Summary
Makalede, termolabil simian virüsü 40'ı eksprese eden transgenik farelerin böbreklerinden şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş glomerüler endotel hücrelerinin izole edilmesi ve foto-aktive edilebilir mitokondri, PhAMeksize edilmesi yöntemi açıklanmaktadır. Boncuklar, sindirim adımları, tohumlama ve GEC-CD31 pozitifin kültürlenmesi kullanılarak tüm böbreklerden glomerül izolasyonu prosedürünü açıklıyoruz.
Abstract
Glomerüler endotel hücresi (GEC) disfonksiyonu glomerüler filtrasyon bariyerinin parçalanmasını başlatabilir ve katkıda bulunabilir. Bazı glomerüler hastalıkların patogenezinde artmış mitokondriyal oksidatif stres, GEC disfonksiyonuna neden olan bir mekanizma olarak önerilmiştir. Tarihsel olarak, GEC'lerin in vivo modellerden izole edilmesi, saf kültürlerin glomerüllerden izole edilmesindeki zorluklar nedeniyle oldukça zor olmuştur. GEC'lerin in vitro karmaşık büyüme gereksinimleri ve çok sınırlı bir ömrü vardır. Burada, şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş GEC'leri floresan mitokondri ile izole etme ve kültürleme prosedürünü açıklıyoruz, bu da mitokondriyal fisyon ve füzyon olaylarının izlenmesini sağlıyor. GEC'ler, termolabil SV40 TAg'yi (Immortomouse'tan) ifade eden, proliferasyonu şartlı olarak teşvik eden ve hücre farklılaşmasını baskılayan çift transgenik bir farenin böbreklerinden ve tüm mitokondrilerde foto-dönüştürülebilir bir floresan proteinden (foto-aktive edilebilir mitokondri [PhAMeksize edilmiş] fareden) izole edildi. Üretilen kararlı hücre hattı, ölümsüzleştirici SV40 TAg geninin inaktivasyonundan sonra hücre farklılaşmasına ve bir mitokondri alt kümesinin foto-aktivasyonuna izin verir ve floresanda yeşilden kırmızıya geçişe neden olur. MitoDendra2-GEC'lerin kullanımı, floresan mitokondrinin dağılımının, füzyonunun ve fisyon olaylarının hücreleri boyamadan canlı görüntülenmesini sağlar.
Introduction
Glomerulus, büyük moleküllerin glomerüler filtrasyon bariyeri 1,2'den geçişini kısıtlayarak kan filtrasyonu için kritik öneme sahiptir. Glomerulus dört hücre tipi içerir: parietal epitel hücreleri, podositler (viseral epitel hücreleri), glomerüler endotel hücreleri (GEC) ve mezangial hücreler3. Glomerüler endotel, büyük filtrasyon hacimleri için gerekli olan fenestra varlığına göre benzersiz bir vasküler yapı ile karakterizedir4. Glomerüler endotelin apikal yüzeyi, negatif yüklü bir glikokaliks tabakası ve endotel ile kan arasında bir boşluk yaratan endotel yüzey tabakası adı verilen bir kat ile kaplıdır. Bu yapı, albümin gibi negatif yüklü moleküllerin geçişini kısıtlayan, lökosit ve trombosit yapışmasını önleyen yüksek yüklü seçicilik sağlar5.
GEC'ler, diyabetik çevre ile ilişkili hiperglisemi gibi metabolik değişikliklere karşı çok hassastır. Gerçekten de, diyabet zararlı maddelerin dolaşımının artmasına, glikoz metabolizması yollarının doygunluğuna ve bozulmuş hücresel redoks dengesine yol açar 3,6. Ayrıca, reaktif oksijen türlerindeki artış, endotel fonksiyonunu etkileyen mitokondriyal disfonksiyona nedenolur 7.
Mevcut protokolün genel amacı, floresan mitokondriyal özelliklere sahip ölümsüzleştirilmiş glomerüler endotel hücrelerini izole etmektir. Gerçekten de, primer GEC'lerin hücre kültürü sınırlı bir proliferatif döngüye ve erken yaşlanmaya sahiptir8. Ek olarak, floresan mitokondrinin varlığı, hiperglisemi veya başka herhangi bir tedaviye yanıt olarak fisyon ve füzyon olaylarının incelenmesine yardımcı olur. Alternatif bir yöntem olarak, diğer laboratuvarlar in vitro9 hücrelerini ölümsüzleştirmek için h-TERT kullandılar.
