Summary
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att generera högt berikade kulturer av astrocyter härledda från olika regioner i centrala nervsystemet hos postnatala möss och deras direkta omvandling till funktionella neuroner genom tvångsuttryck av transkriptionsfaktorer.
Abstract
Direkt neuronal omprogrammering är ett kraftfullt tillvägagångssätt för att generera funktionella neuroner från olika startcellpopulationer utan att passera genom multipotenta intermediärer. Denna teknik har inte bara stora löften inom sjukdomsmodellering, eftersom det gör det möjligt att konvertera till exempel fibroblaster för patienter som lider av neurodegenerativa sjukdomar till neuroner, men representerar också ett lovande alternativ för cellbaserade ersättningsterapier. I detta sammanhang var ett stort vetenskapligt genombrott demonstrationen att differentierade icke-neurala celler i centrala nervsystemet, såsom astrocyter, kunde omvandlas till funktionella neuroner in vitro. Sedan dess har direkt omprogrammering av astrocyter in vitro till nervceller gett betydande insikter om de molekylära mekanismerna bakom tvångsidentitetsomvandling och de hinder som förhindrar effektiv omprogrammering. Resultat från in vitro-experiment utförda i olika laboratorier är dock svåra att jämföra på grund av skillnader i de metoder som används för att isolera, odla och omprogrammera astrocyter. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att på ett tillförlitligt sätt isolera och odla astrocyter med hög renhet från olika regioner i centrala nervsystemet hos möss vid postnatala åldrar via magnetisk cellsortering. Dessutom tillhandahåller vi protokoll för att omprogrammera odlade astrocyter till nervceller via viral transduktion eller DNA-transfektion. Detta strömlinjeformade och standardiserade protokoll kan användas för att undersöka de molekylära mekanismerna som ligger till grund för underhåll av cellidentitet, upprättandet av en ny neuronal identitet, samt genereringen av specifika neuronala subtyper och deras funktionella egenskaper.
Introduction
Däggdjurets centrala nervsystem (CNS) är mycket komplext och består av hundratals olika celltyper, inklusive ett stort antal olika neuronala subtyper 1,2,3,4,5,6. Till skillnad från andra organ eller vävnader 7,8,9 har däggdjurets CNS en mycket begränsad regenerativ kapacitet; neuronal förlust efter traumatisk hjärnskada eller neurodegeneration är irreversibel och resulterar ofta i motoriska och kognitiva underskott10. I syfte att rädda hjärnfunktioner är olika strategier för att ersätta förlorade nervceller under intensiv utredning11. Bland dem framträder direkt omprogrammering av somatiska celler till funktionella neuroner som ett lovande terapeutiskt tillvägagångssätt12. Direkt omprogrammering, eller transdifferentiering, är processen att konvertera en differentierad celltyp till en ny identitet utan att passera genom ett mellanliggande proliferativt eller pluripotent tillstånd 13,14,15,16. Banbrytande genom identifieringen av MyoD1 som en faktor som är tillräcklig för att omvandla fibroblaster till muskelceller17,18, har denna metod framgångsrikt tillämpats för att omprogrammera flera celltyper till funktionella neuroner 19,20,21.
Astrocyter, den vanligaste makroglian i CNS22,23, är en särskilt lovande celltyp för direkt neuronal omprogrammering av flera skäl. För det första är de brett och jämnt fördelade över CNS, vilket ger en riklig loco-källa för nya neuroner. För det andra är astrocyter och neuroner utvecklingsmässigt nära besläktade, eftersom de delar en gemensam förfader under embryonal utveckling, de radiella glialcellerna24. Det gemensamma embryonala ursprunget för de två celltyperna verkar underlätta neuronal omvandling jämfört med omprogrammering av celler från olika bakterielager19,21. Dessutom upprätthålls mönstringsinformation som ärvts av astrocyter genom deras radiella glia-ursprung också i vuxna astrocyter 25,26,27 och verkar bidra till genereringen av regionalt lämpliga neuronala subtyper 28,29,30. Därför är undersökning och förståelse av omvandlingen av astrocyter till neuroner en viktig del av att uppnå den fulla potentialen för denna teknik för cellbaserade ersättningsstrategier.
Omvandlingen av in vitro-odlade astrocyter till neuroner har lett till flera genombrott inom området direkt neuronal omprogrammering, inklusive: i) identifiering av transkriptionsfaktorer som är tillräckliga för att generera neuroner från astrocyter 15,19,31, ii) upplösning av molekylära mekanismer som utlöses av olika omprogrammeringsfaktorer i samma cellulära sammanhang 32 , och iii) belysa effekten av astrocyternas utvecklingsmässiga ursprung på inducering av olika neuronala subtyper 28,29,33. Dessutom avslöjade direkt omvandling av astrocyter in vitro flera stora hinder som begränsar direkt neuronal omprogrammering34,35, såsom ökad produktion av reaktiva syrearter (ROS)34 och skillnader mellan mitokondriellt proteom av astrocyter och neuroner35. Därför stöder dessa observationer starkt användningen av primära kulturer av astrocyter som en modell för direkt neuronal omprogrammering för att undersöka flera grundläggande frågor i biologi12, relaterade till cellidentitetsunderhåll, vägspärrar som förhindrar cell ödesförändringar, samt metabolismens roll i omprogrammering.
