dall'imbuto e raccogliere il campione dalla maglia in un tubo conico da 50 mL con 10 mL di HBSS-2 mM EDTA caldo (fase 4.1). Incubare per 10 minuti a 37 °C, agitando a 200 giri/min.
  6. Vortice per 10 s alla massima velocità (3.200 giri/min) e filtrare il campione con la maglia su un imbuto di vetro, recuperando il flusso in un tubo conico da 50 ml.
  7. Ripetere due volte i punti 4.5 e 4.6, recuperando il flusso nello stesso tubo conico da 50 ml. Le cellule intraepiteliali si trovano in questa frazione di 30 ml. Salvare il tessuto rimanente.
  8. Preparazione di sospensione unicellulare da cellule intraepiteliali
    1. Centrifugare i 30 mL di sospensione cellulare, recuperati nella fase 4.7, a 450 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Scartare il surnatante.
    2. Aggiungere 5 ml di PBS e centrifugare a 450 x g per 5 minuti a RT. Eliminare il surnatante.
    3. Risospendere il pellet cellulare in 3 mL di RPMI 10% FBS-20 μg/mL DNasi (Tabella 1). Conservare sul ghiaccio, al riparo dalla luce fino alla colorazione cellulare.
  9. Preparazione della sospensione unicellulare da cellule della lamina propria
    1. Lavare il tessuto dell'intestino tenue rimanente dal punto 4.7 versando oltre 10 ml di HBSS caldo attraverso la rete sopra l'imbuto. Ripetere il lavaggio. Raccogliere il tessuto dalla rete in un tubo conico da 50 ml con 10 ml di terreno di digestione dell'intestino tenue.
    2. Incubare per 30 minuti a 37 °C, agitando a 200 giri/min. Vortice alla massima velocità per 10 s ogni 5 min.
    3. Aggiungere 10 ml di tampone FACS-EDTA (Tabella 1) per interrompere la reazione di digestione e posizionarlo sul ghiaccio.
    4. Filtrare ogni campione attraverso un filtro cellulare da 100 μm utilizzando una pipetta sierologica, recuperando la sospensione in un tubo conico da 50 mL posto su ghiaccio.
    5. Centrifugare a 600 x g per 6 minuti a 4 °C.
    6. Scartare il surnatante. Lavare il pellet cellulare con 5 mL di PBS e centrifugare a 600 x g per 6 minuti a 4 °C.
    7. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di RPMI 10% FBS-20 μg/mL DNasi. Conservare sul ghiaccio, al riparo dalla luce fino alla colorazione cellulare.
  10. Preparazione della sospensione unicellulare dal polmone
    NOTA: Ogni polmone e intestino tenue devono essere trattati in parallelo da due persone per evitare tempi di manipolazione prolungati, che si traducono in una bassa vitalità cellulare.
    1. Preparare 4 ml di terreno di digestione polmonare (Tabella 1) per campione elaborato.
    2. Rimuovere il mezzo RPMI dal pozzetto contenente i polmoni dal punto 3.2.3. Tagliare il polmone a pezzetti con le forbici sottili.
    3. Trasferire i pezzi polmonari in un tubo conico da 15 mL con una spatola. Aggiungere 4 ml di terreno di digestione polmonare (Tabella 1).
    4. Incubare per 30 minuti a 37 °C, agitando a 250 giri/min. Al termine, conservare in ghiaccio fino a quando ogni campione non viene elaborato.
    5. Filtrare ogni campione attraverso un filtro cellulare da 100 μm, posizionato in un singolo pozzetto di una piastra di coltura a 6 pozzetti. Dissociare il tessuto con uno stantuffo della siringa.
    6. Recuperare ogni campione in una provetta conica da 15 mL e aggiungere 4 mL di terreno R-2 (Tabella 1). Conservare in ghiaccio mentre gli altri campioni vengono elaborati.
    7. Centrifugare a 600 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno R-5 (Tabella 1).
    8. Durante la centrifugazione, preparare 4 ml di soluzione con gradiente di densità al 27,5% (Tabella 1) per campione per arricchire la frazione cellulare ematopoietica15,16. Questa strategia per la separazione a cella singola è più efficiente, economica e meno tossica rispetto ad altri mezzi a gradiente di densità simili17.
    9. Aggiungere 4 mL di soluzione con gradiente di densità al 27,5% all'1 mL di sospensione cellulare del punto 4.10.7 e agitare energicamente.
    10. Aggiungere lentamente 1 mL di mezzo R-5 (Tabella 1) sopra la sospensione mista per creare due fasi.
    11. Centrifugare a 1.500 x g per 20 minuti a RT, con bassa accelerazione e freno spento. Osservare l'anello formato tra le due fasi.
    12. Recuperare l'anello formato tra le due fasi con una micropipetta da 1 mL e risospendere in 4 mL di terreno R-2.
    13. Centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone ACK (Tabella 1) e incubare per 1 minuto a RT.
    14. Aggiungere 4 mL di terreno R-5 e centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno R-10. Conservare sul ghiaccio, al riparo dalla luce fino alla colorazione per la citometria a flusso.
  11. Preparazione della sospensione unicellulare dai linfonodi
    1. Posizionare i linfonodi dei punti 3.2.2 o 3.3.3 tra due pezzi di maglia in un pozzetto da una piastra di coltura a 6 pozzetti e dissociarli con uno stantuffo della siringa.
    2. Recuperare la sospensione cellulare in un tubo conico da 1,5 mL e centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C.
    3. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno R-10. Conservare sul ghiaccio, al riparo dalla luce fino alla colorazione per la citometria a flusso.
      NOTA: se sono visibili grumi, filtrare il campione attraverso un filtro cellulare da 100 μm.