Burada tarif edilen yöntem, şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş mitoDendra2 glomerüler endotel hücrelerinin 4-6 haftalık hayvanlardan izole edilmesini sağlar (Şekil 1). Bu ayrıntılı protokol, termolabil şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş hücreler üretmek için simian virüsü 40 büyük tümör antijeni (SV40 TAg) geni10,11'i barındıran transgenik farelerin (H-2Kb-tsA58) kullanımını açıklar. tsA58 TAg gen ürünü, fare H-2Kb geninin indüklenebilir 5' yan promotörünün kontrolü altında 33 ° C'lik izin verilen sıcaklıkta işlevseldir, bu da interferon gamaya (IFNγ) maruz kalındığında bazal seviyelerin üzerine çıkarılır, bu nedenle koşullu proliferasyon fenotip12'yi korur. H-2K b, IFNγ'nun yokluğunda izin verilmeyen 37 ° C'lik sıcaklıkta hızla parçalanır, tsA58Tag'in hücrelerdeki ölümsüzleştirme işlevini ortadan kaldırır ve hücrelerin daha farklılaşmış bir fenotip13,14,15 geliştirmesine izin verir. H-2Kb-tsA58 transgenik farelerin, mitokondriye özgü (sitokrom c oksidazın alt birimi VIII) Dendra2-yeşilini ifade eden PhAM fareleri ile isteğe bağlı geçişi, floresan mitokondri16'nın canlı tespitine izin verir. Dendra2 yeşil floresan, 405 nm lazer16'ya maruz kaldıktan sonra kırmızı floresana geçer. Mitokondri foto-anahtarlamadan sonra kaynaştığında, yeşil ve sarı malzemenin değişiminden sarı görünen veya fisyona uğradıklarında kırmızı görünen uzun şekiller oluştururlar 7,17. MitoDendra2-GEC'ler, GEC mitokondrisinin farklı uyaranlara hücresel tepkilerini incelemek için harika bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm hayvan prosedürleri, Sina Dağı'ndaki Icahn Tıp Fakültesi'ndeki IACUC tarafından onaylanmıştır. Jackson laboratuvarından satın alınan ve normal bir chow diyetinde tutulan üç erkek fare (foto-aktive edilebilir mitokondri [PhAM]'li H-2Kb-tsA58 transgenik fareler) kullandık.
1. Çalışma koşulları ve hazırlıklar
- Laminer akış davlumbazının içindeki çalışma alanını %70 etanol ve UV-C ışığı kullanarak temizleyin.
- Boncuk yıkama tamponlarını hazırlayın. pH 7.4-8.0'da 0.1 M sodyum fosfat kullanarak tampon-1'i, %0.1 sığır serum antijeni (BSA), 3 mM EDTA, pH 7.4 ile desteklenmiş kalsiyum ve magnezyum takviyesi olmayan 1x fosfat tamponlu salin (PBS) kullanarak tampon-2 ve %0.1 BSA, pH 8.5 ile 0.2 M Tris kullanarak tampon-3 yapın.
2. Manyetik parçacık yoğunlaştırıcı
- Manyetik boncukların hazırlanması
- 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, 200 μL manyetik boncukları (4 x 108 boncuk) 200 μL tampon-1 ile yavaşça karıştırın.
NOT: Doku hasadından 1 gün önce fare başına 200 μL manyetik boncuk hazırlayın. Boncuklar glomerülleri hasat etmek için kullanılacaktır. - Tüpü 1 dakika boyunca manyetik parçacık yoğunlaştırıcıya yerleştirin, ardından süpernatanı dikkatlice aspire edin. Tüpü mıknatıstan çıkarın ve yıkanmış boncukları 200 μL tampon-1'de yeniden askıya alın.
- Manyetik boncukları içeren tüpü manyetik parçacık yoğunlaştırıcısına 1 dakika boyunca yerleştirin ve süpernatanı nazikçe aspire edin.
- Manyetik boncukları her biri 2x, 5 dakika yıkayarak, tüpü manyetik parçacık yoğunlaştırıcısına yerleştirerek ve tamponu atarak 200 μL tampon-2 kullanarak serbest tosil gruplarını etkisiz hale getirin.
- Kalan serbest tosil gruplarını etkisiz hale getirmek için manyetik boncukları 4 ° C'de 24 saat boyunca 24 saat veya 37 ° C'de 4 saat boyunca 200 μL tampon-3'te inkübe edin. Tüpü manyetik yoğunlaştırıcıya 1 dakika boyunca yerleştirin, süpernatanı yavaşça aspire edin ve atın.
- Manyetik boncukları 1x, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 μL tampon-2 ile yıkayın. Tüpü manyetik yoğunlaştırıcıya 1 dakika boyunca geri yerleştirin ve süpernatanı nazikçe aspire edin. Tüpü manyetik yoğunlaştırıcıdan çıkarın ve 4 x 108 boncuk / mL elde etmek için manyetik boncukları 200 μL tampon-2'de yeniden askıya alın.
NOT: Bu aşamada boncukları 4 °C'de 15 güne kadar bırakmak mümkündür.
- 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, 200 μL manyetik boncukları (4 x 108 boncuk) 200 μL tampon-1 ile yavaşça karıştırın.