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att isolera astrocyter från möss vid postnatal (P) ålder med mycket hög renhet, vilket demonstreras genom att isolera astrocyter från den murina ryggmärgen29. Vi tillhandahåller också protokoll för att omprogrammera astrocyter till nervceller via viral transduktion eller DNA-plasmidtransfektion. Omprogrammerade celler kan analyseras vid 7 dagar efter transduktion (7 DPT) för att bedöma olika aspekter, såsom omprogrammeringseffektivitet och neuronal morfologi, eller kan bibehållas i odling i flera veckor för att bedöma deras mognad över tid. Viktigt är att detta protokoll inte är specifikt för ryggmärgsastrocyter och kan lätt appliceras för att isolera astrocyter från olika andra hjärnregioner, inklusive kortikal grå substans, mellanhjärna och cerebellum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande förfarande följer riktlinjerna för djuromsorg från Helmholtz Zentrum München i enlighet med direktiv 2010/63/EU om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål. Se till att följa riktlinjerna för djurvård från den institution där dissektion utförs.
1. Beredning av dissektion, dissociation och odlingsmaterial
OBS: Förbered alla odlingsreagenser i ett biologiskt säkerhetsskåp och arbeta med endast autoklaverad eller steril utrustning. Dissektions- och dissociationsreagens kan framställas utanför ett biologiskt säkerhetsskåp.
- Bered odlingskolvar genom att belägga en T25-odlingskolv med poly-D-lysin (stam 1 mg/ml, arbetslösning 20 μg/ml) iH2Oi minst 2 timmar. Skölj sedan 3x medH2Ooch lufttorka.
- Förbered dissektionsbufferten genom att tillsätta 5 ml 1 M HEPES-buffertlösning till 500 ml av Hanks balanserade saltlösning (HBSS).
- Förbered ett C-rör (se materialtabell) per sex ryggmärg genom att tillsätta 1950 μL buffert X från neuralvävnadsdissociationssatsen (se materialtabell). Förvara på is under dissektion. Förbered enzymatisk digestion masterblandning genom att tillsätta 20 μL buffert Y och 10 μL buffert A per C-rör (del av neuralvävnadsdissociationssatsen; se materialtabell). Blanda väl och förvara vid 4 °C tills det behövs.
- Förbered 1x fosfatbuffrad saltlösning (1x PBS) med kalcium och magnesium och lägg på is. Förbered basodlingsmedium genom att tillsätta 5 ml penicillin-streptomycin (slutlig koncentration, 100 U / ml), 5 ml 45% D-glukos och 5 ml glutamintillskott (slutlig koncentration 2 mM; se materialtabell) till 485 ml DMEM / F12. Basmediet är stabilt vid 4 °C i 4 veckor.
- Förbered astrocytodlingsmedium genom att tillsätta 1 ml B27-tillskott och 5 ml fetalt bovint serum (FBS) till 44 ml basiskt odlingsmedium. Komplettera medium med epidermal tillväxtfaktor (EGF) och basic-fibroblast growth factor (bFGF) (10 ng/ml vardera). Tillsätt EGF och bFGF strax före användning till lämplig mängd medium.
- För dissektion av ryggmärgsvävnad, använd ett par stora pincett med böjd spets, ett par små pincett med böjd spets, ett par små tångar, en liten sax och en liten spatel.
2. Astrocytisolering
- Isolera astrocyter från ryggmärgen hos postnatala möss för att utföra sin direkta omprogrammering till funktionella neuroner (Figur 1A). För detta protokoll, samla ryggmärgsvävnad från möss vid dag 2-3 efter födseln. Samla sex till åtta ryggmärg för astrocytisolering. Använd samma protokoll för att isolera astrocyter från andra regioner i nervsystemet, såsom cortex, midbrain och cerebellum. För dessa regioner, få celler vid fem till sju dagar efter födseln.
OBS: När man syftar till att isolera astrocyter från regioner som inte nämns i detta protokoll bör ålder och ingångsmaterial bestämmas experimentellt.
3. Dissektion av ryggmärgsvävnad
OBS: Dissektion av vävnad kan utföras utanför ett biologiskt säkerhetsskåp.
- Offra möss på P2-P3 genom halshuggning utan att bedöva djuret. Lägg bålen i en 35 mm petriskål och håll den på is.
- Öppna huden med sax, ta bort ryggkotan med en liten sax, extrahera ryggmärgen och placera den i dissektionsbuffert på is. Under ett stereotaktiskt dissektionsmikroskop med 2x förstoring, ta bort hjärnhinnorna från de isolerade ryggmärgen med hjälp av pincett och överför dissekerad och rengjord ryggmärgsvävnad till ett C-rör.
