Summary
Dit protocol beschrijft een calciumfosfaat-geïnduceerd abdominaal aorta-aneurysma (AAA) muismodel om de pathologische kenmerken en moleculaire mechanismen van AAAs te bestuderen.
Abstract
Een abdominaal aorta-aneurysma (AAA) is een levensbedreigende hart- en vaatziekte die wereldwijd voorkomt en wordt gekenmerkt door onomkeerbare verwijding van de abdominale aorta. Momenteel worden verschillende chemisch geïnduceerde murine AAA-modellen gebruikt, die elk een ander aspect van de pathogenese van AAA simuleren. Het calciumfosfaat-geïnduceerde AAA-model is een snel en kosteneffectief model in vergelijking met de angiotensine II- en elastase-geïnduceerde AAA-modellen. De toepassing van CaPO4-kristallen op de aorta van de muis resulteert in elastische vezelafbraak, verlies van gladde spiercellen, ontsteking en calciumafzetting geassocieerd met aortaverwijding. Dit artikel introduceert een standaardprotocol voor het CaPO 4-geïnduceerde AAA-model. Het protocol omvat materiaalvoorbereiding, de chirurgische toepassing van de CaPO4 op de adventitia van de infrarood abdominale aorta, het oogsten van aorta's om aorta-aneurysma's te visualiseren en histologische analyses bij muizen.
Introduction
Een abdominaal aorta-aneurysma (AAA) is een dodelijke hart- en vaatziekte die wordt gekenmerkt door permanente verwijding van de abdominale aorta, met hoge sterftecijfers zodra breuk optreedt. AAA wordt geassocieerd met veroudering, roken, mannelijk geslacht, hypertensie en hyperlipidemie1. Van verschillende pathologische processen is aangetoond dat ze bijdragen aan AAA-vorming, waaronder extracellulaire matrixvezelproteolyse, immuuncelinfiltratie en verlies van vasculaire gladde spiercellen. Momenteel blijven de pathologische mechanismen van AAA ongrijpbaar en zijn er geen bewezen geneesmiddelen voor de behandeling van AAA1. Onderzoek naar menselijke AAA is beperkt vanwege het bestaan van weinig menselijke aortamonsters; daarom zijn verschillende door chemische modificatie geïnduceerde dierlijke AAA-modellen vastgesteld en op grote schaal toegepast, waaronder subcutane angiotensine II (AngII) infusie, perivasculaire of intraluminale elastase-incubatie en perivasculaire calciumfosfaattoepassing2. Een veelgebruikt muismodel is de toepassing van calciumfosfaat (CaPO4) op de adventitia van de infrarood abdominale aorta, die kosteneffectief is en geen genetische modificatie vereist.
Directe periaortische toepassing van CaCl2 op de halsslagader van konijnen om aneurysmale verandering te induceren werd aanvankelijk gemeld door Gertz et al.3 en werd later toegepast op de abdominale aortatas van muizen. Het model is ontwikkeld door Yamanouchi et al. om de aortadilatatie te versnellen door CaPO4-kristallen in muizen4 te gebruiken. Infiltratie van CaPO4 in muizenaortavat veel pathologische kenmerken die zijn waargenomen in menselijke AAAs, waaronder diepgaande macrofaaginfiltratie, extracellulaire matrixafbraak en calciumafzetting. De risicofactoren van menselijke AAA, zoals hyperlipidemie, vergroten ook CaPO 4-geïnduceerde AAA bij muizen5. In tegenstelling tot AngII perfusie-geïnduceerde AAA bij ApoE-/- of LDLR-/- muizen, komt CaPO 4-geïnduceerde AAA voor in het infraroodaortagebied, dat menselijke AAA nabootst. Momenteel is deze methode op grote schaal toegepast om de gevoeligheid voor AAA-ontwikkeling bij genetisch gemodificeerde muizen te beoordelen en de anti-AAA-effecten van geneesmiddelente evalueren 6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierstudies werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee van het Peking University Health Science Center en werden goedgekeurd door de Biomedical Ethics Committee van de Universiteit van Peking (LA2015142). Alle muizen voor een operatie werden verdoofd met isofluraan (1,5% -2%) en de anesthesie werd zorgvuldig gecontroleerd om pijn of ongemak voor de muizen te voorkomen.
1. Voorbereiding
- Snijd 0,3 cm brede stroken poedervrije rubberen handschoenen en gaas.
- Koop 8-10 weken oude C57BL / 6J mannelijke muizen. Huis de dieren in een omgeving met airconditioning met een licht-donkercyclus van 12 uur en gratis toegang tot voedsel en water.