3. Fare böbrek glomerüler hücrelerinin izolasyonu
- Perfüzyon malzemesini hazırlayın: 30 mL şırınga, 25 G kelebek iğnesi. İzolasyon malzemesini hazırlayın: steril 10 cm çanak, neşter, manyetik parçacık yoğunlaştırıcı, 40 μm hücre süzgeci, 100 μm hücre süzgeci.
- % 1 antibiyotik ile desteklenmiş 100 mL 1x Hank's Balanced tuz çözeltisi (HBSS) hazırlayın ve pH'ı 7.35'e ayarlayın. Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtreyle filtreleyin ve kontaminasyonu önlemek için kaputun altında tutun.
- Adım 2.1.6'dan 200 μL manyetik boncukları 20 mL 1x HBSS ile karıştırın.
NOT: Her fare için, 20 mL HBSS 1x'te seyreltilmiş 200 μL boncuk gerekecektir. - 1x HBSS çözeltisinde, pH 7.35'te 1 mg / mL'de 1 mL kollajenaz tip-II (125 CDU / mg) aliquot hazırlayın. RPMI'yı 37 ° C'de bir su banyosunda% 10 FCS ortamı ile önceden ısıtın. Endotel hücre kültürü ortamını 37 °C'de önceden ısıtın (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: RPMI, kollajenazı nötralize etmek için kullanılacaktır. - 6 delikli bir plakanın iki kuyuğunu oda sıcaklığında 45 dakika boyunca 2 mL 10 μg / mL kollajen IV (1 mL / kuyu) ile ön kaplayın. Kollajeni seyreltmek için kullanılan asetik asidi çıkarmak için plakayı 3x 1x PBS ile yıkayın. Kaplanmış plakaları hemen kullanın veya 2-8 ° C'de 4 haftaya kadar saklayın.
NOT: Kurumayı önlemek için plakaların şeffaf bir filmle kapatılması tercih edilir. Kollajen kaplama, hücrelerin plakaya yapışmasını kolaylaştırır. - Şekil 2'deki tüm cerrahi aletleri% 70 etanol kullanarak ve daha sonra 30 dakika boyunca otoklavlayarak temizleyin ve sterilize edin. Cerrahi çalışma alanını %70 etanol ile temizleyin.
- Fareleri intraperitoneal ketamin / ksilazin (10 mg / mL ketamin ve 1 mg / mL ksilazin) enjeksiyonu ile anestezi altına alın. Hayvanın tamamen uyuşturulduğunu doğrulamak için, ayak parmağı sıkışma refleksini kontrol edin.
- Bir diseksiyon platformunda yerinde tutmak için farenin pençelerini 19 G iğnelerle sabitleyin. Göğsü ve karnını% 70 etanol ile temizleyin ve karın bölgesini göğüs boyunca makasla açın (Şekil 2).
- Sol ventriküle bir kelebek iğnesi yerleştirin (Şekil 3A) ve kan dolaşımını genişletmek için boncuk çözeltisinin yaklaşık 100 μL'sini (adım 1.2'den itibaren) enjekte edin.
- Böbreklerin altındaki inferior vena kavayı 19 G'lık bir iğne ile dikkatlice kırın (Şekil 3A). Adım 3.9'da başlatılan perfüzyona devam edin.
NOT: Alternatif olarak, bir mini pompa hızda: 18,0+, süre: 5 dakikada kullanılabilir. İyi perfüzyon, çok sayıda glomerül taşıyan manyetik boncukların toplanması için önemlidir. Bu hayatta kalmayan / terminal bir prosedürdür. - Yağ dokusunu cımbızla nazikçe çıkarın ve her iki böbreği de ince cerrahi makas c ile çıkarın (Şekil 2) ve buz üzerinde 1 mL 1x HBSS içeren bir plakaya koyun. Böbreği makasla bıçağı kesin b (Şekil 2) daha sonra steril bir neşterle Şekil 3B'de gösterildiği gibi 1 mm'lik küçük parçalara bölün.
- Daha sonra, kıyılmış böbreği 3.4. adımdan 1 mL kollajenaz tip II ile 37 ° C'de 35 dakika boyunca yatay bir çalkalayıcı kullanarak hafifçe eğerek inkübe edin. Doku bu adımdan sonra Şekil 3C'de gösterildiği gibi tamamen sindirilmelidir.
- Kollajenazı nötralize etmek için% 10 FBS (adım 3.4'ten itibaren) ile 4 mL RPMI ekleyin. Sindirilen dokuyu steril bir 100 μm hücre süzgecinden 50 mL'lik bir tüpe filtreleyin. Glomerüllerin geçmesine izin vermek için sindirilmiş dokuyu süzgecin üzerine karıştırmak için steril bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünün tabanını kullanın.
- Hücre süzgecini 15 mL 1x HBSS ile durulayın ve ardından akışı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj edin. Bu noktada, pelet üç katman içerir; glomerüllü boncuklar tüpün orta tabakasında görülebilir, üst tabaka tübüller gibi daha küçük yapılardan oluşur ve alt tabaka enkazdır (Şekil 3D).