4. Magnetisk aktiverad cellsortering (MACS)
- Tillsätt 50 μL enzym P från neuralvävnadsdissociationssatsen (se materialtabell) och 30 μL tidigare beredd enzymblandning till varje C-rör. Vänd C-rören och placera dem på en uppvärmd dissociator (se materialtabell) och se till att all vävnad samlas upp i rörets lock.
- Kör 37_NTDK_1 dissociationsprogram med en körtid på cirka 22 minuter. Strax före programmets slut, placera en 70 μm sil (se materialtabell) på ett antal 15 ml rör som motsvarar antalet C-rör som används och förvåt silen med 2 ml iskall PBS. Förvara 1x PBS på is under hela MACS-proceduren.
- Efter avslutat program, ta bort C-rör och centrifugera dem kort för att samla vävnaden i botten av rören. Överför den dissocierade vävnaden från C-rören till de 15 ml rör som framställts genom att leda den genom silen. Lämna silen på 15 ml rör.
- Skölj C-röret med 10 ml 1x PBS för att samla upp överbliven vävnad och samla den i samma 15 ml rör genom att passera genom silen en gång till. Centrifugera 15 ml-rören som innehåller dissocierad vävnad vid 300 x g i 10 minuter vid rumstemperatur.
OBS: Kyl ner centrifugen till 4 °C efter detta steg. - Ta bort supernatanten utan att störa cellpelleten innan du återsuspar cellerna i 80 μL 1x PBS; Tillsätt 10 μl blockerande reagens från musens anti-ACSA-2 MicroBead-sats (se materialtabell). Blanda försiktigt genom pipettering.
- Inkubera vid 4 °C i 10 min i mörker (kylskåp). Tillsätt 10 μL anti-astrocytcellsytantigen-2-kopplade mikropärlor (se materialtabell) och blanda försiktigt genom pipettering. Inkubera i 15 min vid 4 °C i mörker.
- Tvätta cellerna genom tillsats av 3 ml 1x PBS och centrifugera vid 300 x g i 10 minuter vid 4 °C. Under centrifugeringen monterar du en magnetisk separator (se materialtabell) genom att placera lämpligt antal magnetiska sorteringskolonner (se materialtabell) på separatorn med ett 15 ml uppsamlingsrör under. Skölj kolonnerna med 500 μL 1x PBS.
- Ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 500 μL 1x PBS innan cellsuspensionerna överförs till de magnetiska kolonnerna. Låt rinna av tyngdkraften. Tvätta 15 ml rören med 500 μl 1x PBS och applicera på kolonnen. Tvätta kolumner med 500 μL 1x PBS för ytterligare två tvättar.
- Eluera celler genom att ta bort kolonnen från separatorn, tillsätt 800 μL astrocytodlingsmedium och tryck ut celler ur kolonnen med den medföljande kolven.
- Plattceller i de tidigare beredda odlingskolvarna genom tillsats av 4,2 ml astrocytodlingsmedium kompletterat med EGF och bFGF och odling vid 37 °C och 5 %CO2.
OBS: Beläggning av odlingskolvar är inte nödvändigt för astrocyter isolerade från andra hjärnregioner men ger ett bättre substrat för astrocyter isolerade från ryggmärgen. - Odla celler i cirka 7 dagar tills sammanflödet (80% -90%). Om cellerna inte är sammanflytande efter 7 dagar, vänta upp till 10 dagar innan du pläter dem. Efter 10 dagar sprider sig cellerna inte längre, och omprogrammeringseffektiviteten minskar.
5. Sådd av astrocyter för omprogrammering
OBS: Följande steg måste utföras under ett biologiskt säkerhetsskåp med säkerhetsnivå 1 (SL1).
- Förbered 24-brunnsplattor med poly-D-lysinbelagda glasöverdrag på samma sätt som odlingskolvar framställdes tidigare. För att bestämma antalet plattor som behövs, tänk på att astrocyter pläteras med en densitet av 5-5,5 x 104 celler per brunn i en 24-brunnsplatta. Vanligtvis ger isolering av sex ryggmärg från P2-möss cirka 1 x 106 celler.
- Aspirera media från T25-odlingskolvarna som innehåller de odlade astrocyterna och tvätta en gång med 1x PBS. Lossa astrocyterna från odlingskolven genom att tillsätta 0,5 ml 0,05 % trypsin/EDTA och inkubera vid 37 °C i 5 minuter. Knacka försiktigt på sidan av kolven för att frigöra celler från odlingskolvens yta och kontrollera lossningen under ett ljusfältmikroskop med en 10X förstoring.
- Stoppa trypsiniseringen med 2,5 ml astrocytodlingsmedium och samla cellsuspension i 15 ml rör. Centrifugera vid 300 x g i 5 min, aspirera supernatant och återsuspendera celler i 1 ml astrocytodlingsmedium. Beräkna cellkoncentrationen med hjälp av en hemocytometer eller ett automatiserat cellräkningssystem.
