Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

مسبار β-galactosidase المرتبط بالشيخوخة الفلورية الحمراء البعيدة لتحديد وإثراء الخلايا السرطانية الهرمة عن طريق قياس التدفق الخلوي

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64176
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

Summary

يتم تقديم بروتوكول للقياس الكمي الفلوري والتدفق الخلوي للخلايا السرطانية الهرمة التي تسببها أدوية العلاج الكيميائي في زراعة الخلايا أو في نماذج أورام الفئران. تشمل الإجراءات الاختيارية التلطيخ المناعي المشترك ، وتثبيت العينات لتسهيل تحليل الدفعة الكبيرة أو النقطة الزمنية ، وإثراء الخلايا الهرمة القابلة للحياة عن طريق الفرز الخلوي للتدفق.

Abstract

الشيخوخة الخلوية هي حالة من التوقف التكاثري الناجم عن الضرر البيولوجي الذي يتراكم عادة على مدى سنوات في الخلايا المتقدمة في السن ولكنه قد يظهر أيضا بسرعة في الخلايا السرطانية كرد فعل على الضرر الناجم عن علاجات السرطان المختلفة. تعتبر شيخوخة الخلايا السرطانية بشكل عام غير مرغوب فيها ، حيث تصبح الخلايا الهرمة مقاومة للموت وتمنع مغفرة الورم مع تفاقم الورم الخبيث ومقاومة العلاج. لذلك ، فإن تحديد الخلايا السرطانية الهرمة له أهمية مستمرة لمجتمع أبحاث السرطان. توجد فحوصات شيخوخة مختلفة ، يعتمد الكثير منها على نشاط علامة الشيخوخة المعروفة ، بيتا غالاكتوزيداز المرتبطة بالشيخوخة (SA-β-Gal).

عادة ، يتم إجراء اختبار SA-β-Gal باستخدام ركيزة كروموجينية (X-Gal) على الخلايا الثابتة ، مع التعداد البطيء والذاتي للخلايا الهرمة "الزرقاء" بواسطة الفحص المجهري الضوئي. وقد مكنت المقايسات المحسنة باستخدام ركائز SA-β-Gal الفلورية نفاذة للخلايا، بما في ذلك C12-FDG (الأخضر) و DDAO-Galactoside (DDAOG؛ الأحمر الأقصى)، من تحليل الخلايا الحية وسمحت باستخدام منصات تحليل الفلورسنت عالية الإنتاجية، بما في ذلك مقاييس التدفق الخلوي. C12-FDG هو مسبار موثق جيدا ل SA-β-Gal ، لكن انبعاثاته الفلورية الخضراء تتداخل مع التألق الذاتي الخلوي الجوهري (AF) الذي ينشأ أثناء الشيخوخة بسبب تراكم مجاميع الليبوفوسين. من خلال استخدام مسبار SA-β-Gal الأحمر البعيد DDAOG ، يمكن استخدام التألق الذاتي الخلوي الأخضر كمعلمة ثانوية لتأكيد الشيخوخة ، مما يضيف موثوقية إلى الفحص. يمكن استخدام قنوات التألق المتبقية لتلطيخ صلاحية الخلية أو وضع العلامات المناعية الفلورية الاختيارية.

باستخدام قياس التدفق الخلوي ، نوضح استخدام التألق الذاتي DDAOG و lipofuscin كاختبار ثنائي المعلمات لتحديد الخلايا السرطانية الهرمة. يتم إجراء تحديد النسبة المئوية للخلايا الهرمة القابلة للحياة. إذا رغبت في ذلك ، يمكن تضمين خطوة مناعية اختيارية لتقييم مستضدات سطح الخلية ذات الأهمية. يمكن أيضا فرز الخلايا الهرمة المحددة وفرزها خلويا وجمعها لتحليلها في اتجاه مجرى النهر. يمكن تحليل الخلايا الهرمة المجمعة على الفور (على سبيل المثال ، للمقايسات المناعية أو "تحليل أوميكس") أو مزيد من الاستزراع.

Introduction

تتراكم الخلايا الهرمة عادة في الكائنات الحية على مدى سنوات أثناء الشيخوخة البيولوجية الطبيعية ولكنها قد تتطور أيضا بسرعة في الخلايا السرطانية كرد فعل للضرر الناجم عن علاجات السرطان المختلفة ، بما في ذلك الإشعاع والعلاج الكيميائي. على الرغم من أنها لم تعد تتكاثر ، إلا أن الخلايا السرطانية الهرمة التي يسببها العلاج (TIS) قد تساهم في مقاومة العلاج وتدفع التكرار1،2،3. يمكن أن تؤدي العوامل التي تفرزها خلايا TIS إلى تفاقم الورم الخبيث عن طريق تعزيز التهرب المناعي أو ورم خبيث 4,5. تطور خلايا TIS أنماطا ظاهرية معقدة ومحددة السياق ، وملفات أيضية متغيرة ، واستجابات مناعية فريدة6،7،8. لذلك ، فإن تحديد وتوصيف الخلايا السرطانية TIS التي تسببها مناهج علاج السرطان المختلفة هو موضوع يحظى باهتمام مستمر لمجتمع أبحاث السرطان.

للكشف عن الخلايا السرطانية TIS ، تستخدم فحوصات الشيخوخة التقليدية على نطاق واسع ، وتعتمد بشكل أساسي على اكتشاف النشاط المتزايد لإنزيم علامة الشيخوخة ، بيتا غالاكتوزيداز GLB19 الليزوزومي. يسمح الكشف عند درجة حموضة ليزوزومية شبه محايدة (وليس حمضية) بالكشف المحدد عن بيتا غالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة (SA-β-Gal)10. يستخدم اختبار SA-β-Gal القياسي الذي تم استخدامه لعدة عقود X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) ، وهو ركيزة بيتا غالاكتوزيداز زرقاء كروموجينية ، للكشف عن SA-β-Gal في الخلايا الثابتة عن طريق الفحص المجهريالضوئي 11. يسمح اختبار X-Gal بالتأكيد البصري النوعي لنظام TIS باستخدام الكواشف ومعدات المختبرات المتاحة بشكل شائع. المجهر الضوئي الأساسي المنقول هو الأجهزة الوحيدة المطلوبة لتقييم وجود الكروموجين الأزرق. ومع ذلك ، يمكن أن يفتقر إجراء تلطيخ X-Gal إلى الحساسية ، ويتطلب أحيانا أكثر من 24 ساعة حتى يتطور اللون. يتبع التلوين تسجيل ذاتي منخفض الإنتاجية للخلايا الهرمة الفردية بناء على حساب الخلايا التي تظهر مستوى معينا من شدة الكروموجين الأزرق تحت المجهر الضوئي. نظرا لأن X-Gal غير منفذ للخلية ، فإن هذا الفحص يتطلب خلايا ثابتة بالمذيبات ، والتي لا يمكن استردادها لتحليل المصب. عند العمل مع عينات محدودة من الحيوانات أو المرضى ، يمكن أن يكون هذا عيبا كبيرا.

مقايسات SA-β-Gal المحسنة باستخدام ركائز إنزيم فلورية منفذة للخلايا ، بما في ذلك C 12-FDG (5-dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside ، أخضر) و DDAOG (9H- (1،3-ثنائي كلورو-9،9-ثنائي ميثيل أكريدين-2-واحد-7-يل) β-D-Galactopyranoside ، أحمر بعيد) ظهرت سابقا في الأدبيات12،13،14،15. يتم عرض هيكل المسبار الكيميائي والخصائص البصرية ل DDAOG في الشكل التكميلي S1. تسمح هذه المجسات الخلوية بتحليل الخلايا الحية (بدلا من الخلايا الثابتة) ، وتسهل المجسات الفلورية بدلا من المجسات الكروموجينية استخدام منصات تحليل الفلورسنت السريعة عالية الإنتاجية ، بما في ذلك أدوات الفحص عالية المحتوى ومقاييس التدفق الخلوي. تمكن مقاييس التدفق الخلوي للفرز من استعادة المجموعات المخصبة من الخلايا الهرمة الحية من مزارع الخلايا أو الأورام لتحليلها في اتجاه مجرى النهر (على سبيل المثال ، النشاف الغربي ، ELISA ، أو "omics"). يوفر تحليل التألق أيضا إشارة كمية ، مما يسمح بتحديد أكثر دقة للنسبة المئوية للخلايا الهرمة داخل عينة معينة. يمكن بسهولة إضافة مجسات فلورية إضافية ، بما في ذلك مجسات الجدوى والأجسام المضادة الموسومة بالفلوروفور ، للتحليل المتعدد للأهداف خارج SA-β-Gal.

على غرار DDAOG ، C12-FDG هو مسبار فلوري ل SA-β-Gal ، لكن انبعاثه الفلوري الأخضر يتداخل مع AF الخلوي الجوهري ، والذي ينشأ أثناء الشيخوخة بسبب تراكم مجاميع الليبوفوسين في الخلايا16. من خلال استخدام مسبار DDAOG الأحمر البعيد ، يمكن استخدام التركيز البؤري التلقائي الخلوي الأخضر كمعلمة ثانوية لتأكيد الشيخوخة17. يعمل هذا على تحسين موثوقية الفحص باستخدام علامة ثانية بالإضافة إلى SA-β-Gal ، والتي غالبا ما تكون غير موثوقة كعلامة واحدة للشيخوخة18. نظرا لأن اكتشاف الرجفان الأذيني الداخلي في الخلايا الهرمة هو نهج خال من الملصقات ، فهو طريقة سريعة وبسيطة لتوسيع خصوصية الفحص المستند إلى DDAOG.

في هذا البروتوكول ، نوضح استخدام DDAOG و AF كاختبار سريع لقياس التدفق الخلوي ثنائي المعلمات لتحديد الخلايا السرطانية TIS القابلة للحياة من الثقافات المختبرية أو المعزولة عن الأورام المعالجة بالعقاقير الموجودة في الفئران (الشكل 1). يستخدم البروتوكول الفلوروفورات المتوافقة مع مجموعة واسعة من أجهزة تحليل وفرز التدفق الخلوي التجارية القياسية (الجدول 1). يتم تمكين تحديد النسبة المئوية للخلايا الهرمة القابلة للحياة باستخدام تحليل قياس التدفق الخلوي القياسي. إذا رغبت في ذلك ، يمكن إجراء خطوة مناعية اختيارية لتقييم مستضدات سطح الخلية ذات الأهمية بالتزامن مع الشيخوخة. يمكن أيضا إثراء الخلايا الهرمة المحددة باستخدام منهجية فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS).

