Summary
Her beskriver vi en detaljert protokoll for å generere høyt berikede kulturer av astrocytter avledet fra forskjellige regioner i sentralnervesystemet hos postnatale mus og deres direkte konvertering til funksjonelle nevroner ved tvungen uttrykk for transkripsjonsfaktorer.
Abstract
Direkte neuronal omprogrammering er en kraftig tilnærming for å generere funksjonelle nevroner fra forskjellige startcellepopulasjoner uten å passere gjennom multipotente mellomprodukter. Denne teknikken har ikke bare store løfter innen sykdomsmodellering, da det gjør det mulig å konvertere for eksempel fibroblaster for pasienter som lider av nevrodegenerative sykdommer til nevroner, men representerer også et lovende alternativ for cellebaserte erstatningsterapier. I denne sammenheng var et stort vitenskapelig gjennombrudd demonstrasjonen av at differensierte ikke-nevrale celler i sentralnervesystemet, som astrocytter, kunne omdannes til funksjonelle nevroner in vitro. Siden da har in vitro direkte omprogrammering av astrocytter i nevroner gitt betydelig innsikt i de molekylære mekanismene som ligger til grunn for tvungen identitetskonvertering og hindringene som forhindrer effektiv omprogrammering. Resultater fra in vitro-eksperimenter utført i forskjellige laboratorier er imidlertid vanskelige å sammenligne på grunn av forskjeller i metodene som brukes til å isolere, dyrke og omprogrammere astrocytter. Her beskriver vi en detaljert protokoll for pålitelig å isolere og dyrke astrocytter med høy renhet fra forskjellige regioner i sentralnervesystemet hos mus i postnatal alder via magnetisk cellesortering. Videre gir vi protokoller for å omprogrammere dyrkede astrocytter til nevroner via viral transduksjon eller DNA-transfeksjon. Denne strømlinjeformede og standardiserte protokollen kan brukes til å undersøke de molekylære mekanismene som ligger til grunn for vedlikehold av celleidentitet, etablering av en ny nevronidentitet, samt generering av spesifikke nevronale subtyper og deres funksjonelle egenskaper.
Introduction
Pattedyrets sentralnervesystem (CNS) er svært komplekst, og består av hundrevis av forskjellige celletyper, inkludert et stort antall forskjellige nevronale subtyper 1,2,3,4,5,6. I motsetning til andre organer eller vev 7,8,9 har pattedyrets CNS en svært begrenset regenerativ kapasitet; nevrontap etter traumatisk hjerneskade eller nevrodegenerasjon er irreversibel og resulterer ofte i motoriske og kognitive underskudd10. Med sikte på å redde hjernefunksjoner, er forskjellige strategier for å erstatte tapte nevroner under intens undersøkelse11. Blant dem fremstår direkte omprogrammering av somatiske celler til funksjonelle nevroner som en lovende terapeutisk tilnærming12. Direkte omprogrammering, eller transdifferensiering, er prosessen med å konvertere en differensiert celletype til en ny identitet uten å passere gjennom en mellomliggende proliferativ eller pluripotent tilstand 13,14,15,16. Banebrytende ved identifisering av MyoD1 som en faktor som er tilstrekkelig til å konvertere fibroblaster til muskelceller17,18, har denne metoden blitt brukt til å omprogrammere flere celletyper til funksjonelle nevroner 19,20,21.
Astrocytter, den mest tallrike makroglia i CNS22,23, er en spesielt lovende celletype for direkte neuronal omprogrammering av flere grunner. For det første er de bredt og jevnt fordelt over CNS, noe som gir en rikelig i loco kilde for nye nevroner. For det andre er astrocytter og nevroner utviklingsmessig nært beslektet, da de deler en felles forfader under embryonal utvikling, de radiale gliacellene24. Den felles embryonale opprinnelsen til de to celletypene ser ut til å lette nevronkonvertering sammenlignet med omprogrammering av celler fra forskjellige kimlag19,21. Videre opprettholdes mønsterinformasjon arvet av astrocytter gjennom deres radiale glia-opprinnelse også i voksne astrocytter 25,26,27, og ser ut til å bidra til generering av regionalt passende nevronale subtyper 28,29,30. Derfor er undersøkelse og forståelse av konvertering av astrocytter til nevroner en viktig del av å oppnå det fulle potensialet i denne teknikken for cellebaserte erstatningsstrategier.
Omdannelsen av in vitro-dyrkede astrocytter til nevroner har ført til flere gjennombrudd innen direkte nevronal omprogrammering, inkludert: i) identifisering av transkripsjonsfaktorer som er tilstrekkelige til å generere nevroner fra astrocytter 15,19,31, ii) oppløsningen av molekylære mekanismer utløst av forskjellige omprogrammeringsfaktorer i samme cellulære kontekst 32 , og iii) fremheve virkningen av utviklingsopprinnelsen til astrocytter på å indusere forskjellige nevronale subtyper 28,29,33. Videre unravelled in vitro direkte konvertering av astrocytter flere store hindringer som begrenser direkte neuronal omprogrammering34,35, for eksempel økt reaktiv oksygenart (ROS) produksjon34 og forskjeller mellom mitokondriell proteom av astrocytter og nevroner35. Derfor støtter disse observasjonene sterkt bruken av primære kulturer av astrocytter som en modell for direkte neuronal omprogrammering for å undersøke flere grunnleggende spørsmål i biologi12, relatert til vedlikehold av celleidentitet, veisperringer som forhindrer celleskjebneendringer, samt metabolismens rolle i omprogrammering.
