Summary
ここでは、出生後マウスの中枢神経系のさまざまな領域に由来するアストロサイトの高度に濃縮された培養物を生成し、転写因子の強制発現によって機能的ニューロンに直接変換するための詳細なプロトコルについて説明します。
Abstract
直接ニューロンリプログラミングは、多能性中間体を介さずに異なるスターター細胞集団から機能的ニューロンを生成する強力なアプローチです。この技術は、例えば、神経変性疾患に罹患している患者の線維芽細胞をニューロンに変換することを可能にするため、疾患モデリングの分野で大きな可能性を秘めているだけでなく、細胞ベースの補充療法の有望な代替手段でもある。この文脈において、主要な科学的ブレークスルーは、アストロサイトなどの中枢神経系内の分化した非神経細胞が、 インビトロで機能的ニューロンに変換できることの実証であった。それ以来、アストロサイトのニューロンへの インビトロ 直接リプログラミングは、強制的な同一性変換の根底にある分子メカニズムと、効率的なリプログラミングを妨げるハードルに関する実質的な洞察を提供してきました。しかし、異なるラボで行われた in vitro実験の結果は、アストロサイトの単離、培養、および再プログラムに使用される方法の違いにより、比較が困難です。ここでは、出生後のマウスの中枢神経系の異なる領域から、磁気細胞選別 を介して 高純度のアストロサイトを確実に単離・培養するための詳細なプロトコールについて述べる。さらに、培養したアストロサイトをウイルス形質導入またはDNAトランスフェクション を介して ニューロンに再プログラムするプロトコルも提供しています。この合理化され標準化されたプロトコルは、細胞同一性の維持、新しいニューロン同一性の確立、ならびに特定のニューロンサブタイプの生成およびそれらの機能的特性の根底にある分子メカニズムを調査するために使用することができる。
Introduction
哺乳類の中枢神経系(CNS)は非常に複雑であり、膨大な数の異なるニューロンサブタイプ1、2、3、4、5、6を含む何百もの異なる細胞型からなる。他の器官または組織7、8、9とは異なり、哺乳動物CNSは非常に限られた再生能力を有する。外傷性脳損傷または神経変性に続くニューロン喪失は不可逆的であり、しばしば運動的および認知的欠損をもたらす10。脳機能を救うことを目指して、失われたニューロンを置き換えるためのさまざまな戦略が、激しい調査を受けている11。その中で、体細胞を機能的ニューロンに直接リプログラミングすることは、有望な治療的アプローチとして浮上している12。直接リプログラミング、または分化転換は、中間増殖性または多能性状態を経ることなく、1つの分化した細胞型を新しい同一性に変換するプロセスである13、14、15、16。線維芽細胞を筋細胞に変換するのに十分な因子としてのMyoD1の同定によって先駆的に開発された17,18、この方法は、いくつかの細胞型を機能的ニューロンに再プログラムするために首尾よく適用されてきた19、20、21。
アストロサイトは、CNS22、23において最も豊富なマクログリアであり、いくつかの理由から、直接ニューロンリプログラミングのために特に有望な細胞型である。第一に、それらはCNS全体に広く均等に分布しており、新しいニューロンのための豊富なロコ源を提供する。第2に、アストロサイトとニューロンは、胚発生中に共通の祖先、放射状グリア細胞24を共有するように、発達的に密接に関連している。2つの細胞型の共通の胚起源は、異なる胚葉からの細胞のリプログラミングと比較してニューロン変換を促進するようである19、21。さらに、その放射状グリア起源を介してアストロサイトによって受け継がれるパターニング情報は、成体アストロサイト25、26、27においても維持され、かつ、局所的に適切なニューロンサブタイプ28、29、30の生成に寄与するようである。したがって、アストロサイトのニューロンへの変換を調査および理解することは、細胞ベースの置換戦略のためのこの技術の可能性を最大限に引き出すための重要な部分です。
インビトロ培養アストロサイトのニューロンへの変換は、直接ニューロンリプログラミングの分野において、i)アストロサイトからニューロンを生成するのに十分な転写因子の同定15、19、31、ii)同じ細胞コンテキストにおける異なるリプログラミング因子によって引き起こされる分子機構の解明を含むいくつかのブレークスルーをもたらした32iii)異なるニューロンサブタイプの誘導に対するアストロサイトの発達起源の影響を強調する28、29、33。さらに、アストロサイトのインビトロ直接変換は、活性酸素種(ROS)産生の増加34およびアストロサイトとニューロン35のミトコンドリアプロテオームの違いなど、直接ニューロンリプログラミング34、35を制限するいくつかの主要なハードルを解明した。したがって、これらの観察は、細胞同一性の維持、細胞の運命の変化を防ぐ障害、およびリプログラミングにおける代謝の役割に関連する生物学12におけるいくつかの基本的な問題を調査するための直接ニューロンリプログラミングのモデルとしてのアストロサイトの初代培養の使用を強く支持する。