5. Colorazione cellulare per citometria a flusso (Figura 2 e Figura 3)

NOTA: Centrifugare le sospensioni delle cellule linfonodali dal punto 4.11.3 a 450 x g per 5 minuti a 4 °C e risospendere il pellet cellulare in 500 μL di tampone FACS (Tabella 1).

  1. Colorazione cellulare per l'identificazione di ILC2 (Figura 3 e Figura supplementare 2)
    NOTA: Questa procedura di colorazione è specifica per l'identificazione delle cellule ILC2 che esprimono IL-9.
    1. Piastra 150 μL per campione polmonare (circa 1,8 x 10 6 cellule) dal passo 4.10.14 e 50 μL per campione linfonodale dalla fase 4.11.3 (circa 0,7 x 106 e 2,2 x 106 cellule per campioni di linfonodi mediastinici e mesenterici, rispettivamente) in una piastra di coltura inferiore conica a 96 pozzetti. Aggiungere 100 μL di tampone FACS e centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C.
    2. Piastra 100 μL per campione di intestino tenue (circa 2,7 x 10 6 e 0,6 x 106 cellule per campioni intraepiteliali e lamina propria, rispettivamente) dai punti 4.8.3 e 4.9.7 in una piastra di coltura inferiore conica a 96 pozzetti. Aggiungere 150 μL di tampone FACS e centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C.
    3. Scartare il surnatante e risospendere ogni pellet cellulare in 50 μL del cocktail di anticorpi biotinilati (Tabella 2) diluito nel tampone FACS. Incubare per 30 minuti a 4 °C al riparo dalla luce.
      NOTA: Utilizzare tampone FACS con 20 μg/mL DNasi per campioni intraepiteliali e di lamina propria.
    4. Aggiungere 150 μL di tampone FACS. Centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C.
    5. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 200 μL di tampone FACS. Centrifugare di nuovo e scartare il surnatante.
    6. Risospendere il pellet cellulare in 50 μL del cocktail anticorpo/macchia (Tabella 2) e incubare per 30 minuti a 4 °C al riparo dalla luce.
    7. Aggiungere 150 μL di tampone FACS. Centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C.
    8. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 200 μL di tampone FACS. Centrifugare di nuovo e scartare il surnatante. Ripetere il lavaggio (punto 5.1.7) ed eliminare il surnatante.
    9. Risospendere il pellet cellulare in 300 μL di tampone FACS e analizzarlo mediante citometria a flusso.
    10. Per i campioni dell'intestino tenue e del polmone, utilizzare la strategia di gating: linfociti, cellule singole, cellule vive, cellule ematopoietiche, cellule CD90 + lignaggio, cellule ST2 + e cellule IL-9 + (Figura 3A, B e Figura supplementare 2A). Per i campioni linfonodali, utilizzare la strategia di gating: cellule vive, cellule singole, cellule di lignaggio CD90+, cellule ST2+ e cellule IL-9+ (Figura supplementare 2B,C).
  2. Colorazione cellulare per l'identificazione dei linfociti produttori di IL-9 (Figura 2 e Figura 3 supplementare)
    1. Trasferire 800 μL per campione polmonare dalla fase 4.10.14 a una provetta da 1,5 mL (circa 14,6 x 106 cellule). Centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
    2. Per i campioni linfonodali, piastra 400 μL della sospensione cellulare dal punto 4.11.3 (circa 5,6 x 10 6 e 17,5 x 106 cellule per campioni di linfonodi mediastinici e mesenterici, rispettivamente) in una piastra inferiore conica a 96 pozzetti in due fasi.
      1. Trasferire prima 200 μL, centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
      2. Trasferire altri 200 μL al pozzetto corrispondente. Centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
    3. Risospendere il pellet cellulare in 50-400 μL del cocktail anticorpo/colorante (Tabella 3) e incubare per 30 minuti a 4 °C al riparo dalla luce.
      NOTA: I campioni polmonari devono essere risospesi in 400 μL, i campioni di linfonodi mediastinici in 50 μL e i campioni di linfonodi mesenterici in 100 μL del cocktail di colorazione.
    4. Aggiungere 150 μL di tampone FACS ai campioni di linfonodi mediastinici e 100 μL ai campioni di linfonodi mesenterici. Centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
    5. Lavare i campioni di polmone e linfonodi risospendendo i pellet rispettivamente in 1 mL e 200 μL di tampone FACS. Centrifugare a 450 xg per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e ripetere il lavaggio.
    6. Risospendere i campioni polmonari in 600 μL di tampone FACS e analizzarli mediante citometria a flusso. Utilizzare la strategia di gating: linfociti, cellule singole, cellule vive, cellule ematopoietiche, cellule CD4+TCRβ+ e cellule IL-9+ (Figura 2A).
    7. Risospendere i campioni linfonodali in 300 μL di tampone FACS e analizzarli mediante citometria a flusso. Utilizzare la strategia di gating: linfociti, cellule singole, cellule vive, cellule TCRβ+ CD4+ e cellule IL-9+ (Figura 2B e Figura 3A supplementare).

