En kalsiumfosfat-indusert mus abdominal aortaaneurisme modell

Summary

Denne protokollen beskriver en kalsiumfosfatindusert abdominal aortaaneurisme (AAA) musemodell for å studere de patologiske egenskapene og molekylære mekanismene til AAA.

Abstract

En abdominal aortaaneurisme (AAA) er en livstruende kardiovaskulær sykdom som oppstår over hele verden og er preget av irreversibel utvidelse av abdominal aorta. For tiden brukes flere kjemisk induserte murine AAA-modeller, som hver simulerer et annet aspekt av patogenesen til AAA. Den kalsiumfosfatinduserte AAA-modellen er en rask og kostnadseffektiv modell sammenlignet med angiotensin II- og elastaseinduserte AAA-modeller. Anvendelsen av CaPO_4-krystaller til musens aorta resulterer i elastisk fiberforringelse, tap av glatte muskelceller, betennelse og kalsiumavsetning forbundet med aortautvidelse. Denne artikkelen introduserer en standardprotokoll for CaPO_4-indusert AAA-modell. Protokollen inkluderer materialforberedelse, kirurgisk påføring av CaPO₄ til adventitia av infrarenal abdominal aorta, høsting av aorta for å visualisere aortaaneurismer og histologiske analyser hos mus.

Introduction

En abdominal aortaaneurisme (AAA) er en dødelig kardiovaskulær sykdom preget av permanent utvidelse av abdominal aorta, med høy dødelighet når brudd oppstår. AAA er assosiert med aldring, røyking, mannlig kjønn, hypertensjon og hyperlipidemi^. Flere patologiske prosesser har vist seg å bidra til AAA-dannelse, inkludert ekstracellulær matriksfiberproteolyse, immuncelleinfiltrasjon og tap av vaskulære glatte muskelceller. For tiden forblir de patologiske mekanismene til AAA unnvikende, og det finnes ingen påviste stoffer for behandling av AAA¹. Forskning på human AAA er begrenset på grunn av eksistensen av få humane aortaprøver; dermed har flere kjemiske modifikasjonsinduserte AAA-modeller for dyr blitt etablert og allment vedtatt, inkludert subkutan angiotensin II (AngII) infusjon, perivaskulær eller intraluminal elastaseinkubasjon og perivaskulær kalsiumfosfatapplikasjon². En vanlig musemodell er anvendelsen av kalsiumfosfat (CaPO₄) til adventitia av infrarenal abdominal aorta, som er kostnadseffektiv og ikke krever genetisk modifisering.

Direkte periaortisk påføring av CaCl₂ på halspulsåren hos kaniner for å indusere aneurysmal forandring ble opprinnelig rapportert av Gertz et ^al.3 og ble senere brukt på abdominale aortas hos mus. Modellen ble utviklet av Yamanouchi og medarbeidere for å akselerere aortautvidelsen ved å bruke CaPO 4-krystaller hos mus₄. Infiltrasjon av CaPO₄ i mus aorta rekapitulerer mange patologiske egenskaper observert i humane AAA, inkludert dyp makrofaginfiltrasjon, ekstracellulær matriksnedbrytning og kalsiumavsetning. Risikofaktorene for human AAA, som hyperlipidemi, øker også CaPO_4-indusert AAA hos mus⁵. I motsetning til AngII perfusjonsindusert AAA hos ApoE-/- eller LDLR-^/- mus, forekommer CaPO ^4-indusert AAA i infrarenal aortaregion, som etterligner human AAA. For tiden har denne metoden blitt mye brukt for å vurdere følsomhet for AAA-utvikling hos genmodifiserte mus og evaluere anti-AAA-effektene av legemidler ^6,7.

Protocol

Dyrestudier ble utført i samsvar med retningslinjene fra Institutional Animal Care and Use Committee ved Peking University Health Science Center og ble godkjent av Biomedical Ethics Committee of Peking University (LA2015142). Alle musene for kirurgi ble bedøvet med isofluran (1,5% -2%), og anestesi ble nøye overvåket for å unngå smerte eller ubehag for musene.

1. Forberedelse

1. Skjær 0,3 cm brede strimler med pulverfrie gummihansker og gasbind.
2. Kjøp 8-10 uker gamle C57BL/6J hannmus. Hus dyrene i et luftkondisjonert miljø med en 12 timers lys-mørk syklus og fri tilgang til mat og vann.
3. Autoklav gasbind, bomullspinner, saks og tang før operasjonen.
4. Få betadin, 70% etanol og antiseptisk håndvask.
5. Ta på deg maske, kjole og sterile hansker.