Figure 1
الشكل 1: سير العمل التجريبي. رسم تخطيطي يلخص النقاط الرئيسية لفحص DDAOG. (أ) يضاف دواء يحفز TIS إلى خلايا الثدييات المستزرعة أو يعطى للفئران الحاملة للورم. ثم يسمح الوقت لبداية TIS: للخلايا ، 4 أيام بعد العلاج. للفئران ، إجمالي 22 يوما ، مع ثلاثة علاجات كل 5 أيام بالإضافة إلى 7 أيام للتعافي. يتم حصاد الخلايا أو فصل الأورام إلى تعليق. (ب) تعامل العينات ب Baf لضبط الأس الهيدروجيني للجسيمات الليزوزومية للكشف عن SA-β-Gal لمدة 30 دقيقة ؛ بعد ذلك ، يتم إضافة مسبار DDAOG لمدة 60 دقيقة للكشف عن SA-β-Gal. يتم غسل العينات 2x في PBS ، ويتم إضافة بقعة صلاحية لفترة وجيزة (15 دقيقة). اختياريا ، يمكن تلطيخ العينات بالأجسام المضادة الفلورية في قنوات مضان مفتوحة و / أو ثابتة لتحليلها لاحقا. (ج) تحلل العينات باستخدام مقياس التدفق الخلوي القياسي. يتم تصور الخلايا القابلة للحياة في مخططات نقطية تظهر DDAOG الأحمر (يشير إلى SA-β-Gal) مقابل التألق الذاتي الأخضر (lipofuscin). يتم إنشاء بوابة لتحديد النسبة المئوية لخلايا TIS بناء على عينات التحكم غير المعالجة (غير معروضة). إذا تم استخدام مقياس الفرز الخلوي (FACS) ، فيمكن جمع خلايا TIS ووضعها مرة أخرى في المزرعة لمزيد من المقايسات في المختبر أو تحليلها ومعالجتها لمقايسات البيولوجيا الجزيئية. الاختصارات: DDAO = 9H- (1،3-ثنائي كلورو-9،9-ثنائي ميثيل أكريدين-2-واحد) ؛ DDAOG = DDAO-غالاكتوسيد ؛ TIS = الشيخوخة الناجمة عن العلاج ؛ FL-Ab = الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور ؛ باف = بافيلوميسين A1 ؛ SA-β-Gal = بيتا غالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة ؛ PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات ؛ FACS = فرز الخلايا المنشط بالتألق. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

فلوروفور الكشف عن السابق/م (نانومتر) ليزر مقياس الخلايا (نانومتر) كاشف مقياس الخلايا / مرشح تمرير النطاق (نانومتر)
داوج SA-β-Gal 645/6601 640 670 / 30
أ ف ليبوفوسين < 600 488 525 / 50
CV450 صلاحيه 408/450 405 450 / 50
بيه الجسم المضاد / علامة السطح 565/578 561 582 / 15

الجدول 1: المواصفات البصرية للفلوروفورات ومقياس الخلايا. يتم سرد مواصفات مقياس الخلايا المستخدمة في هذا البروتوكول لجهاز يحتوي على ما مجموعه 4 ليزر و 15 كاشفا للانبعاثات. DDAOG المكتشف عند 645/660 نانومتر هو شكل المسبار المشقوق بواسطة SA-β-Gal1. يمكن أن يظهر DDAOG غير المشقوق مضانا منخفض المستوى عند 460/610 نانومتر ولكن يتم إزالته عن طريق خطوات الغسيل في البروتوكول. الاختصارات: DDAO = 9H- (1،3-ثنائي كلورو-9،9-ثنائي ميثيل أكريدين-2-واحد) ؛ DDAOG = DDAO-غالاكتوسيد ؛ AF = التألق الذاتي ؛ PE = فيكوريثرين ؛ SA-β-Gal = بيتا غالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الأعمال الحيوانية الموصوفة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية في جامعة شيكاغو.

1. إعداد وتخزين حلول المخزون

ملاحظة: إذا كانت الخلايا سيتم فرزها بالتدفق ، فيجب تحضير جميع المحاليل باستخدام تقنيات معقمة وتصفيتها من خلال جهاز مرشح 0.22 ميكرومتر.

  1. تحضير محلول مخزون من DDAO-Galactoside عند 5 مجم / مل في DMSO. القسمة عند 50 ميكرولتر لكل أنبوب (أو الحجم المطلوب). يخزن في -20 درجة مئوية في الظلام لمدة تصل إلى 1 سنة.
  2. تحضير محلول مخزون من Bafilomycin A1 عند 1 mM في DMSO. القسمة عند 50 ميكرولتر لكل أنبوب (أو الحجم المطلوب). يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  3. تحضير محلول مخزون من Calcein Violet 450 AM عند 1 mM في DMSO. القسمة عند 50 ميكرولتر لكل أنبوب (أو الحجم المطلوب). يخزن في -20 درجة مئوية في الظلام لمدة تصل إلى 1 سنة.
  4. لمعالجة الخلايا المستزرعة في المختبر ، قم بإعداد محاليل مخزون مركزة 10 مللي مول من عامل (عوامل) محفزة للشيخوخة في المذيب المناسب ، وقم بتعقيمها باستخدام مرشحات حقنة 0.2 ميكرومتر. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية أو حسب توجيهات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: لتوصيل عوامل العلاج الكيميائي المسببة للشيخوخة في الجسم الحي (للفئران المصابة بأورام راسخة) ، يجب أن تكون العوامل من درجة USP ومخففة إلى محلول ملحي من المخزون المركز قبل الحقن مباشرة.
  5. قم بإعداد وسيط استزراع كامل لخط (خطوط) الخلية المستخدمة.
    ملاحظة: على سبيل المثال ، قم بإعداد وسيط لخلايا B16-F10 أو A549 مع DMEM 1x + 10٪ FBS + 1x بديل الجلوتامين + 1x البنسلين / الستربتومايسين. يجب أن تبقى وسائل الإعلام عقيمة. يمكن استخدام تركيبات وسائط أخرى خاصة بخط الخلية. قد تتداخل مكونات معينة مثل الجلوتاثيون ، في بعض الحالات ، مع بداية الشيخوخة. يجب إجراء اختبار تجريبي لتركيبات الوسائط المختلفة إذا كانت بداية الشيخوخة أقل من المتوقع أو لم يتم ملاحظتها مع عوامل العلاج الكيميائي الضابطة.
  6. إعداد تلطيخ وغسل المخازن المؤقتة.
    1. تحضير 1٪ ألبومين مصل بقري (BSA) في 1x PBS للاستخدام في إجراءات التلطيخ. قم بإذابة 2 جم من BSA في 200 مل من PBS وحركه لمدة 10 دقائق ، أو حتى يذوب تماما ، في درجة حرارة الغرفة.
    2. تحضير 0.5٪ BSA في 1x PBS كمخزن مؤقت للغسيل. قم بتخفيف 100 مل من 1٪ BSA المحضر في الخطوة 1.6.1 إلى 100 مل من 1x PBS ل 0.5٪ BSA.
    3. تخزين المخازن المؤقتة في 4 °C لمدة تصل إلى 1 شهر.
  7. تحضير 4 ٪ بارافورمالدهيد في 1x PBS. استخدم أمبولات بارافورمالدهيد المختومة المتاحة تجاريا (على سبيل المثال ، 16٪ v / v) للراحة والاستقرار: 2.5 مل من 16٪ PFA + 7.5 مل من 1x PBS (= 10 مل من 4٪ PFA). اضبط الحجم المعد اعتمادا على الحجم الإجمالي المطلوب لكل تجربة.
    ملاحظة: التحضير حسب الحاجة لتثبيت الخلية فقط ؛ تحضير طازج في كل مرة.
  8. تحضير المخزن المؤقت لفرز FACS: 1x PBS ، 1 mM EDTA ، 25 mM HEPES ، 1٪ BSA (الرقم الهيدروجيني 7.2). مرشح معقم من خلال جهاز ترشيح 0.22 ميكرومتر وتخزينه في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
    ملاحظة: التحضير حسب الحاجة لفرز FACS فقط. وقد تختلف التركيبات العازلة لفرز التدفق باختلاف أجهزة نظام مراقبة الأصول الميدانية. تتوافق الصيغة أعلاه مع الأداة المستخدمة في هذه الدراسة (انظر جدول المواد). راجع إرشادات الشركة المصنعة.
  9. تحضير محلول تفكك الورم: 20 ميكروغرام / مل ليبراز TL + 100 ميكروغرام / مل DNAse I في وسائط RPMI-1640 (بدون FBS أو مكملات أخرى). تعد محاليل المخزون مفيدة للاحتفاظ ب Liberase TL (الذي يتم إعداده وتخزينه وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة) و DNAse I (100 مجم / مل في ماء مقطر مزدوج [ddH2O] ، مخزن في -20 درجة مئوية).
    ملاحظة: الاستعداد حسب الحاجة في حالة استخدام الأورام فقط ؛ تحضير طازج في كل مرة.

2. تحريض الشيخوخة بواسطة أدوية العلاج الكيميائي في الخلايا السرطانية المستزرعة

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع خطوات معالجة الخلايا في هذا القسم في خزانة السلامة البيولوجية باستخدام ممارسات معقمة. تمت كتابة هذا القسم لأنواع الخلايا الملتصقة. يمكن استخدام خلايا التعليق مع التعديلات المناسبة كما هو مذكور.

  1. قم بزراعة خط (خطوط) الخلايا السرطانية وفقا للبروتوكول القياسي من المورد أو المختبر الذي قدم خط (خطوط) الخلايا المحددة المستخدمة.
    ملاحظة: يفضل عموما استخدام خلايا المرور المنخفض (p < 10) حيث ستكون هناك مستويات أقل من الشيخوخة المتماثلة ، أي الخلفية السفلية ، في عينات الخلايا غير المعالجة.
  2. قبل يوم واحد من تحريض الشيخوخة عن طريق الأدوية ، حصاد الخلايا مع التربسين-EDTA 0.25 ٪ (أو على النحو الموصى به). تحييد التربسين عن طريق إضافة حجم متساو من وسط الاستزراع الكامل ، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي معقم.
    ملاحظة: هذه الخطوة غير ضرورية لخلايا التعليق.
  3. عد الخلايا باستخدام طريقة مقياس الدم القياسية وسجل الخلايا / مل. خلايا الصفيحة في 1 × 10 3-10 × 103 خلايا / سم2 في أطباق الاستزراع البلاستيكية القياسية المكونة من 6 آبار.
    ملاحظة: تعتمد كثافة الطلاء المثلى على معدل تكاثر الخلايا ويجب أن يحددها المستخدم. يجب أن تكون الخلايا في مرحلة نمو لوغاريتمية عند التقاء 10٪ -20٪ تقريبا في وقت العلاج (أي بعد حضانة 18-24 ساعة بعد الطلاء). يجب أن تكون كثافة البدء (الخلايا / مل) لخلايا التعليق محددة من قبل المستخدم. عادة ما تنتج الألواح المكونة من ستة آبار ما يكفي من الخلايا الهرمة لكل بئر لعينة تحليل التدفق الخلوي القياسية الواحدة. في حالة فرز التدفق ، يجب استخدام مساحة سطح أكبر بكثير (على سبيل المثال ، ألواح P150 متعددة) لتمكين استعادة أعداد كافية من الخلايا الهرمة للمقايسات النهائية (≥1 × 106).
  4. احتضان الخلايا المطلية طوال الليل (18-24 ساعة) في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 ووعاء الرطوبة.
  5. عالج الخلايا المطلية بدواء (أدوية) العلاج الكيميائي المحفز للشيخوخة. قم بتضمين عنصر تحكم إيجابي واحد على الأقل ، على سبيل المثال ، إيتوبوسيد (ETO) أو بليوميسين (BLM). إعداد آبار مكررة لكل دواء. قم بتضمين مجموعة واحدة تعامل مع السيارة فقط كعنصر تحكم.
    ملاحظة: يجب اختبار منحنى الجرعة لكل عامل تجريبي من قبل المستخدم لتحديد التركيز الأمثل لتحريض الشيخوخة في خط (خطوط) الخلية المستخدمة.
  6. احتضان الخلايا لمدة 4 أيام في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 ووعاء رطوبة للسماح بظهور الشيخوخة. افحص يوميا التغيرات المورفولوجية المتوقعة باستخدام المجهر الضوئي.
    ملاحظة: قد تكون أوقات الحضانة من 3-5 أيام مقبولة اعتمادا على معدل بداية الشيخوخة. يمكن تغيير الوسائط وإعادة تطبيق العامل (أو لا) ، حسب الرغبة ، لتعزيز ظروف النمو الصحي مع تحقيق نسبة مقبولة من الخلايا الهرمة.
  7. بعد بداية الشيخوخة ، احصد الخلايا بإضافة التربسين-EDTA 0.25٪ لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. عندما يتم فصل الخلايا إلى تعليق ، قم بتحييد التربسين بحجم متساو من الوسط الكامل.
    ملاحظة: هذه الخطوة ليست ضرورية للخلايا التي تنمو في التعليق. إذا تم إجراء تلطيخ علامة السطح ، فتجنب استخدام التربسين-EDTA لأنه يمكن أن يدمر المستضدات السطحية مؤقتا على الخلايا. بدلا من ذلك ، افصل الطبقة الأحادية برفق باستخدام مكشطة خلايا بلاستيكية معقمة (أو كاشف تفكك بديل مصمم للحفاظ على المستضدات السطحية).
  8. عد الخلايا في كل عينة باستخدام مقياس الدم. احسب الخلايا / مل لكل عينة.
    ملاحظة: يمكن إضافة Trypan blue لتقييم النسبة المئوية للخلايا الميتة في هذه المرحلة (أي بسبب العلاج الدوائي) ، ولكن سيتم أيضا تحديد موت الخلايا باستخدام صبغة الصلاحية الفلورية أثناء سير عمل تلطيخ DDAOG.
  9. القسمة ≥0.5 × 106 خلايا لكل عينة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.7 مل.
    ملاحظة: يجب توحيد عدد الخلايا لكل عينة عبر جميع العينات.
  10. أجهزة الطرد المركزي للأنابيب لمدة 5 دقائق عند 1000 × جم في جهاز طرد مركزي دقيق عند 4 درجات مئوية. إزالة طاف .
    ملاحظة: في حالة عدم توفر جهاز طرد مركزي دقيق مبرد ، فقد يكون من المقبول إجراء عمليات طرد مركزي في درجة حرارة محيطة لأنواع معينة من الخلايا المرنة.
  11. انتقل إلى تلطيخ DDAOG في القسم 4.