- Süpernatant ve üst beyaz tabakayı dikkatlice aspire edin. Kalan pelet glomerülleri ve kalıntıları taşıyan boncukları içerir (Şekil 3D). Peleti 1,5 mL 1x HBSS ile yeniden askıya alın ve 2 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Tüpü manyetik yoğunlaştırıcıya yerleştirin (Şekil 3E), süpernatanı aspire edin ve ardından boncukları 1 mL 1x HBSS ile 2x yıkayın; Bu aşamada, mikroskop altında glomerüllerin varlığını doğrulamak için hücre süspansiyonunun 20 μL'sini bir slayta koyun (Şekil 3F; bir glomerulus [siyah ok] ve süspansiyondaki bazı boncuklar [sarı oklar]).
- Süpernatanı dikkatlice aspire edin, peleti endotel hücre büyüme ortamında (Malzeme Tablosu) yeniden askıya alın ve temiz bir 2 mL tüpe aktarın. Tüpe 2 μL IFNγ (100 U / mL) ekleyin ve hücreleri 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin. Hücreleri 33 ° C'de inkübe edin.
- 3 günlük kültürden sonra, ortamın 1 mL'sini pipetleyerek, 1 mL taze medya ile değiştirerek ortamı dikkatlice değiştirin. Bu aşamada, hücreler glomerüler hücrelerin bir karışımı ile heterojendir (Şekil 4G).
NOT: Büyüyen kültürde, glomerüler hücrelerin ve bazı manyetik boncukların bir karışımı olacaktır (Şekil 4G). Tüm hücrelerin yeşil, floresan mitokondri göstermesi gerektiğine dikkat edin. - 7 günlük kültürden sonra, ortamı tamamen aspire edin ve IFNγ (100 U / mL) ile desteklenmiş taze bir 2 mL endotel hücre büyüme ortamı ile değiştirin. Bu aşamada, hücreler çoğalmaya başlar, ancak yine de heterojendir (Şekil 4A).
- Hücreler ~% 80 akıcılığa ulaştığında 10 günlük kültürden sonra, hücreleri adım 5.1'de açıklandığı gibi tripsin kullanarak geçirin ve daha sonra kollajen IV ile kaplanmış bir T25 şişesine aktarın.
- 1 hafta sonra (toplam ~ 21 günlük kültür), hücreleri kollajen IV ile kaplanmış bir T75 şişesine geçirin.
4. Endotel hücre izolasyonu için boncukların hazırlanması
- Koyun anti-sıçan boncuklarını bir sıçan anti-fare CD31 antikoru 3,18,19 ile kaplayarak başlayın. Her T75 şişesi için 10 μL boncuk kullanın.
- 10 μL boncukları 3x, %0,1 BSA, 2 mM EDTA, %1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş 200 μL 1x PBS ile yıkayın. Her seferinde yıkama tamponunu pipetlemek için tüpü yoğunlaştırıcı mıknatısa yerleştirin.
- Boncukları 200 μL PBS,% 1 BSA, 2 mM EDTA,% 1 penisilin / streptomisin içinde yeniden askıya alın. 4.8 μL sıçan anti-fare CD31 antikoru 7,18,19 ekleyin, tüpü yatay bir çalkalayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca hafifçe karıştırın ve ardından tüpü gece boyunca 4 ° C'de tutun.
5. Glomerüler endotel hücrelerinin CD31 kaplı boncuklarla izole edilmesi
- Bir T75 şişesine 3 mL% 0.25 tripsin ekleyin ve hücreleri 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Tripsini 3 mL endotel büyüme ortamı ile nötralize edin, hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve ardından 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın.
- Süpernatantı aspire edin ve hücreleri% 1 BSA,% 1 mM EDTA,% 1 penisilin / streptomisin içeren 1 mL PBS içinde yıkayın. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj.
- Pelet, adım 4'te hazırlanan 200 μL kaplamalı boncukta yeniden askıya alın ve% 1 BSA, 2 mM EDTA,% 1 penisilin / streptomisin içeren 800 μL PBS ekleyin. Hücreleri 45 dakika boyunca 37 ° C'de,% 5 CO 2'de sürekli sallama ileinkübe edin.
- Tüpü manyetik yoğunlaştırıcıya yerleştirin ve hücreleri% 1 BSA,% 1 mM EDTA,% 1 penisilin / streptomisin içeren 1x PBS ile 4x yıkayın. Hücreleri, 100 U / mL IFNγ ile desteklenmiş 3 mL endotel büyüme ortamında yeniden askıya alın.
- 6 delikli bir plaka üzerinde kollajen IV kaplı kuyucuklarda 1,5 mL hücre/kuyu plakası. Hücreleri 33 ° C'de izin verilen koşullar altında kültürleyin.