ここでは、マウス脊髄29からアストロサイトを単離することによって実証されるように、出生後(P)年齢のマウスから非常に高い純度でアストロサイトを単離するための詳細なプロトコルを提示する。また、ウイルス形質導入またはDNAプラスミドトランスフェクション を介して アストロサイトをニューロンに再プログラムするためのプロトコルも提供しています。リプログラミングされた細胞は、形質導入後7日間(7DPT)で分析して、リプログラミング効率やニューロン形態などのさまざまな側面を評価するか、または数週間培養中に維持して経時的な成熟を評価することができます。重要なことに、このプロトコルは脊髄アストロサイトに特異的ではなく、皮質灰白質、中脳、小脳を含む様々な他の脳領域からアストロサイトを単離するために容易に適用することができる。
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Protocol
以下の手順は、ヘルムホルツ・ツェントルム・ミュンヘンの動物ケアガイドラインに従い、科学的目的で使用される動物の保護に関する指令2010/63/EUに準拠しています。解剖を行う施設の動物愛護ガイドラインを必ず遵守してください。
1. 解剖・解離・培養材料の調製
メモ:生物学的安全キャビネット内のすべての培養試薬を準備し、オートクレーブまたは滅菌装置のみを使用して作業してください。解剖および解離試薬は、生物学的安全キャビネットの外で調製することができる。
- T25培養フラスコをH2O中のポリD-リジン(原液1mg/mL;作業液20μg/mL)で最低2時間コーティングして培養フラスコを調製する。その後、H2Oで3xですすぎ、風乾します。
- 5 mL の 1 M HEPES 緩衝液を 500 mL のハンクス平衡塩溶液 (HBSS) に添加して、解剖バッファーを調製します。
- 神経組織解離キット(材料表参照)から1950μL の緩衝液Xを加えて、6本の脊髄あたり1本のCチューブ( 材料表を参照)を準備する。解剖中は氷の上に保管してください。Cチューブあたり20 μLの緩衝液Yと10 μLの緩衝液Aを加えて酵素消化マスターミックスを調製する(神経組織解離キットの一部; 材料表を参照)。よく混ぜ合わせ、必要になるまで4°Cで保存します。
- カルシウムとマグネシウムで1xリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)を準備し、氷の上に置きます。5 mL のペニシリン-ストレプトマイシン (終濃度 100 U/mL)、45% D-グルコース 5 mL、およびグルタミンサプリメント 5 mL (終濃度 2 mM; 材料表参照) を 485 mL の DMEM/F12 に添加して、基本培地を調製します。塩基性培地は4°Cで4週間安定である。
- 基本培地44 mLに1 mLのB27サプリメントと5 mLのウシ胎児血清(FBS)を加えてアストロサイト培養液を調製する。培地に上皮成長因子(EGF)および塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)(それぞれ10ng/mL)を補充する。使用直前にEGF及びbFGFを適量の培地に添加する。
- 脊髄組織の解剖には、先端が曲がった大きな鉗子、先端が曲がった小さな鉗子、小さな鉗子のペア、小さなはさみ、小さなヘラを使用します。
2. アストロサイト単離
- アストロサイトを出生後マウスの脊髄から単離し、機能的ニューロンへの直接リプログラミングを実行する(図1A)。このプロトコールのために、出生後2〜3日目にマウスから脊髄組織を採取する。アストロサイト単離のために6〜8本の脊髄を集める。この同じプロトコルを使用して、皮質、中脳、小脳などの神経系の他の領域からアストロサイトを分離します。これらの領域については、生後5〜7日で細胞を得る。
注:このプロトコルで言及されていない領域からアストロサイトを単離することを目指す場合、年齢および入力物質は実験的に決定されるべきである。
