Summary
המאמר מתאר את השיטה לבידוד תאי אנדותל גלומרולריים מותנים מכליות של עכברים מהונדסים המבטאים את נגיף סימיאן התרמולבילי 40 ואת המיטוכונדריה הניתנת להפעלה פוטו-אקטיבית, PhAMנכרת. אנו מתארים את ההליך לבידוד גלומרולי מכליות שלמות באמצעות חרוזים, שלבי עיכול, זריעה וגידול של GECs-CD31 חיובי.
Abstract
תפקוד לקוי של תאי אנדותל גלומרולריים (GEC) יכול ליזום ולתרום לפירוק מחסום סינון גלומרולרי. עקה חמצונית מיטוכונדריאלית מוגברת הוצעה כמנגנון הגורם לתפקוד לקוי של GEC בפתוגנזה של מחלות גלומרולריות מסוימות. מבחינה היסטורית, הבידוד של GECs ממודלים in vivo היה מאתגר לשמצה בשל קשיים בבידוד תרבויות טהורות מגלומרולי. ל-GECs יש דרישות גידול מורכבות במבחנה ותוחלת חיים מוגבלת מאוד. במאמר זה נתאר את הליך הבידוד וההתרבות של GECs מונצחים מותנים עם מיטוכונדריה פלואורסצנטית, מה שמאפשר מעקב אחר ביקוע מיטוכונדריאלי ואירועי היתוך. GECs בודדו מכליות של עכבר מהונדס כפול המבטא את התרמולביל SV40 TAg (מה-Immortomouse), מקדם באופן מותנה התפשטות ודיכוי התמיינות תאים, וחלבון פלואורסצנטי הניתן להמרה (Dendra2) בכל המיטוכונדריה (מהעכבר המיטוכונדריה הניתן להפעלה פוטו-אקטיבית [PhAMנכרת]). קו התאים היציב שנוצר מאפשר התמיינות תאים לאחר השבתה של הגן האמונטלי SV40 TAg והפעלה פוטו-אקטיבית של תת-קבוצה של מיטוכונדריה הגורמת למתג בפלואורסצנטיות מירוק לאדום. השימוש ב-mitoDendra2-GECs מאפשר הדמיה חיה של אירועי התפלגות, איחוי וביקוע של מיטוכונדריה פלואורסצנטית מבלי להכתים את התאים.
Introduction
הגלומרולוס חיוני לסינון הדם על ידי הגבלת המעבר של מולקולות גדולות דרך מחסום הסינון הגלומרולרי 1,2. הגלומרולוס מכיל ארבעה סוגי תאים: תאי אפיתל קודקודיים, פודוציטים (תאי אפיתל קרביים), תאי אנדותל גלומרולריים (GEC) ותאים מסנגיאליים3. האנדותל הגלומרולרי מאופיין במבנה כלי דם ייחודי, בהתאם לנוכחות של fenestrae הנדרשת לנפחי סינון גדולים4. המשטח האפיקלי של האנדותל הגלומרולרי מכוסה בשכבת גליקוקליקס טעונה שלילית ובשכבה הנקראת שכבת פני השטח של האנדותל היוצרת רווח בין האנדותל לדם. מבנה זה מספק סלקטיביות מטען גבוהה המגבילה את המעבר של מולקולות טעונות שלילית כגון אלבומין ומניעת הידבקות לויקוציטים וטסיות דם5.
GECs רגישים מאוד לשינויים מטבוליים, כגון היפרגליקמיה הקשורה לסביבה הסוכרתית. ואכן, סוכרת מובילה לזרימת דם מוגברת של חומרים רעילים, לרוויה של מסלולי חילוף החומרים של הגלוקוז ולהפרעה במאזן החיזור התאי 3,6. יתר על כן, העלייה בכמות החמצן הריאקטיבי גורמת לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה, מה שמשפיע על תפקוד האנדותל7.
המטרה הכוללת של הפרוטוקול הנוכחי היא לבודד תאי אנדותל גלומרולריים מונצחים עם תכונות מיטוכונדריאליות פלואורסצנטיות. ואכן, לתרבית התאים של GECs ראשוניים יש מחזור התפשטות מוגבל וסנסנציה מוקדמת8. בנוסף, נוכחות של מיטוכונדריה פלואורסצנטית מסייעת לבחון אירועי ביקוע ואיחוי בתגובה להיפרגליקמיה או כל טיפול אחר. כשיטה חלופית, מעבדות אחרות השתמשו ב-h-TERT כדי להנציח תאים במבחנה9.