Her presenterer vi en detaljert protokoll for å isolere astrocytter fra mus i postnatal (P) alder med svært høy renhet, som vist ved å isolere astrocytter fra murine ryggmargen29. Vi tilbyr også protokoller for å omprogrammere astrocytter til nevroner via viral transduksjon eller DNA-plasmidtransfeksjon. Omprogrammerte celler kan analyseres 7 dager etter transduksjon (7 DPT) for å vurdere ulike aspekter, for eksempel omprogrammeringseffektivitet og nevronmorfologi, eller kan opprettholdes i kultur i flere uker, for å vurdere modningen over tid. Det er viktig at denne protokollen ikke er spesifikk for ryggmargs astrocytter og kan lett brukes til å isolere astrocytter fra forskjellige andre hjernegrupper, inkludert kortikal grå substans, midthjerne og cerebellum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende prosedyre følger retningslinjene for dyrepleie fra Helmholtz Zentrum München i samsvar med direktiv 2010/63/EU om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål. Sørg for å overholde retningslinjene for dyrepleie ved institusjonen der disseksjonen utføres.
1. Fremstilling av disseksjons-, dissosiasjons- og kulturmaterialer
MERK: Klargjør alle dyrkningsreagenser i et biologisk sikkerhetsskap og arbeid med kun autoklavert eller sterilt utstyr. Disseksjons- og dissosiasjonsreagenser kan fremstilles utenfor et biologisk sikkerhetsskap.
- Forbered kulturflasker ved å belegge en T25-kulturkolbe med poly-D-lysin (lager 1 mg / ml; arbeidsløsning 20 μg / ml) i H2O i minst 2 timer. Skyll deretter 3x med H2O og lufttørk.
- Klargjør disseksjonsbuffer ved å tilsette 5 ml 1 M HEPES bufferløsning til 500 ml av Hanks balanserte saltløsning (HBSS).
- Forbered ett C-rør (se Materialtabell) per seks ryggmarger ved å legge til 1950 μL buffer X fra nevralvevsdissosiasjonssettet (se Materialtabell). Oppbevares på is under disseksjon. Forbered enzymatisk fordøyelsesmesterblanding ved å tilsette 20 μL buffer Y og 10 μL buffer A per C-rør (del av nevralvevsdissosiasjonssettet; se Materialtabell). Bland godt og oppbevar ved 4 °C til det er nødvendig.
- Forbered 1x fosfatbufret saltvann (1x PBS) med kalsium og magnesium og legg på is. Klargjør basiskulturmediet ved å tilsette 5 ml penicillin-streptomycin (endelig konsentrasjon, 100 U/ml), 5 ml 45 % D-glukose og 5 ml glutamintilskudd (endelig konsentrasjon 2 mM; se materialtabell) til 485 ml DMEM/F12. Basismediet er stabilt ved 4 °C i 4 uker.
- Forbered astrocyttkulturmedium ved å tilsette 1 ml B27-supplement og 5 ml føtalt bovint serum (FBS) til 44 ml basiskulturmedium. Supplement medium med epidermal vekstfaktor (EGF) og basisk-fibroblast vekstfaktor (bFGF) (10 ng / ml hver). Tilsett EGF og bFGF like før bruk til riktig mengde medium.
- For disseksjon av ryggmargsvev, bruk et par store tang med bøyd spiss, et par små tang med bøyd spiss, ett par små tang, en liten saks og en liten spatel.
2. Astrocytt isolasjon
- Isoler astrocytter fra ryggmargen hos barselmus for å utføre direkte omprogrammering til funksjonelle nevroner (figur 1A). For denne protokollen samler ryggmargsvev fra mus på dag 2-3 etter fødselen. Samle seks til åtte ryggmarger for astrocyttisolasjon. Bruk den samme protokollen for å isolere astrocytter fra andre regioner i nervesystemet, som cortex, midbrain og cerebellum. For disse regionene, få celler på fem til syv dager etter fødselen.
MERK: Når man tar sikte på å isolere astrocytter fra regioner som ikke er nevnt i denne protokollen, bør alder og inngangsmateriale bestemmes eksperimentelt.
3. Ryggmargsvev disseksjon
MERK: Disseksjon av vev kan utføres utenfor et biologisk sikkerhetsskap.
- Ofre mus ved P2-P3 ved halshugging uten å bedøve dyret. Legg overkroppen i et 35 mm petriskål og hold deg på is.