3. 脊髄組織解剖
注:組織の解剖は、生物学的安全キャビネットの外で行うことができます。
- 動物を麻酔なしで断頭することによってP2−P3でマウスを屠殺する。胴体を35mmのペトリ皿に入れ、氷の上に置きます。
- はさみで皮膚を開き、小さなはさみで椎骨を取り除き、脊髄を抽出し、氷上の解剖バッファーに入れます。倍率2倍の定位解剖顕微鏡下で、鉗子を使用して単離された脊髄から髄膜を除去し、解剖および洗浄した脊髄組織をCチューブに移す。
4. 磁気活性化細胞選別(MACS)
- 神経組織解離キットから50 μLの酵素P( 材料表を参照)および30 μLの予め調製した酵素ミックスを各Cチューブに加える。Cチューブを反転させ、加熱した解離器の上に置き( 材料表を参照)、すべての組織がチューブの蓋に集められていることを確認します。
- 37_NTDK_1解離プログラムを約 22 分間の実行時間で実行します。プログラム終了の直前に、使用したCチューブの数に等しい15 mLチューブに70 μmのストレーナー( 材料表を参照)を置き、2 mLの氷冷PBSでストレーナーをプリウェットします。MACS 手順全体を通して 1x PBS を氷上に保管します。
- プログラムの終了後、Cチューブを取り出し、短時間遠心分離してチューブの底部の組織を採取します。解離した組織をCチューブからストレーナーに通すことによって調製した15mLチューブに移す。ストレーナーを15 mLチューブに入れたままにします。
- Cチューブを10 mLの1x PBSですすぎ、残りの組織を回収し、もう一度ストレーナーを通過して同じ15 mLチューブに集めます。解離した組織を含む15mLチューブを300 x g で室温で10分間遠心分離する。
メモ: このステップの後、遠心分離機を 4 °C まで冷却します。 - 細胞ペレットを乱さずに上清を除去してから、細胞を80μLの1x PBSに再懸濁する。マウス抗ACSA-2マイクロビーズキットから10μLのブロッキング試薬を加える( 材料表を参照)。ピペッティングでやさしく混ぜる。
- 暗所(冷蔵庫)中で4°Cで10分間インキュベートする。10μLの抗アストロサイト細胞表面抗原-2結合マイクロビーズ( 材料表参照)を加え、ピペッティングにより穏やかに混合する。暗所で4°Cで15分間インキュベートする。
- 3 mLの1x PBSを加え、300 x gで4°Cで10分間遠心分離して細胞を洗浄する。 遠心分離中に、適切な数の磁気選別カラム(材料表を参照)をセパレーターの上に置き、その下に15mLの収集管を置いて磁気分離器(材料表を参照)を組み立てます。カラムを 500 μL の 1x PBS ですすいでください。
- 上清を除去し、細胞懸濁液を磁気カラムに移す前に、500 μL の 1x PBS に細胞を再懸濁します。重力で排水しましょう。15 mL チューブを 500 μL の 1x PBS で洗浄し、カラムに塗布します。カラムを 500 μL の 1x PBS で洗浄し、さらに 2 回の洗浄を行います。
- 分離器からカラムを取り出し、800 μLのアストロサイト培養液を加え、付属のプランジャーで細胞をカラムから押し出すことによって細胞を溶出させる。
- 予め調製した培養フラスコにプレート細胞にEGF及びbFGFを添加したアストロサイト培養液を4.2 mL添加し、37°C及び5%CO2で培養した。
注:コーティング培養フラスコは、他の脳領域から単離されたアストロサイトには必要ありませんが、脊髄から単離されたアストロサイトのためのより良い基質を提供します。 - 細胞をコンフルエントになるまで約7日間培養する(80%〜90%)。細胞が7日後にコンフルエントでない場合は、それらをプレーティングする前に10日まで待ってください。10日後、細胞はもはや増殖せず、リプログラミング効率が低下する。
5. リプログラミングのためのアストロサイトの播種
メモ: 次の手順は、安全レベル 1 (SL1) の生物学的安全キャビネットの下で実行する必要があります。
- 以前に調製した培養フラスコと同じ方法で、ポリ-D-リジンコーティングされたガラスカバースリップで24ウェルプレートを準備します。必要なプレート数を決定するために、アストロサイトが24ウェルプレートにウェルあたり5〜5.5 x104 細胞の密度で播種されることを考慮してください。通常、P2マウスから6本の脊髄を単離すると、約1 x106個の 細胞が得られる。