NOT: İzole hücreler simian virus 40 (SV40) büyük T antijeni tsA58'i eksprese eder ve 33 °C'de sürekli proliferasyonun aktivasyonunu sağlar (izin verilen durum). - Kültürde 4 gün sonra, ortamın 750 μL'sini çıkarın ve 100 U / mL IFNγ ile desteklenmiş aynı hacimdeki taze ortamla değiştirin.
- 10 gün ila 14 günlük kültürden sonra, 488 nm filtreli bir epifloresan mikroskobu kullanarak floresan mitokondri eksprese eden CD31 pozitif GEC kolonilerinin (Şekil 4C) büyümesini kontrol edin.
- 21 günlük kültürden sonra, hücreler% 80 -% 90 akıcılığa ulaşmış olabilir; bunları bir T25 şişesine aktarın. Akıcılığa ulaştıktan sonra, hücreler RPMI büyüme ortamı ve% 10 FCS ile korunabilir.
NOT: Birleşmeye ulaşmadan önce, hücreler heterojen görünebilir (Şekil 4B). Bununla birlikte, bir kez birleştiklerinde, bir parke taşı morfolojisi kazanırlar. - Bu aşamada, hücreler kriyoprezerve edilebilir. % 80 akıcılığa ulaştıktan sonra, hücrelere 3 mL% 0.25 tripsin ekleyin ve bunları 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Tripsin'i% 10 FBS ile desteklenmiş eşit miktarda büyüme ortamı ile nötralize edin.
- 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj. Süpernatantı atın ve hücreleri 3 mL donma ortamında (RPMI,% 20 FBS,% 10 DMSO) yeniden askıya alın. Hücreleri kriyo-tüplerde alıkoyun ve sıvı azot buharı sıcaklığında saklayın.
6. MitoDendra2-GEC'lerin yetiştirilmesi
- Kriyoaliquot'taki hücreleri, adım 5.10'dan itibaren, 37 ° C'de bir su banyosunda çözün ve bunları 10 mL önceden ısıtılmış endotel büyüme ortamı ile 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Süspansiyonu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın. Ortamı çıkarın ve peleti, 100 U / mL IFNγ ile desteklenmiş önceden ısıtılmış endotel hücre büyüme ortamı ile kollajen IV kaplıT25 cm2 hücre kültürü şişesine aktarın ve 33 ° C'de inkübe edin.
- Ertesi gün ortamı değiştirin. Hücreler% 70 -% 80 akıcılığa ulaştığında, genellikle 5 gün sonra, onları bir T75cm2 hücre kültürü şişesine aktarın.
- Hücreleri endotel fenotipine ayırt etmek için, hücreleri IFNγ olmadan büyüme ortamında 37 ° C'de izin verilmeyen koşullara aktarın.
7. MitoDendra2-GEC'lerin geçişi
- Ortamı çıkarın, hücreleri PBS ile yıkayın ve 3 mL sıcak% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi (T75 cm2 şişe) ekleyin, 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Hücreler ayrıldığında, 5 mL büyüme ortamı ve yukarı ve aşağı pipet ekleyin. Süspansiyonu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın ve hücreleri yeni bir kollajen IV kaplı şişeye veya plakaya aktarın.
NOT: Passaging haftada bir kez 1:4 oranında yapılmalıdır.
8. MitoDendra2-GEC'lerin karakterizasyonu
- Diferansiye hücreler 7,18,19,20 üzerinde CD31 için immünofloresan boyama yapın (Şekil 4D). vWF ve Isolectin-B4 gibi diğer belirteçleri ve20'yi kullanın.
- Dendra2'nin mitokondriyal özgüllüğünü doğrulamak için, hücreleri 100 nM mitokondriyal izleyici içeren büyüme ortamında 37 ° C'de,% 5 CO2'de 30 dakika boyunca inkübe ederek mitokondriyal spesifik belirteçlerle etiketleyin.
- Ortamı çıkarın ve canlı görüntüleme yapmak için hücreleri fenol kırmızısı olmadan önceden ısıtılmış ortamla nazikçe yıkayın.
NOT: Alternatif olarak, hücreler 30 dakika boyunca formaldehit fiksatörleri (% 4) kullanılarak sabitlenebilir ve ardından PBS'de birkaç kez yıkanabilir. Sabit hücreler kullanıma kadar 4 °C'de 1x PBS'de saklanabilir. Akış sitometrisi ile bir doğrulama da mümkündür: hücreleri anti-CD31, anti-PECAM, anti-CD45 ile etiketleyin. GEC'ler podosit belirteçleri (sinaptopodin, Nphs1, Podxl), mezangial hücre belirteçleri (PDGFRβ, anjiyotensinojen ) ve tübüler hücre belirteçleri (Aquaporin, Aminopeptidaz-N) için negatif boyama yapmalıdır. Bu belirteçler negatif kontroller görevi görür. Bu hücrelerin mitokondriyal spesifik Dendra2 ekspresyonu nedeniyle, FITC kanalını kullanmaktan kaçının.