- Autoclaaf het gaas, wattenstaafjes, scharen en tang voorafgaand aan de operatie.
- Verkrijg betadine, 70% ethanol en antiseptische handwas.
- Zet een masker, toga en steriele handschoenen op.
2. Chirurgische ingreep
- Voer kauwtabletten (dosis van 5 mg/kg) 2-4 uur vóór de operatie aan een 8-10 weken oude C57BL/6J-muis. Plaats de muis vervolgens in een inductiekamer (206 mm x 210 mm x 140 mm) met isofluraan met een stroomsnelheid van 1,5% -2%.
- Houd de muis ongeveer 5 minuten in de gaten totdat de ademhaling zichtbaar is vertraagd. Zorg ervoor dat de muis geen reactie heeft op pijnstimulatie vóór de operatie.
- Breng een oogzalf aan op de ogen en zorg voor thermische ondersteuning met een verwarmingskussen of deken. Bevestig de diepte van de anesthesie met een teenknijper om de 15 minuten tijdens de chirurgische procedure.
- Scheer de buikhaar van de muis met een elektrische tondeuse of ontharingscrème. Wattenstaaf en veeg het geschoren gebied af met betadine, gevolgd door 70% ethanol, meerdere keren in een cirkelvormige beweging. Wissel handschoenen om de steriliteit te behouden.
- Gebruik een schaar om een incisie van ~ 1,5 cm te maken in de onderbuik langs de middellijn van de buik.
- Gebruik een steriel wattenstaafje bevochtigd met normale zoutoplossing om de darm voorzichtig te verwijderen totdat de infraroodaorta zichtbaar is.
- Ontleed het bindweefsel en vet uit de infraroodaorta gedurende een sectie van ongeveer 0,5 cm. Let op de kleine vaten aan de dorsale kant en vermijd scheuren. Het is niet nodig om de abdominale aorta te scheiden van de abdominale hoofdader.
- Verpak een stuk van de met zoutoplossing doordrenkte rubberen handschoenentrip onder de abdominale aorta en de abdominale hoofdader. Gebruik een wattenstaafje om overtollige vloeistof af te vegen.
- Verpak een stuk gaas gedrenkt met 0,5 M CaCl2 op de adventitia van de infrarood buikvaculatuur gedurende 10 min. Vervang voor de schijnmuisgroep de 0,5 M CaCl2 door een normale zoutoplossing.
- Verwijder het gaas en pak nog een stuk gaas gedrenkt in PBS-oplossing gedurende 5 minuten om CaPO4-kristallen in situ te genereren in de adventitia van de aorta.
- Verwijder voorzichtig de rubberen handschoenentrip en het gaas. Reset het darmkanaal van de muis.
- Hecht de buikincisie en de huid met een 5-0 hechting.
- Plaats de muis op een verwarmingskussen totdat de muis weer bij bewustzijn is. Zorg voor postoperatieve pijnherstelhuisvesting en analgesie, volgens de lokale commissie voor dierenethiek.
- Huis de muis nog 14 dagen. Houd de muis na de operatie nauwlettend in de gaten en observeer daarna minstens 1x per dag. Voer onmiddellijk een obductie uit als er muizen sterven tijdens deze periode.
3. Oogsten voor beeldvorming van aorta's
- Offer 14 dagen na de operatie de muizen op met CO2.
- Knip de thoracale en buikholtes van de muis ventraal open en snijd het rechter atrium open.
- Perfuseer de muizen met PBS-buffer door de linker ventrikel van het hart om bloed in de aorta te verwijderen en perfuseer vervolgens met 4% paraformaldehyde zoals eerder beschreven8.
- Oogst de aorta onder de stereoscoop.
- Plaats geoogste aorta's in buizen met 5 ml 4% paraformaldehyde gedurende 48 uur.
- Verwijder adventsweefsel en vet voorzichtig onder de stereoscoop en speld de aorta op een zwarte wasplaat met insectennaalden.
- Verkrijg aortabeelden.
4. Evaluatie van de afbraak van de elastische vezels
- Snijd de aorta-aneurysmaweefsels in seriële cryosecties (7 μm dik).
- Analyseer de elastische vezels met behulp van een commerciële elastische van Gieson (EVG) kleuringskit volgens het protocol van de fabrikant.