- 培養アストロサイトを含むT25培養フラスコから培地を吸引し、1x PBSで1回洗浄する。0.5 mLの0.05%トリプシン/EDTAを加えて培養フラスコからアストロサイトを剥離し、37°Cで5分間インキュベートする。フラスコの側面を静かにタップして培養フラスコ表面から細胞を放出し、10倍の倍率を用いて明視野顕微鏡下で剥離を確認した。
- 2.5 mLのアストロサイト培養培地でトリプシン処理を停止し、細胞懸濁液を15 mLチューブに集めます。300 x g で5分間遠心分離し、上清を吸引し、細胞を1mLのアストロサイト培養培地に再懸濁した。血球計数器または自動細胞計数システムを使用して細胞濃度を計算します。
- 細胞数に基づいて、細胞懸濁液を新鮮なアストロサイト培地で希釈し、1mLあたり1-1.1 x105 細胞の溶液を得た。EGFおよびbFGFを因子あたり10ng/mLで培地に補充する。5-5.5 x 104細胞に相当する500 μLの細胞懸濁液を、以前に調製した24 ウェルプレートの各ウェルに加え、37°Cおよび5%CO2で細胞を培養する。
6. 転写因子の強制発現
注: プロトコルに進む前に、実験を適切に設計することが不可欠です。特に、リプログラミングのためのネガティブコントロール、すなわちリプログラミング因子が発現しない状態を常に含めることが重要である。例えば、初期化因子およびレポーター用のcDNAを保持するベクター(例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、DsRed)を使用する場合、ネガティブコントロールは、レポーターのみを保持する同じベクターによって表される。異なるレポーターを運ぶ複数の因子を表現する場合、ネガティブコントロールはそれに応じて調整されるべきである。
- メッキの翌日、24ウェルプレートを検査して、細胞がカバースリップに付着していることを確認します。
- 実験目的および利用可能なリソースに基づいて、初期化因子の強制発現は、ウイルス形質導入(ステップ6.3参照)またはDNAトランスフェクション(ステップ6.4参照)によって達成することができる。
注:レトロウイルスまたはレンチウイルスの使用には政府当局の承認が必要であり、安全レベル2(SL2)の実験室内の生物学的安全キャビネットの下で実行する必要があります。 - アストロサイトを再プログラムするには、遺伝情報を持つレトロウイルスまたはレンチウイルスで細胞を形質導入し、以下のように目的の初期化因子を発現させます。
- 1 μL の細胞懸濁液をアストロサイト培地に直接添加することにより、1 x 1010-1 x 1012 粒子/mL の高いウイルス力価を持つ細胞を形質導入します。これにより、高い感染率が保証されます。実験の目的に応じて、セクション7またはセクション8に進む前に、ウイルス粒子を含むアストロサイト培地で細胞を37°Cで24〜36時間培養する。
注:導入遺伝子の発現を駆動するために、異なるプロモーターを使用することができる(代表的な結果も参照のこと)。構成的プロモーター(例えば、CMV、CAG)は、誘導性プロモーターよりも早く導入遺伝子の発現を誘導する;しかし、両方のタイプのプロモータータイプは、細胞をニューロンに再プログラムするために首尾よく使用されてきました。
- 1 μL の細胞懸濁液をアストロサイト培地に直接添加することにより、1 x 1010-1 x 1012 粒子/mL の高いウイルス力価を持つ細胞を形質導入します。これにより、高い感染率が保証されます。実験の目的に応じて、セクション7またはセクション8に進む前に、ウイルス粒子を含むアストロサイト培地で細胞を37°Cで24〜36時間培養する。
- DNAプラスミドは、後述するようにDNAトランスフェクション を介して アストロサイトに導入することもできる。
注:これは、SL1用に承認された生物学的安全キャビネットの下で行うことができます。- トランスフェクションの前に、トランスフェクション試薬、所望の構築物のプラスミドDNA、新鮮なアストロサイト培地、および血清還元培地を得る( 材料表を参照のこと)。24 ウェルプレートの各ウェルには 300 μL の血清還元培地が必要であることを考慮して、血清還元培地の必要量を計算します ( 材料表を参照)。50mLチューブに適量の血清還元培地を加え、37°Cに加温する。
- 血清還元培地が温かいときは、すべてのウェルからアストロサイト培地を吸引し、50mLチューブに集めます。回収したアストロサイト培地を0.45 μMシリンジフィルターでろ過し、剥離した細胞を除去します。