6. Determinazione del numero assoluto di cellule in sospensioni monocellulari

  1. Diluire i campioni dalle fasi di isolamento 4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 e 4.11.3 con PBS in rapporto 1:20 (10 μL di campione + 190 μL di PBS).
  2. Mescolare 10 μL di ciascun campione diluito del punto 6.1 con 10 μL di Trypan Blue. Caricare 10 μL in un emocitometro e contare le cellule vive, considerando ogni diluizione.
  3. Ottenere il numero assoluto di cellule moltiplicando la percentuale della popolazione di interesse da cellule vive determinata dalla citometria a flusso (cellule negative al colorante di vitalità) per il numero totale di cellule vive nella sospensione unicellulare dopo l'isolamento e dividendo questo numero per 100 (Figura supplementare 4, Figura supplementare 5 e Figura supplementare 6).
    Numero assoluto = (Percentuale della popolazione di interesse da cellule vive determinata dalla citometria a flusso x Numero totale di cellule vive nella sospensione unicellulare)/100

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Representative Results

I topi sono stati iniettati per via sottocutanea con 200 larve di N. brasiliensis in stadio L3 o con PBS per controlli fittizi. Il numero di larve utilizzate in questo protocollo è stato regolato al fine di isolare le cellule vitali dai polmoni, dal tessuto linfoide e dall'intestino tenue, a differenza dei rapporti precedenti in cui sono stati utilizzati carichi più elevati di vermi per rilevare le cellule nei tessuti linfoidi e nei polmoni solo4. I polmoni, i linfonodi mediastinici, i linfonodi mesenterici e l'intestino tenue sono stati prelevati ai giorni 0, 4, 7 e 10 post-infezione per l'isolamento dei linfociti e la caratterizzazione delle popolazioni produttrici di IL-9. Un totale di 27 topi sono stati utilizzati in due o più esperimenti indipendenti, inclusi nove controlli e da quattro a sei topi infetti da N. brasiliensis per punto temporale analizzato. I controlli con infezione fittizia sono stati inclusi in ogni esperimento per ottenere numeri basali. Utilizzando questo protocollo, le cellule T CD4+ produttrici di IL-9 (principalmente cellule Th9 in questo modello) possono essere isolate dai linfonodi polmonari, mesenterici e mediastinici per la quantificazione e ulteriori analisi.