9. Oksidatif strese veya yüksek glikoza yanıt olarak mitokondri yapısal değişikliklerinin canlı hücre görüntülemesi
- Endotel hücre büyüme ortamı kullanılarak kollajen IV ile kaplanmış 35 mm'lik cam tabanlı bir çanak üzerinde 1 x 105 GEC plakası (Malzeme Tablosu). 24 saat sonra, fenol kırmızısı olmadan ortama geçin. Hücreler yeşil, floresan mitokondriye sahiptir.
- Deneyin başlamasından önce çevre odasını 37 °C, %5 nem ve %5 CO2 1 saate ayarlayın.
- Bir konfokal mikroskop altında, odağı ayarlamak ve ilgilenilen bölgeyi seçmek için 40x/1,2 W objektif kullanın. Hücreleri 60 dakika boyunca 2mL 5 mM veya 25 mM glikoz ile inkübe edin.
- Mitokondrinin bir alt popülasyonunu yeşilden kırmızıya foto-dönüştürmek için hücreleri 405 nm lazere (% 4 lazer gücü) maruz bırakın (Şekil 5A-B, D-E).
- Kırmızı floresanı görselleştirmek üzere Dendra2'yi dönüştürülmemiş durumda heyecanlandırmak için 561 nm lazeri kullanın. Daha önce açıklandığı gibi ayrıntılı fotoğraf anahtarlama protokolüne bakın16. Füzyon olayları, yeşil matriks ve kırmızı matriks füzyonu nedeniyle birkaç dakika sonra sarı floresan olarak ortaya çıkar (Şekil 4C, F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu makalede, şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş glomerüler endotel hücrelerinin stabil floresan mitokondri (mitoDendra2-GEC'ler) ile izolasyonu için ayrıntılı bir protokol tanımlanmıştır (Şekil 1). 6-10 haftalık genç farelerin kullanımı, önemli sayıda sağlıklı hücre elde etmek için gereklidir. 3 günlük kültürden sonra, hücreler Şekil 3G'de gösterildiği gibi izole glomerüllerden yavaşça büyümeye başlar. 7 gün sonra, hücreler heterojendir ve podositler, parietal epitel hücreleri ve mezangial hücreler gibi diğer glomerüler hücre tiplerini gösterir (Şekil 4A). %70 ila %80 akıcılığa ulaştıktan sonra, manyetik CD31 etiketli boncuklu endotel hücrelerinin pozitif bir seçimi kullanılarak diğer glomerüler hücreler çıkarıldı (Şekil 4B-C). MitoDendra2-GEC'ler CD31'i eksprese ettiler (Şekil 4D) ve sinaptopodin negatif boyama ile gösterildiği gibi podosit belirteci için negatifti (Şekil 4E-F).
MitoDendra2-GEC'lerdeki floresan mitokondriyal özellik, in vitro olarak çeşitli koşullar altında mitokondri morfolojisinin incelenmesine izin verir. Burada, yüksek glikozun (25mM) mitoDendra2-GEC'lerin mitokondri yapısı üzerindeki etkisini test ettik (Şekil 5D-F). Normal glikoz altındaki hücrelerde görülen uzamış mitokondri ile karşılaştırıldığında (5mM; Şekil 5A-C), belirgin sferoid şekilli mitokondri tarafından gözlenen yüksek glikoz kaynaklı parçalanma veya mitokondri fisyonu (Şekil 5E). Ayrıca, seçilen bir mitokondri alt popülasyonunu tek bir canlı mitoDendra2-GEC'de foto-dönüştürmek için 405 nm lazer kullandık (Şekil 5A, D). Şekil 5B ve Şekil 5E'de, seçilen alanda mitokondrinin yeşilden (488nm) kırmızıya (561 nm) başarılı bir şekilde foto-geçişi sunulmuştur. Daha da önemlisi, mitokondri matriks füzyonunun bir sonucu olarak sarı birleşmiş yeşil ve kırmızı floresan ile gözlemlenebileceği gibi, normal glikoz altında yetiştirilen mitoDendra2-GEC'lerdeki füzyon olaylarına tanık olmaya izin verdi (Şekil 5C). Buna karşılık, yüksek glukoz ile tedavi edilen mitoDendra2-GEC'de, mitokondri parçalandı ve esas olarak kırmızıydı (Şekil 5F), test edilen zaman diliminde, fisyon / füzyon olaylarının yüksek glikoz tedavisinin neden olduğu hasar nedeniyle geciktiğini veya inhibe edildiğini düşündürmektedir ve bu, önceki raporlar18,19 ile tutarlıdır.