2. Kirurgisk prosedyre

1. Gi tyggetabletter (5 mg/kg dose) til en 8-10 uker gammel C57BL/6J mus 2-4 timer før kirurgi. Plasser deretter musen i et induksjonskammer (206 mm x 210 mm x 140 mm) med isofluran med en strømningshastighet på 1,5%-2%.
   1. Overvåk musen i ca. 5 minutter til respirasjonen er synlig redusert. Sørg for at musen ikke har respons på smertestimulering før operasjonen.
2. Påfør en oftalmisk salve på øynene og gi termisk støtte med en varmepute eller teppe. Bekreft dybden av anestesi med en tåklemme hvert 15. minutt under den kirurgiske prosedyren.
3. Barber bukhåret på musen ved hjelp av en elektrisk klipper eller hårfjerningskrem. Vattpinne og tørk det barberte området med betadin, etterfulgt av 70% etanol, flere ganger i en sirkulær bevegelse. Bytt hansker for å opprettholde steriliteten.
4. Bruk saks for å lage et ~ 1,5 cm snitt i underlivet langs midtlinjen av magen.
5. Bruk en steril bomullspinne fuktet med vanlig saltvann for å fjerne tarmen forsiktig til infrarenal aorta er synlig.
6. Disseker bindevev og fett fra infrarenal aorta i ca. 0,5 cm snitt. Legg merke til de små fartøyene til dorsalsiden og unngå å rive dem. Det er ikke nødvendig å skille abdominal aorta fra abdominal hovedvenen.
7. Pakk et stykke av den saltvannsbløte gummihanskestripen under abdominal aorta og abdominal hovedvene. Bruk en bomullspinne til å tørke av overflødig væske.
8. Pakk et stykke gasbind gjennomvåt med 0,5 M CaCl₂ på adventitia av infrarenal abdominal vaskulatur i 10 minutter. For humbugmusgruppen, erstatt 0,5 M CaCl₂ med vanlig saltvann.
9. Fjern gasbindet og pakk et annet stykke gasbind gjennomvåt med PBS-løsning i 5 minutter for å generere CaPO_4-krystaller in situ i aortaens adventitia.
10. Fjern gummihanskebåndet og gasbindet forsiktig. Tilbakestill musens tarmkanal.
11. Sutur abdominal snitt og hud med en 5-0 sutur.
12. Plasser musen på en varmepute til musen gjenvinner bevisstheten. Gi posturgisk smertegjenopprettingsbolig og analgesi, ifølge den lokale dyreetiske komiteen.
13. Hus musen i ytterligere 14 dager. Overvåk musen nøye etter operasjonen og observer minst 1x hver dag senere. Utfør en nekropsy umiddelbart hvis noen mus dør i denne perioden.

3. Høsting for avbildning av aortas

1. 14 dager etter operasjonen, ofre musene ved hjelp av CO₂.
2. Skjær opp musens brysthulrom og bukhulen ventralt og skjær opp høyre atrium.
3. Perfuse musene med PBS buffer gjennom venstre ventrikkel i hjertet for å fjerne blod i aorta, og deretter perfuse med 4% paraformaldehyd som tidligere beskrevet⁸.
4. Høst aorta under stereoskopet.
5. Plasser høstet aorta i rør som inneholder 5 ml 4% paraformaldehyd i 48 timer.
6. Fjern adventitivt vev og fett forsiktig under stereoskopet og fest aorta på en svart voksplate med insektnåler.
7. Skaff deg aortabilder.

4. Evaluering av nedbrytningen av de elastiske fibrene

1. Skjær aortaaneurismevevet i serielle kryoseksjoner (7 μm tykke).
2. Analyser de elastiske fibrene ved hjelp av et kommersielt elastisk van Gieson (EVG) fargesett i henhold til produsentens protokoll.
3. Vurder elastinnedbrytningen. Grad 1: <25% nedbrytning; grad 2: 25% til 50% nedbrytning; grad 3: 50% til 75% nedbrytning; eller grad 4: >75% nedbrytning.

Representative Results

14 dager etter påføring av CaPO₄ ble C57BL/6J hannmus avlivet, og aortaene deres ble høstet og renset. Morfologien til aortas ble avbildet for å visualisere AAA-dannelse. Som vist i figur 1A-B førte anvendelsen av CaPO₄ til utvidelse av infrarenal abdominal aorta. Histologisk resulterte CaPO₄ i en dramatisk nedbrytning av elastiske fibre, som illustrert ved elastinbrudd (figur 1C).

Figur 1: De 8 uker gamle hannmusene C57BL/6J ble behandlet med saltvann (humbug) eller CaPO₄ høstet etter 14 dager. (A) Representative bilder av infrarenal abdominal aorta under et stereoskop. (B) Representative morfologibilder av aorta fra mus; skalastang = 1 mm. (C) Representative bilder av elastisk van Gieson-farging av aorta. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Periaortisk bruk av CaPO₄ er en robust tilnærming for å indusere AAA hos mus. Flere studier har brukt CaPO_4-modellen og konsekvent rapportert at dette er en rask og reproduserbar metode for å studere AAA hos mus ^7,9. Denne modellen anses å rekapitulere en del av egenskapene til human aortaaneurisme og gi mekanistisk innsikt i AAA-patogenesen, inkludert betennelse og ekstracellulær matriksnedbrytning.