3. تحريض الشيخوخة عن طريق أدوية العلاج الكيميائي في الأورام التي أنشئت في الفئران

ملاحظة: إذا كانت الخلايا السرطانية سيتم فرزها بواسطة FACS ، فتأكد من العقم في كل خطوة من خلال العمل في خزانة السلامة الحيوية والعمل مع الأدوات والإجراءات والكواشف المعقمة.

  1. قم بإنشاء نماذج ورم الفئران عن طريق حقن الخلايا السرطانية تحت الجلد ، وفقا للطرق القياسية (على سبيل المثال ، Appelbe et al.19).
    ملاحظة: يجب تحسين عدد الخلايا السرطانية المراد حقنها وموقع الحقن وسلالة الماوس المناسبة لكل بروتوكول. هنا ، تم حقن خلايا B16-F10 تحت الجلد في 1 × 106 خلايا في 0.1 مل من المحلول الملحي (1 × 107 خلايا / مل).
    1. تحقق من أن صلاحية الخلايا التي تستخدم التريبان الأزرق هي >90٪ قبل إجراء الحقن. تخدير الفئران مع إيزوفلوران.
    2. تخدير إناث الفئران C57 / BL6 البالغة من العمر 6-7 أسابيع بمزيج من 3٪ إيزوفلوران والهواء والاحتفاظ بها في ظل هذه الظروف في غرفة تحريض موضوعة داخل خزانة سلامة حيوية معقمة. تأكد من التخدير عن طريق الضغط برفق على قدم الماوس. ضع مرهما بيطريا معقما على كلتا العينين لمنع جفاف القرنية أثناء العملية. أثناء الإجراء ، حافظ على درجة حرارة جسم الماوس باستخدام مصباح التدفئة.
    3. من خلال العمل داخل خزانة معقمة للسلامة الحيوية ، قم بإزالة الماوس من غرفة الحث وضعه على اتصال بمخروط الأنف الذي يوفر إمدادا بنسبة 3٪ من الأيزوفلوران. احلق منطقة الخاصرة في موقع الحقن باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية نظيفة. امزج معلق الخلية المحضر لفترة وجيزة عن طريق قلب الأنبوب يدويا قبل الحقن مباشرة ، وحقن معلق الخلية تحت الجلد في الجناح (الأجنحة) المحلوق باستخدام حقنة معقمة سعة 0.5 مل مزودة بإبرة معقمة 27 جم. أخرج الماوس من الغطاء وانقله إلى قفص الاسترداد.
    4. في قفص الاسترداد ، راقب العلامات الحيوية للفئران بشكل مستمر حتى تستعيد وعيها الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي ، وإظهار رد الفعل الصحيح ، وتكون قادرة على التحرك بأمان في القفص. لا تترك الفئران دون مراقبة أو تعيد الحيوانات التي خضعت لتلقيح الخلايا السرطانية إلى صحبة الحيوانات الأخرى حتى تتعافى تماما. مراقبة جميع الفئران الملقحة يوميا لفقدان الوزن ، وانخفاض النشاط / الحركة ، والأعراض العصبية ؛ القتل الرحيم الفئران التي تظهر عليها أعراض حادة في أي فئة. بالنسبة للفئران التي تظهر عليها أعراض الألم بعد التلقيح، يتم تطبيق البوبرينورفين (0.1-0.2 ملغ/كغ) مرة واحدة تحت الجلد.
      ملاحظة: يجب القتل الرحيم للفئران التي تظهر ألما مستمرا بعد البوبرينورفين.
  2. بدءا من 5-7 أيام بعد تلقيح الخلايا السرطانية ، قم بقياس نمو الورم باستخدام الفرجار كل 2-3 أيام. بدء العلاج prosenescent عندما يصل الورم إلى 50 مم 3 ± 10 مم3 في الحجم.
    ملاحظة: في هذا العمل، تم إعطاء جرعات من دوكسوروبيسين هيدروكلوريد (DOX) من الدرجة USP أو دوكسوروبيسين ليبوسومال (PLD) بمعدل 10 ملغم/كغم في حقن كلوريد الصوديوم 0.9٪ (USP). تم حقن الأدوية داخل الصفاق 3x ، مرة واحدة كل 5 أيام ، بدءا من الأورام التي وصلت إلى 50 مم 3 ± 10 مم3. تعافت الفئران لمدة 7 أيام بعد العلاج النهائي للسماح بظهور TIS في الأورام. يجب تحسين جرعات تحريض الشيخوخة وشروط العلاجات الأخرى و / أو نماذج الورم.
  3. في 7 أيام بعد العلاج الدوائي النهائي ، التضحية الفئران عن طريق جرعة زائدة من CO2 وخلع عنق الرحم أو غيرها من الطرق المعتمدة وفقا لإرشادات عمل المختبر. استئصال الأورام وجمعها في أنابيب معقمة أو ألواح ذات 6 آبار مملوءة بوسط نمو RPMI معقم (للحفاظ على الصلاحية أثناء المعالجة).
    ملاحظة: في حالة إجراء فحص نسيجي (على سبيل المثال ، X-Gal أو الكيمياء الهيستولوجية المناعية) ، يمكن تقسيم الأورام هنا ، مع تجميد نصفها في O.C.T. تضمين الوسط والقطع بالتبريد باستخدام الإجراءات القياسية لأنسجة الأنسجة المجمدة. يجب أن ينتج نصف الورم المتبقي مادة وفيرة للتفكك وتلطيخ DDAUG.
  4. انقل ورما واحدا إلى طبق بلاستيكي P100 يحتوي على 5 مل من وسط RPMI. فرم الورم إلى قطع باستخدام مشرط.
  5. نقل 5 مل من تعليق قطع الورم التي تحتوي على خلايا معلقة وحطام إلى أنبوب مخروطي 15 مل. استخدم الطرف الأوسع لماصة مصلية سعة 25 مل لنقل هذا التعليق في حالة وجود حطام كبير. شطف الطبق مع حجم إضافي من RPMI معقمة لجمع المواد. قم بتغطية الأنبوب المخروطي ووضعه على الثلج.
  6. كرر الخطوات 3.45-3.5 للأورام المتبقية. استخدم صفيحة ومشرطا منفصلين لكل ورم لتجنب التلوث المتبادل ، أو اشطفه جيدا باستخدام PBS بين الأورام. استخدم 5 مل من الوسط الطازج لفرم كل ورم.
  7. تحضير محلول تفكك الورم: 20 ميكروغرام / مل ليبراز TL + 100 ميكروغرام / مل DNAse I في وسائط RPMI-1640 (بدون FBS).
    ملاحظة: توجد العديد من التركيبات الفعالة لحلول تفكك الورم ويمكن أن تشمل مجموعة متنوعة من الإنزيمات والمكونات الأخرى من مختلف الصانعين. يمكن أن تختلف التركيزات المثلى للمكونات اختلافا كبيرا عبر أنواع الأورام. إذا كانت خلايا الدم الحمراء موجودة بشكل كبير في الورم ، فقد يتم إجراء تحلل خلايا الدم الحمراء بشكل إضافي. إذا كانت الخلايا الميتة تمثل مشكلة ، فيمكن استخدام مجموعة إزالة الخلايا الميتة. يوصى بشدة للمستخدم بتحديد ظروف تفكك الورم المثلى بشكل مستقل والتي توفر قابلية عالية للحياة ووجودا منخفضا للخلايا الملوثة والمواد الضامة والحطام.
  8. أجهزة الطرد المركزي لجميع عينات الورم في أنابيب مخروطية لمدة 5 دقائق عند 1000 × جم (4 درجات مئوية). إزالة طاف .
  9. أضف 1-5 مل من محلول تفكك الورم إلى كل عينة ورم ، اعتمادا على حجم مادة الورم. تأكد من وجود 1-2 مل زائدة عن حبيبات مادة الورم في الأنبوب. دوامة بسرعة معتدلة للخلط.
  10. ضع العينات في حاضنة 37 درجة مئوية مع دوران سريع لمدة 45 دقيقة. دوامة لفترة وجيزة كل 15 دقيقة.
  11. قم بتصفية كل عينة من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. إذا كانت العينات لزجة جدا بحيث لا يمكن تمريرها عبر المرشح ، أضف 10 مل من وسيط RPMI-1640 لتخفيفه. شطف المرشحات مع وسيط RPMI لجمع الخلايا المتبقية.
  12. استخدم مقياس الدم لحساب الخلايا / مل لكل عينة.
  13. حاصل على نسختين أو أكثر من 5 × 106 خلايا لكل عينة ورم.
  14. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 1000 × جم (4 درجات مئوية). إزالة طاف .
  15. (اختياري) قم بحفظ عينات الورم بالتبريد لتلطيخ DDAOG لاحقا إذا رغبت في ذلك.
    1. أعد تعليق حبيبات الخلايا السرطانية المنفصلة في وسط الحفظ بالتبريد: 50٪ FBS ، 40٪ RPMI-1640 ، 10٪ DMSO ، محضرة في ظروف معقمة عند 5 × 106 خلايا / مل.
    2. حاصل 1 مل من معلق الخلية في كل كريوفيال.
    3. تجميد المبردات لمدة 24 ساعة في حاوية تجميد خلايا الأيزوبروبانول عند -80 درجة مئوية ؛ بعد ذلك ، انقله إلى التخزين بالتبريد للنيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل (>1 أسبوع).
    4. عندما يكون التلوين مطلوبا ، قم بإذابة الكريوفيال على الجليد وانتقل إلى تلطيخ DDAOG في القسم 4.
      ملاحظة: قد لا تظل بعض الأورام قابلة للحياة من خلال الحفظ بالتبريد ، ويجب تقييم المرونة لهذه العملية من قبل المستخدم لنموذج الورم محل الاهتمام.
  16. انتقل إلى القسم 4 لتلطيخ DDAOG.