Seguendo il decorso naturale dell'infezione, abbiamo prima valutato le frequenze dei linfociti T CD4+ produttori di IL-9 (Th9) presenti nei polmoni e nei linfonodi mediastinici (strategia di gating mostrata in Figura 2A e Figura 3A supplementare). In entrambi gli organi, le frequenze Th9 sono aumentate, a partire dal giorno 4, e hanno raggiunto un picco al giorno 7 dopo l'infezione (Figura 2C), un incremento che è stato osservato anche nei numeri assoluti Th9 (Figura supplementare 4A,B). Nei linfonodi mesenterici (strategia di gating mostrata in Figura 2B), c'è stato un aumento significativo sia delle frequenze che del numero assoluto di cellule Th9 ai giorni 7 e 10 post-infezione (Figura 2C e Figura supplementare 4C), in conformità con i precedenti rapporti4. La presenza di cellule T e ILC2 è stata confermata nei campioni intraepiteliali e di lamina propria; tuttavia, non sono state osservate cellule Th9 in questi compartimenti intestinali durante l'infezione (Figura supplementare 3B,C).

Abbiamo quindi valutato le cellule ILC2 che esprimono IL-9 nei tessuti linfoidi e non linfoidi di topi infetti (strategia di gating mostrata in Figura 3A, B e Figura supplementare 2). Abbiamo osservato un aumento significativo delle frequenze di ST2+ IL-9- e ST2+ IL-9+ che esprimono ILC2 nei polmoni al giorno 7 dopo l'infezione (Figura 3C). Allo stesso tempo, l'analisi dei numeri assoluti ha rivelato un aumento statisticamente significativo solo nella popolazione ST2+ IL-9+ al giorno 7 post-infezione (Figura supplementare 5A). Nei linfonodi mediastinici (strategia di gating mostrata nella Figura supplementare 2B), il numero di cellule ILC2 che esprimono IL-9 (ST2+ IL-9+) è aumentato significativamente al giorno 10 dopo l'infezione, mentre il numero assoluto di cellule ST2+ ha mostrato una tendenza ad aumentare, a partire dal giorno 7 e continuando fino al giorno 10 post-infezione (Figura supplementare 6A,C).

Le cellule IL-9+ ILC2 sono state trovate anche nei compartimenti della lamina propria e intraepiteliale dell'intestino tenue (strategia di gating mostrata in Figura 3B e Figura supplementare 2A). L'infezione da N. brasiliensis ha determinato un aumento statisticamente significativo delle frequenze delle cellule ST2+ IL-9+ al giorno 4 e delle popolazioni ST2-IL-9+ ai giorni 7 e 10 nella lamina propria. Nel compartimento intraepiteliale, è stato osservato anche un cambiamento significativo nelle frequenze delle cellule ST2+ IL9+ e ST2-IL-9+ rispettivamente al giorno 7 e al giorno 10 dopo l'infezione (Figura 3C). È importante sottolineare che, anche con un numero relativamente basso di carico di larve, l'infezione con il parassita ha causato danni estesi all'intestino tenue; quindi, l'analisi dei numeri assoluti di ILC2 che esprimono IL-9 è tecnicamente impraticabile, ostacolando la quantificazione accurata di questa popolazione a causa delle basse rese di cellule vive (Figura supplementare 5B,C). D'altra parte, l'analisi dei linfonodi mesenterici (strategia di gating mostrata nella Figura supplementare 2C) ha rivelato un aumento significativo del numero assoluto di cellule ST2+ IL-9-, ST2+ IL-9+ e ST2- IL-9+ ILC2 al giorno 10 post-infezione (Figura supplementare 6D), come precedentemente riportato4. Nel frattempo, non è stata osservata alcuna differenza nelle frequenze di queste popolazioni durante l'infezione (Figura supplementare 6B). Questi diversi sottogruppi di cellule che esprimono ST2 e IL-9 sono popolazioni intriganti con ruoli potenzialmente differenziali in vivo e potrebbero corrispondere a ILC2 naturali rispetto a quelle infiammatorie come recentemente descritto 18,19,20,21. Tuttavia, questo deve essere affrontato in studi futuri.

In sintesi, abbiamo adattato questo protocollo per il recupero delle cellule che esprimono IL-9 dall'intestino infetto da N. brasiliensis, pur essendo in grado di rilevarle nel tessuto polmonare e linfoide. Il recupero delle cellule immunitarie dalle viscere infette da parassiti si è dimostrato tecnicamente difficile. Qui, un numero aggiustato di larve utilizzate per l'infezione ha portato a una migliore integrità del tessuto intestinale, che ha permesso il recupero di una popolazione IL-9+. A nostra conoscenza, questo è il primo protocollo sviluppato specificamente per l'analisi delle cellule che esprimono IL-9 nell'intestino durante l'infezione da N. brasiliensis. Tuttavia, anche altre cellule immunitarie possono essere isolate seguendo questi passaggi. I dati presentati qui mostrano che la maggior parte delle cellule che esprimono IL-9 residenti nei tessuti nell'intestino tenue sono ILC2.