- 濾過した培地に等量の新鮮なアストロサイト培地を加え、ウェルあたり1mLのアストロサイト培地を添加するのに十分な溶液を得た。アストロサイト馴化培地をインキュベーター内で使用時まで37°Cに維持する(ステップ6.4.9)。
注:培養培地は、培養物の生存率を支持するいくつかの分泌因子を含むため、再利用される。 - 予め加温した血清還元培地を各ウェルに300 μL加え、24ウェルプレートをインキュベーターに戻します。
- 溶液A、DNA及び血清還元培地からなる。各ウェルについて、合計 0.6 μg の DNA を使用し、50 μL の血清還元培地に添加します。溶液Aは使用時まで室温で保存してください。
メモ: 通常、条件ごとの技術的な 3 連が考慮されます。したがって、3.5 反応に十分な混合液 (例えば、175 μL の血清還元培地で希釈した 2.1 μg の総 DNA を調製し)、24 ウェルプレートの 3 ウェルをトランスフェクトするのに十分な材料を確保します。 - 溶液Bを調製し、トランスフェクション試薬と血清還元培地とからなる。各ウェルについて、0.75 μL のトランスフェクション試薬を 50 μL の血清還元培地に加えます。この溶液はすべてのトランスフェクション条件に共通であるため、一括で準備して、トランスフェクション間のばらつきを低減します。
- 溶液Bを室温で5分間インキュベートする。溶液Aに溶液Bを1:1の比率で一滴ずつ加え、穏やかに混合する。渦を巻かないでください。溶液A + Bをフードの下で室温で20〜30分間インキュベートする。
- すべてのトランスフェクション条件について、ステップ6.4.5~6.4.7を繰り返します。20~30分後、溶液A+Bを各ウェルに1滴ずつ加え、最終容量100μLにします。プレートを静かに振って、細胞を37°Cのインキュベーターに4時間戻します。
- 4時間後、トランスフェクション培地を取り出し、ステップ6.4.3で調製した予め加温したアストロサイト馴化培地を1mL加える。実験の目的に応じて、セクション7またはセクション8に進む前に、細胞を36〜48時間維持する。
7. アストロサイトのリプログラミング(7日間解析)
- 基本培地49 mLにB27-supplement 1 mLを添加して神経分化培地を調製する(ステップ1.4参照)。24~48時間後、細胞が形質導入またはトランスフェクトされたかどうかに応じて(それぞれステップ6.3および6.4を参照)、アストロサイト培地を1ウェルあたり1mLの神経分化培地と交換し、細胞を37°Cおよび9%CO2で培養する。
注:9%CO2インキュベーターが利用できない場合、細胞を5%CO2 に保つこともできます。 しかし、ニューロンのリプログラミングは、これらの条件下ではより効率的である。 - オプション:リプログラミング効率を高めるために、アストロサイト培地を分化培地に交換する場合は、神経分化培地をフォルスコリン(終濃度30 μM)およびドルソモルフィン(終濃度1 μM)で補う。フォルスコリンおよびドルソモルフィンで細胞を治療することを選択した場合は、最初の治療の2日後にドルソモルフィンの2回目の投与を提供する。この第2の処理を培養培地に直接加える。
- マウスアストロサイトの神経細胞への直接リプログラミングは、通常、培地を交換してから7日以内に起こる。したがって、ニューロンのリプログラミングの開始から7日後に、下流分析のために細胞を固定または収集する。
8. アストロサイトの成熟ニューロンへのリプログラミング(長期培養)
- 基本培地49 mLにB27-supplement 1 mLを添加して神経分化培地を調製する(ステップ1.4参照)。24~48時間後、細胞を形質導入またはトランスフェクトしたかどうかに応じて(それぞれステップ6.3および6.4を参照)、アストロサイト培地を、1ウェルあたりフォルスコリン(終濃度30μM)およびドルソモルフィン(終濃度1μM)を添加した1mLの神経分化培地に交換し、細胞を37°Cおよび9%CO2で培養する。
注:9%CO2インキュベーターが利用できない場合、細胞を5%CO2 に保つこともできます。 しかし、ニューロンのリプログラミングは、これらの条件下ではより効率的である。 - ドルソモルフィンを神経分化培地に直接添加して初期処理の2日後に処理を繰り返す。
- ニューロンリプログラミング開始から7日後、N2 6 μL、NT3 1.2 μL(ストック20 μg/mL)、BDNF(ストック20 μg/mL)1.2 μL、GDNF(ストック20 μg/mL)、cAMP(ストック100 mM)1.2 μLをニューロン分化培地189.2 μLに添加して成熟培地を調製します。各ウェルに存在する神経分化培地に200μLの成熟培地を補充する。