4. تلطيخ DDAOG من SA-β-Gal في عينات الخلايا أو الأورام

  1. قم بتخفيف 1 مليمول من مرق بافيلوميسين A1 بمعدل 1:1,000x إلى وسط DMEM (بدون FBS) للحصول على تركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر.
  2. أضف محلول Baf-DMEM المحضر إلى عينات حبيبات الخلايا (من الخطوة 2.11 أو الخطوة 3.16) لتركيز 1 × 106 خلايا / مل.
    ملاحظة: على سبيل المثال، في حالة استخدام 0.5 × 106 خلايا لكل عينة، أضف 0.5 مل من Baf-DMEM. بالنسبة للأورام ، يمكن تلطيخ 5 × 106 خلايا في 5 مل من Baf-DMEM.
  3. احتضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية (بدون ثاني أكسيد الكربون2) على دوار / شاكر مضبوط بسرعة بطيئة.
    ملاحظة: تجنب حاضنات CO2 لعملية التلوين ، والتي يمكن أن تحمض المحاليل وبالتالي تتداخل مع تلطيخ Baf و DDAOG.
  4. بدون غسيل ، أضف محلول مخزون DDAOG (5 مجم / مل) عند 1: 500x (10 ميكروغرام / مل نهائي) لكل عينة. ماصة للخلط. استبدل على دوار / شاكر عند 37 درجة مئوية (بدون ثاني أكسيد الكربون2) لمدة 60 دقيقة. يحفظ بعيدا عن الضوء المباشر.
  5. أجهزة الطرد المركزي للأنابيب لمدة 5 دقائق عند 1000 × جم عند 4 درجات مئوية. إزالة طاف .
  6. يغسل مع 1 مل من الثلج البارد 0.5٪ BSA لكل أنبوب وماصة للخلط. قم بالطرد المركزي للأنابيب لمدة 5 دقائق عند 1000 × جم عند 4 درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية. كرر هذه الخطوة 2x لغسل الخلايا جيدا. إزالة الطافي والمتابعة.
    ملاحظة: من المهم تنفيذ خطوات الغسيل في الخطوة 4.6 لإزالة DDAOG غير المشقوق ، والذي يمكن أن يظهر انبعاثا مضانا غير مرغوب فيه (460/610 نانومتر).
    ملاحظة: في حالة التلوين المناعي لعلامات سطح الخلية، انتقل إلى القسم 5 أدناه.
  7. (اختياري) تثبيت وتخزين الخلايا الملطخة DDAOG لتحليلها لاحقا
    1. أضف 0.5 مل من الثلج البارد 4٪ بارافورمالدهيد قطرة قطرة إلى كل عينة مغسولة. ماصة للخلط.
    2. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. اغسل الخلايا 2x مع 1 مل من PBS.
    4. تخزين العينات لمدة تصل إلى 1 أسبوع في 4 °C قبل تحليل التدفق الخلوي.
      ملاحظة: بالنسبة للعينات الثابتة، تخطي الخطوة 4.8.
  8. تمييع مخزون Calcein Violet 450 AM (1 mM) عند 1: 1,000x إلى 1٪ BSA-PBS (1 ميكرومتر نهائي). أضف 300 ميكرولتر (لعينات الخلايا المستزرعة) أو 1000 ميكرولتر (لعينات الورم) إلى كريات الخلايا المغسولة من الخطوة 4.6. احتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد في الظلام.
  9. انتقل إلى إعداد قياس التدفق الخلوي (القسم 6).

5. (اختياري) تلطيخ مناعي لعلامات سطح الخلية بالاشتراك مع DDAOG

ملاحظة: كما هو الحال مع أي تجربة لقياس التدفق الخلوي ، يجب إعداد عينات التحكم أحادية اللون مع DDAOG فقط والجسم المضاد الفلوري فقط لتحديد الحديث المتبادل (إن وجد) عبر قنوات التألق. إذا لوحظ الحديث المتبادل ، فيجب إجراء تعويض قياس التدفق الخلوي القياسي20.

  1. أعد تعليق كريات الخلية التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.6 في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ (1٪ BSA في 1x PBS).
  2. أضف كاشف حجب مستقبلات Fc المناسب لأنواع الخلايا (الفأر أو الإنسان) عند المعايرة بالتحليل الحجمي الموصى بها من قبل الشركة المصنعة. احتضان لمدة 10 دقائق عند 24 درجة مئوية.
  3. أضف الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور عند المعايرة بالتحليل الحجمي الموصى بها من قبل الشركة المصنعة (أو التي يحددها المستخدم). احتضان لمدة 20 دقيقة على الجليد ، محمية من الضوء.
  4. أجهزة الطرد المركزي للأنابيب لمدة 5 دقائق عند 1000 × جم عند 4 درجات مئوية. إزالة طاف .
  5. اغسل ب 1 مل من محلول الغسيل المثلج البارد (0.5٪ BSA-PBS) لكل أنبوب وماصة للخلط. قم بالطرد المركزي للأنابيب لمدة 5 دقائق عند 1000 × جم عند 4 درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية. كرر هذه الخطوة 2x لغسل الخلايا جيدا.
  6. قم بتخفيف 1 مللي متر من بنفسجي الكالسيين 450 صباحا الساعة 1:1000 مرة إلى 1٪ BSA-PBS. أضف 300 ميكرولتر إلى كريات الخلايا المغسولة من الخطوة 5.5. احتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد في الظلام.
  7. انتقل إلى تحليل قياس التدفق الخلوي (الأقسام 6-7).

6. إعداد مقياس التدفق الخلوي والحصول على البيانات

  1. نقل عينات الخلية إلى أنابيب متوافقة مع أداة قياس التدفق الخلوي. ضع الأنابيب على الثلج واحتفظ بها محمية من الضوء.
    ملاحظة: إذا لوحظت الركام في معلقات الخلية، مرر المعلق عبر مصافي الخلايا 70-100 ميكرومتر قبل التحليل. لا تستخدم مصافي 40 ميكرومتر لأنها يمكن أن تستبعد بعض الخلايا الهرمة الأكبر.
  2. في البرنامج المشار إليه (انظر جدول المواد) ، افتح المؤامرات التالية: 1) مخطط نقطة FSC-A مقابل SSC-A ، 2) الرسم البياني للقناة البنفسجية ، 3) القناة الحمراء البعيدة (على سبيل المثال ، APC-A) مقابل القناة الخضراء (على سبيل المثال ، FITC-A) مخطط نقطة.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام مخططات الاستبعاد المزدوج والمدرج التكراري أحادي القناة ولكنها ليست مطلوبة بشكل صارم.
  3. بدء الحصول على بيانات مقياس الخلايا.
    1. ضع عينة التحكم في السيارة فقط الملطخة ب DDAOG على منفذ السحب. بسرعة دخول منخفضة ، ابدأ في الحصول على بيانات العينة.
    2. اضبط الفولتية FSC و SSC بحيث يتم احتواء >90٪ من الأحداث داخل المؤامرة. إذا كانت الخلايا لا تتناسب بشكل جيد مع قطعة الأرض ، فقم بخفض إعداد قياس المنطقة إلى 0.33-0.5 وحدة.
    3. قم بإزالة عينة السيارة فقط دون تسجيل البيانات.
    4. (اختياري) أضف قطرة واحدة من الكريات المجهرية لمعايرة قوس قزح إلى أنبوب مقياس الخلايا مع 1 مل من PBS. ضع الأنبوب على منفذ سحب مقياس الخلايا. البدء في الحصول على عينة من البيانات.
    5. اضبط فولتية القناة البنفسجية والخضراء والحمراء البعيدة بحيث تكون القمة العليا للكرة المجهرية قوس قزح في حدود 10 4-10 5 وحدات من التألق النسبي في كل قناة ويتم فصل جميع القمم جيدا في كل قناة. سجل 10000 حدث. قم بإزالة الأنبوب.
  4. ضع عينة التحكم الإيجابية (على سبيل المثال ، BLM ، ETO) ملطخة ب DDAOG على منفذ السحب. بسرعة منخفضة ، احصل على عينة من البيانات. راقب الأحداث في قنوات FSC و SSC والبنفسجي والأخضر والأحمر البعيد لضمان احتواء أكثر من 90٪ من الأحداث داخل جميع المؤامرات. ابحث عن زيادة في إشارة التركيز البؤري التلقائي و DDAOG مقابل التحكم في السيارة فقط.
  5. في حالة استخدام مقياس فرز خلوي ، ابدأ الفرز في هذه الخطوة.
    1. لأغراض حفظ السجلات ، سجل 10000 خلية لعينة التحكم وكل عينة تم فرزها.
    2. قم بفرز الكمية المطلوبة من الخلايا (عادة ما يكون ≥1 × 106 مناسبا) في أنبوب تجميع مناسب للأداة مع 3-5 مل من وسط الاستزراع.
    3. بعد الفرز ، انتقل إلى ثقافة أو تحليل المصب.
    4. انتقل إلى القسم 7 للتحليل الروتيني للعينات التي تم فرزها.
  6. في حالة استخدام الأجسام المضادة الفلورية ، قم بتحسين جهد القناة هنا باستخدام العينات غير الملوثة والمفردة والمزدوجة الملطخة المحضرة في القسم 5.
    ملاحظة: بالنسبة لمقياس التدفق الخلوي المعاير المستخدم هنا ، تنخفض الفولتية المثلى للقناة عادة بين 250 و 600 (متوسط المدى) ، لكن الفولتية المثلى ونطاقات جهد القناة ستختلف عبر الأجهزة. تجنب استخدام الفولتية في نطاقات منخفضة جدا أو عالية ، والتي قد تمنع الإشارة أو تضخم الضوضاء.
  7. بعد إكمال الخطوات 6.1-6.5 وإجراء تعديلات على إعدادات مقياس الخلايا حسب الضرورة، قم بتسجيل البيانات لجميع العينات. تأكد من أن الإعدادات تظل موحدة لجميع تسجيلات العينات. سجل ≥10000 حدث لكل عينة خلية مستزرعة أو ≥100000 حدث لكل عينة خلية ورمية.
    ملاحظة: على الرغم من أنه يمكن إجراء البوابات والتحليل باستخدام برنامج الحصول على البيانات (على سبيل المثال ، FACSDiva) ، إلا أن سير عمل البوابات والتحليل الكامل الذي سيتم إجراؤه بعد الاستحواذ باستخدام برنامج تحليل منفصل (FlowJo) موصوف في القسم 7 أدناه. يفضل تحليل ما بعد الاستحواذ لتقليل الوقت في محطة عمل مقياس الخلايا والاستفادة من الأدوات الإضافية المضمنة في برنامج التحليل المخصص.
  8. احفظ عينة البيانات بتنسيق ملف .fcs. قم بتصدير الملفات إلى كمبيوتر محطة عمل مزود ببرنامج تحليل قياس التدفق الخلوي (على سبيل المثال ، FlowJo). انتقل إلى القسم 7.

7. تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي

ملاحظة: يستخدم سير العمل المقدم برنامج FlowJo. يمكن استخدام برنامج تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي البديل إذا تم اتباع الخطوات الرئيسية الموضحة في هذا القسم بالمثل.