- Baserat på antalet celler, späd cellsuspensionen med färskt astrocytmedium för att erhålla en lösning av 1-1,1 x 105 celler per ml. Komplettera mediet med EGF och bFGF vid 10 ng / ml per faktor. Tillsätt 500 μl cellsuspension, motsvarande 5–5,5 x 104 celler, till varje brunn i de tidigare beredda 24-brunnsplattorna och odlingscellerna vid 37 °C och 5 %CO2.
6. Tvingat uttryck av transkriptionsfaktorer
OBS: Innan du fortsätter med protokollet är det viktigt att utforma experimentet korrekt. I synnerhet är det viktigt att alltid inkludera en negativ kontroll för omprogrammeringen, nämligen ett villkor där ingen omprogrammeringsfaktor uttrycks. Till exempel, när du använder vektorer som bär cDNA för omprogrammeringsfaktorn och en reporter (t.ex. grönt fluorescerande protein (GFP), DsRed), representeras den negativa kontrollen av samma vektor som endast bär reportern. När man uttrycker flera faktorer som bär olika reportrar bör den negativa kontrollen justeras i enlighet därmed.
- Dagen efter plätering, inspektera 24-brunnsplattorna för att se till att cellerna har fäst vid täckglasen.
- Baserat på det experimentella syftet och tillgängliga resurser kan tvångsuttryck av omprogrammeringsfaktorer uppnås genom viral transduktion (se steg 6.3) eller DNA-transfektion (se steg 6.4).
OBS: Användning av retrovirus eller lentivirus kräver godkännande av myndigheter och måste utföras under ett biologiskt säkerhetsskåp i ett laboratorium med säkerhetsnivå 2 (SL2). - Omprogrammera astrocyterna genom att transducera cellerna med det retrovirus eller lentivirus som bär den genetiska informationen för att uttrycka den eller de omprogrammeringsfaktorer som är av intresse enligt beskrivningen nedan.
- Transducera celler med en hög virustiter på 1 x 1010-1 x 1012 partiklar/ml genom att tillsätta 1 μl av cellsuspensionen direkt till astrocytmediet. Detta säkerställer en hög infektionshastighet. Odla cellerna med astrocytmediet som innehåller viruspartiklar vid 37 °C i 24–36 timmar innan du fortsätter med avsnitt 7 eller avsnitt 8, beroende på syftet med försöket.
OBS: Olika promotorer kan användas för att driva uttrycket av transgenerna (se även representativa resultat). Konstitutiva promotorer (t.ex. CMV, CAG) inducerar uttrycket av transgenen tidigare än inducerbara promotorer; emellertid, båda typerna av promotor typer har framgångsrikt använts för att omprogrammera celler till nervceller.
- Transducera celler med en hög virustiter på 1 x 1010-1 x 1012 partiklar/ml genom att tillsätta 1 μl av cellsuspensionen direkt till astrocytmediet. Detta säkerställer en hög infektionshastighet. Odla cellerna med astrocytmediet som innehåller viruspartiklar vid 37 °C i 24–36 timmar innan du fortsätter med avsnitt 7 eller avsnitt 8, beroende på syftet med försöket.
- DNA-plasmider kan också införas i astrocyter via DNA-transfektion enligt beskrivningen nedan.
OBS: Detta kan göras under ett biologiskt säkerhetsskåp godkänt för SL1.- Före transfektion, erhålla transfektionsreagenset, ett plasmid-DNA av de önskade konstruktionerna, färskt astrocytmedium och serumreducerat medium (se materialtabell). Beräkna den erforderliga mängden serumreducerat medium (se materialtabell) genom att överväga att varje brunn på en 24-brunnsplatta kräver 300 μL serumreducerat medium. Tillsätt lämplig mängd serumreducerat medium till ett 50 ml rör och värm det till 37 °C.
- När det serumreducerade mediet är varmt, aspirera astrocytmedium från alla brunnar och samla det i ett 50 ml rör. Filtrera det uppsamlade astrocytmediet med ett 0,45 μM sprutfilter för att avlägsna fristående celler.
- Tillsätt en lika stor volym färskt astrocytmedium till det filtrerade mediet för att erhålla en lösning som är tillräcklig för att tillsätta 1 ml astrocytmedium per brunn. Behåll det astrocytkonditionerade mediet i inkubatorn vid 37 °C fram till användning (steg 6.4.9).
OBS: Odlingsmediet återanvänds eftersom det innehåller flera utsöndrade faktorer som stöder kulturens livskraft. - Tillsätt 300 μL förvärmt serumreducerat medium till varje brunn och placera 24-brunnsplattan tillbaka till inkubatorn.
- Förbered lösning A, bestående av DNA och serumreducerat medium. För varje brunn, använd totalt 0,6 μg DNA och tillsätt det till 50 μL serumreducerat medium. Förvara lösning A vid rumstemperatur tills den används.