Şekil 1: Murin GEC izolasyonunun temsili tanımı. Diyagram, böbrek glomerüllerini izole etmek için farelerin kalbini manyetik boncuklarla perfüze etmekten, kollajenazın sindiriminden, glomerüler hücrelerin kültüründen ve son olarak CD31 kaplı boncuklar kullanılarak GEC'nin saflaştırılmasından başlayarak GEC izolasyonunun önemli adımlarını temsil etmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Böbrek diseksiyonunun tanımı. Diseksiyon için gerekli tüm steril cerrahi aletlerin temsili görüntüsü. Farenin derisini açmak için makas (a) gereklidir ve böbreği izole etmek için ayrı bir makas çifti (b, c) gereklidir. Cildi tutmak için cımbız (d) ve (e) gereklidir. Disseke edilmiş böbreği toplamak için cımbız (f) gereklidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Glomerül hasadının tanımı . (A) 20 mL'lik bir şırınga kullanarak sol ventrikülü HBSS-boncuk çözeltisi ile perfüze edin. İnferior vena kavayı 19 G iğne ile delin. (B) Perfüzyondan sonra, yağı böbrekten çıkarın ve 1 mm'lik parçalara bölün. (C) Dokuyu kollajenaz tip II ile sindirmek. (D) Sindirim ve santrifüjlemeden sonra üç katman oluşur; glomerülleri taşıyan boncuklar, siyah okla gösterildiği gibi orta tabakadadır. (E) Manyetik konsantratör kullanarak glomerülleri taşıyan izole boncukları ayırın. (F) Yeni izole edilmiş glomerüllerin temsili görüntüsü. (G) 3 gün sonra izole glomerüllerden büyüyen hücreler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İn vitro mitokondriyal tahlil . (A) 3 günlük kültürden sonra glomerüler hücreler. (B) 7 gün sonra GEC. (D) GEC'nin CD31 etiketli boncuklarla saflaştırılması. CD31 boyamasının mikroskobik görüntülemesi. (E) GEC'ler sinaptopodin için negatiftir. (F) Negatif kontrol olarak sinaptopodin (488 nm, yeşil floresan) ile boyanmış podositler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Floresan mitokondriyal füzyonun in vitro mikroskobik görüntülemesi. Görüntüler, 40x su hedefi kullanılarak konfokal mikroskopla elde edildi. (A-B) Seçilen alan (kırmızı daire), daha önce açıklandığı gibi 6.3-12.61 / piksel hızında 300 ağartma yinelemesi için 405 nm çizgi (% 4 lazer gücü) ile aydınlatıldı16. (A-C) 5 mM glikoz içeren büyüme ortamındaki hücreler; yeşil floresan (488 nm) sağlıklı mitokondri gösterir. (B,E) Mitokondriler foto-kırmızıya (567 nm) dönüştürüldü. (C) Sarı floresan, 5mM glikoz ile muamele edilmiş GEC'nin aktif bir füzyon olayını tespit eder. (D) Hücreler 30 dakika boyunca 25 mM yüksek glikoz ile tedavi edildi. Yeşil floresan, parçalanmış mitokondri ve (E) foto-kırmızıya dönüştürülmüş bir kısmı gösterir. (F) Şekil, azaltılmış sarı floresan ile gösterildiği gibi azalmış bir füzyon olayını göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mitokondri, hücresel metabolizma, homeostaz ve stres yanıtları için kritik öneme sahiptir ve işlev bozuklukları böbrek hastalığı da dahil olmak üzere birçok hastalıkla bağlantılıdır. Mitokondri, aşırı reaktif oksijen türlerinin (ROS) patolojik oluşumunda, hücre içi kalsiyum düzeylerinin düzenlenmesinde, hücre ölüm yolaklarında ve sitoiskelet dinamiklerinde rol oynamaktadır21,22,23.
Murin GEC'lerin izolasyonu, az sayıları, boyutları, matris faktörleri ve hayatta kalmaları için gerekli olan diğer glomerüler hücrelerle birbirine bağımlı olmaları nedeniyle zordur. Mevcut makale, fare GEC yalıtımı için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Spesifik olarak, transgenik fareleri, yüksek proliferasyon potansiyeline sahip şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş hücre hatları elde etmek için bir araç olarak kullandık. Simian virüsü 40 (SV40) büyük T antijeni tsA58'i eksprese eden transgenik fareler, 33 ° C'de izin verilen koşullar altında sürekli proliferasyonun aktivasyonunu sağlar ve burada mitokondriyal spesifik floresan eksprese eden PHAMeksize edilmiş farelerle çaprazlanmıştır. Çift transgenik fareler, mitokondri yapısını incelemek için mükemmel bir araç sundu. Gerçekten de, PHAMeksize edilmiş fareler mitokondriyal spesifik (sitokrom c oksidazın alt ünitesi VIII) Dendra2 yeşilini taşır, bu da floresan mitokondrinin canlı tespitine ve yeşil-kırmızı foto-anahtarlama16 yoluyla fisyon ve füzyon olaylarının gözlemlenmesine izin verir.