注:成熟培地は、最初の治療のためにのみ補充される。その後の全ての処置は、後述するように神経分化培地を部分的に交換することによって行われる。 - 200 μLの神経分化培地を除去し、200 μLの新鮮な成熟培地を週2回添加して、小分子による治療を最大6週間繰り返します。成熟の間、細胞を電気生理学的実験(典型的には、21日目以降)に使用するか、または下流分析(例えば、免疫蛍光)のために固定する。
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Representative Results
アストロサイトの初代培養物は、典型的には、MACソーティングおよびプレーティング後7〜10日の間に80%〜90%のコンフルエンシーに達する(図1B)。一般に、単一のT25培養フラスコは約1〜1.5 x106 細胞を生成し、これはウェルあたり5〜5.5 x104 細胞の密度で細胞を播種する場合、20〜30カバースリップに十分である。めっきの翌日、細胞は通常、カバースリップ表面の50%〜60%を覆う(図1C)。この段階では、培養物はほぼ独占的にアストロサイトで構成されていますが、神経芽細胞などの他の細胞型は事実上存在しません(図1D)29。
初期化因子は、レトロウイルスまたはレンチウイルスの形質導入またはDNAプラスミドのトランスフェクションのいずれかを介してアストロサイトに送達することができる。通常、ウイルス形質導入は、トランスフェクションと比較してより多くの細胞に感染する。直接的なニューロン変換が相当量の細胞死を引き起こすように34、35、レトロウイルスまたはレンチウイルス形質導入が、分析のための細胞数を最大化するのに好ましい。異なるプロモーターは、初期化因子の発現を制御するために使用され得る:構成的(例えば、CMV、CAG)15、32、誘導性(例えば、Tet応答性エレメント、Tet−ON)21、または細胞型特異的(例えば、GFAPプロモーター)36、37。構成的または細胞型特異的プロモーターを使用する場合、アストロサイトは、蛍光レポーター発現(例えば、GFP、DsRed)によって評価される導入遺伝子の検出可能なレベルを、遺伝子送達後24時間以内に、各細胞を他の細胞から独立させて発現し始める。逆に、誘導性プロモーターは、小分子(例えば、ドキシサイクリン)を培養培地に添加した後に活性化されるように、形質導入された細胞全体にわたって導入遺伝子の発現を同期させることを可能にする。転写因子の検出可能なレベルは、通常、プロモーターの活性化後18〜20時間に達する。ほとんどの場合、初期化因子発現のピークは約48時間で到達し、レンチウイルス媒介性発現はわずかに長くかかる。
初期化因子発現後の転写変化は早くも4時間32で検出できるが、ロバストな変化は24時間後と29,32時間以降に起こる。形態学的変化は転写変化に続き、変換の最初の徴候は形質導入/トランスフェクション(3DPT)の約3日後に観察することができる。7DPTでは、誘導されたニューロン細胞はアストロサイトと明確に区別できます:それらのソーマは、対照または再プログラムされていないアストロサイトよりも小さく、長いプロセスを有し、ニューロンマーカーβIIIタブに対して陽性であり、アストロサイトマーカーGFAPに対して陰性である(図1E)。しかし、一部の細胞はGFAPとβIII-tubの両方に対して陽性であり、ニューロンプログラムが誘導されたがアストロサイト同一性が阻害されていないことを示唆するか、またはアストロサイト同一性の抑制を示すがニューロンカスケードの誘導がないことを示す両方のマーカーについて陰性であり得ることは注目に値する。いずれの場合も、細胞は通常、アストロサイトの形態を維持する。
電気生理学や生成されたニューロンサブタイプの評価などのより機能的な分析のために、培養物は一般に最低21DPT維持され、成熟培地で処理される。21DPTでは、多くの誘導ニューロンは活動電位を発火させることができ、成熟ニューロンマーカーNeuNおよび汎シナプスタンパク質シナプトフィジン29 に対して陽性である(図1F)。