Figure 1
Figura 1: Diagramma di flusso del protocollo descritto. Diagramma schematico con le principali fasi utilizzate per elaborare diversi organi e i sottoinsiemi cellulari che esprimono IL-9 attesi ottenuti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Le cellule Th9 si trovano nei polmoni, nei linfonodi mediastinici e mesenterici durante l'infezione da N. brasiliensis. Analisi rappresentativa della citometria a flusso e strategia di gating utilizzata per l'identificazione delle cellule Th9 da (A) polmoni e (B) linfonodi mesenterici. Le sospensioni monocellulari di ciascun organo sono state colorate con un colorante di vitalità fissabile, marcato con fluorescenza anti-CD45 per l'identificazione delle cellule ematopoietiche e anti-recettore delle cellule T (TCR) β e anti-CD4 per l'identificazione dei linfociti T CD4 +. Il segnale GFP+ indica la percentuale di cellule Th9 presenti. Il primo gate mostra proprietà di dispersione laterale (SSC)-A/forward scatter (FSC)-A con la morfologia classica delle cellule linfoidi. Sono stati selezionati eventi a cellula singola, seguiti da cellule vive e quindi da cellule CD45+. All'interno di questa popolazione, ci siamo concentrati sulle cellule TCR-β e CD4 double-positive, da cui le cellule GFP + sono state identificate come cellule Th9. La colorazione dei linfonodi non includeva l'anticorpo anti-CD45, poiché l'intera popolazione dovrebbe essere positiva. (C) Frequenze delle cellule Th9 presenti nei polmoni, nei linfonodi mediastinici e mesenterici nei momenti indicati dopo l'infezione. I dati rappresentano la media ± SEM di uno o due topi analizzati per gruppo, da tre esperimenti indipendenti, per punto temporale; Test T spaiato; *p≤ 0,05, **p≤ 0,001, ***p≤ 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Le cellule ILC2 produttrici di IL-9 si trovano negli organi non linfoidi. Analisi rappresentativa della citometria a flusso e strategia di gating utilizzata per l'identificazione di cellule IL-9+ ILC2 da (A) polmone e (B) lamina propria dell'intestino tenue. Le sospensioni a singola cellula di ciascun organo sono state marcate con anticorpi biotinilati per identificare le cellule del lignaggio (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 e anti-Ter119) e Fc-Block. Le sospensioni cellulari sono state quindi colorate con colorante di vitalità fissabile, streptavidina marcata con fluorocromo, anti-CD45 per l'identificazione delle cellule ematopoietiche e anti-CD90 per l'identificazione delle cellule ILC2. Il primo gate mostra proprietà di scatter (SSC)-A/side scatter (FSC)-A con la morfologia classica delle cellule linfoidi. Sono stati selezionati eventi a cellula singola, seguiti da cellule vive e quindi da cellule CD45+. All'interno di questa popolazione, ci siamo concentrati sulle cellule di lin-line CD90+; da questo gruppo, abbiamo valutato l'espressione di ST2 e GFP per identificare le cellule IL-9+ ILC2. (C) Frequenze delle cellule ILC2 presenti nei polmoni, nella lamina propria e nel compartimento cellulare intraepiteliale nei punti temporali indicati dopo l'infezione. I dati rappresentano la media ± SEM di uno o due topi analizzati per gruppo, da tre esperimenti indipendenti, per punto temporale; test T spaiato; *p ≤ 0,05. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Elenco delle soluzioni chimiche e delle loro composizioni. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Cocktail di anticorpi per identificare le cellule ILC2 produttrici di IL-9. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Cocktail di anticorpi per identificare i linfociti T produttori di IL-9. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Figura supplementare 1: Rappresentazione schematica della posizione del linfonodo mediastinico. Creato nel BioRender.com Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Citometria a flusso rappresentativa e strategia di gating utilizzata per identificare IL-9+ ILC2 all'interno delle cellule intraepiteliali dell'intestino tenue e dei linfonodi. (A) Le sospensioni monocellulari da cellule intraepiteliali dell'intestino tenue sono state prima incubate con anticorpi marcati con biotina per selezionare le cellule del lignaggio (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 e anti-Ter119) e Fc-Block. Questo è stato seguito dalla colorazione con un colorante di vitalità fissabile, streptavidina marcata con fluorocromo, anti-CD45 per l'identificazione delle cellule ematopoietiche e anti-CD90 per l'identificazione delle cellule ILC2. Il primo gate mostra proprietà di dispersione laterale (SSC)-A/forward scatter (FSC)-A con la morfologia classica delle cellule linfoidi. Sono stati selezionati eventi a cellula singola, seguiti da cellule vive e quindi da cellule CD45+. All'interno di questa popolazione, ci siamo concentrati sulle cellule di lin-line CD90+; da questo gruppo, le cellule GFP + sono state identificate come cellule IL-9 + ILC2. (B,C) Citometria a flusso rappresentativa e strategia di gating per (B) linfonodi mediastinici e (C) linfonodi mesenterici per identificare le cellule IL-9+ ILC2. La colorazione dei linfonodi non includeva l'anticorpo anti-CD45, poiché ci si aspettava che l'intera popolazione fosse positiva. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: Analisi rappresentativa della citometria a flusso e strategia di gating utilizzata per identificare le cellule Th9 nei linfonodi mediastinici e nell'intestino tenue. Le sospensioni unicellulari dai linfonodi mediastinici (A) sono state colorate con un colorante di vitalità fissabile e anticorpi anti-TCR-β e anti-CD4 marcati con fluorescenza. Il primo gate mostra proprietà di dispersione laterale (SSC)-A/forward scatter (FSC)-A con la morfologia classica delle cellule linfoidi. Sono stati selezionati eventi a singola cellula, seguiti da cellule vive e quindi da cellule TCR-β e CD4 double-positive; da questo gruppo, le cellule GFP + sono state identificate come cellule Th9. Una strategia di citometria a flusso simile è stata utilizzata per (B) lamina propria e (C) cellule intraepiteliali dall'intestino tenue, tranne che le cellule CD45+ sono state selezionate dopo le cellule vive, seguite da cellule TCR-β e CD4 doppie positive, da dove le cellule GFP + sono state identificate come cellule Th9. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 4: Il numero assoluto di cellule Th9 cambia significativamente durante l'infezione. Il numero assoluto di cellule IL-9+ da cellule TCR-β e CD4 doppie positive è stato determinato ai giorni 0, 4, 7 e 10 post-infezione nei linfonodi (A) polmonari, (B) mediastinici e (C) linfonodi mesenterici. I dati rappresentano la media ± SEM di uno o due topi analizzati per gruppo, da tre esperimenti indipendenti, per punto temporale; T-test spaiato *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.001, ***P ≤ 0.0001. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 5: Il numero assoluto di cellule IL-9+ ILC2 differisce durante l'infezione. Un numero assoluto di cellule IL-9+ ILC2 della popolazione lin-CD90+ ai giorni 0, 4, 7 e 10 post-infezione è stato determinato in (A) polmone, (B) lamina propria e (C) cellule intraepiteliali dall'intestino tenue. I dati rappresentano la media ± SEM di uno o due topi analizzati per gruppo, da tre esperimenti indipendenti, per punto temporale; T-test spaiato *p ≤ 0,05. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 6 supplementare: Le frequenze e il numero assoluto di cellule IL-9+ ILC2 nei linfonodi aumentano significativamente durante l'infezione. (A) Frequenza e (C) numeri assoluti di cellule IL-9+ ILC2 dai linfonodi mediastinici. (B) Frequenza e (D) numeri assoluti di cellule IL-9+ ILC2 dai linfonodi mesenterici. I valori sono stati determinati come cellule IL-9+ ILC2 all'interno della popolazione lin-CD90+ ai giorni 0, 4, 7 e 10 post-infezione. I dati rappresentano la media ± SEM di uno o due topi analizzati per gruppo, da tre esperimenti indipendenti, per punto temporale; test T spaiato *p ≤ 0,05, ***p ≤ 0,0001. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 7: Analisi citometrica a flusso di IL-9 che esprimono cellule ILC2 da intestino infetto da N. brasiliensis. Grafici rappresentativi di cellule ILC2 isolate dall'intestino di topi reporter IL-9 al giorno 7 post-infezione. L'espressione di IL-9 è stata valutata in cellule ILC2 appena isolate dai compartimenti intraepiteliali o lamina propria di topi reporter infetti (IL-9 REP) rispettoal precedente protocollo di colorazione intracellulare IL-9 9 (IL-9 AB, utilizzando un clone di anticorpi IL-9 RM9A4, BioLegend). Per identificare ILC2 che esprimono IL-9, le sospensioni a singola cellula sono state prima incubate con anticorpi marcati con biotina per selezionare le cellule del lignaggio (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 e anti-Ter119) e Fc-Block, seguiti da colorazione con colorante di vitalità flessibile, streptavidina marcata con fluorocromo, anti-CD45 e anti-CD90. I grafici mostrano cellule ILC2 che esprimono IL-9 dipendenti sulla popolazione lin-CD45 + CD90 + presente nei compartimenti intraepiteliale (A, B) e lamina propria (C, D), rilevati tramite il segnale reporter da cellule appena isolate (A, C) o in seguito alla colorazione intracellulare di IL-9 (B, D). I topi di controllo sono stati iniettati con PBS. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Una comprensione completa delle interazioni parassita-ospite intestinale e delle risposte immunitarie all'infezione da elminti richiede l'identificazione e l'analisi delle diverse popolazioni cellulari e delle molecole effettrici che sono fondamentali per l'induzione del rimodellamento tissutale e l'espulsione dei vermi. Le infezioni da elminti trasmesse dal suolo rappresentano un grosso problema nei paesi in via di sviluppo di tutto il mondo. Tuttavia, fino a poco tempo fa, nonera disponibile un protocollo che consentisse l'analisi di popolazioni cellulari rare presenti nell'intestino tenue, il principale organo colpito da questa infezione. Questo protocollo copre i metodi precedentemente descritti che consentono l'analisi citometrica a flusso delle cellule linfoidi che esprimono IL-9 nei linfonodi polmonari, mediastinici e mesenterici durante l'infezione da N. brasiliensis , con l'ulteriore vantaggio dell'identificazione di questa popolazione per la prima volta nell'intestino tenue.