Protokol üç önemli adımdan oluşur: boncuklar kullanarak glomerüllerin çıkarılması, glomerüler hücrelerin çoğalması ve hücreler kültüre girdikten sonra CD31 boncukları kullanılarak GEC'nin saflaştırılması. Kollajenaz ile sadece bir sindirimin kullanılması, glomerüler hücreleri izole etmek için yeterlidir. Diğer protokoller, DNAse ve proteinaz24 ile ikinci bir sindirimden yararlanır. Bununla birlikte, sadece bir sindirim adımıyla daha iyi hücre verimi olduğunu fark ettik. DNAse aktif kalabilir ve hücrelerin çoğalmasını yavaşlatabilir. Ayrıca, GEC, daha önce tarif edildiği gibi diferansiyel eleme kullanılarak izole edilebilir20, bu da farelerin böbreklerini kullanırken her zaman kolay değildir.
Kontaminasyonu önlemek için böbreklerin ve glomerüllerin izolasyonuna başlamadan önce tüm cerrahi aletlerin otoklavlanması çok önemlidir. Ayrıca, herhangi bir kirletici kaynağı ortadan kaldırmak için çözeltileri antibiyotiklerle filtrelemek ve desteklemek önemlidir. Gerçekten de, mikoplazma enfeksiyonları, hücre kültüründe ölçülen her parametreye müdahale eden sitopatolojiye neden olabilir25.
Glomerüllerin izolasyonu, boncukların intra-kardiyak perfüzyonuna dayanır. Elbette, 20 mL 1x HBSS içeren boncuklarla yavaş perfüzyon, çok sayıda glomerül toplamak için gereklidir. Boncuklar, manyetik bir konsantratör kullanarak saflaştırmalarını kolaylaştıran glomerüllerde sıkışıp kalacaktır. Boncuklar, deneysel prosedürü kolaylaştırmak için kullanılmadan önce 4 ° C'de 15 güne kadar hazırlanabilir ve saklanabilir.
Ayrıca, glomerüllerin sürekli sallanarak sindirilmesi, çok sayıda glomerülün böbrekten ayrılması için çok önemlidir. Öte yandan, murin GEC'lerin izolasyonu, küçük boyutları ve diğer glomerüler hücrelerin varlığı nedeniyle zordur. Bu nedenle, glomerüllerin kademeli izolasyonu, kültürdeki tüm glomerüler hücrelerin büyümesi ve daha sonra endotel hücrelerini saflaştırmak için CD31 kaplı boncukların kullanılması, özellikle daha önemli sayıda canlı ve şartlı olarak proliferatif GEC elde etmek için hayati öneme sahiptir. Bununla birlikte, immünoboyama ve akış sitometrisi ile hücrelerin saflığının doğrulanması gereklidir.
Ek olarak, protokol GEC fenotipinin karakterizasyonunu ve in vitro mitokondri füzyon / fisyon testini tanımlar. MitoDendra2-GEC'ler, GEC mitokondrisinin transfeksiyon veya boyama gerektirmeden in vitro olarak farklı uyaranlara hücresel tepkilerini incelemek için mükemmel bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan etmek için rekabet eden finansal çıkarları yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, farelerin endotel hücre izolasyonu konusundaki görüşleri için Profesör Cijiang He ve Dr. Fu Jia'ya teşekkür ediyor ve PhAMeksize edilmiş fareleri ve değerli tartışmaları sağladığı için Profesör Mone Zaidi'ye teşekkür ediyor. Yazarlar ayrıca, Sina Dağı'ndaki Icahn Tıp Fakültesi'ndeki Mikroskopi CORE'a ve aldığımız rehberlik için personele teşekkür etmek istiyorlar. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi R01DK097253 ve Savunma Bakanlığı CDMRP hibesi E01 W81XWH2010836'dan I.S.D.'ye verilen hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
References
- Daehn, I. S., Duffield, J. S. The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).
- Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).
- Lassen, E., Daehn, I. S. Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).
- Haraldsson, B., Jeansson, M.
- Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. The role of endothelial glycocalyx in health and disease. Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).
- Giacco, F., Brownlee, M. Oxidative stress and diabetic complications. Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).
- Daehn, I. S. Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease. Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Wieser, M., et al. hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).
- Jat, P. S., Sharp, P. A. Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).
- Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene. Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).
- Rops, A. L., et al. Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines. Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics--Mitochondrial fission and fusion in human diseases. The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Casalena, G. A., et al. The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).
- Qi, H., et al. Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility. Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).
- Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).
- Schuler, M. H., et al. Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration. Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).
- Tang, C., et al. Mitochondrial quality control in kidney injury and repair. Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).
- Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size. bioRxiv. , 827998 (2019).
- Dylewski, J. F., et al. Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype. MethodsX. 7, 101048 (2020).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