- Åpne huden med saks, fjern vertebra med liten saks, trekk ut ryggmargen og legg den i disseksjonsbuffer på is. Under et stereotaktisk disseksjonsmikroskop med 2x forstørrelse, fjern meningene fra de isolerte ryggmargene ved hjelp av tang og overfør dissekert og rengjort ryggmargsvev til et C-rør.
4. Magnetisk aktivert cellesortering (MACS)
- Tilsett 50 μL enzym P fra nevralvevsdissosiasjonssettet (se materialtabell) og 30 μL tidligere tilberedt enzymblanding til hvert C-rør. Snu C-rørene og legg dem på en oppvarmet dissosiator (se materialtabell), og sørg for at alt vev samles i lokket på røret.
- Kjør det 37_NTDK_1 dissosiasjonsprogrammet med en kjøretid på omtrent 22 minutter. Kort tid før slutten av programmet, legg en 70 μm sil (se materialtabell) på et antall 15 ml rør som tilsvarer antall C-rør som brukes og forfukt silen med 2 ml iskald PBS. Oppbevar 1x PBS på is under hele MACS-prosedyren.
- Etter at programmet er fullført, fjern C-rør og sentrifuger dem kort for å samle vevet i bunnen av rørene. Overfør det dissosierte vevet fra C-rørene til 15 ml rørene fremstilt ved å føre det gjennom silen. La silen stå på 15 ml rør.
- Skyll C-tube med 10 ml 1x PBS for å samle rester av vev og samle det i samme 15 ml rør ved å passere gjennom silen igjen. Sentrifuger 15 ml rør som inneholder dissosiert vev ved 300 x g i 10 minutter ved romtemperatur.
MERK: Avkjøl sentrifugen ned til 4 °C etter dette trinnet. - Fjern supernatanten uten å forstyrre cellepelleten før du gjenoppliver cellene i 80 μL 1x PBS; tilsett 10 μL blokkerende reagens fra musens anti-ACSA-2 MicroBead-sett (se Materialtabell). Bland forsiktig ved pipettering.
- Rug ved 4 °C i 10 minutter i mørket (kjøleskap). Tilsett 10 μL anti-astrocyttcelle overflateantigen-2-koblede mikroperler (se materialtabell) og bland forsiktig ved pipettering. Rug i 15 minutter ved 4 °C i mørket.
- Vask cellene ved å tilsette 3 ml 1x PBS og sentrifugen ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C. Under sentrifugering monterer du en magnetisk separator (se Materialtabell) ved å plassere riktig antall magnetiske sorteringskolonner (se Materialtabell) på separatoren med et 15 ml oppsamlingsrør under. Skyll kolonnene med 500 μL 1x PBS.
- Fjern supernatant og resuspender cellene i 500 μL av 1x PBS før du overfører cellesuspensjonene til de magnetiske kolonnene. La drenere av tyngdekraften. Vask 15 ml rørene med 500 μL 1x PBS og påfør kolonnen. Vask kolonner med 500 μL 1x PBS for ytterligere to vasker.
- Eluer celler ved å fjerne kolonnen fra separatoren, tilsette 800 μL astrocyttkulturmedium og skyve celler ut av kolonnen med det medfølgende stempelet.
- Plateceller i de tidligere tilberedte kulturflaskene ved å tilsette 4,2 ml astrocyttkulturmedium supplert med EGF og bFGF og kultur ved 37 °C og 5 % CO2.
MERK: Beleggkulturflasker er ikke nødvendig for astrocytter isolert fra andre hjernegrupper, men gir et bedre substrat for astrocytter isolert fra ryggmargen. - Dyrkningsceller i ca. 7 dager inntil de er sammenføyd (80%-90%). Hvis cellene ikke er sammenflytende etter 7 dager, vent til 10 dager før du plater dem. Etter 10 dager sprer ikke cellene seg lenger, og omprogrammeringseffektiviteten avtar.
5. Såing av astrocytter for omprogrammering
MERK: Følgende trinn må utføres under et biologisk sikkerhetsskap med sikkerhetsnivå 1 (SL1).
- Forbered 24-brønns plater med poly-D-lysinbelagte glassdeksler på samme måte som kulturflasker ble tilberedt tidligere. For å bestemme antall plater som trengs, vurder at astrocytter er belagt med en tetthet på 5-5,5 x 104 celler per brønn i en 24-brønns plate. Vanligvis gir isolering av seks ryggmarger fra P2-mus rundt 1 x 106 celler.
- Aspirer media fra T25-kulturflaskene som inneholder de dyrkede astrocytter og vask en gang med 1x PBS. Løsne astrocytter fra dyrkningskolben ved å tilsette 0,5 ml 0,05 % trypsin/EDTA og ruge ved 37 °C i 5 minutter. Trykk forsiktig på siden av kolben for å frigjøre celler fra kulturkolbens overflate og kontroller løsrivelse under et lysfeltmikroskop ved hjelp av en 10X forstørrelse.
- Stopp trypsinisering med 2,5 ml astrocyttkulturmedium og samle cellesuspensjon i 15 ml rør. Sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter, aspirat supernatant og resuspend celler i 1 ml astrocyttkulturmedium. Beregn cellekonsentrasjon ved hjelp av et hemocytometer eller et automatisert celletellingssystem.