השיטה המתוארת כאן מאפשרת בידוד של תאי האנדותל הגלומרולריים mitoDendra2 המונצחים מותנה מחיות בנות 4-6 שבועות (איור 1). פרוטוקול מפורט זה מתאר את השימוש בעכברים מהונדסים (H-2K b-tsA58) המכילים את נגיף הסימיאן 40 אנטיגן גידולי גדול (SV40 TAg) גן10,11 ליצירת תאים אימורטליים מותנים תרמולביליים. תוצר הגן tsA58 TAg מתפקד בטמפרטורה המתירנית של 33 מעלות צלזיוס תחת שליטתו של מקדם האגפים 5' הבלתי ניתן להשראה של הגן H-2K b של העכבר, אשר מוגבר מעל הרמות הבסיסיות עם חשיפה לגמא אינטרפרון (IFNγ), ובכך שומר על פנוטיפ ההתפשטות המותנה12. H-2Kb מתפרק במהירות בטמפרטורה הלא מתירנית של 37 מעלות צלזיוס בהיעדר IFNγ, מסיר את הפונקציה המונצחת של tsA58Tag בתאים ומאפשר לתאים לפתח פנוטיפ ממוין יותר13,14,15. חצייה אופציונלית של עכברי H-2Kb-tsA58 מהונדסים עם עכברי PhAM, המבטאים מיטוכונדריה ספציפית (תת-יחידה VIII של ציטוכרום c אוקסידאז) דנדרה2-ירוקה, מאפשרת זיהוי חי של מיטוכונדריה פלואורסצנטית16. פלואורסצנציה ירוקה של Dendra2 עוברת לפלואורסצנציה אדומה לאחר חשיפה ללייזר 405 ננומטר16. כאשר המיטוכונדריה מתמזגים לאחר החלפת תמונות, הם יוצרים צורות מוארכות שנראות צהובות מחילופי חומרים ירוקים וצהובים או נראות אדומות כאשר הן עוברות ביקוע 7,17. MitoDendra2-GECs הם כלי נהדר לחקר התגובות התאיות של מיטוכונדריה של GEC לגירויים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים המתוארים כאן אושרו על ידי IACUC בבית הספר לרפואה של אייקן בהר סיני. השתמשנו בשלושה עכברים זכרים (H-2Kb-tsA58 עכברים מהונדסים עם מיטוכונדריה הניתנת להפעלה פוטו-אקטיבית [PhAM]) שנרכשו ממעבדת ג'קסון ושמרנו על דיאטת צ'או רגילה.
1. תנאי עבודה והכנות
- נקו את חלל העבודה בתוך מכסה המנוע עם זרימה למינרית באמצעות 70% אתנול ואור UV-C.
- מכינים את מאגרי הכביסה של החרוז. הכינו את בופר-1 באמצעות 0.1 M נתרן פוספט ב-pH 7.4-8.0, בופר-2 באמצעות 1x תמיסת מלח עם חיץ פוספט (PBS) ללא סידן ומגנזיום בתוספת 0.1% אנטיגן בסרום בקר (BSA), 3 mM EDTA, pH 7.4 ו-buffer-3 באמצעות 0.2 M Tris עם 0.1% BSA, pH 8.5.
2. רכז חלקיקים מגנטיים
- הכנת חרוזים מגנטיים
- בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, ערבבו בעדינות 200 μL של חרוזים מגנטיים (4 x 108 חרוזים) עם 200 μL של buffer-1.
הערה: יש להכין 200 מיקרו-ליטר של חרוזים מגנטיים לכל עכבר יום אחד לפני קצירת הרקמות. החרוזים ישמשו לקצירת הגלומרולי. - מניחים את הצינור ברכז חלקיקים מגנטיים למשך דקה אחת, ולאחר מכן שאפו בזהירות את הסופרנטנט. הסר את הצינור מהמגנט ושלח מחדש את החרוזים השטופים ב 200 μL של buffer-1.
- מניחים את הצינור המכיל את החרוזים המגנטיים ברכז החלקיקים המגנטיים למשך דקה אחת ושאפו בעדינות את הסופרנטנט.
- השבת את קבוצות הטוסיל החופשיות על ידי שטיפת החרוזים המגנטיים 2x, 5 דקות כל אחת, באמצעות 200 μL של buffer-2 על ידי הצבת הצינור ברכז החלקיקים המגנטיים והשלכת המאגר.
- דגירה של החרוזים המגנטיים ב-200 μL של buffer-3 במשך 24 שעות ב-4 °C, או במשך 4 שעות ב-37 °C, כדי להשבית את קבוצות הטוסיל החופשיות הנותרות. מניחים את הצינור ברכז המגנטי למשך דקה אחת, שאפו בעדינות את הסופרנטנט והשליכו אותו.
- לשטוף את החרוזים המגנטיים 1x עם 200 μL של buffer-2 במשך 5 דקות ב 4 °C. החזירו את הצינור לרכז המגנטי למשך דקה אחת ושאפו בעדינות את הסופר-נט. הסר את הצינור מהרכז המגנטי והשהה את החרוזים המגנטיים ב-200 μL של buffer-2 כדי לקבל 4 x 108 חרוזים / מ"ל.
הערה: בשלב זה, ניתן להשאיר את החרוזים ב 4 מעלות צלזיוס עד 15 ימים.
- בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, ערבבו בעדינות 200 μL של חרוזים מגנטיים (4 x 108 חרוזים) עם 200 μL של buffer-1.
3. בידוד של תאים גלומרולריים בכליות עכבר
- הכן את חומר הזילוף: מזרק 30 מ"ל, מחט פרפר 25 גרם. הכינו את חומר הבידוד: צלחת סטרילית בקוטר 10 ס"מ, אזמל, רכז חלקיקים מגנטיים, מסננת תאים 40 מיקרומטר, מסננת תאים 100 מיקרומטר.
- הכינו 100 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת (HBSS) של האנק בתוספת 1% אנטיביוטיקה והתאימו את ה-pH ל-7.35. סנן את התמיסה עם מסנן 0.2 מיקרומטר ושמור אותה מתחת למכסה המנוע כדי למנוע זיהום.
- ערבבו 200 μL של חרוזים מגנטיים משלב 2.1.6 עם 20 מ"ל של HBSS אחד.
הערה: עבור כל עכבר, יהיה צורך ב-200 μL של חרוזים מדוללים ב-20 מ"ל של HBSS 1x. - הכינו אליקוט של 1 מ"ל של קולגן מסוג II (125 CDU/מ"ג) ב-1 מ"ג/מ"ל בתמיסת HBSS אחת, pH 7.35. חממו מראש את RPMI עם 10% FCS בינוני באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מחממים מראש את תרבית תאי האנדותל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (ראו טבלת חומרים לפרטים).
הערה: ה-RPMI ישמש לנטרול הקולגן. - מצפים מראש שתי בארות של צלחת 6 בארות עם 2 מ"ל של 10 מיקרוגרם / מ"ל קולגן IV (1 מ"ל / טוב) במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את הצלחת 3x עם 1x PBS כדי להסיר את החומצה האצטית המשמשת לדילול הקולגן. השתמש בצלחות המצופות מיד או אחסן אותן בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שבועות.
הערה: עדיף לאטום את הצלחות עם סרט שקוף כדי למנוע התייבשות. ציפוי הקולגן מקל על חיבור התאים לצלחת. - נקו ועקרו את כל כלי הניתוח באיור 2 על-ידי שימוש ב-70% אתנול ולאחר מכן שימוש אוטומטי בהם למשך 30 דקות. נקו את סביבת העבודה הכירורגית עם 70% אתנול.
- הרדימו את העכברים בהזרקה תוך-צפקית של קטמין/קסילזין (10 מ"ג/מ"ל קטמין ו-1 מ"ג/מ"ל קסילזין). כדי לוודא שהחיה מורדמת במלואה, בדוק את רפלקס צביטה בבוהן.
- תקן את כפות העכבר עם 19 מחטי G כדי להחזיק אותו במקומו על פלטפורמת דיסקציה. נקו את החזה ואת הבטן עם 70% אתנול, ופתחו את הבטן לאורך החזה עם מספריים a (איור 2).
- החדירו מחט פרפר לחדר השמאלי (איור 3A) והזריקו כ-100 μL מתמיסת החרוזים (משלב 1.2) כדי להרחיב את זרימת הדם.
- שברו בזהירות את הווריד הנבוב התחתון מתחת לכליות בעזרת מחט של 19 גרם (איור 3A). המשך את הזלוף שהחל בשלב 3.9.
הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במשאבה קטנה במהירות: 18.0+, זמן: 5 דקות. זלוף טוב חשוב לקצור מספר רב של גלומרולי הנושא חרוזים מגנטיים. זהו הליך שאינו הישרדותי/ סופי. - הסירו בעדינות את רקמת השומן עם פינצטה וכלו את שתי הכליות עם מספריים כירורגיים דקים c (איור 2) והכניסו אותן לצלחת עם 1 מ"ל של HBSS 1x על קרח. טחנו את הכליה עם מספריים b (איור 2) ואז עם אזמל סטרילי לחתיכות קטנות של 1 מ"מ כפי שמוצג באיור 3B.
- לאחר מכן, לדגור את הכליה הטחונה עם 1 מ"ל של collagenase סוג II משלב 3.4 במשך 35 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם הטיה עדינה באמצעות שייקר אופקי. יש לעכל את הרקמה לחלוטין לאחר שלב זה, כפי שמוצג באיור 3C.
- הוסיפו 4 מ"ל של RPMI עם 10% FBS (משלב 3.4) כדי לנטרל את הקולגן. סננו את הרקמה המעוכלת דרך מסננת תאים סטרילית של 100 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מ"ל. השתמש בתחתית צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל כדי לערבב את הרקמה המעוכלת כנגד המסננת כדי לאפשר לגלומרולי לעבור.