Risikofaktorene for human AAA inkluderer hovedsakelig aldring, mannlig kjønn, røyking, hyperlipidemi, hypertensjon og aterosklerose¹⁰. Selv om det ikke ble systematisk studert, ble hyperlipidemi også funnet å predisponere mus for AAA-ekspansjon ved bruk av CaPO_4-modellen . I motsetning til mennesker spiller aldring en mindre rolle i AAA-dannelse i musen CaPO₄ modell⁵. Tidligere store epidemiologiske studier har vist at diabetes er en uavhengig negativ risikofaktor for human AAA¹¹. Mens noen data tyder på at metformin, et diabetisk legemiddel, forårsaker denne effekten, er det alternativt av interesse at hyperglykemi i CaPO_4-modellen hemmer aortautvidelse ved undertrykkelse av makrofagaktivering¹².

For tiden er det etablert flere kjemisk induserte murine AAA-modeller, inkludert elastaseinkubasjon, CaPO 4-inkubasjon og subkutan AngII-perfusjon². Generelt har elastase- og CaPO_4-modellene blitt utført i 8-10 uker gamle mannlige villtypemus, og AngII-modellen har blitt utført i hyperlipidemi-mus (som ApoE-/- og LDLR-/- mus) eller ^5-6 måneder gamle mus for å indusere AAA¹³. Alle de tre modellene fenokopierer de viktigste patologiske egenskapene til human AAA, inkludert elastisk fibernedbrytning og immuncelleinfiltrasjon. Sammenlignet med de to andre modellene, fører CaPO 4-påføring til en rask og mer enn 1,5 ganger utvidelse av aorta 7 dager etter operasjonen, assosiert med dramatisk elastinnedbrytning og kalsiumavsetning⁴. CaPO_4-modellen induserer en fusiform dilatasjon ved infrarenal abdominal aorta, som etterligner den humane AAA-tilstanden, mens AngII-perfusjon induserer både suprarenal AAA og thorax aortaaneurisme. Med tanke på kostnaden for elastase, AngII og den osmotiske minipumpen, er det mer kostnadseffektivt å utføre CaPO_4-modellen. Det er imidlertid rimelig å si at CaPO_4-modellen ikke kan indusere AAA-funksjoner som veggmaleri trombusdannelse og aortabrudd, og modellen er rask og dermed mindre egnet for å utføre intervensjonsstudier med eksisterende AAA. CaPO_4-modellen er ideell for å jobbe med genmodifiserte mus for å vurdere følsomhet for AAA-utvikling.

Mekanismen bak CaPO_4-indusert AAA-dannelse er ennå ikke fullstendig belyst. Tidligere studier antyder at kalsiumionet kan binde seg direkte til de viktigste arterielle strukturelle komponentene, elastin og kollagen, noe som letter ekstracellulær matriksnedbrytning og redusert karveggstabilitet¹⁴. CaPO_4-krystaller har også blitt identifisert for å utløse signifikant NOD-lignende reseptorprotein 3 (NLRP3) inflammasomaktivering og glatt muskelcelleapoptose ^4,15. Dessuten er mikrokalsifiseringskrystaller i stand til å indusere mononukleære celler i osteoklastlignende celler og fremme matriksmetalloproteinase (MMP) produksjon og kan til slutt resultere i aortautvidelse¹⁶.

Når du utfører CaPO_4-modellen , må flere problemer unngås for å forbedre suksessraten. Man bør unngå å rive dorsale grenblodkar, unngå tilsetning av overflødig CaCl_2-løsning i bukhulen, og unngå overdosering av anestesi. Mus med alvorlig blødning under operasjon eller med postoperativ infeksjon bør utelukkes fra forsøket. Som tidligere rapportert, når antallet observasjoner er tilstrekkelig, er de maksimale diametrene til aortaene i CaPO_4-modellen vanligvis normalfordelt, noe som er forskjellig fra AngII-modellen⁷. Derfor anbefaler vi en sammenligning av de maksimale diametrene til aorta i stedet for AAA-forekomst når du bruker CaPO_4-modellen .

Samlet sett er CaPO_4-induserte mus AAA-modellen en rask og kostnadseffektiv tilnærming for å utforske de molekylære mekanismene og terapeutiske strategiene til AAA og kan brukes parallelt med de andre modellene for å etterligne funksjonene til menneskelig AAA fullt ut.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl2	MECKLIN	C805225
NaCl	Biomed	SH5001-01
PBS	HARVEYBIO	MB5051
Small animal ventilator	RWD	H1550501-012