OBS: Vanligtvis beaktas en teknisk tredubbling per villkor. Därför framställs en blandning som är tillräcklig för 3,5 reaktion (t.ex. 2,1 μg totalt DNA utspätt i 175 μL serumreducerat medium) för att säkerställa tillräckligt med material för att transfektera tre brunnar på en 24-brunnsplatta. - Bered lösning B, bestående av transfektionsreagens och serumreducerat medium. Tillsätt 0,75 μl transfektionsreagens till 50 μL serumreducerat medium för varje brunn. Eftersom den här lösningen är gemensam för alla transfektionsförhållanden, förbered den i bulk för att minska variationen mellan transfektioner.
- Inkubera lösning B vid rumstemperatur i 5 min. Tillsätt lösning B till lösning A droppe för droppe i förhållandet 1:1 och blanda försiktigt. Virvel inte. Inkubera lösning A+B i 20-30 min vid rumstemperatur under huven.
- Upprepa steg 6.4.5-6.4.7 för alla transfektionsförhållanden. Efter 20-30 min, tillsätt lösning A+B till varje brunn droppe för droppe för en slutlig volym på 100 μL. Skaka försiktigt plattan och placera cellerna tillbaka i inkubatorn vid 37 °C i 4 timmar.
- Efter 4 timmar avlägsna transfektionsmediet och tillsätt 1 ml av det förvärmda astrocytkonditionerade mediet som beretts i steg 6.4.3. Behåll cellerna i 36-48 timmar innan du fortsätter med avsnitt 7 eller avsnitt 8, beroende på syftet med experimentet.
7. Omprogrammering av astrocyter (7 dagars analys)
- Förbered neuronalt differentieringsmedium genom att tillsätta 1 ml B27-tillskott till 49 ml basiskt odlingsmedium (se steg 1.4). Efter 24-48 timmar, beroende på om celler har transducerats eller transfekterats (se steg 6.3 respektive 6.4), ersätt astrocytmedium med 1 ml neuronalt differentieringsmedium per brunn och odlingsceller vid 37 °C och 9% CO2.
OBS: Celler kan också hållas vid 5% CO2 om ingen 9% CO2-inkubator är tillgänglig. Neuronal omprogrammering är dock effektivare under dessa förhållanden. - Valfritt: För att öka omprogrammeringseffektiviteten, komplettera neuronalt differentieringsmedium med Forskolin (slutlig koncentration av 30 μM) och Dorsomorphin (slutlig koncentration av 1 μM) när du ersätter astrocytmediet till differentieringsmediet. När du väljer att behandla celler med Forskolin och Dorsomorphin, ge en andra dos dos Dorsomorphin 2 dagar efter den första behandlingen. Lägg till denna andra behandling direkt till odlingsmediet.
- Direkt omprogrammering av murina astrocyter till neuronala celler sker normalt inom 7 dagar efter byte av medium. Därför, 7 dagar efter initieringen av neuronal omprogrammering, fixa eller samla celler för nedströmsanalys.
8. Omprogrammering av astrocyter till mogna neuroner (långsiktiga kulturer)
- Förbered neuronalt differentieringsmedium genom att tillsätta 1 ml B27-tillskott till 49 ml basiskt odlingsmedium (se steg 1.4). Efter 24-48 timmar, beroende på om cellerna transducerades eller transfekterades (se steg 6.3 respektive 6.4), ersätt astrocytmedium med 1 ml neuronalt differentieringsmedium kompletterat med Forskolin (slutlig koncentration på 30 μM) och Dorsomorphin (slutlig koncentration av 1 μM) per brunn och odlingsceller vid 37 °C och 9%CO2.
OBS: Celler kan också hållas vid 5% CO2 om ingen 9% CO2-inkubator är tillgänglig. Neuronal omprogrammering är dock effektivare under dessa förhållanden. - Upprepa dorsomorfinbehandling 2 dagar efter den första behandlingen genom att lägga den direkt till det neuronala differentieringsmediet.
- Efter 7 dagar från början av neuronal omprogrammering, förbered mognadsmediet genom att tillsätta 6 μL N2, 1,2 μL NT3 (lager 20 μg / ml), 1,2 μL BDNF (lager 20 μg / ml), 1,2 μL GDNF (lager 20 μg / ml) och 1,2 μL cAMP (lager 100 mM) till 189,2 μL neuronalt differentieringsmedium. Komplettera neuronalt differentieringsmedium som finns i varje brunn med 200 μL mognadsmedium.