- Basert på antall celler, fortynn cellesuspensjonen med fersk astrocyttmedium for å oppnå en løsning på 1-1,1 x 105 celler per ml. Suppler mediet med EGF og bFGF ved 10 ng/ml per faktor. Tilsett 500 μL cellesuspensjon, tilsvarende 5-5,5 x 104 celler, til hver brønn av de tidligere fremstilte 24-brønns platene og kulturcellene ved 37 °C og 5 % CO2.
6. Tvungen uttrykk for transkripsjonsfaktorer
MERK: Før du fortsetter med protokollen, er det viktig å utforme eksperimentet riktig. Spesielt er det viktig å alltid inkludere en negativ kontroll for omprogrammeringen, nemlig en tilstand der ingen omprogrammeringsfaktor uttrykkes. For eksempel, når du bruker vektorer som bærer cDNA for omprogrammeringsfaktoren og en reporter (f.eks. Grønt fluorescerende protein (GFP), DsRed), er den negative kontrollen representert av den samme vektoren som bare bærer reporteren. Når du uttrykker flere faktorer som bærer forskjellige journalister, bør den negative kontrollen justeres tilsvarende.
- Dagen etter plating, inspiser platene med 24 brønner for å sikre at cellene har festet seg til dekslene.
- Basert på det eksperimentelle målet og tilgjengelige ressurser, kan tvungen ekspresjon av omprogrammeringsfaktorer oppnås ved viral transduksjon (se trinn 6.3) eller DNA-transfeksjon (se trinn 6.4).
MERK: Bruk av retrovirus eller lentivirus krever godkjenning fra offentlige myndigheter og må utføres under et biologisk sikkerhetsskap i et laboratorium med sikkerhetsnivå 2 (SL2). - Omprogrammer astrocytter ved å transdusere cellene med retrovirus eller lentivirus som bærer den genetiske informasjonen for å uttrykke omprogrammeringsfaktoren (e) av interesse som beskrevet nedenfor.
- Transduser celler med en høy virustiter på 1 x 1010-1 x 1012 partikler/ml ved å tilsette 1 μL av cellesuspensjonen direkte til astrocyttmediet. Dette sikrer et høyt smittetall. Dyrk cellene med astrocyttmediet som inneholder viruspartikler ved 37 °C i 24-36 timer før du fortsetter med seksjon 7 eller seksjon 8, avhengig av formålet med forsøket.
MERK: Ulike promotører kan brukes til å drive uttrykket av transgenes (se også Representative resultater). Konstitutive promotorer (f.eks. CMV, CAG) induserer uttrykket av transgenet tidligere enn induserbare promotorer; Imidlertid har begge typer promotortyper blitt brukt til å omprogrammere celler til nevroner.
- Transduser celler med en høy virustiter på 1 x 1010-1 x 1012 partikler/ml ved å tilsette 1 μL av cellesuspensjonen direkte til astrocyttmediet. Dette sikrer et høyt smittetall. Dyrk cellene med astrocyttmediet som inneholder viruspartikler ved 37 °C i 24-36 timer før du fortsetter med seksjon 7 eller seksjon 8, avhengig av formålet med forsøket.
- DNA-plasmider kan også innføres i astrocytter via DNA-transfeksjon som beskrevet nedenfor.
MERK: Dette kan gjøres under et biologisk sikkerhetsskap som er godkjent for SL1.- Før transfeksjon, oppnå transfeksjonsreagenset, et plasmid-DNA av de ønskede konstruksjonene, ferskt astrocyttmedium og serumredusert medium (se Materialtabell). Beregn den nødvendige mengden serumredusert medium (se materialtabell) ved å vurdere at hver brønn i en 24-brønns plate krever 300 μL serumredusert medium. Tilsett riktig mengde serumredusert medium til en slange på 50 ml og varm den opp til 37 °C.
- Når det serumreduserte mediet er varmt, aspirer astrocyttmediet fra alle brønner og samle det i et 50 ml rør. Filtrer det oppsamlede astrocyttmediet med et 0,45 μM sprøytefilter for å fjerne frittliggende celler.
- Tilsett et likt volum ferskt astrocyttmedium til det filtrerte mediet for å oppnå en løsning som er tilstrekkelig til å tilsette 1 ml astrocyttmedium per brønn. Oppbevar det astrocyttkondisjonerte mediet i inkubatoren ved 37 °C til bruk (trinn 6.4.9).
MERK: Kulturmediet gjenbrukes da det inneholder flere utskilte faktorer som støtter kulturens levedyktighet. - Tilsett 300 μL forvarmet serumredusert medium til hver brønn og legg 24-brønnsplaten tilbake til inkubatoren.
- Forbered løsning A, bestående av DNA og serumredusert medium. For hver brønn, bruk totalt 0,6 μg DNA og tilsett det til 50 μL serumredusert medium. Oppløsning A oppbevares ved romtemperatur inntil bruk.