  1. باستخدام برنامج FlowJo، افتح ملفات بيانات .fcs من الخطوة 6.7.
  2. افتح نافذة التخطيط.
  3. اسحب جميع العينات وأفلتها في نافذة التخطيط.
  4. بوابة الخلايا القابلة للحياة.
    1. انقر نقرا مزدوجا أولا على عينة البيانات لعنصر التحكم في السيارة فقط لفتح نافذة البيانات الخاصة به.
    2. تصور البيانات كمدرج تكراري للقناة البنفسجية. حدد الخلايا القابلة للحياة الملطخة ب CV450 بناء على تألقها الأكثر إشراقا من الخلايا الميتة.
    3. ارسم بوابة باستخدام أداة الرسم البياني أحادي البوابة لتضمين الخلايا القابلة للحياة فقط. اسم البوابة قابلة للحياة.
    4. بعد ذلك ، من نافذة تخطيط العينة ، اسحب البوابة القابلة للحياة إلى عينات الخلايا الأخرى لتطبيق البوابة بشكل موحد.
    5. في نافذة التخطيط ، تصور جميع العينات كرسوم بيانية للقناة البنفسجية (الجدوى). تحقق من أن بوابة الخلايا القابلة للحياة مناسبة عبر العينات قبل المتابعة ؛ إذا لم يكن كذلك ، فقم بإجراء التعديلات حسب الحاجة.
      ملاحظة: يمكن أن يظهر تلطيخ الجدوى اختلافات عبر العلاجات أو الأورام.
  5. بوابة الخلايا الهرمة.
    1. انقر نقرا مزدوجا فوق بيانات الخلية القابلة للتطبيق المسورة للتحكم في السيارة فقط لفتح نافذة البيانات الخاصة بها.
    2. تصور البيانات كمخطط نقطي للقناة الحمراء البعيدة (DDAOG) مقابل القناة الخضراء (AF).
    3. ارسم بوابة باستخدام أداة بوابة المستطيل لتضمين <5٪ من الخلايا التي هي DDAOG+ و AF + (الربع الأيمن العلوي). اسم البوابة الشيخوخة.
    4. بعد ذلك ، من نافذة تخطيط العينة ، اسحب بوابة الشيخوخة إلى المجموعات الفرعية القابلة للتطبيق لعينات الخلايا الأخرى لتطبيق البوابة بشكل موحد.
    5. في نافذة التخطيط ، اسحب وأفلت جميع المجموعات الفرعية للخلايا القابلة للتطبيق في القسم 7.4. تصور جميع العينات القابلة للحياة على أنها مخططات نقطية حمراء بعيدة (على سبيل المثال ، APC-A) مقابل قناة خضراء (على سبيل المثال ، FITC-A).
    6. تأكد من أن بوابة الشيخوخة المرسومة في الخطوة 7.5.3 مرئية على جميع قطع الأراضي وأن بوابة التحكم في السيارة فقط تظهر خلايا شيخوخة ≤5٪ -10٪.
  6. بمجرد تحديد النسبة المئوية للخلايا الهرمة باستخدام الخطوات المذكورة أعلاه ، قدم البيانات الناتجة باستخدام مخططات FlowJo ، ملخصة في جدول بيانات و / أو تم تحليلها إحصائيا باستخدام برنامج قياسي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم إجراء العديد من التجارب لإثبات قابلية مقارنة DDAOG ب X-Gal و C12-FDG للكشف عن الشيخوخة بواسطة SA-β-Gal. أولا ، تم استخدام X-Gal لتلطيخ خلايا سرطان الجلد B16-F10 الهرمة التي يسببها ETO (الشكل 2 أ). تطور لون أزرق مكثف في مجموعة فرعية من الخلايا المعالجة ب ETO ، بينما أظهرت الخلايا الأخرى تلطيخا أزرق أقل كثافة. تم توسيع التشكل في معظم الخلايا المعالجة ب ETO. أظهر تلطيخ الخلايا المعالجة ب ETO باستخدام الركيزة الفلورية SA-β-Gal C12-FDG (أخضر) أو DDAOG (أحمر بعيد) أنماط تلطيخ مماثلة واختلافات في الشدة مع X-Gal (الشكل 2 ب). ومع ذلك ، تداخل انبعاث C 12-FDG الأخضر مع AF الخلوي (الشكل 2C) ، والذي من المعروف أنه يتراكم في الخلايا الهرمة17. في المقابل ، كان AF ضئيلا في نطاق الانبعاثات الأحمر البعيد ل DDAOG.

بدلا من استخدام المجهر الفلوري لتسجيل الخلايا الهرمة وعدها ، كان من الأنسب الاستفادة من القدرات عالية الإنتاجية لمقياس التدفق الخلوي للحصول على بيانات لآلاف الخلايا لكل عينة في وقت قصير (<5 دقيقة لكل عينة). أولا ، تم تنفيذ سلسلة من معلمات إعداد قياس التدفق الخلوي القياسي لضمان الحصول على البيانات المثلى (الشكل 3). باتباع نهج نموذجي ، تم تعيين معلمات تشتت الضوء لتصور الحجم (التشتت الأمامي ، FSC) والدقة (التشتت الجانبي ، SSC) للخلايا (الشكل 3 أ). هنا ، لاحظنا اتجاه زيادة حجم الخلايا المعالجة ب ETO ، والتي تتفق مع التشكل الموسع الذي لوحظ عادة للخلايا الهرمة باستخدام الفحص المجهري. كان من الضروري تقليل إعدادات قياس المنطقة الافتراضية (إلى 0.33-0.50 وحدة اعتمادا على نوع الخلية والمعالجة) لتصور المزيد من الخلايا الأكبر على قطعة الأرض. بالنسبة لبعض خطوط / علاجات الخلايا ، كانت زيادة الدقة (SSC) واضحة أيضا (البيانات غير معروضة). بشكل عام ، تم استخدام تقييم التشتت كخطوة لمراقبة الجودة للتحقق من ظهور بيانات تشتت الخلايا كما هو متوقع ، وعدم وجود حطام خلوي مفرط ، ومعالجة الخلايا من خلال مقياس الخلايا بمعدلات تدفق مناسبة (~ 100-1000 خلية / ثانية). كخطوة لمراقبة الجودة تستخدم فقط لإعداد الأداة ، لم يتم إجراء أي بوابة أو تحليل هنا.

كانت الخطوة الثانية (الاختيارية) في إعداد قياس التدفق الخلوي هي التحليل الموجز لعينة من جزيئات معايرة "قوس قزح" المتاحة تجاريا لضمان ضبط جهد الكشف عن الفلورسنت في نطاقات مقبولة (الشكل 3 ب). تم تعيين ألمع قمة بين 1 × 104 وحدات و 1 × 105 وحدات من شدة الفلورسنت النسبية في كل قناة ، مع قمم منخفضة الكثافة محددة بوضوح ، وفصل كاف بين كل قمة ، وعدم تداخل القمم المجاورة. تم تسجيل عينة تحكم من 10000 كرة مجهرية باستخدام إعدادات الجهد هذه. ثم تم استخدام الكريات المجهرية بهذه الطريقة في كل جلسة قياس خلوي لتحسين توحيد الحصول على البيانات على مدار البروتوكول.

بعد ذلك ، تم تصور عينات من الخلايا المركبة فقط أو المعالجة ب ETO في كل قناة فلورية ، وتم ضبط البوابات. تم تعيين بوابات صلاحية الخلية بناء على إشارة صبغة صلاحية CV450 في القناة البنفسجية (الشكل 3C). أظهرت الخلايا المعالجة بالمركبات فقط قابلية بقاء بنسبة 88٪ ، وأظهرت الخلايا المعالجة ب ETO قابلية للحياة بنسبة 75٪ (في عينة الخلية النهائية ؛ من المحتمل أن تكون الخلايا الميتة الإضافية قد أزيلت في البداية في وسائط المزرعة المهملة وتفككت ميكانيكيا أثناء عملية التلطيخ). بعد ذلك ، تم تصور خلايا مسورة قابلة للحياة في قنوات الانبعاث الخضراء (الشكل 3D) والحمراء البعيدة (الشكل 3E). تم ضبط بوابات AF HI الخضراء و DDAOGHI باللون الأحمر البعيد على <5٪ من الخلايا المخصصة للمركبة فقط ، ثم تم تطبيق هذه البوابات على الخلايا المعالجة ب ETO. باستخدام هذا النهج ، تم تحديد أن 46٪ من الخلايا المعالجة ب ETO كانت AF HI و 33٪ كانت DDAOGHI. كانت هذه القيم في النطاق المتوقع بناء على الأدبيات ومن نتائج العديد من التجارب المكررة في مختبرنا. بمجرد اكتمال إعداد مقياس الخلايا، تم تشغيل جميع عينات الخلايا في التجربة باستخدام إعدادات متطابقة للحصول على البيانات. تم الحصول على بيانات ل 10000 حدث لكل عينة.

تظهر بيانات الفحص التمثيلي في الشكل 4. تم استخدام خلايا سرطان الجلد الفئران B16-F10 أو خلايا الورم الغدي الرئوي البشري A549 كنماذج لخط الخلايا السرطانية. تم علاج كل خط خلية بعامل علاج كيميائي معروف بالحث على الشيخوخة (ETO أو BLM) لمدة 4 أيام للحث على الشيخوخة أو السيارة فقط. علاوة على ذلك ، تمت إضافة عامل senolytic المعروف ABT-26321 إلى الخلايا الهرمة المستحثة لمدة يومين لإثبات خصوصية مسبار DDAOG. تم إعداد عينات ABT-263 فقط كضوابط إضافية. هنا ، يتم تصور البيانات كمخططات نقطية ثنائية الأبعاد مع DDAOG (انبعاث 670 نانومتر) مقابل AF (525 نانومتر). تم استخدام سير العمل من الشكل 3 لإعداد مقياس الخلايا ، وتم تعيين بوابة TIS بحيث يتم تسجيل <5٪ من خلايا السيارة فقط على أنها TIS. أظهرت النتائج باستخدام خلايا B16-F10 (الشكل 4 أ) أن ETO المستحث TIS في 35٪ من خلايا B16-F10 القابلة للحياة (على غرار البيانات المقارنة الموضحة في الشكل 2D ، E) وعامل senolytic قضى تماما تقريبا على خلايا TIS (<2٪). في خلايا A549 (الشكل 4B) ، تسبب BLM في TIS في 66٪ من الخلايا القابلة للحياة ، وخفض ABT-263 النسبة المئوية إلى 15٪. لم يكن ABT-263 وحده ساما للخلايا غير المعالجة والمتكاثرة.

كما سعينا إلى إثبات أن التلوين المشترك للأجسام المضادة الفلورية كان متوافقا مع مقايسة الشيخوخة DDAOG لتسهيل فحص العلامات السطحية المرتبطة ب TIS أو الجديدة. هنا ، تم علاج خلايا سرطان الجلد في الفأر B16-F10 مرة أخرى باستخدام ETO (أو السيارة) التي تحفز TIS لمدة 4 أيام. بعد ذلك ، تم تلطيخ الخلايا ب DDAOG لتقييم TIS وبجسم مضاد فلوري للكشف عن علامة السطح المرتبطة ب TIS DPP422 (الشكل 5). تم استخدام مضاد DPP4 المترافق مع R-phycoerythrin (PE) ، وأكدنا تداخلا ضئيلا بين PE و DDAOG و AF على مقياس التدفق الخلوي المستخدم (الشكل التكميلي S2). أظهر الرسم البياني لبيانات قناة PE (الشكل 5A) ل >5000 خلية قابلة للحياة أن 42٪ من الخلايا المعالجة ب ETO كانت DPP4 + (باستخدام عينة السيارة فقط لتعيين بوابة الإيجابية). أشار تصور المخططات النقطية ثنائية الأبعاد لنفس العينات (الشكل 5B ، C) إلى أن 44٪ من الخلايا المعالجة ب ETO كانت إيجابية مزدوجة ل DDAOG (أي شيخوخة) و DPP4 مقابل 4٪ من الخلايا التي تحتوي على مركبة فقط. توضح هذه البيانات أن تلطيخ الخلايا الحية بالأجسام المضادة لعلامات السطح ممكن مع مقايسة شيخوخة DDAOG.