- יש לשטוף את מסננת התאים ב-15 מ"ל של HBSS 1x ולאחר מכן לבצע צנטריפוגה של הזרימה ב-200 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. בשלב זה, הכדור מכיל שלוש שכבות; החרוזים עם הגלומרולי נראים בשכבה האמצעית של הצינור, השכבה העליונה מורכבת ממבנים קטנים יותר כמו צינוריות, והשכבה התחתונה היא פסולת (איור 3D).
- שאפו בזהירות את הסופרנטנט ואת השכבה הלבנה העליונה. הכדור הנותר מכיל את החרוזים הנושאים את הגלומרולי והפסולת (איור 3D). השהה את הכדור עם 1.5 מ"ל של HBSS 1x והעבר לצינור 2 מ"ל.
- הניחו את הצינור ברכז המגנטי (איור 3E), שאפו את הסופר-נטנט, ואז שטפו את החרוזים פי 2 עם 1 מ"ל של HBSS אחד; בשלב זה, הניחו 20 μL מתרחיף התאים על שקופית כדי לאמת את נוכחותם של גלומרולי מתחת למיקרוסקופ (איור 3F; גלומרולוס [חץ שחור], וכמה חרוזים [חיצים צהובים] בתרחיף).
- שאפו בזהירות את הסופרנטנט, החזירו את הכדור למדיום צמיחת תאי האנדותל (Table of Materials), והעבירו אותו לצינור נקי של 2 מ"ל. מוסיפים 2 μL של IFNγ (100 U/mL) לצינור ומצפים את התאים לבאר אחת של צלחת 6 בארות. לדגור על התאים ב 33 מעלות צלזיוס.
- לאחר 3 ימים של תרבית, בזהירות לשנות את המדיום על ידי pipetting החוצה 1 מ"ל של המדיום והחלפתו עם 1 מ"ל של מדיה טרייה. בשלב זה, התאים הטרוגניים עם תערובת של תאים גלומרולריים (איור 4G).
הערה: בתרבית הצומחת, תהיה תערובת של תאים גלומרולריים וכמה חרוזים מגנטיים (איור 4G). שימו לב שכל התאים צריכים להראות מיטוכונדריה ירוקה ופלואורסצנטית. - לאחר 7 ימים של תרבית, לחלוטין לשאוף את המדיום ולהחליף אותו עם 2 מ"ל טרי של מזון צמיחת תאי אנדותל בתוספת IFNγ (100 U / mL). בשלב זה התאים מתחילים להתרבות אך הם עדיין הטרוגניים (איור 4A).
- לאחר 10 ימים של תרבית כאשר התאים מגיעים למפגש של ~80%, מעבירים את התאים באמצעות טריפסין כמתואר בשלב 5.1 ואז מעבירים אותם לתוך בקבוק T25 המצופה בקולגן IV.
- לאחר שבוע אחד (סה"כ ~ 21 ימים של תרבית), להעביר את התאים בקבוק T75 מצופה קולגן IV.
4. הכנת חרוזים לבידוד תאי אנדותל
- התחילו בציפוי חרוזי הכבשים נגד חולדות בנוגדן CD31 נגד עכברים 3,18,19. השתמש 10 μL של חרוזים עבור כל בקבוק T75.
- יש לשטוף 10 μL של חרוזים 3x עם 200 μL של 1x PBS בתוספת 0.1% BSA, 2 mM EDTA, 1% פניצילין/סטרפטומיצין. הניחו את הצינור במגנט הרכז כדי לקטר את חיץ הכביסה בכל פעם.
- יש להשהות את החרוזים ב-200 μL של PBS, 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% פניצילין/סטרפטומיצין. הוסיפו 4.8 μL של נוגדן CD31 נגד עכברים 7,18,19, הניחו את השפופרת על שייקר אופקי וערבבו בעדינות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן השאירו את הצינור על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
5. בידוד תאי האנדותל הגלומרולרי עם חרוזים מצופים CD31
- יש להוסיף 3 מ"ל של 0.25% טריפסין לבקבוק T75 ולדגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לנטרל את הטריפסין עם 3 מ"ל של מדיום צמיחת אנדותל, להעביר את התאים לצינור 15 מ"ל, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות.
- שאפו את הסופר-נטנט ושטפו את התאים ב-1 מ"ל של PBS המכיל 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% פניצילין/סטרפטומיצין. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות.
- יש להשעות את הכדור ב-200 μL של חרוזים מצופים שהוכנו בשלב 4, ולהוסיף 800 μL של PBS המכיל 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% פניצילין/סטרפטומיצין. דגירה על התאים במשך 45 דקות עם רעידות מתמשכות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
- מניחים את הצינור ברכז המגנטי ושוטפים את התאים 4x עם PBS אחד המכיל 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% פניצילין/סטרפטומיצין. החזירו את התאים ל-3 מ"ל של מדיום גדילת אנדותל בתוספת 100 U/mL IFNγ.
- צלחת 1.5 מ"ל של תאים/באר בארות מצופות קולגן IV על צלחת 6 בארות. תרבית את התאים בתנאים מתירניים ב 33 מעלות צלזיוס.