OBS: Mognadsmedium kompletteras endast för den första behandlingen. Alla efterföljande behandlingar görs genom att delvis ersätta det neuronala differentieringsmediet enligt beskrivningen nedan. - Upprepa behandlingen med små molekyler genom att ta bort 200 μL neuronalt differentieringsmedium och tillsätt 200 μL färskt mognadsmedium två gånger i veckan i upp till 6 veckor. Under mognaden, använd celler för elektrofysiologiska experiment (vanligtvis vid dag 21 eller senare) eller fixa för nedströmsanalys (t.ex. immunofluorescens).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primära kulturer av astrocyter når vanligtvis 80% -90% sammanflöde mellan 7 och 10 dagar efter MAC-sortering och plätering (figur 1B). I allmänhet ger en enda T25-odlingskolv cirka 1-1,5 x 106 celler, vilket är tillräckligt för 20-30 täckglas vid sådd av celler med en densitet av 5-5,5 x 104 celler per brunn. Dagen efter plätering täcker celler vanligtvis 50% -60% av täckglasytan (figur 1C). I detta skede består kulturer nästan uteslutande av astrocyter, medan andra celltyper, såsom neuroblaster, praktiskt taget saknas (figur 1D)29.
Omprogrammeringsfaktorer kan levereras till astrocyter antingen via retroviral eller lentiviral transduktion eller genom transfektion av DNA-plasmider. Vanligtvis infekterar viral transduktion fler celler jämfört med transfektion. Eftersom direkt neuronal omvandling orsakar en betydande mängd celldöd34,35, föredras retroviral eller lentiviral transduktion för att maximera antalet celler för analys. Olika promotorer kan användas för att kontrollera uttrycket av omprogrammeringsfaktorerna: konstitutiva (t.ex. CMV, CAG)15,32, inducerbara (t.ex. Tet-responsiva element, Tet-ON)21 eller celltypsspecifika (t.ex. GFAP-promotor)36,37. Vid användning av konstitutiva eller celltypspecifika promotorer börjar astrocyter uttrycka detekterbara nivåer av transgenerna, bedömda med fluorescerande reporteruttryck (t.ex. GFP, DsRed), inom 24 timmar efter genleveransen, med varje cell oberoende av de andra. Omvänt tillåter inducerbara promotorer att synkronisera uttrycket av transgenerna över de transducerade cellerna, eftersom de aktiveras efter tillsats av en liten molekyl (t.ex. doxycyklin) till odlingsmediet. Detekterbara nivåer av transkriptionsfaktorerna uppnås vanligtvis 18-20 timmar efter aktiveringen av promotorn. I de flesta fall nås toppen av omprogrammeringsfaktoruttrycket vid cirka 48 timmar, med lentivirusmedierat uttryck som tar något längre tid.
Medan transkriptionella förändringar efter omprogrammeringsfaktorers uttryck kan detekteras så tidigt som 4 h32, inträffar robusta förändringar efter 24 timmar och senare29,32. Morfologiska förändringar följer transkriptionella förändringar, och de första tecknen på omvandling kan observeras cirka 3 dagar efter transduktion / transfektion (3 DPT). Vid 7 DPT är inducerade neuronala celler tydligt urskiljbara från astrocyter: deras soma är mindre än kontroll eller omprogrammerade astrocyter, de har långa processer och de är positiva för neuronal markör βIII-tub och är negativa för astrocytmarkör GFAP (Figur 1E). Det är emellertid värt att notera att vissa celler kan vara antingen positiva för både GFAP och βIII-tub, vilket tyder på att det neuronala programmet har inducerats men astrocytidentiteten inte har hämmats, eller negativ för båda markörerna, vilket indikerar undertryckandet av astrocytidentiteten men frånvaron av induktion av neuronal kaskaden. I båda fallen upprätthåller cellerna vanligtvis en astrocytmorfologi.
För mer funktionella analyser, såsom elektrofysiologi eller utvärdering av de genererade neuronala subtyperna, upprätthålls kulturer i allmänhet i minst 21 DPT och behandlas med mognadsmedium. Vid 21 DPT kan många inducerade neuroner avfyra åtgärdspotentialer och är positiva för den mogna neuronala markören NeuN såväl som för det pansynaptiska proteinet Synaptofysin29 (Figur 1F).