MERK: Vanligvis vurderes et teknisk tre eksemplar per tilstand. Derfor fremstilles en blanding tilstrekkelig for 3,5 reaksjon (f.eks. 2,1 μg totalt DNA fortynnet i 175 μL serumredusert medium) for å sikre nok materiale til å transfektere tre brønner av en 24-brønns plate. - Forbered løsning B, sammensatt av transfeksjonsreagenset og serumredusert medium. For hver brønn tilsettes 0,75 μL transfeksjonsreagens til 50 μL serumredusert medium. Siden denne løsningen er felles for alle transfeksjonsforhold, må du forberede den i bulk for å redusere variasjonen på tvers av transfeksjoner.
- Inkuber oppløsning B ved romtemperatur i 5 minutter. Tilsett løsning B i løsning A dråpe for dråpe i forholdet 1:1 og bland forsiktig. Ikke virvel. Inkuber løsning A+B i 20-30 minutter ved romtemperatur under panseret.
- Gjenta trinn 6.4.5-6.4.7 for alle transfeksjonsbetingelser. Etter 20-30 min, tilsett løsning A + B til hver brønn dråpe for dråpe for et endelig volum på 100 μL. Rist platen forsiktig og legg cellene tilbake i inkubatoren ved 37 ° C i 4 timer.
- Etter 4 timer fjernes transfeksjonsmediet og tilsettes 1 ml av det forvarmede astrocyttbetingede mediet fremstilt i trinn 6.4.3. Vedlikehold celler i 36-48 timer før du fortsetter med seksjon 7 eller seksjon 8, avhengig av formålet med forsøket.
7. Omprogrammering av astrocytter (7 dagers analyse)
- Forbered neuronal differensieringsmedium ved å tilsette 1 ml B27-supplement til 49 ml basiskulturmedium (se trinn 1.4). Etter 24-48 timer, avhengig av om celler har blitt transdusert eller transfisert (se henholdsvis trinn 6.3 og 6.4), erstatt astrocyttmedium med 1 ml nevrondifferensieringsmedium per brønn og kulturceller ved 37 ° C og 9% CO2.
MERK: Celler kan også holdes på 5% CO2 hvis ingen 9% CO2 inkubator er tilgjengelig. Imidlertid er neuronal omprogrammering mer effektiv under disse forholdene. - Valgfritt: For å øke omprogrammeringseffektiviteten, supplere neuronal differensieringsmedium med Forskolin (endelig konsentrasjon på 30 μM) og Dorsomorphin (endelig konsentrasjon på 1 μM) når du erstatter astrocyttmediet til differensieringsmedium. Når du velger å behandle celler med Forskolin og Dorsomorphin, gi en andre dose av Dorsomorphin 2 dager etter den første behandlingen. Legg denne andre behandlingen direkte til kulturmediet.
- Direkte omprogrammering av murine astrocytter i nevronceller skjer normalt innen 7 dager etter endring av mediet. Derfor, 7 dager etter initiering av neuronal omprogrammering, fikse eller samle celler for nedstrøms analyse.
8. Omprogrammering av astrocytter til modne nevroner (langsiktige kulturer)
- Forbered neuronal differensieringsmedium ved å tilsette 1 ml B27-supplement til 49 ml basiskulturmedium (se trinn 1.4). Etter 24-48 timer, avhengig av om cellene ble transdusert eller transfisert (se henholdsvis trinn 6.3 og 6.4), erstatt astrocyttmedium med 1 ml nevrondifferensieringsmedium supplert med Forskolin (endelig konsentrasjon på 30 μM) og Dorsomorphin (endelig konsentrasjon på 1 μM) per brønn og kulturceller ved 37 ° C og 9% CO2.
MERK: Celler kan også holdes på 5% CO2 hvis ingen 9% CO2 inkubator er tilgjengelig. Imidlertid er neuronal omprogrammering mer effektiv under disse forholdene. - Gjenta dorsomorfinbehandling 2 dager etter den første behandlingen ved å legge den direkte til nevrondifferensieringsmediet.
- Etter 7 dager fra starten av nevronal omprogrammering, klargjør modningsmedium ved å tilsette 6 μL N2, 1,2 μL NT3 (lager 20 μg / ml), 1,2 μL BDNF (lager 20 μg / ml), 1,2 μL GDNF (lager 20 μg / ml) og 1,2 μL cAMP (lager 100 mM) til 189,2 μL nevrondifferensieringsmedium. Supplement neuronal differensiering medium tilstede i hver brønn med 200 μL modningsmedium.