Il successo di questo protocollo dipende fortemente dai tempi di lavorazione dei tessuti. È imperativo elaborare un massimo di sei campioni di intestino tenue, per persona, contemporaneamente. Se devono essere elaborati diversi organi, si consiglia di farlo in parallelo da un'altra persona. Utilizzando un carico parassitario relativamente basso (200 larve di L3), questo protocollo consente l'isolamento delle cellule linfoidi dall'intestino infetto da N. brasiliensis mantenendo la capacità di isolare queste cellule da altri organi. L'uso di carichi parassitari più elevati mette a repentaglio la qualità e la quantità di cellule isolate dall'intestino tenue (dati non mostrati); tuttavia, potrebbe comportare un aumento significativo delle cellule linfoidi che esprimono IL-9 in altri organi4. Quando si elaborano l'intestino e i linfonodi mesenterici, è fondamentale rimuovere il tessuto adiposo aderito, poiché in caso contrario si verifica un aumento della morte cellulare. I dati supportano l'osservazione che il decorso naturale dell'infezione influisce negativamente sul numero assoluto di cellule linfoidi recuperate dall'intestino tenue. Negli studi qui descritti, le frequenze delle cellule IL-9+ ILC2 rimangono coerenti, mentre i numeri assoluti mostrano un'elevata variabilità in ogni esperimento indipendente. Pertanto, le conclusioni tratte dai numeri assoluti potrebbero essere imprecise e dovrebbero essere evitate. Inoltre, data la bassa frequenza delle cellule T che esprimono IL-9 nei tessuti, si raccomanda l'acquisizione e la colorazione del maggior numero possibile di cellule.