Figur 1: Översikt över astrocytkultur och omprogrammering. Varje svart linje representerar ett viktigt steg i protokollet. (B) Representativa ljusfältsbilder av odlade ryggmärgs-härledda astrocyter efter 7 dagar i odling. Bilderna togs med ett ljusfältmikroskop och 10x mål. Skalstreck representerar 100 μm. (C) Representativa ljusfältsbilder av ryggmärgsastrocyter 1 dag efter omplätering med en densitet av 5,5 x 104 celler per brunn i en 24-brunnsplatta. Bilderna togs med ett ljusfältmikroskop och ett 10x mål. Skalstreck representerar 100 μm. (D) Immunofluorescensbild av ett βIII-badkar, Sox9, GFAP trippelfärgning på astrocyter fixerade 1 dag efter plätering för att visa odlingsrenhet. Cellerna fixerades i 4% paraformaldehyd i 10 min och tvättades två gånger med 1x PBS. Celler blockerades med en 3% BSA, 0,5% Triton-X 100 i 1x PBS-lösning. Primära antikroppar späddes ut vid rätt koncentration (t.ex. anti-GFAP 1:250; anti-βIII-tub 1:250; anti-Syp1 1:500) i blockerande lösning och inkuberades i 2 timmar vid rumstemperatur. Cellerna tvättades tre gånger med 1x PBS och inkuberades med fluoroforkonjugerade sekundära antikroppar i 1 timme vid rumstemperatur. Täckglas tvättades tre gånger med 1x PBS innan montering med Aqua Poly/Mount. Bilder förvärvades med hjälp av ett epifluorescensmikroskop och ett 40x mål. Skalstreck representerar 20 μm. (E) Immunofluorescensbild av ett βIII-badkar, DsRed dubbelfärgning för att demonstrera astrocyt till neuronomvandling med Ascl1 efter 7 DPT. Protokoll för immunofluorescens och bildförvärv var som beskrivits ovan. Skalstreck representerar 20 μm. (F) Immunofluorescensbilder av ett βIII-badkar, DsRed, Synaptofysin 1 (Syp1) trippelfärgning för att visa neuronal mognad efter 21 DPT omprogrammering med Ascl1. Protokoll för immunofluorescens och bildförvärv var som beskrivits ovan. Skalstrecket representerar 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Primära kulturer av murina astrocyter är ett anmärkningsvärt in vitro-modellsystem för att studera direkt neuronal omprogrammering. Faktum är att trots att de isoleras i ett postnatalt stadium uttrycker celler typiska astrocytmarkörer29, behåller uttrycket av mönstringsgener 28,29 och upprätthåller förmågan att föröka sig, liknande in vivo-astrocyter vid en jämförbar ålder38. Efter MACS-medierad isolering fäster cellerna först vid kolven och börjar sedan föröka sig, vilket ger upphov till högt berikade astrocytkulturer29. Viktigt är att odlade astrocyter inte dedifferentierar sig till ett multipotent celltillstånd eller blir odödliga. Dessutom genererar de inte spontant neuroner efter uttrycket av ett reporterprotein (t.ex. DsRed eller GFP), men upprätthåller en astrocytidentitet. De sprider sig inte heller på obestämd tid, utan saktar snarare ner deras spridning och övergång till ett mer moget stadium, vilket minskar deras direkta neuronala omprogrammeringspotential32,39.
Det finns flera kritiska steg i detta protokoll: för det första är det viktigt att noggrant isolera regionen av intresse och ta bort eventuella förorenande vävnader. Till exempel, för att förbereda ryggmärgsastrocyter, extraheras ryggmärgen från ryggkotorna och dorsala rotganglierna (DRG) avlägsnas försiktigt. För det andra genomgår konverterande celler signifikant celldöd34, vilket har en negativ inverkan på de transducerade cellerna och den totala kulturen på grund av stimulering av fagocytos genom omgivande astrocyter samt förändrad mediaosmolaritet. Därför är det viktigt att ersätta astrocytmediet med en tillräcklig volym differentieringsmedium (vanligtvis 1 ml/brunn på en 24-brunnsplatta). Dessutom är transfektion av plasmid-DNA ett enkelt och mer tillgängligt tillvägagångssätt jämfört med viral transduktion, vilket kräver ett godkänt cellodlingsrum på säkerhetsnivå 2. Transfektionshastigheten och omprogrammeringseffektiviteten är dock lägre jämfört med virusmedierad leverans av omprogrammeringsfaktorerna. Därför kan transfektion användas som en snabb metod för att testa omprogrammeringspotentialen hos nya kandidatomprogrammeringsfaktorer eller för att screena pooler av faktorer. När det gäller neuronal mognad blir omprogrammerade celler vanligtvis elektrofysiologiskt aktiva vid cirka 3 veckor. Även om det inte krävs, ökar behandling av cellerna med små molekyler både överlevnad och mognad av de omprogrammerade cellerna, vilket leder till en högre densitet av inducerade nervceller och en mer mogen morfologi.
Även om den beskrivna metoden för att isolera och odla astrocyter är robust och pålitlig, måste några aspekter beaktas. För det första, medan konventionella metoder baserade på mekanisk dissociation av vävnad ger ett totalt sett högre antal celler i odling per vävnad dissekerad40, kräver ett MAC-sorterat tillvägagångssätt dissektion av vävnad från sex till åtta valpar för att isolera ett tillräckligt antal celler för efterföljande experiment. Dessutom är isoleringen av astrocyter baserad på uttrycket av ATPas Na +/ K + som transporterar subenhet Beta2-protein (Atp1b2), erkänt av antikroppen ACSA-241. I princip skulle astrocyter som inte uttrycker Atp1b2 gå förlorade i preparatet, vilket orsakar en bias i preparatet. Även om vi inte kan utesluta att detta är fallet, avslöjade vår analys av MACS-genomströmning att få celler i den negativa fraktionen var immunreaktiva för astroglia-markörerna Sox9, vilket tyder på den höga effektiviteten hos MAC-sorteringsprotokollet. En andra varning angående Atp1b2 är relaterad till dess uttryck. Atp1b2 uttrycks specifikt av astrocyter i postnatalt stadium, medan i musens vuxna hjärna uttrycker andra celltyper det, särskilt myeliniserande oligodendrocyter och ependymala celler27. Därför krävs en noggrann dissektion av intresseområdet och ett myelinavlägsnande steg för att isolera astrocyter från vuxna hjärnor.