הערה: התאים המבודדים מבטאים אנטיגן T גדול מסוג T tsA58 של נגיף סימיאן 40 (SV40), מה שמאפשר הפעלה של התפשטות רציפה בטמפרטורה של 33 מעלות צלזיוס (מצב מתירני). - לאחר 4 ימים בתרבית, הסר 750 μL של המדיום והחלף אותו עם אותו נפח של מדיום טרי בתוספת 100 U / mL IFNγ.
- לאחר 10 ימים עד 14 ימים של תרבית, בדקו אם יש מושבות GECs חיוביות ל-CD31 (איור 4C) שמבטאות מיטוכונדריה פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם מסנן של 488 ננומטר.
- לאחר 21 ימים של תרבית, התאים עשויים להגיע למפגש של 80%-90%; להעביר אותם לתוך בקבוקון T25. לאחר הגעה למפגש, תאים יכולים להישמר עם בינוני גידול RPMI ו 10% FCS.
הערה: לפני שהם מגיעים למפגש, התאים עשויים להיראות הטרוגניים (איור 4B). עם זאת, ברגע שהם נפגשים, הם רוכשים מורפולוגיה של אבן מרוצפת. - בשלב זה, התאים יכולים להיות בהקפאה. עם ההגעה למפגש של 80%, יש להוסיף 3 מ"ל של טריפסין 0.25% לתאים ולדגור אותם ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לנטרל את הטריפסין עם נפח שווה של מדיום צמיחה בתוספת 10% FBS.
- צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות. השליכו את הסופר-נאטנט והחזירו את התאים ל-3 מ"ל של מדיום מקפיא (RPMI, 20% FBS, 10% DMSO). Aliquot את התאים בצינורות קריו ולאחסן אותם בטמפרטורת אדי חנקן נוזלי.
6. טיפוח המיטודנדרה2-GECs
- הפשירו את התאים מהקריואליקוט, משלב 5.10, באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והעבירו אותם לצינור של 15 מ"ל עם 10 מ"ל של מדיום צמיחת אנדותל מחומם מראש.
- צנטריפוגה המתלה ב 200 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את המדיום, והעבר את הכדור לבקבוק תרבית התאיםT25 ס"מ 2 ס"מ מצופה קולגן IV עם מדיום צמיחת תאי אנדותל מחומם מראש בתוספת 100 U/mL IFNγ ודגירה בטמפרטורה של 33 מעלות צלזיוס.
- שנה את המדיום למחרת. כאשר התאים מגיעים למפגש של 70%-80%, בדרך כלל לאחר 5 ימים, מעבירים אותם לבקבוק תרבית תאים בגודל T75 ס"מ2 .
- כדי להתמיין בין התאים לפנוטיפ אנדותל, העבירו את התאים לתנאים לא מתירניים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במדיית גדילה ללא IFNγ.
7. העברת מיטודנדרה2-GECs
- הסר את המדיום, לשטוף את התאים עם PBS, ולהוסיף 3 מ"ל של חם 0.25% טריפסין-EDTA פתרון (T75 ס"מ2 בקבוקון), דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- כאשר התאים מנותקים, מוסיפים 5 מ"ל של מדיום גדילה ופיפטה למעלה ולמטה. צנטריפוגה של המתלים ב 200 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהעביר את התאים בקבוק חדש מצופה קולגן IV או צלחת.
הערה: יש לבצע את המעבר פעם בשבוע ביחס של 1:4.
8. אפיון מיטודנדרה2-GECs
- בצע צביעה אימונופלואורסצנטית עבור CD31 על תאים ממוינים 7,18,19,20 (איור 4D). השתמש בסמנים אחרים כגון vWF ואיזולקטין-B4 וכן20.
- כדי לאשר את הספציפיות המיטוכונדריאלית של Dendra2, תייג תאים עם סמנים ספציפיים למיטוכונדריה על ידי דגירה של התאים במדיום גדילה המכיל 100 ננומטר של גשש מיטוכונדריאלי למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
- הסר את המדיום ושטוף את התאים בעדינות עם מדיום מחומם מראש ללא אדום פנול לביצוע הדמיה חיה.
הערה: לחלופין, ניתן לתקן תאים באמצעות קיבוע פורמלדהיד (4%) למשך 30 דקות ולאחר מכן לשטוף מספר פעמים ב- PBS. ניתן לאחסן תאים קבועים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ב-PBS אחד עד לשימוש. אישור עם ציטומטריה זרימה אפשרי גם: תאי תווית עם אנטי CD31, אנטי PECAM, אנטי CD45. GECs צריכים להכתים שלילי עבור סמני פודוציטים (סינפטופודין, Nphs1, Podxl), סמני תאים מזנגיאליים (PDGFRβ, אנגיוטנסינוגן), וסמני תאים צינוריים (Aquaporin, Aminopeptidase-N). סמנים אלה משמשים כבקרות שליליות. בשל ביטוי Dendra2 ספציפי למיטוכונדריה של תאים אלה, הימנע משימוש בערוץ FITC.