- Beoordeel de elastineafbraak. Graad 1: <25% afbraak; graad 2: 25% tot 50% afbraak; graad 3: 50% tot 75% afbraak; of graad 4: > 75% afbraak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
14 dagen na capo4-toepassing werden de C57BL/6J-mannetjesmuizen geëuthanaseerd en hun aorta's geoogst en gereinigd. De morfologie van de aorta's werd in beeld gebracht om AAA-formatie te visualiseren. Zoals te zien is in figuur 1A-B, leidde de toepassing van CaPO4 tot verwijding van de infrarood abdominale aorta. Histologisch resulteerde CaPO4 in een dramatische afbraak van elastische vezels, zoals geïllustreerd door elastinebreuken (figuur 1C).
Figuur 1: De 8 weken oude mannelijke C57BL/6J muizen werden behandeld met zoutoplossing (sham) of CaPO4 geoogst na 14 dagen. (A) Representatieve beelden van infrarood abdominale aorta onder een stereoscoop. (B) Representatieve morfologiebeelden van aorta's van muizen; schaalbalk = 1 mm. (C) Representatieve beelden van elastische van Gieson-kleuring van aorta's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Periaortische toepassing van CaPO4 is een robuuste aanpak om AAA bij muizen te induceren. Verschillende studies hebben het CaPO4-model gebruikt en consequent gemeld dat dit een snelle en reproduceerbare methode is om AAA te bestuderen bij muizen 7,9. Dit model wordt beschouwd als een samenvatting van een deel van de kenmerken van menselijk aorta-aneurysma en biedt mechanistische inzichten in AAA-pathogenese, waaronder ontsteking en extracellulaire matrixafbraak.
De risicofactoren van menselijke AAA omvatten voornamelijk veroudering, mannelijk geslacht, roken, hyperlipidemie, hypertensie en atherosclerose10. Hoewel niet systematisch bestudeerd, bleek hyperlipidemie ook muizen vatbaar te maken voor AAA-expansie bij gebruik van het CaPO4-model . In tegenstelling tot mensen speelt veroudering een ondergeschikte rol bij AAA-vorming in de muis CaPO4 model5. Eerdere grote epidemiologische studies hebben aangetoond dat diabetes een onafhankelijke negatieve risicofactor is van menselijke AAA11. Hoewel sommige gegevens suggereren dat metformine, een diabetisch medicijn, dit effect veroorzaakt, is het ook van belang dat, in het CaPO4-model , hyperglycemie aortaverwijding remt door de onderdrukking van macrofaagactivering12.
Momenteel zijn er verschillende chemisch geïnduceerde murine AAA-modellen vastgesteld, waaronder elastase-incubatie, CaPO 4-incubatie en subcutane AngII-perfusie2. Over het algemeen zijn de elastase- en CaPO4-modellen uitgevoerd bij 8-10 weken oude mannelijke wildtypemuizen en het AngII-model is uitgevoerd bij hyperlipidemiemuizen (zoals ApoE-/- en LDLR-/-muizen) of 5-6 maanden oude muizen om AAA13 te induceren. Alle drie de modellen fenocopie de belangrijkste pathologische kenmerken van menselijke AAA, waaronder elastische vezelafbraak en immuuncelinfiltratie. In vergelijking met de andere twee modellen leidt CaPO4-toepassing tot een snelle en meer dan 1,5-voudige uitbreiding van de aorta 7 dagen na de operatie, geassocieerd met dramatische elastineafbraak en calciumafzetting4. Het CaPO4-model induceert een fusiforme verwijding bij de infrarood abdominale aorta, die de menselijke AAA-conditie nabootst, terwijl AngII-perfusie zowel suprarenale AAA als thoracale aorta-aneurysma induceert. Gezien de kosten van elastase, AngII en de osmotische minipomp, is het kosteneffectiever om het CaPO4-model uit te voeren. Het is echter redelijk om te stellen dat het CaPO4-model geen AAA-kenmerken kan induceren, zoals muurschildering trombusvorming en aortaruptuur, en het model is snel en dus minder geschikt voor het uitvoeren van interventiestudies met bestaande AAA. Het CaPO4-model is ideaal voor het werken met genetisch gemodificeerde muizen om de gevoeligheid voor AAA-ontwikkeling te beoordelen.
Het mechanisme dat ten grondslagligt aan CaPO 4-geïnduceerde AAA-formatie is nog niet volledig opgehelderd. Eerdere studies wijzen erop dat het calciumion direct kan binden aan de belangrijkste arteriële structurele componenten, elastine en collageen, waardoor extracellulaire matrixdegradatie en verminderde vaatwandstabiliteitworden vergemakkelijkt 14. CaPO4-kristallen zijn ook geïdentificeerd om significante NOD-achtige receptoreiwit 3 (NLRP3) inflammasoomactivering en gladde spiercelapoptose 4,15 te veroorzaken. Bovendien zijn microcalcificatiekristallen in staat om mononucleaire cellen in osteoclastische cellen te induceren en de productie van matrixmetalloproteinase (MMP) te bevorderen en kunnen ze uiteindelijk resulteren in aorta-expansie16.