تشمل المخاوف المحتملة مع أي طريقة تلطيخ الخلايا الحية موت الخلايا الذي يحدث أثناء جلسات التحليل المطولة (>1 ساعة) وكيفية تلطيخ العينات وتحليلها بكفاءة أكبر عبر العديد من النقاط الزمنية المختلفة (حتى أيام متباعدة). يعالج التثبيت القائم على المذيبات للخلايا الملطخة كلا هذين الشاغلين ، حيث يمكن تثبيت العينات بمجرد تلطيخها ثم تخزينها في الثلاجة حتى تحليلها في دفعة واحدة مستقرة الحرارة. وبالتالي ، اختبرنا ما إذا كان يمكن تثبيت الخلايا الحية الملطخة ب DDAOG بنسبة 100٪ ميثانول أو 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) وتخزينها لمدة تصل إلى أسبوع واحد عند 4 درجات مئوية. بشكل غير مرغوب فيه ، قلل تثبيت الميثانول من إشارة DDAOG وخفض بشكل كبير التركيز البؤري التلقائي (البيانات غير معروضة) ؛ وبالتالي ، ينبغي تجنب استخدام الميثانول كمذيب تثبيت. ومع ذلك ، كان التثبيت باستخدام PFA أكثر نجاحا ، كما هو موضح في الشكل 6 للخلايا الثابتة في 4٪ PFA لمدة 10 دقائق بعد تلطيخها باستخدام DDAOG. مقارنة بعينات التحكم غير الثابتة (الشكل 6 أ ؛ غير المعالجة ، 5٪ و BLM ، 67٪ DDAOGHI AFHI) ، أظهرت العينات الثابتة (الشكل 6 ب) خلفية أعلى قليلا في الخلايا غير المعالجة (9٪) وأيضا نسبة أعلى من الخلايا التي سجلت الشيخوخة في الخلايا المعالجة ب BLM (80٪). شوهد هذا التأثير أيضا في العينات الثابتة المخزنة طوال الليل (الشكل 6C ؛ غير المعالجة ، 12٪ و BLM ، 72٪) وتخزينها لمدة أسبوع واحد عند 4 درجات مئوية (الشكل 6D ؛ 14٪ و 70٪). على الرغم من الزيادات الطفيفة في التألق الناجم عن تثبيت PFA ، كان تحريض الشيخوخة بواسطة BLM لا يزال واضحا في جميع العينات الثابتة مقابل العينة المتطابقة غير المعالجة. علاوة على ذلك ، ظلت الخلايا سليمة في التخزين مع تدهور طفيف فقط بحلول اليوم 7 ، ولم يلاحظ أي تجميع إشكالي. نستنتج أن راحة القدرة على إصلاح وتخزين عينات الخلايا للتحليل الدفعي اللاحق ستبرر تحمل الخلفية الأعلى قليلا الناتجة عن تثبيت PFA ، لا سيما في التجارب مع العديد من العينات أو النقاط الزمنية.

التحدي الشائع في أبحاث الشيخوخة القائمة على الخلايا هو بداية الشيخوخة غير المتجانسة في مجموعات الخلايا. هنا ، نظهر أنه يمكن استخدام DDAOG ل FACS للخلايا الهرمة القابلة للحياة وأن الخلايا المجمعة تعيش في مزرعة لفحوصات المصب في المختبر (الشكل 7). لفرز الخلايا حسب FACS ، تتم معالجة الخلايا وتلطيخها ، كما هو موضح ، وفرزها بواسطة مقياس التدفق الخلوي القادر على FACS باستخدام استراتيجية بوابات DDAOG مقابل AF الموضحة هنا (الشكل 7 أ). نظرا لعدم استخدام مسبار الجدوى هنا بسبب مخاوف السمية طويلة المدى ، فإننا نوصي بإجراء بوابات مبعثرة صارمة قبل بوابة الخلايا الهرمة النهائية (الشكل التكميلي S3) لإزالة الحطام الإيجابي الكاذب من الخلايا التي تم جمعها. هذه هي إجراءات بوابات FACS القياسية التي يجب أن تكون مألوفة للمستخدم ذي الخبرة المتوسطة ويمكن إنشاؤها بسرعة باستخدام برنامج في الجهاز (<10 دقائق).

بعد فرز عينة من خلايا A549 المعالجة ب BLM ، أعدنا الخلايا إلى الثقافة في أطباق قياسية متعددة الآبار لمدة 5 أيام (ن = 6 تكرارات) في 10 × 103 خلايا / سم2. تم طلاء الضوابط غير المصنفة بنفس الكثافة ، ونمت جنبا إلى جنب ، وتم تضمين الخلايا غير المعالجة والمعالجة ب BLM. تمت مراقبة الخلايا يوميا. بالنسبة للخلايا التي تم فرزها ، لم يلاحظ أي موت كبير للخلايا أو عودة إلى التكاثر. ظلت الخلايا المصنفة متناثرة (أي لا تتكاثر) على مدار 5 أيام في الثقافة ، بينما أصبحت الخلايا غير المعالجة والمعالجة ب BLM متقاربة كما هو موضح. في اليوم 5 ، تم تثبيت الخلايا في PFA وتلطيخها بعلامات التشكل والانتشار (الشكل 7 ب). تم الكشف عن التشكل الموسع المميز للخلايا المصنفة من خلال تلطيخ Phalloidin الفلوري للأكتين الخيطي ، مع تلطيخ DAPI لإظهار نوى متضخمة. كانت الخلايا المصنفة كبيرة جدا في القطر (>10 ميكرومتر) مع مظهر دائري مميز. كما هو متوقع ، كشف تلطيخ الأجسام المضادة Ki67 عن فقدان كامل لعلامة الانتشار في العينة التي تم فرزها مقابل خسارة جزئية في العينة المعالجة ب BLM غير المصنفة ، وشوهدت المستويات الطبيعية من Ki67 في العديد من الخلايا في العينة غير المعالجة وغير المصنفة. تم التقاط ثلاث صور على الأقل لكل بئر باستخدام إعدادات تصوير موحدة عبر العينات. يتم عرض الصور التمثيلية (الشكل 7 ب).

أخيرا ، قمنا بتقييم ما إذا كان يمكن تحديد الخلايا الهرمة الناشئة في الأورام الموجودة في الفئران المعالجة بأدوية العلاج الكيميائي باستخدام DDAOG. تم تحفيز أورام الورم الميلانيني B16-F10 في جناح الفئران C57 / BL6 ، والتي تم علاجها بعد ذلك ثلاث مرات (أي ، كل 5 أيام) بالمحلول الملحي فقط (الشكل 8 أ) أو DOX (الشكل 8 ب) أو PLD (الشكل 8 ج). بعد العلاج الثالث ، تعافت الفئران لمدة 7 أيام للسماح بظهور الشيخوخة ثم تم التضحية بها واستئصال الأورام. تم تقسيم الأورام إلى النصف ، مع استخدام نصفها لإعداد شرائح الأنسجة المجمدة لتلطيخ X-Gal (الشكل 8) والنصف الآخر تم فصله إلى معلقات أحادية الخلية وتلطيخها ب DDAOG (الشكل 8 والشكل التكميلي S4). كان تلطيخ X-Gal في الأنسجة ضعيفا إلى حد ما على الرغم من مدة التلوين الطويلة (72 ساعة) ، لكن التلوين الأزرق كان واضحا في أورام DOX و PLD عند الفحص الدقيق ، خاصة في الأورام التي سجلت أيضا نتائج إيجابية للشيخوخة بواسطة مقايسة تدفق DDAOG (الشكل 8B ، C). تم التقاط ثلاث صور على الأقل لكل شريحة مناديل وعرض صور تمثيلية.

بالمقارنة مع X-Gal ، كان DDAOG طريقة أكثر حساسية ودقة لقياس الشيخوخة في الأورام (الشكل 8). لتحليل الورم DDAOG ، تم استخدام الورم المعالج بالمحلول الملحي مع أعلى خلفية مضان لضبط بوابة الشيخوخة عند <5٪ ، بحيث لم تسجل الأورام الأخرى المعالجة بالمحلول الملحي أعلى من 5٪ من الشيخوخة. ثم تم تطبيق بوابة الشيخوخة هذه على خلايا قابلة للحياة من جميع الأورام. تسبب كلا عاملي العلاج الكيميائي في الشيخوخة في بعض الأورام (اثنان من خمسة أورام ل DOX ، وثلاثة من خمسة أورام ل PLD) ، مع نسب مئوية من الخلايا السرطانية الهرمة تتراوح من 3٪ إلى 36٪ لكل ورم. يتم عرض مخططات بيانات قياس الخلايا لجميع الأورام ال 15 في الشكل التكميلي S4 ، ويظهر ملخص لبيانات قياس الخلايا السرطانية في الشكل 8D (n = 5; (*) p < 0.05 مقابل مجموعة التحكم المالحة فقط بواسطة اختبار F للتباين). نستنتج أن قياس التدفق الخلوي DDAOG مقابل AF هو طريقة مقبولة لفحص الأورام وعوامل العلاج الكيميائي لتحريض الشيخوخة في الجسم الحي.