9. הדמיית תאים חיים של שינויים מבניים במיטוכונדריה בתגובה לעקה חמצונית או גלוקוז גבוה
- צלחת 1 x 105 GECs על צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ מצופה קולגן IV באמצעות מדיום צמיחת תאי אנדותל (טבלת חומרים). לאחר 24 שעות, שנה למדיום ללא פנול אדום. לתאים יש מיטוכונדריה ירוקה ופלואורסצנטית.
- הגדר את התא הסביבתי ל-37 מעלות צלזיוס, 5% לחות ו-5% CO2 שעה אחת לפני תחילת הניסוי.
- תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, השתמש במטרה של 40x/1.2 W כדי להתאים את המיקוד ולבחור את אזור העניין. לדגור על התאים עם 2mL של 5 mM או 25 mM גלוקוז במשך 60 דקות.
- חשוף את התאים ללייזר של 405 ננומטר (4% עוצמת לייזר) כדי להמיר תת-אוכלוסייה של מיטוכונדריה מירוק לאדום (איור 5A-B, D-E).
- השתמש בלייזר של 561 ננומטר כדי לעורר את Dendra2 במצב לא הפוך כדי לדמיין את הפלואורסצנציה האדומה. ראה את פרוטוקול החלפת התמונות המפורט כפי שתואר קודםלכן 16. אירועי ההיתוך מופיעים כפלואורסצנציה צהובה לאחר מספר דקות בגלל היתוך מטריצה ירוקה ומטריצה אדומה (איור 4C, F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במאמר זה מתואר פרוטוקול מפורט לבידוד של תאי אנדותל גלומרולריים מותנים עם מיטוכונדריה פלואורסצנטית יציבה (mitoDendra2-GECs) (איור 1). השימוש בעכברים צעירים בני 6-10 שבועות חיוני להשגת מספר משמעותי של תאים בריאים. לאחר 3 ימים של תרבית, תאים מתחילים לגדול לאט מהגלומרולי המבודד, כפי שמוצג באיור 3G. לאחר 7 ימים, התאים הם הטרוגניים, ומראים סוגי תאים גלומרולריים אחרים, כגון פודוציטים, תאי אפיתל קודקודיים ותאים מסנגיאליים (איור 4A). לאחר שהגיעו למפגש של 70% עד 80%, תאים גלומרולריים אחרים הוסרו באמצעות בחירה חיובית של תאי אנדותל עם חרוזי CD31 מגנטיים (איור 4B-C). ה-mitoDendra2-GECs ביטאו את CD31 (איור 4D) והיו שליליים עבור סמן פודוציטים, כפי שמוצג על-ידי צביעה שלילית של סינפטופודין (איור 4E-F).
תכונת המיטוכונדריה הפלואורסצנטית במיטודנדרה2-GECs מאפשרת לחקור את המורפולוגיה של המיטוכונדריה בתנאים שונים במבחנה. כאן בדקנו את ההשפעה של גלוקוז גבוה (25mM) על מבנה המיטוכונדריה של mitoDendra2-GECs (איור 5D-F). בהשוואה למיטוכונדריה המוארכת הנראית בתאים תחת גלוקוז תקין (5mM; איור 5A-C), קיטוע גבוה או ביקוע של מיטוכונדריה המושרה על-ידי גלוקוז, כפי שנצפה על-ידי מיטוכונדריה בולטת בצורת ספרואידים (איור 5E). יתר על כן, השתמשנו בלייזר של 405 ננומטר כדי לבצע פוטו-המרה של תת-אוכלוסייה נבחרת של מיטוכונדריה במיטו-דנדרה2-GEC חיה אחת (איור 5A,D). באיורים 5B ובאיור 5E מוצגת החלפה מוצלחת של מיטוכונדריה מירוק (488 ננומטר) לאדום (561 ננומטר) באזור שנבחר. חשוב לציין שהוא איפשר לחזות באירועי היתוך ב-mitoDendra2-GECs שגדלו תחת גלוקוז רגיל, כפי שניתן לראות על-ידי הפלואורסצנציה הצהובה הירוקה והאדומה כתוצאה מאיחוי מטריצת המיטוכונדריה (איור 5C). לעומת זאת, במיטו-דנדרה2-GEC שטופלה בגלוקוז גבוה, המיטוכונדריה היו מקוטעות והיו בעיקר אדומות (איור 5F), מה שמרמז על כך שבמסגרת הזמן שנבדקה, אירועי הביקוע/איחוי התעכבו או עוכבו בגלל הנזק שנגרם על ידי הטיפול בגלוקוז גבוה, וזה עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים18,19.