MERK: Modningsmedium suppleres kun for den første behandlingen. Alle påfølgende behandlinger gjøres ved delvis å erstatte det nevrale differensieringsmediet som beskrevet nedenfor. - Gjenta behandlingen med små molekyler ved å fjerne 200 μL nevrondifferensieringsmedium og tilsette 200 μL fersk modningsmedium to ganger i uken i opptil 6 uker. Under modningen, bruk celler til elektrofysiologiske eksperimenter (vanligvis på dag 21 eller senere) eller fikse for nedstrøms analyse (f.eks. Immunfluorescens).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primære kulturer av astrocytter når vanligvis 80% -90% samløp mellom 7 og 10 dager etter MAC-sortering og plating (figur 1B). Vanligvis gir en enkelt T25 kulturkolbe rundt 1-1,5 x 106 celler, noe som er tilstrekkelig for 20-30 deksler ved såing av celler med en tetthet på 5-5,5 x 104 celler per brønn. Dagen etter plating dekker cellene vanligvis 50% -60% av dekslipoverflaten (figur 1C). På dette stadiet består kulturer nesten utelukkende av astrocytter, mens andre celletyper, som nevroblaster, er praktisk talt fraværende (figur 1D)29.
Omprogrammeringsfaktorer kan leveres til astrocytter enten via retroviral eller lentiviral transduksjon eller gjennom transfeksjon av DNA-plasmider. Vanligvis infiserer viral transduksjon flere celler sammenlignet med transfeksjon. Da direkte nevronal konvertering forårsaker en betydelig mengde celledød34,35, foretrekkes retroviral eller lentiviral transduksjon for å maksimere antall celler for analyse. Ulike promotorer kan brukes til å kontrollere uttrykket av omprogrammeringsfaktorene: konstituerende (f.eks. CMV, CAG)15,32, induserbare (f.eks. Tet-responsive elementer, Tet-ON)21 eller celletypespesifikke (f.eks. GFAP-promotorer)36,37. Ved bruk av konstitutive eller celletypespesifikke promotorer begynner astrocytter å uttrykke detekterbare nivåer av transgene, vurdert ved fluorescerende reporteruttrykk (f.eks. GFP, DsRed), innen 24 timer etter genleveringen, med hver celle uavhengig av de andre. Omvendt tillater induserbare promotorer å synkronisere uttrykket av transgene over cellene transducert, da de aktiveres etter tilsetning av et lite molekyl (f.eks. Doxycyklin) til kulturmediet. Detekterbare nivåer av transkripsjonsfaktorene nås vanligvis 18-20 timer etter aktivering av promotoren. I de fleste tilfeller er toppen av omprogrammeringsfaktoruttrykket nådd på rundt 48 timer, med lentivirusmediert uttrykk som tar litt lengre tid.
Mens transkripsjonsendringer etter omprogrammeringsfaktoruttrykk kan oppdages så tidlig som 4 t32, oppstår robuste endringer etter 24 timer og senere29,32. Morfologiske endringer følger transkripsjonsendringer, og første tegn på konvertering kan observeres rundt 3 dager etter transduksjon/transfeksjon (3 DPT). Ved 7 DPT er induserte nevronceller tydelig skilt fra astrocytter: deres soma er mindre enn kontroll eller ikke-omprogrammerte astrocytter, de har lange prosesser, og de er positive for nevronmarkør βIII-kar og er negative for astrocyttmarkør GFAP (figur 1E). Det er imidlertid verdt å merke seg at noen celler kan være enten positive for både GFAP og βIII-tub, noe som tyder på at nevronprogrammet har blitt indusert, men astrocytidentiteten har ikke blitt hemmet eller negativ for begge markørene, noe som indikerer undertrykkelsen av astrocytidentiteten, men fraværet av induksjon av nevronkaskaden. I begge tilfeller opprettholder cellene vanligvis en astrocyttmorfologi.
For mer funksjonelle analyser, som elektrofysiologi eller evaluering av de genererte nevronale subtypene, opprettholdes kulturer generelt i minimum 21 DPT og behandles med modningsmedium. Ved 21 DPT er mange induserte nevroner i stand til å skyte handlingspotensialer og er positive for den modne nevronmarkøren NeuN så vel som for det pansynaptiske proteinet Synaptophysin29 (figur 1F).