Figure 2
الشكل 2: DDAOG هي بقعة حساسة ومحددة ل SA-β-Gal. (أ) التلوين التقليدي ل SA-β-Gal باستخدام X-Gal يظهر خلايا سرطان الجلد غير المعالجة (يسار) أو ETO (يمين) B16-F10. الشيخوخة الناجمة عن ETO: تظهر الخلايا مورفولوجيا متضخمة وتلطيخ أزرق بسبب انشقاق X-Gal بواسطة SA-β-Gal المرتفع. قضبان المقياس = 10 ميكرومتر. (ب) تلطيخ الفلورسنت ل SA-β-Gal في الخلايا المعالجة ب ETO باستخدام إما C12-FDG (انبعاث 515 نانومتر ، أخضر) أو DDAOG (660 نانومتر ، أحمر). يتشابه توزيع التلوين لكلا المجسين ، مما يشير إلى أن DDAOG يكتشف SA-β-Gal بطريقة مماثلة ل C12-FDG. (ج) تقييم الرجفان الأذيني في الخلايا غير الملوثة والمعالجة ب ETO إما في قناة الانبعاث الخضراء (انبعاث 525 نانومتر ، يسار) أو الأحمر البعيد (660 نانومتر ، يمين). AF من lipofuscin مرتفع في قناة الانبعاثات الخضراء ولا يكاد يذكر في القناة الحمراء البعيدة. وقت التعرض = 2000 مللي ثانية لكل صورة. قضبان المقياس = 10 ميكرومتر. أعيد طبع هذا الرقم من Flor and Kron23. الاختصارات: DDAO = 9H- (1،3-ثنائي كلورو-9،9-ثنائي ميثيل أكريدين-2-واحد) ؛ DDAOG = DDAO-غالاكتوسيد ؛ X-Gal = 5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل-β-د-غالاكتوبيرانوسيد؛ UNT = غير معالج ؛ ETO = إيتوبوسيد ؛ AF = التألق الذاتي ؛ C12-FDG = 5-دوديكانويلامينوفلوريسئين دي β-د-غالاكتوبيرانوسيد ؛ SA-β-Gal = بيتا غالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: إعداد الحصول على بيانات مقياس التدفق الخلوي. (أ) توزيع مخطط التشتت التمثيلي للخلايا. FSC-A هي قراءة لحجم الخلية ، ويشير SSC-A إلى الدقة الخلوية. اللوحة اليسرى ، معالجة السيارة فقط لخلايا A549. اللوحة اليمنى ، علاج ETO للحث على الشيخوخة. لاحظ الاتجاه نحو حجم الخلية الموسع للخلايا المعالجة ب ETO ، بالاتفاق مع التشكل الموسع الواضح من الفحص المجهري. (ب) الاستخدام الاختياري للكريات المجهرية التجارية "قوس قزح" ذات 5 قمم لضبط الفولتية الكاشفة لمقياس الخلايا. في كل قناة مضان مستخدمة ، يجب ضبط الحد الأقصى للذروة ≤1 × 105 وحدات فلورسنت نسبية عن طريق ضبط جهد كاشف مقياس الخلايا أثناء تشغيل العينات. اللوحة اليسرى ، قناة BV421 (البنفسجي) ؛ مركز ، قناة FITC (خضراء) ؛ يمين ، قناة APC (حمراء). يجب أن تظهر قمم الفلورسنت الخمس تباعدا مميزا كما هو موضح. (جيم - ه) بيانات مضان أحادية القناة تمثيلية (C) تلطيخ الجدوى باستخدام صبغة CV450 البنفسجية ؛ د: التألق الذاتي الأخضر للخلايا؛ (ه) إشارة حمراء بعيدة من DDAOG ، تكشف عن SA-β-Gal. مدرج تكراري أغمق اللون ، علاج للمركبة فقط ؛ الرسم البياني لون أفتح ، علاج ETO. يشار إلى بوابات الوالدين فوق كل قطعة أرض. الاختصارات: FSC-A = منطقة ذروة التشتت الأمامية ؛ SSC-A = منطقة ذروة التشتت الجانبية ؛ ETO = إيتوبوسيد ؛ BV421-A = منطقة ذروة قناة البنفسج اللامع 421 ؛ FITC-A = منطقة ذروة قناة إيزوثيوسيانات الفلوريسئين ؛ APC-A = منطقة ذروة قناة allophycocyanin ؛ AF = التألق الذاتي ؛ DDAO = 9H- (1،3-ثنائي كلورو-9،9-ثنائي ميثيل أكريدين-2-واحد) ؛ DDAOG = DDAO-غالاكتوسيد ؛ VEH = مركبة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: بيانات تمثيلية لمقايسة شيخوخة قياس التدفق الخلوي. (أ) خلايا سرطان الجلد الفئران B16-F10 المعالجة بمركبة (أعلى اليسار) فقط ، (أعلى اليمين) ETO ، (أسفل اليسار) ABT-263 (1 ميكرومتر) فقط ، أو (أسفل اليمين) ETO بالإضافة إلى ABT-263. (ب) خلايا الورم الغدي الرئوي البشري A549 المعالجة بمركبة (أعلى اليسار) فقط ، (أعلى اليمين) BLM ، (أسفل اليسار) ABT-263 فقط ، أو (أسفل اليمين) BLM بالإضافة إلى ABT-263. (أ، ب) تحدد البوابات المستطيلة في الأرباع العلوية اليمنى لجميع المؤامرات الخلايا الهرمة (DDAOG HI AFHI). يشار إلى النسبة المئوية للخلايا الهرمة (من إجمالي الخلايا القابلة للحياة لكل عينة) في كل قطعة. الاختصارات: DDAO = 9H- (1،3-ثنائي كلورو-9،9-ثنائي ميثيل أكريدين-2-واحد) ؛ DDAOG = DDAO-غالاكتوسيد ؛ ETO = إيتوبوسيد ؛ BLM = بليوميسين. VEH = مركبة ؛ TIS = الشيخوخة الناجمة عن العلاج. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: التلوين المشترك لمثال علامة سطح الخلية مع مقايسة الشيخوخة. (أ) الكشف المناعي لعلامة الشيخوخة DPP4 على سطح الخلايا المستزرعة B16-F10 القابلة للحياة ؛ برتقالي داكن ، مركبة فقط ؛ برتقالي فاتح ، ETO. (ب، ج) الألواح المركزية واليمنى: خلايا ملطخة بشكل مشترك مع DDAOG ومضادة DPP4: PE. توجد خلايا DDAOG HI DPP4HI داخل بوابات مستطيلة موضحة على المؤامرات ، ويشار إلى النسبة المئوية للخلايا الإيجابية المزدوجة لكل عينة. موضح: خلايا ذات بوابات قابلة للحياة. الاختصارات: DDAO = 9H- (1،3-ثنائي كلورو-9،9-ثنائي ميثيل أكريدين-2-واحد) ؛ DDAOG = DDAO-غالاكتوسيد ؛ ETO = إيتوبوسيد ؛ VEH = مركبة ؛ DPP4 = ديببتيديل ببتيداز 4. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 6
الشكل 6: تثبيت وتخزين عينات الخلايا الملطخة ب DDAOG بعد تلطيخها لتحليلها لاحقا. (أ) التحكم ، عينات غير ثابتة من خلايا A549 الحية إما غير المعالجة (يسار) أو المعالجة ب BLM (يمين) للحث على الشيخوخة ، ثم تلطيخها وتحليلها على الفور باستخدام بروتوكول DDAOG (بدون تثبيت ، اليوم 0). (ب) العينات المحضرة كما في (أ) ثم تثبيتها على الفور في 4٪ بارافورمالدهيد وتحليلها (اليوم 0). (ج) العينات المحضرة كما في (أ) ، مثبتة على الفور في 4٪ بارافورمالدهيد ، وتخزن طوال الليل عند 4 درجات مئوية قبل التحليل. (د) العينات المحضرة كما في (أ) ، ثابتة على الفور ، وتخزن لمدة 7 أيام قبل التحليل. تحدد البوابات المستطيلة في الأرباع العلوية اليمنى لجميع المؤامرات الخلايا الهرمة (DDAOG HI AFHI). يشار إلى النسبة المئوية للخلايا الهرمة في كل قطعة. الاختصارات: TIS = الشيخوخة الناجمة عن العلاج ؛ DDAO = 9H- (1،3-ثنائي كلورو-9،9-ثنائي ميثيل أكريدين-2-واحد) ؛ DDAOG = DDAO-غالاكتوسيد ؛ BLM = بليوميسين. AF = التألق الذاتي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 7
الشكل 7: فرز التدفق الخلوي والتحقق من صحة مجموعات الخلايا الهرمة المخصبة. (أ) بيانات الفرز الخلوي للتدفق تظهر (يسار) عنصر التحكم غير المعالج والملطخ ب DDAOG المستخدم لضبط بوابة فرز الخلايا الهرمة (<5٪ خلايا شيخوخة في منطقة مسورة) و (يمين) العينة المعالجة ب BLM والملطخة ب DDAOG التي تم فرزها باستخدام بوابة الفرز كما هو موضح. (ب) صور مجهرية مضان لخلايا (العمود الأيسر) الملطخة ب Phalloidin-Alexa Fluor 647 (لون كاذب برتقالي) للكشف عن F-actin و DAPI (الأزرق) لتضخيم النوى ، مما يدل على التشكل الموسع للخلايا الهرمة ، أو (العمود الأيمن) الملطخة بالجسم المضاد للأرانب Ki67 و Alexa Fluor 594 المضاد للأرانب للكشف عن فقدان الانتشار في الخلايا الهرمة. الصف العلوي ، الخلايا غير المعالجة وغير المصنفة. الصف الأوسط ، الخلايا المعالجة ب BLM وغير المصنفة. الصف السفلي ، الخلايا المعالجة ب BLM وفرزها. قضبان المقياس = 10 ميكرومتر. الاختصارات: TIS = الشيخوخة الناجمة عن العلاج ؛ DDAO = 9H- (1،3-ثنائي كلورو-9،9-ثنائي ميثيل أكريدين-2-واحد) ؛ DDAOG = DDAO-غالاكتوسيد ؛ BLM = بليوميسين. UNT = غير معالج ؛ DAPI = 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 8
الشكل 8: القياس الكمي للشيخوخة في أورام الفئران المعالجة بأدوية العلاج الكيميائي. تم إنشاء أورام الورم الميلانيني B16-F10 في أجنحة الفئران C67BL / 6 ، والتي تم علاجها بعد ذلك بثلاث جرعات من (A) محلول ملحي أو (B) DOX أو (C) PLD كل 5 أيام بالإضافة إلى أسبوع واحد للسماح بظهور الشيخوخة. تم استئصال الأورام وخفضها إلى النصف. تم تحضير شرائح الأنسجة المجمدة من النصف لتلطيخ X-Gal (الصف العلوي) ، وتم فصل النصف الآخر عن تلطيخ DDAOG (الصف السفلي). في الصور الملطخة ب X-Gal ، تكون الخلايا الزرقاء خلايا شيخوخة SA-β-Gal HI ، بينما تكون المناطق البنية ناتجة عن الميلانين في الأورام. يتم عرض النتائج التمثيلية ل DOX و PLD من ورمين لكل مجموعة أظهرت الشيخوخة. أظهرت جميع الأورام المالحة فقط شيخوخة ضئيلة. (د) القياس الكمي للشيخوخة في الأورام المعالجة بالعقاقير من الفئران. (*) p < 0.05 بواسطة F اختبار التباين ، n = 5 فئران لكل مجموعة. أشرطة الخطأ ، يعني ± SEM. الاختصارات: DDAO = 9H- (1،3-ثنائي كلورو-9،9-ثنائي ميثيل أكريدين-2-واحد) ؛ DDAOG = DDAO-غالاكتوسيد ؛ DOX = دوكسوروبيسين. PLD = دوكسوروبيسين ليبوسومال PEGylated ؛ X-Gal = 5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل-β-د-غالاكتوبيرانوسيد؛ AF = التألق الذاتي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي S1: التركيب الكيميائي لمسبار DDAOG. DDAOG هو مترافق من 7-هيدروكسي-9H- (1،3-ثنائي كلورو-9،9-ثنائي ميثيل أكريدين-2-واحد) وبيتا غالاكتوسيد. عند شقه بواسطة بيتا جالاكتوزيداز ، يظهر منتج الانقسام المتحلل تحولا في انبعاث مضان أحمر بعيد بمقدار 50 نانومتر ، مما يتيح اكتشافه المحدد بإثارة أعلى من 600 نانومتر. الاختصارات: DDAO = 9H- (1،3-ثنائي كلورو-9،9-ثنائي ميثيل أكريدين-2-واحد) ؛ DDAOG = DDAO-غالاكتوسيد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2: المسح الطيفي للحديث المتبادل DDAOG مع القنوات الفلورية الأخرى لمقياس التدفق الخلوي. لتحديد القنوات المتاحة للكشف عن الأجسام المضادة الفلورية ، تم إجراء مسح طيفي على مقياس تدفق خلوي 4 ليزر و 15 قناة باستخدام خلايا A549 المعالجة ب BLM والملطخة ب DDAOG (أحمر) أو غير ملوث (أسود). تم الحصول على البيانات في كل قناة من مقياس التدفق الخلوي ل 10000 خلية. (أ) قنوات انبعاث الليزر 405 نانومتر: من اليسار إلى اليمين ، BV421 و BV510 و BV605 و BV660 و BV711. الحديث المتبادل الذي لوحظ في قنوات BV605 و BV660 و BV711 يجعلها غير مناسبة للتلطيخ المشترك مع DDAOG دون تعويض. BV421 و BV510 مناسبان للتلطيخ المشترك (لاحظ أن BV421 يستخدم عادة لتلطيخ الجدوى). (ب) قنوات انبعاث الليزر 488 نانومتر: FITC و PerCP-Cy5. لوحظ ارتفاع الحديث المتبادل لقناة PerCP-Cy5. FITC مناسب للتلطيخ المشترك ؛ ومع ذلك ، لاحظ أن قناة FITC تستخدم عادة في مقايسة DDAOG لتقييم الانبعاثات الخضراء AF. (ج) قنوات انبعاث الليزر 561 نانومتر: PE و PE-Dazzle 594 و PE-Cy5 و PE-Cy5.5 و PE-Cy7. قنوات PE و PE-Dazzle 594 مناسبة للكشف عن الأجسام المضادة الموسومة بهذه الفلوروفورات (تم توضيح PE للكشف عن DPP4 في هذه الدراسة). (د) قنوات انبعاث الليزر 640 نانومتر: APC و APC-H700 و APC-Cy7. تظهر إشارة DDAOG للخلايا الهرمة في قناة APC (47.8٪ شيخوخة). تتداخل الإشارة مع قنوات APC-H700 و APC-Cy7 ، مما يجعلها غير مناسبة للتلطيخ المشترك دون تعويض طيفي كبير. الاختصارات: BLM = بليوميسين. BV = البنفسج اللامع. FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات ؛ PerCP = بروتين بيريدينين كلوروفيل ؛ PE = فيكوريثرين ؛ DZ594 = انبهار 594 ؛ APC = ألوفيوسيانين ؛ AF = التألق الذاتي ؛ DDAO = 9H- (1،3-ثنائي كلورو-9،9-ثنائي ميثيل أكريدين-2-واحد) ؛ DDAOG = DDAO-غالاكتوسيد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S3: استراتيجية بوابات الخلايا لفرز الخلايا الهرمة FACS. يمكن أن يتطلب تمرير تعليق الخلايا من خلال مقياس خلوي حساس FACS بوابات إضافية لضمان نقاء الفرز والوظيفة المثلى للأداة. يتم عرض مثال على الإستراتيجية هنا. استراتيجيات أخرى ممكنة اعتمادا على توصيات الشركة المصنعة لمقياس الخلية FACS المستخدم. العمود الأيسر ، التحكم في الخلية المعالجة للمركبة فقط. العمود الأيمن ، خلايا A549 المعالجة ب BLM للحث على فرز الشيخوخة. (أ) FSC-A (حجم الخلية) مقابل SSC-A (حبيبات الخلية) بوابة الخلايا السليمة. تزيل البوابة السليمة حطام الخلية من العينة التي تم فرزها. (ب) بوابة نقاء FSC-A مقابل بوابة نقاء FSC-H ؛ يزيل المزدوجات والحطام. (ج) بوابة نقاء SSC-A مقابل بوابة نقاء SSC-H؛ يزيل المزدوجات والحطام. (د) بوابات للسكان المعنيين باستخدام قناة APC-A (637 نانومتر استثارة، 670 نانومتر ± 30 نانومتر، تستخدم ل DDAOG) مقابل قناة FITC-A (488 نانومتر إثارة، 530 نانومتر ± 30 نانومتر، تستخدم للتركيز البؤري البؤري)؛ يزيل التحف تلطيخ ممكن. ه: بوابة الخلايا الشائخة للفرز النهائي. الاختصارات: FACS = فرز الخلايا المنشط بالتألق ؛ BLM = بليوميسين. FSC-A = منطقة ذروة التشتت الأمامية ؛ SSC-A = منطقة ذروة التشتت الجانبية ؛ FSC-H = ارتفاع ذروة التشتت الأمامي ؛ SSC-H = ارتفاع ذروة التشتت الجانبي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S4: تلطيخ الخلايا بتدفق الشيخوخة DDAOG للأورام. بيانات قياس التدفق الخلوي ل ≥50,000 خلية ورمية قابلة للحياة. بوابة الخلية الهرمة ، الربع العلوي الأيمن من كل قطعة. تظهر النسبة المئوية للخلايا السرطانية الهرمة (القابلة للحياة) داخل البوابة. وشملت علاجات الأورام (أ) المالحة فقط. (ب) دوكس؛ و (ج) PLD. عولجت الفئران ثلاث مرات ، مرة واحدة كل 5 أيام ، مع 7 أيام للشفاء للسماح ببداية الشيخوخة قبل التضحية. تم تحليل خمسة أورام لكل حالة. الاختصارات: AF = التألق الذاتي ؛ DDAO = 9H- (1،3-ثنائي كلورو-9،9-ثنائي ميثيل أكريدين-2-واحد) ؛ DDAOG = DDAO-غالاكتوسيد ؛ DOX = دوكسوروبيسين. PLD = دوكسوروبيسين ليبوسومال PEGylated. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