Una limitazione di questa analisi ILC2 è l'uso di una combinazione discreta di marcatori per definire questa popolazione. A seconda del tessuto di interesse e della fase dell'infezione, ulteriori marcatori, come CD25, Klrg1 e ST2 tra gli altri, potrebbero essere utilizzati per una caratterizzazione fenotipica più dettagliata delle cellule ILC222. Riconosciamo che il protocollo qui presentato si basa sul ceppo 4 del topo reporter INFER e potrebbe rappresentare un vantaggio per l'identificazione delle cellule che esprimono IL-9. Tuttavia, ci aspettiamo che i risultati trovati qui possano essere ottenuti utilizzando strategie alternative, incluso l'uso di altri ceppi di topi reporter e la colorazione intracellulare di IL-9 6,7,8,9. È importante ricordare che l'uso di topi convenzionali e l'esecuzione della colorazione intracellulare di IL-9 nelle cellule intraepiteliali e della lamina propria possono comportare la perdita di qualsiasi segnale rilevabile e compromettere i dati ottenuti (Figura 7 supplementare). Ciò potrebbe essere dovuto alla manipolazione a lungo termine necessaria per colorare un sottoinsieme che è già difficile da isolare e mantenere ex vivo. Pertanto, raccomandiamo l'uso di ceppi di topi reporter per ridurre i tempi di elaborazione e garantire un'analisi affidabile dell'espressione di IL-9 in vivo. Riconosciamo anche il fatto che le cellule Th9 non sono le uniche cellule T che esprimono IL-923; Tuttavia, in questo modello parassitario, non ci aspetteremmo che altri sottoinsiemi lo esprimano. Tuttavia, per scartare la presenza di altri sottogruppi che esprimono IL-9 nel contesto descritto, è possibile una caratterizzazione completa delle citochine di tipo 2 insieme all'uso di marcatori trascrizionali.