図1:アストロサイト培養とリプログラミングの概要 (A)アストロサイトからニューロンへの直接変換のタイムライン。各黒い線は、プロトコルの重要なステップを表しています。(b)培養7日後の培養脊髄由来アストロサイトの代表的な明視野画像。写真は、明視野顕微鏡および10倍対物レンズを用いて撮影した。(C)24ウェルプレートにおけるウェル当たり5.5 x104細胞の密度で再プレーティングしてから1日後の脊髄アストロサイトの代表的な明視野画像。画像は、明視野顕微鏡と10倍対物レンズを使用して撮影しました。(D)培養純度を実証するためにプレーティング後1日目に固定したアストロサイト上のβIIIタブ、Sox9、GFAPトリプル染色の免疫蛍光画像。細胞を4%パラホルムアルデヒド中で10分間固定し、1x PBSで2回洗浄した。細胞を、1x PBS溶液中で3%BSA、0.5%Triton-X 100を用いてブロッキングした。一次抗体をブロッキング溶液中で適切な濃度(例えば、抗GFAP 1:250;抗βIIIタブ1:250;抗Syp1 1:500)で希釈し、室温で2時間インキュベートした。細胞を1x PBSで3回洗浄し、フルオロフォア結合二次抗体と共に室温で1時間インキュベートした。カバースリップは、アクアポリ/マウントで取り付ける前に1x PBSで3回洗浄しました。画像は、落射蛍光顕微鏡と40倍の対物レンズを使用して取得しました。(E)βIIIタブの免疫蛍光画像、7DPT後のAscl1によるアストロサイトからニューロンへの変換を実証するDsRed二重染色の免疫蛍光画像。(F)Ascl1によるリプログラミングの21 DPT後のニューロン成熟を実証するためのβIIIタブ、DsRed、シナプトフィジン1(Syp1)トリプル染色の免疫蛍光画像。免疫蛍光および画像取得のプロトコールは上述の通りであった。スケール バーは 20 μm を表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
マウスアストロサイトの初代培養物は、直接ニューロンのリプログラミングを研究するための注目すべきin vitroモデルシステムである。実際、出生後の段階で単離されるにもかかわらず、細胞は典型的なアストロサイトマーカー29を発現し、パターニング遺伝子28、29の発現を保持し、増殖する能力を維持し、同等の年齢におけるインビボアストロサイトと同様に38である。MACS媒介性単離後、細胞は最初にフラスコに接着し、次いで増殖し始め、高度に濃縮されたアストロサイト培養物29を生じる。重要なことに、培養アストロサイトは多能性細胞状態に脱分化せず、不死化することもない。さらに、それらはレポータータンパク質(例えば、DsRedまたはGFP)の発現に続いて自発的にニューロンを生成するのではなく、アストロサイト同一性を維持する。また、それらは無期限に増殖するのではなく、むしろ増殖を遅らせ、より成熟した段階に移行し、直接ニューロンの再プログラミング可能性を低下させる32,39。
このプロトコルにはいくつかの重要なステップがあります:まず、関心領域を慎重に分離し、汚染組織を除去することが不可欠です。例えば、脊髄アストロサイトを調製するために、脊髄を椎骨から抽出し、後根神経節(DRG)を慎重に除去する。第2に、変換細胞は、周囲のアストロサイトならびに培地浸透圧の変化による貪食作用の刺激のために、形質導入細胞および培養全体に悪影響を及ぼす重大な細胞死34を受ける。したがって、アストロサイト培地を適切な量の分化培地(通常、24ウェルプレートの1mL/ウェル)に交換することが重要です。さらに、プラスミドDNAのトランスフェクションは、承認された安全レベル2の細胞培養室を必要とするウイルス形質導入と比較して、簡単でアクセスしやすいアプローチです。しかしながら、トランスフェクション率およびリプログラミング効率は、リプログラミング因子のウイルス媒介性送達と比較して低い。したがって、トランスフェクションは、新しい候補リプログラミング因子の再プログラミング可能性をテストしたり、因子のプールをスクリーニングしたりするための迅速な方法として使用できます。ニューロンの成熟に関しては、再プログラムされた細胞は通常、約3週間で電気生理学的に活性になる。必須ではないが、細胞を小分子で処理すると、生存率と再プログラムされた細胞の成熟の両方が増加し、誘導されたニューロンの密度が高くなり、より成熟した形態が得られる。