Bij het uitvoeren van het CaPO4-model moeten verschillende problemen worden vermeden om het slagingspercentage te verbeteren. Men moet voorkomen dat de bloedvaten van de dorsale tak scheuren, vermijd de toevoeging van overtollige CaCl2-oplossing in de buikholte en vermijd een overdosis anesthesie. Muizen met ernstige bloedingen tijdens de operatie of met een postoperatieve infectie moeten worden uitgesloten van het experiment. Zoals eerder gemeld, wanneer het aantal waarnemingen voldoende is, worden de maximale diameters van de aorta's in het CaPO4-model meestal normaal verdeeld, wat verschilt van het AngII-model7. Daarom raden we een vergelijking aan van de maximale diameters van aorta's in plaats van AAA-incidentie bij gebruik van het CaPO4-model .
Over het algemeen is het CaPO 4-geïnduceerde muizen AAA-model een snelle en kosteneffectieve benadering om de moleculaire mechanismen en therapeutische strategieën van AAA te verkennen en kan het parallel met de andere modellen worden toegepast om de kenmerken van menselijke AAA volledig te imiteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door financiering van de National Natural Science Foundation of China (NSFC, 81730010, 91839302, 81921001, 31930056 en 91529203) en het National Key R &D Program of China (2019YFA 0801600).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CaCl2 | MECKLIN | C805225 | |
| NaCl | Biomed | SH5001-01 | |
| PBS | HARVEYBIO | MB5051 | |
| Small animal ventilator | RWD | H1550501-012 |
References
- Kent, K. C.
- Patelis, N., et al. Animal models in the research of abdominal aortic aneurysms development. Physiological Research. 66 (6), 899-915 (2017).
- Gertz, S. D., Kurgan, A., Eisenberg, D. Aneurysm of the rabbit common carotid artery induced by periarterial application of calcium-chloride in vivo. Journal of Clinical Investigation. 81 (3), 649-656 (1988).
- Yamanouchi, D., et al. Accelerated aneurysmal dilation associated with apoptosis and inflammation in a newly developed calcium phosphate rodent abdominal aortic aneurysm model. Journal of Vascular Surgery. 56 (2), 455-461 (2012).
- Wang, Y. T., et al. Influence of apolipoprotein E, age and aortic site on calcium phosphate induced abdominal aortic aneurysm in mice. Atherosclerosis. 235 (1), 204-212 (2014).
- Zhao, G., et al. Unspliced xbp1 confers VSMC homeostasis and prevents aortic aneurysm formation via foxo4 interaction. Circulation Research. 121 (12), 1331-1345 (2017).
- Jia, Y., et al. Targeting macrophage TFEB-14-3-3 epsilon interface by naringenin inhibits abdominal aortic aneurysm. Cell Discovery. 8 (1), 21 (2022).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Yu, B., et al. CYLD deubiquitinates nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4 contributing to adventitial remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (8), 1698-1709 (2017).
- Altobelli, E., Rapacchietta, L., Profeta, V. F., Fagnano, R. Risk factors for abdominal aortic aneurysm in population-based studies: A systematic review and meta-analysis. International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (12), 2805 (2018).
- Theivacumar, N. S., Stephenson, M. A., Mistry, H., Valenti, D. Diabetes mellitus and aortic aneurysm rupture: A favorable association. Vascular and Endovascular Surgery. 48 (1), 45-50 (2014).
- Tanaka, T., Takei, Y., Yamanouchi, D. Hyperglycemia suppresses calcium phosphate-induced aneurysm formation through inhibition of macrophage activation. Journal of the American Heart Association. 5 (3), 003062 (2016).
- Lu, H., et al. Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e53191 (2015).
- Urry, D. W. Neutral sites for calcium ion binding to elastin and collagen: A charge neutralization theory for calcification and its relationship to atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (4), 810-814 (1971).
- Li, Z. Q., et al. Runx2 (runt-related transcription factor 2)-mediated microcalcification is a novel pathological characteristic and potential mediator of abdominal aortic aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (5), 1352-1369 (2020).
- Kelly, M. J., Igari, K., Yamanouchi, D. Osteoclast-like cells in aneurysmal disease exhibit an enhanced proteolytic phenotype. International Journal of Molecular Sciences. 20 (19), 4689 (2019).