איור 1: תיאור מייצג של בידוד מורין GEC. הדיאגרמה מייצגת את השלבים המשמעותיים של בידוד GEC, החל מחדירת לב עכברים עם חרוזים מגנטיים כדי לבודד את גלומרולי הכליות, עיכול של קולגן, תרבית של תאים גלומרולריים, ולבסוף, טיהור של GEC באמצעות חרוזים מצופים CD31. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: תיאור של כריתת כליות. תמונה מייצגת של כל מכשירי הניתוח הסטריליים הדרושים לנתיחה. מספריים (a) נדרשים כדי לפתוח את העור של העכבר, וזוג נפרד של מספריים (b,c) נדרשים כדי לבודד את הכליה. פינצטה (d) ו-(e) נחוצות כדי להחזיק את העור. פינצטה (f) יש צורך לאסוף את הכליה מנותקת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: תיאור של קציר גלומרולי . (A) יש למזג את החדר השמאלי עם תמיסת חרוזי HBSS באמצעות מזרק של 20 מ"ל. לנקב את הווריד הנבוב התחתון עם מחט 19 גרם. (B) לאחר הזליפה, להסיר את השומן מן הכליה לחתוך אותו לחתיכות 1 מ"מ. (C) לעכל את הרקמה עם קולגן מסוג II. (D) לאחר העיכול והצנטריפוגה נוצרות שלוש שכבות; החרוזים הנושאים את הגלומרולי נמצאים בשכבה האמצעית, כפי שמציין החץ השחור. (E) להפריד את החרוזים המבודדים הנושאים את הגלומרולי באמצעות הרכז המגנטי. (F) תמונה מייצגת של גלומרולי מבודד טרי. (G) גידול תאים מגלומרולי מבודד לאחר 3 ימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: בדיקה מיטוכונדריאלית במבחנה. (A) תאים גלומרולריים לאחר 3 ימים של תרבית. (B) GEC לאחר 7 ימים. (D) טיהור GEC עם חרוזים עם תווית CD31. הדמיה מיקרוסקופית של צביעת CD31. (E) GECs שליליים עבור סינפטופודין. (F) פודוציטים מוכתמים בסינפטופודין (488 ננומטר, פלואורסצנציה ירוקה) כבקרה שלילית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: הדמיה מיקרוסקופית של היתוך מיטוכונדריאלי פלואורסצנטי במבחנה. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות מטרת מים של 40x. (א-ב) האזור שנבחר (עיגול אדום) הואר בקו של 405 ננומטר (4% עוצמת לייזר) עבור 300 איטרציות הלבנה במהירות של 6.3-12.61/פיקסל, כפי שתואר קודם לכן16. (א-ג) תאים במדיית צמיחה המכילים 5 mM גלוקוז; פלואורסצנציה ירוקה (488 ננומטר) מראה מיטוכונדריה בריאה. (ב,ה) המיטוכונדריה עברה פוטו-פוטו לאדום (567 ננומטר). (C) פלואורסצנציה צהובה מזהה אירוע היתוך פעיל של GEC שטופל בגלוקוז של 5mM. (D) תאים טופלו בגלוקוז גבוה 25 mM במשך 30 דקות. פלואורסצנציה ירוקה מראה מיטוכונדריה מקוטעת ו-(E) חלק שהועבר לאדום. (F) האיור מראה אירוע היתוך מופחת כפי שמוצג על ידי פלואורסצנטיות צהובה מופחתת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מיטוכונדריה חיונית לחילוף החומרים בתאים, להומאוסטזיס ולתגובות סטרס, ותפקוד לקוי שלהם קשור למחלות רבות, כולל מחלות כליות. למיטוכונדריה יש תפקיד ביצירה הפתולוגית של מיני חמצן תגובתי יתר (ROS), בוויסות רמות הסידן התוך-תאי, במסלולי המוות של התאים ובדינמיקה הציטוסקטלית 21,22,23.
הבידוד של GECs מורין הוא מאתגר בגלל מספרם הקטן, גודלם, גורמי המטריצה ואופיים התלויים זה בזה עם תאים גלומרולריים אחרים החיוניים להישרדותם. המאמר הנוכחי מציג פרוטוקול מפורט לבידוד GEC של עכבר. באופן ספציפי, השתמשנו בעכברים מהונדסים ככלי להשגת קווי תאים מונצחים מותנים עם פוטנציאל התפשטות גבוה. העכברים המהונדסים, המבטאים את נגיף סימיאן 40 (SV40) אנטיגן T גדול tsA58, מאפשרים הפעלה של התפשטות מתמשכת בתנאים מתירניים בטמפרטורה של 33 מעלות צלזיוס והיו כאן חצויים עם עכברים כריתת PHAM המבטאים פלואורסצנטיות ספציפית למיטוכונדריה. העכברים המהונדסים הכפולים הציעו כלי מצוין לחקר מבנה המיטוכונדריה. ואכן, PHAMכרת עכברים דובים במיטוכונדריה ספציפית (תת-יחידה VIII של ציטוכרום c אוקסידאז) דנדרה2 ירוק, מה שמאפשר זיהוי חי של מיטוכונדריה פלואורסצנטית ותצפית על אירועי ביקוע ואיחוי באמצעות החלפת תמונות ירוקה-אדומה16.