La quantificazione delle cellule linfoidi che esprimono IL-9 prima del giorno 5 post-infezione è stata precedentemente riportata; Tuttavia, si traduce in frequenze cellulari molto basse4. Il protocollo in questo studio copre gran parte della cinetica dell'infezione da N. brasiliensis fino all'inizio della clearance del parassita2. Tuttavia, abbiamo notato che alcune delle popolazioni cellulari in questo studio non sono tornate ai livelli basali entro il lasso di tempo analizzato, suggerendo che lo studio potrebbe beneficiare di punti temporali estesi per avere una prospettiva completa sul comportamento di queste cellule in una fase più avanzata dell'infezione in vivo. Indipendentemente da ciò, riteniamo che il lavoro qui presentato potrebbe servire come guida di riferimento per i ricercatori interessati a studiare le cellule linfoidi che esprimono IL-9 in modelli di infezione parassitaria, consentendo loro di scegliere la fase ideale dell'infezione per il rilevamento dei tipi cellulari specifici dai tessuti di interesse. Complessivamente, i metodi qui descritti saranno utili per valutare il fenotipo e la funzione dei linfociti T e delle cellule ILC2 che esprimono IL-9 durante un modello fisiologicamente rilevante di infezione parassitaria, ampliando la nostra conoscenza di queste cellule e potenzialmente migliorando la nostra comprensione di esse in altre condizioni patologiche.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare José Luis Ramos-Balderas per il suo supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dalla seguente sovvenzione a PLL da parte di CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P e EO-M hanno ricevuto una borsa di studio da CONACYT (rispettivamente 736162 e 481437). MCM-M ha ricevuto una borsa di studio da CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK buffer Homemade
Attune Nxt cytometer Thermofisher
B220 Biolegend 103204
CD11b Biolegend 101204
CD11c  Biolegend 117304
CD19  Biolegend 115504
CD4 Biolegend 100404
CD4 (BV421) Biolegend 100443
CD45.2 Biolegend 109846
CD8  Biolegend 100703
CD90.2 Biolegend 105314
Collagenase D Roche 11088866001
DNAse I Invitrogen 18068015 Specific activity: ≥10 000 units/mg   
Facs ARIA II sorter BD Biosciences
FACS Melody cell sorter BD Biosciences
Fc-Block Biolegend 101320
FcεRI eBioscience 13589885
Fetal bovine serum Gibco 26140079
FlowJo FlowJo Flow cytometry analysis data software
Gr-1 Tonbo 305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Homemade
IL-9 biolegend 514103
NK1.1  Biolegend 108704
Nylon mesh  ‎ lba B07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556
Phosphate-buffered saline  Homemade
RPMI Gibco 11875093
Siglec F  Biolegend 155512
Streptavidin Biolegend 405206
TCR-β  Biolegend 109203
TCR-β (PE/Cy7) Biolegend 109222
TCR-γδ  Biolegend 118103
Ter119 Biolegend 116204
Tricine buffer  Homemade
Zombie Aqua Fixable Viability Dye Biolegend 423101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Immunologia e infezione Numero 193 IL-9 Th9 ILC2 IL-9 cellule linfoidi parassita intestino tenue N. brasiliensis
Una strategia per lo studio delle cellule linfoidi produttrici di IL-9 nel modello di infezione <em>da Nippostrongylus brasiliensis</em>
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Muñoz-Paleta, O.,… More

Muñoz-Paleta, O., Olguín-Martínez, E., Ruiz-Medina, B. E., Alonso-Quintana, A., Marcial-Medina, M. C., Licona-Limón, P. A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model. J. Vis. Exp. (193), e64075, doi:10.3791/64075 (2023).

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