アストロサイトを単離および培養するための記載された方法は堅牢で信頼性が高いが、いくつかの側面を考慮する必要がある。まず、組織の機械的解離に基づく従来の方法は、40の切開された組織あたり培養中の細胞数を全体的に多く得るが、MACソーティングアプローチでは、その後の実験のために適切な数の細胞を単離するために、6〜8匹の仔犬から組織を解剖する必要がある。さらに、アストロサイトの単離は、抗体ACSA−241によって認識されるATPase Na+/K+輸送サブユニットΒ2タンパク質(Atp1b2)の発現に基づく。原則として、Atp1b2を発現していないアストロサイトは調製中に失われ、したがって調製においてバイアスを引き起こす。これが事実であることを排除することはできませんが、MACSフロースルーの分析により、陰性画分のほとんどの細胞がアストログリアマーカーSox9に対して免疫反応性を示すことが明らかになり、MACソーティングプロトコルの高効率が示唆されました。Atp1b2 に関する 2 つ目の注意点は、その式に関連しています。Atp1b2は、出生後の段階でアストロサイトによって特異的に発現され、一方、マウス成体脳では他の細胞型、特に髄鞘形成希突起膠細胞および上衣細胞27でそれを発現する。したがって、成人の脳からアストロサイトを単離するために、関心領域の慎重な解剖およびミエリン除去工程が必要である。
アストロサイトを単離するための他の方法と比較して、MACSベースのアプローチは、培養物の高純度(Sox9+細胞の>90%)を保証し、CNSの異なる領域からアストロサイトを単離するための標準化された手順を提供する。古典的な機械的解離によって得られる培養純度は著しく変化する可能性があるため(皮質灰白質から>80%GFAP+/DAPI、脊髄から約50%GFAP+/DAPI)15,29。標準化されたプロトコルは、このような変動性を低減し、in vitroリプログラミング実験の共通の出発点を提供する。これにより、例えば、異なる領域28,29からのアストロサイトの分子同一性を体系的に比較し、誘導されたニューロンのリプログラミング効率およびサブタイプ同一性に対する発生起源の影響を調査することができる。
要約すると、最適化されたアストロサイトの培養物の インビトロ 直接ニューロンリプログラミングは、アストロサイトからニューロンへの変換の普遍的および領域特異的な分子メカニズムを解明するための非常に強力なアプローチであり、常在CNSアストロサイトの インビボ 直接変換のためのより良く、より効果的な戦略を設計するための重要な情報を提供する。
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Disclosures
著者は利益相反がないと宣言しています。
Acknowledgments
リプログラミングのためにコンストラクトをクローンしてくれたInes Mühlhahn、バイラル制作のためにPaulina Chlebik、原稿に対するコメントをしてくれたMagdalena GötzとJudith Fischer-Sternjakに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| anti-mouse IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
| anti-Mouse IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
| anti-mouse IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| anti-rabbit Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
| cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
| C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
| Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
| Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
| MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
| Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
| Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
| Rabbit anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
| Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
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