Figur 1: Oversikt over astrocyttkultur og omprogrammering. (A)Tidslinje for direkte astrocytt-til-nevron-konvertering. Hver svarte linje representerer et viktig skritt i protokollen. (B) Representative brightfield-bilder av dyrkede ryggmargsavledede astrocytter etter 7 dager i kultur. Bildene ble tatt med et lysfeltmikroskop og 10x mål. Skalastang representerer 100 μm. (C) Representative lysfeltbilder av ryggmargsestrikocytter 1 dag etter re-plating med en tetthet på 5,5 x 104 celler per brønn i en 24-brønns plate. Bildene ble tatt med et brightfield mikroskop og et 10x mål. Skalastang representerer 100 μm. (D) Immunfluorescensbilde av et βIII-kar, Sox9, GFAP trippelfarging på astrocytter festet 1 dag etter plating for å demonstrere kulturrenhet. Cellene ble festet i 4% paraformaldehyd i 10 minutter og vasket to ganger med 1x PBS. Cellene ble blokkert ved hjelp av en 3% BSA, 0,5% Triton-X 100 i 1x PBS-løsning. Primære antistoffer ble fortynnet i riktig konsentrasjon (f.eks. anti-GFAP 1:250; anti-βIII-tub 1:250; anti-Syp1 1:500) i blokkerende oppløsning og inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Cellene ble vasket tre ganger med 1x PBS og inkubert med fluoroforkonjugerte sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur. Omslagslips ble vasket tre ganger med 1x PBS før montering med Aqua Poly / Mount. Bildene ble tatt ved hjelp av et epifluorescensmikroskop og et 40x mål. Skala bar representerer 20 μm. (E) Immunfluorescensbilde av et βIII-kar, DsRed dobbel farging for å demonstrere astrocytt til nevronkonvertering med Ascl1 etter 7 DPT. Protokoll for immunfluorescens og bildeinnsamling var som beskrevet ovenfor. Skala bar representerer 20 μm. (F) Immunfluorescensbilder av en βIII-tub, DsRed, Synaptophysin 1 (Syp1) trippelfarging for å demonstrere nevronmodenhet etter 21 DPT for omprogrammering med Ascl1. Protokoll for immunfluorescens og bildeinnhenting var som beskrevet ovenfor. Skalalinjen representerer 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Primære kulturer av murine astrocytter er et bemerkelsesverdig in vitro modellsystem for å studere direkte neuronal omprogrammering. Faktisk, til tross for at de er isolert på et postnatalstadium, uttrykker celler typiske astrocyttmarkører29, beholder uttrykket av mønstergener 28,29, og opprettholder kapasiteten til å spre seg, lik in vivo astrocytter i en sammenlignbar alder38. Etter MACS-mediert isolasjon fester cellene seg først til kolben og begynner deretter å spre seg, noe som gir opphav til svært berikede astrocyttkulturer29. Det er viktig at dyrkede astrocytter ikke dedifferensierer seg til en multipotent celletilstand eller blir udødeliggjort. Videre genererer de ikke spontant nevroner etter uttrykket av et reporterprotein (f.eks. DsRed eller GFP), men opprettholder en astrocytidentitet. De sprer seg heller ikke på ubestemt tid, men reduserer heller spredningen og overgangen til et mer modent stadium, noe som reduserer deres direkte nevronale omprogrammeringspotensial32,39.
Det er flere kritiske trinn i denne protokollen: For det første er det viktig å nøye isolere interesseområdet og fjerne forurensende vev. For eksempel, for å forberede ryggmargs astrocytter, blir ryggmargen ekstrahert fra ryggvirvlene og dorsale rotganglia (DRG) fjernes forsiktig. For det andre gjennomgår konverteringsceller signifikant celledød34, noe som har en negativ innvirkning på de transducerte cellene og den generelle kulturen, på grunn av stimulering av fagocytose ved å omgi astrocytter samt endret media osmolaritet. Derfor er det viktig å erstatte astrocyttmediet med et tilstrekkelig volum differensieringsmedium (vanligvis 1 ml /brønn av en 24-brønns plate). I tillegg er transfeksjon av plasmid-DNA en enkel og mer tilgjengelig tilnærming sammenlignet med viral transduksjon, som krever et godkjent sikkerhetsnivå 2 cellekulturrom. Transfeksjonshastigheten og omprogrammeringseffektiviteten er imidlertid lavere sammenlignet med viralmediert levering av omprogrammeringsfaktorene. Derfor kan transfeksjon brukes som en rask metode for å teste omprogrammeringspotensialet til nye kandidatomprogrammeringsfaktorer eller for å skjerme bassenger av faktorer. Når det gjelder nevronmodning, blir omprogrammerte celler vanligvis elektrofysiologisk aktive etter rundt 3 uker. Selv om det ikke er nødvendig, øker behandlingen av cellene med små molekyler både overlevelse og modning av de omprogrammerte cellene, noe som fører til en høyere tetthet av induserte nevroner og en mer moden morfologi.
Selv om den beskrevne metoden for å isolere og dyrke astrocytter er robust og pålitelig, må noen aspekter vurderes. For det første, mens konvensjonelle metoder basert på mekanisk dissosiasjon av vev gir et generelt høyere antall celler i kultur per vev dissekert40, krever en MAC-sortert tilnærming disseksjon av vev fra seks til åtte valper for å isolere et tilstrekkelig antall celler for påfølgende eksperimenter. Videre er isoleringen av astrocytter basert på ekspresjonen av DET ATPase Na+/K+-transporterende underenheten Beta2-protein (Atp1b2), anerkjent av antistoffet ACSA-241. I prinsippet vil astrocytter som ikke uttrykker Atp1b2 gå tapt i preparatet, og dermed forårsake en forstyrrelse i preparatet. Selv om vi ikke kan utelukke at dette er tilfelle, viste vår analyse av MACS-gjennomstrømning at få celler i den negative fraksjonen var immunreaktive for astrogliamarkørene Sox9, noe som tyder på høy effektivitet av MAC-sorteringsprotokollen. En annen advarsel angående Atp1b2 er relatert til uttrykket. Atp1b2 uttrykkes spesifikt av astrocytter i postnatalstadiet, mens i den voksne musehjernen uttrykker andre celletyper det, spesielt myeliniserende oligodendrocytter og ependymale celler27. Derfor er det nødvendig med en forsiktig disseksjon av interesseområdet og et myelinfjerningstrinn for å isolere astrocytter fra voksne hjerner.