Jämfört med andra metoder för att isolera astrocyter säkerställer det MACS-baserade tillvägagångssättet hög renhet hos kulturerna (>90% av Sox9+ -cellerna) och ger ett standardiserat förfarande för att isolera astrocyter från olika regioner i CNS. Detta är särskilt viktigt när man jämför kulturer från olika CNS-regioner, eftersom kulturrenheten som erhålls genom klassisk mekanisk dissociation kan variera anmärkningsvärt (>80% GFAP +/ DAPI från kortikal grå substans, ~ 50% GFAP + / DAPI från ryggmärgen)15,29. Ett standardiserat protokoll minskar sådan variation och ger en gemensam utgångspunkt för in vitro-omprogrammeringsexperiment. Detta gör det till exempel möjligt att systematiskt jämföra den molekylära identiteten hos astrocyter från olika regioner28,29 och att undersöka effekten av utvecklingsursprunget på omprogrammeringseffektiviteten och subtypidentiteten hos de inducerade neuronerna.
Sammanfattningsvis är in vitro-direkt neuronal omprogrammering av optimerade kulturer av astrocyter ett mycket kraftfullt tillvägagångssätt för att avslöja universella såväl som regionspecifika molekylära mekanismer för astrocyt-till-neuron-omvandling, vilket ger viktig information för att utforma bättre och effektivare strategier för in vivo direkt omvandling av bosatta CNS-astrocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi vill tacka Ines Mühlhahn för kloning av konstruktionerna för omprogrammering, Paulina Chlebik för viral produktion och Magdalena Götz och Judith Fischer-Sternjak för kommentarer till manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| anti-mouse IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
| anti-Mouse IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
| anti-mouse IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| anti-rabbit Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
| cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
| C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
| Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
| Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
| MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
| Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
| Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
| Rabbit anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
| Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
References
- Johnson, T. S., et al. Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing. Scientific Reports. 10 (1), 18014 (2020).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Nowakowski, T. J., et al. Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex. Science. 358 (6368), 1318-1323 (2017).
- Sagner, A., Briscoe, J. Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place. Development. 146 (22), (2019).
- Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Iismaa, S. E., et al. Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues. NPJ Regenerative Medicine. 3, 6 (2018).
- Lange, C., Brand, M. Vertebrate brain regeneration - a community effort of fate-restricted precursor cell types. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 101-108 (2020).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature Reviews Genetics. 11 (10), 710-722 (2010).
- Grade, S., Gotz, M. Neuronal replacement therapy: previous achievements and challenges ahead. NPJ Regenerative Medicine. 2, 29 (2017).
- Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
- Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
- Di Tullio, A., et al. CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP(alpha))-induced transdifferentiation of pre-B cells into macrophages involves no overt retrodifferentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (41), 17016-17021 (2011).
- Fishman, V. S., et al. Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells. Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biology. 8 (5), 1000373 (2010).
- Treutlein, B., et al. Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq. Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).
- Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242 (4877), 405-411 (1988).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).
- Marro, S., et al. Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Bass, N. H., Hess, H. H., Pope, A., Thalheimer, C. Quantitative cytoarchitectonic distribution of neurons, glia, and DNa in rat cerebral cortex. The Journal of Comparative Neurology. 143 (4), 481-490 (1971).
- Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PLoS One. 12 (7), 0180697 (2017).
- Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Batiuk, M. Y., et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution. Nature Communication. 11 (1), 1220 (2020).
- Boisvert, M. M., Erikson, G. A., Shokhirev, M. N., Allen, N. J. The aging astrocyte transcriptome from multiple regions of the mouse brain. Cell Reports. 22 (1), 269-285 (2018).
- Ohlig, S., et al. Molecular diversity of diencephalic astrocytes reveals adult astrogenesis regulated by Smad4. The EMBO Journal. 40 (21), 107532 (2021).
- Herrero-Navarro, A., et al. Astrocytes and neurons share region-specific transcriptional signatures that confer regional identity to neuronal reprogramming. Science Advances. 7 (15), (2021).
- Kempf, J., et al. Heterogeneity of neurons reprogrammed from spinal cord astrocytes by the proneural factors Ascl1 and Neurogenin2. Cell Reports. 36 (3), 109409 (2021).
- Mattugini, N., et al. Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse Cerebral Cortex. Neuron. 103 (6), 1086-1095 (2019).
- Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nature Neuroscience. 5 (4), 308-315 (2002).
- Masserdotti, G., et al. Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes. Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).
- Rao, Z., et al. Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion. Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).
- Gascon, S., et al. Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).
- Russo, G. L., et al. CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion. Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).
- Guo, S., et al. Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state. Cell. 156 (4), 649-662 (2014).
- Hu, X., et al. Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming. Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).
- Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
- Price, J. D., et al. The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation. The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).
- Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).