הפרוטוקול מורכב משלושה שלבים משמעותיים: חילוץ גלומרולי באמצעות חרוזים, התפשטות תאים גלומרולריים, וטיהור GEC לאחר מכן באמצעות חרוזי CD31 ברגע שהתאים נמצאים בתרבית. השימוש בעיכול אחד בלבד עם קולגן מספיק כדי לבודד תאים גלומרולריים. פרוטוקולים אחרים עושים שימוש בעיכול שני עם DNAse ופרוטאינאז24. עם זאת, שמנו לב לתפוקות תאים טובות יותר עם שלב עיכול אחד בלבד. הדנ"א עשוי להישאר פעיל ולהאט את התפשטות התאים. יתר על כן, ניתן לבודד את GEC באמצעות סינון דיפרנציאלי כפי שתואר קודםלכן 20, וזה לא תמיד קל בעת שימוש בכליות עכברים.
זה חיוני כדי autoclave כל כלי הניתוח לפני תחילת בידוד של הכליות ואת glomeruli כדי למנוע זיהום. יתר על כן, חשוב לסנן ולהשלים את הפתרונות עם אנטיביוטיקה כדי לחסל כל מקור של מזהמים. ואכן, זיהומים מיקופלסמה עלולים לגרום לציטופתולוגיה וכתוצאה מכך מפריעה לכל פרמטר הנמדד בתרבית תאים25.
הבידוד של glomeruli מסתמך על זלוף תוך לבבי של חרוזים. אין ספק, זלוף איטי עם 20 מ"ל של 1x חרוזים המכילים HBSS הוא חיוני כדי לקצור מספר גבוה של glomeruli. החרוזים יילכדו בגלומרולי, מה שמקל על טיהורם באמצעות רכז מגנטי. ניתן להכין ולאחסן את החרוזים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 15 יום לפני השימוש בהם כדי להקל על הליך הניסוי.
יתר על כן, עיכול גלומרולי עם רעידות מתמשכות הוא חיוני לניתוק מספר רב של גלומרולי מהכליה. מצד שני, הבידוד של GECs מורין הוא מאתגר בגלל גודלם הקטן ונוכחותם של תאים גלומרולריים אחרים. לכן, הבידוד המדורג של גלומרולי, הצמיחה של כל התאים הגלומרולריים בתרבית, והשימוש הבא בחרוזים מצופים CD31 לטיהור תאי אנדותל הם חיוניים, במיוחד להשגת מספר משמעותי יותר של GECs ברי קיימא ומתרבים. עם זאת, יש צורך באימות טוהר התאים עם ציטומטריה חיסונית וזרימה.
בנוסף, הפרוטוקול מתאר את האפיון של פנוטיפ ה-GEC ואת בדיקת ההיתוך/ביקוע של המיטוכונדריה במבחנה. mitoDendra2-GECs הם כלי מצוין לחקר התגובות התאיות של מיטוכונדריה GEC לגירויים שונים במבחנה ללא צורך בהעברה או הכתמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לסופרים אין אינטרסים כלכליים מתחרים להצהיר.
Acknowledgments
המחברים מודים לפרופסור צ'יג'יאנג הוא ולד"ר פו ג'יה על התובנות שלהם בבידוד תאי אנדותל בעכברים ומודים לפרופסור מונה זיידי על שסיפקו את העכבריםשנכרתו על ידי PhAM ודיונים חשובים. המחברים רוצים גם להודות למיקרוסקופיה CORE בבית הספר לרפואה של אייקן בהר סיני ולצוות על ההדרכה שקיבלנו. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות מענק R01DK097253 ומענק CDMRP של משרד ההגנה E01 W81XWH2010836 ל- I.S.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
References
- Daehn, I. S., Duffield, J. S. The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).
- Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).
- Lassen, E., Daehn, I. S. Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).
- Haraldsson, B., Jeansson, M.
- Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. The role of endothelial glycocalyx in health and disease. Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).
- Giacco, F., Brownlee, M. Oxidative stress and diabetic complications. Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).
- Daehn, I. S. Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease. Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Wieser, M., et al. hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).
- Jat, P. S., Sharp, P. A. Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).
- Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene. Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).
- Rops, A. L., et al. Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines. Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics--Mitochondrial fission and fusion in human diseases. The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Casalena, G. A., et al. The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).
- Qi, H., et al. Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility. Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).
- Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).
- Schuler, M. H., et al. Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration. Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).
- Tang, C., et al. Mitochondrial quality control in kidney injury and repair. Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).
- Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size. bioRxiv. , 827998 (2019).
- Dylewski, J. F., et al. Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype. MethodsX. 7, 101048 (2020).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