Sammenlignet med andre metoder for å isolere astrocytter, sikrer den MACS-baserte tilnærmingen høy renhet av kulturene (>90% av Sox9 + -cellene) og gir en standardisert prosedyre for å isolere astrocytter fra forskjellige regioner i CNS. Dette er spesielt viktig når man sammenligner kulturer fra forskjellige CNS-regioner, da kulturrenheten oppnådd ved klassisk mekanisk dissosiasjon kan variere bemerkelsesverdig (>80% GFAP + / DAPI fra kortikal grå substans, ~ 50% GFAP + / DAPI fra ryggmargen) 15,29. En standardisert protokoll reduserer slik variabilitet og gir et felles utgangspunkt for in vitro omprogrammeringseksperimenter. Dette gjør det for eksempel mulig å systematisk sammenligne den molekylære identiteten til astrocytter fra forskjellige regioner 28,29 og å undersøke virkningen av utviklingsmessig opprinnelse på omprogrammeringseffektiviteten og subtypeidentiteten til de induserte nevronene.
Oppsummert er in vitro direkte neuronal omprogrammering av optimaliserte kulturer av astrocytter en svært kraftig tilnærming til å avdekke universelle så vel som regionspesifikke molekylære mekanismer for astrocytt-til-nevronkonvertering, noe som gir viktig informasjon for å designe bedre og mer effektive strategier for in vivo direkte konvertering av bosatt CNS-astrocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Ines Mühlhahn for kloning av konstruksjonene for omprogrammering, Paulina Chlebik for viral produksjon, og Magdalena Götz og Judith Fischer-Sternjak for kommentarer til manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| anti-mouse IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
| anti-Mouse IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
| anti-mouse IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| anti-rabbit Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
| cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
| C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
| Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
| Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
| MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
| Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
| Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
| Rabbit anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
| Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
References
- Johnson, T. S., et al. Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing. Scientific Reports. 10 (1), 18014 (2020).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Nowakowski, T. J., et al. Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex. Science. 358 (6368), 1318-1323 (2017).
- Sagner, A., Briscoe, J. Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place. Development. 146 (22), (2019).
- Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Iismaa, S. E., et al. Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues. NPJ Regenerative Medicine. 3, 6 (2018).
- Lange, C., Brand, M. Vertebrate brain regeneration - a community effort of fate-restricted precursor cell types. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 101-108 (2020).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature Reviews Genetics. 11 (10), 710-722 (2010).
- Grade, S., Gotz, M. Neuronal replacement therapy: previous achievements and challenges ahead. NPJ Regenerative Medicine. 2, 29 (2017).
- Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
- Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
- Di Tullio, A., et al. CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP(alpha))-induced transdifferentiation of pre-B cells into macrophages involves no overt retrodifferentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (41), 17016-17021 (2011).
- Fishman, V. S., et al. Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells. Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biology. 8 (5), 1000373 (2010).
- Treutlein, B., et al. Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq. Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).
- Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242 (4877), 405-411 (1988).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).
- Marro, S., et al. Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Bass, N. H., Hess, H. H., Pope, A., Thalheimer, C. Quantitative cytoarchitectonic distribution of neurons, glia, and DNa in rat cerebral cortex. The Journal of Comparative Neurology. 143 (4), 481-490 (1971).
- Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PLoS One. 12 (7), 0180697 (2017).
- Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Batiuk, M. Y., et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution. Nature Communication. 11 (1), 1220 (2020).
- Boisvert, M. M., Erikson, G. A., Shokhirev, M. N., Allen, N. J. The aging astrocyte transcriptome from multiple regions of the mouse brain. Cell Reports. 22 (1), 269-285 (2018).
- Ohlig, S., et al. Molecular diversity of diencephalic astrocytes reveals adult astrogenesis regulated by Smad4. The EMBO Journal. 40 (21), 107532 (2021).
- Herrero-Navarro, A., et al. Astrocytes and neurons share region-specific transcriptional signatures that confer regional identity to neuronal reprogramming. Science Advances. 7 (15), (2021).
- Kempf, J., et al. Heterogeneity of neurons reprogrammed from spinal cord astrocytes by the proneural factors Ascl1 and Neurogenin2. Cell Reports. 36 (3), 109409 (2021).
- Mattugini, N., et al. Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse Cerebral Cortex. Neuron. 103 (6), 1086-1095 (2019).
- Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nature Neuroscience. 5 (4), 308-315 (2002).
- Masserdotti, G., et al. Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes. Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).
- Rao, Z., et al. Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion. Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).
- Gascon, S., et al. Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).
- Russo, G. L., et al. CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion. Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).
- Guo, S., et al. Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state. Cell. 156 (4), 649-662 (2014).
- Hu, X., et al. Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming. Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).
- Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
- Price, J. D., et al. The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation. The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).
- Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).