على مدى العقد الماضي أو نحو ذلك ، أصبح قياس التدفق الخلوي منصة فحص أكثر شيوعا في أبحاث السرطان بسبب الشعبية الناشئة لعلم المناعة السرطاني ، وتطوير مقاييس التدفق الخلوي منخفضة التكلفة ، وتحسين مرافق الأجهزة المشتركة في المؤسسات الأكاديمية. أصبحت المقايسات متعددة الألوان قياسية الآن ، حيث تم تجهيز معظم الأدوات الحديثة بمصفوفات بصرية بنفسجية وزرقاء وخضراء وحمراء إلى حمراء بعيدة. وبالتالي ، من المحتمل أن يكون بروتوكول DDAOG هذا متوافقا مع مجموعة واسعة من مقاييس التدفق الخلوي. بالطبع ، يجب تقييم أي مقياس تدفق خلوي من قبل المستخدم. يجب توخي الحذر بشكل خاص عند إضافة فلوروفورات إضافية (على سبيل المثال ، الأجسام المضادة الفلورية والمترافقة) إلى مقايسة DDAOG. يجب إجراء تقييم للحديث المتبادل بين القنوات باستخدام عناصر تحكم أحادية اللون يتم تصورها في جميع القنوات الأخرى ذات الصلة. إذا لوحظ التداخل ، يمكن إجراء التعويض الطيفي20 للتصحيح باتباع الطرق النموذجية.

تهدف النتائج الموضحة هنا في المقام الأول إلى إثبات أن مقايسة قياس التدفق الخلوي DDAOG يمكن أن تنتج نتائج سريعة وكمية وسهلة التفسير ل TIS الناجم عن أدوية العلاج الكيميائي في الخلايا أو الأورام. تم توثيق العوامل المستخدمة هنا ، بما في ذلك ETO 23,24 و DOX 7,25 و BLM26,27 ، للحث على TIS في خطوط الخلايا السرطانية المختلفة 24. لإثبات خصوصية مسبار DDAOG ، تم إثبات عامل senolytic المعروف ABT-26321 للقضاء بشكل انتقائي على الخلايا الهرمة في الثقافة. توضح هذه الورقة استخدام فأر واحد (B16-F10) وخط خلايا سرطانية بشرية واحدة (A549) ، بالإضافة إلى أورام B16-F10 الموجودة في الفئران. ومع ذلك ، يمكن استخدام أي خلايا تعبر عن β-Gal وتحتفظ بالحيوية من خلال إعداد عينة قياس التدفق الخلوي القياسي. قد تكون بعض أنواع الخلايا أكثر هشاشة أو أقل عرضة ل TIS ، ويجب تقييم ذلك قبل الشروع في شاشة كبيرة أو دراسة. إذا تفككت الخلايا أثناء التحضير ، أو كانت الصلاحية ضعيفة ، أو كان TIS أقل بكثير من المتوقع باستخدام عناصر تحكم العامل الإيجابي ، فقد لا يكون نوع الخلية نموذجا مثاليا لدراسات الشيخوخة. يمكن استخدام العوامل وخطوط الخلايا الموضحة هنا من قبل مجموعات أخرى كعناصر تحكم في مزيد من الفحص للعوامل المحتملة التي تحفز TIS أو senolytics الجديدة ، والتي تظل هدفا نشطا في هذا المجال.

يمكن أن تختلف السمية التي تسببها أدوية العلاج الكيميائي باختلاف أنواع الخلايا وتؤثر على نتائج الفحص. إذا كان التأثير الأساسي الملحوظ للعامل و / أو التركيز المستخدم هو موت الخلايا الحاد ، فقد يكون الشيخوخة الإجمالية ضئيلة. في الجسم الحي ، يجب تجنب نخر الورم العالي أو السمية الجهازية في الحيوانات عن طريق خفض جرعة العامل. مفتاح نجاح الفحص هو اختبار مجموعة من تركيزات العوامل ، مع فحص دقيق لبيانات مقايسة الجدوى (على سبيل المثال ، على النحو المنصوص عليه في CV450 داخل مقايسة DDAOG). في المختبر ، إذا انفصلت العديد من الخلايا الميتة عن الصفيحة أثناء العلاج ، بما في ذلك وسط المزرعة في العينة التي تم تحليلها ، فمن المهم تقييم موت الخلايا بشكل إجمالي. CV450 ليست وصمة الجدوى الوحيدة المتوافقة مع هذا الفحص ؛ يمكن استخدام الفلوروفورات البنفسجية / الزرقاء الأخرى الباعثة للوزنج. يمكن أيضا استخدام مجسات الجدوى القابلة للتثبيت إذا كان المستخدم يخطط لإصلاح العينات الملطخة باستخدام PFA ، بشرط ألا يتداخل مضان المسبار بشكل كبير مع DDAOG أو AF (أو يقوم المستخدم بإجراء تعويض طيفي لتصحيح التداخل). في بعض الحالات التي تكون فيها سمية العامل منخفضة والخلايا قوية ، يمكن أن يكون عزل الخلايا السليمة عن طريق تشتت الضوء (FSC مقابل SSC) كافيا لعزل الخلايا "القابلة للحياة" للتحليل.

تتمثل إحدى الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول في المختبر في وضع الخلايا في النطاق الأدنى لكثافة نمو اللوغاريتم (عادة 2 × 10 3-5 × 103 خلايا / سم2) للسماح بالانتشار الأولي السريع ، مما يسهل امتصاص دواء العلاج الكيميائي من قبل معظم الخلايا. بمجرد العلاج ، من المهم أيضا إتاحة الوقت لظهور TIS: في المختبر ، 4 أيام ± 1 يوم في وجود الدواء ؛ في الجسم الحي ، 7 أيام من الشفاء بعد العلاج الكيميائي النهائي. بعد التلوين باستخدام DDAOG كما هو موصوف ، يجب إجراء التحليل الكمي لبيانات القياس الخلوي كما هو موضح ، أي بوابات DDAOG مقابل خلايا AF في كل عينة لتحديد النسبة المئوية للخلايا الهرمة (من إجمالي قابلة للحياة). تشمل الخطوات الاختيارية استخدام الكريات المجهرية لمعايرة "قوس قزح" الفلورية لتوحيد قياس التدفق الخلوي ، وتثبيت PFA للعينات الملطخة ، والتلوين المناعي المشترك للعلامات السطحية ، وفرز التدفق لإثراء الخلايا الهرمة لفحوصات المصب. ومع ذلك ، توفر كل خطوة من هذه الخطوات الاختيارية مزايا رئيسية في تطبيقات معينة. تعمل الكريات المجهرية للمعايرة على توحيد إعداد القياس الخلوي عبر جلسات متعددة وتسمح للمستخدم في البداية بتعيين الفولتية في نطاق مفيد للكشف عن الشيخوخة والجدوى ، مع الحد الأدنى من التعديلات بعد ذلك. تثبيت PFA للعينات يعمل على استقرار الخلايا ويسمح بالتحليل الدفعي لمجموعات كبيرة من الخلايا في وقت لاحق. يمكن استخدام التلوين المناعي المشترك للعلامات السطحية للكشف عن البروتينات الجديدة المرتبطة بالشيخوخة والتفاعلات المناعية. في الدراسات المستقبلية ، نخطط للتحقق من صحة التلوين المشترك لعلامات الشيخوخة داخل الخلايا باستخدام DDAOG.

يسمح فرز خلايا TIS بواسطة FACS بإثراء خلايا TIS القابلة للحياة من المجموعات غير المتجانسة ، والتي يمكن أن تربك قراءات المقايسات النهائية مثل النشاف الغربي أو البروتينات أو النسخ. بعد الفرز ، لم يلاحظ أي سمية كبيرة ل DDAOG في خلايا TIS التي أعيد وضعها في المزرعة لمدة تصل إلى 5 أيام. ومع ذلك ، ينبغي أن يؤخذ في الاعتبار أن الخلايا المصنفة قد عولجت ب Baf ، DDAOG الداخلي (الذي يتم شقه بواسطة SA-β-Gal إلى DDAO ، صبغة أكريدين) ، وتعرضت لضغط ميكانيكي يمر عبر أداة FACS. لذلك ، قد تكون بعض التعديلات البيولوجية غير المرتبطة بالشيخوخة موجودة في الخلايا المصنفة. ومع ذلك ، في هذه الدراسة ، احتفظت الخلايا المصنفة بسمات قوية للشيخوخة وقدمت نتائج بروتينات ونسخ مميزة28 عند مقارنتها بالضوابط غير المصنفة. على الرغم من الفائدة الواضحة إلى حد ما لاستخدام FACS لجمع وتحليل الخلايا الهرمة من الأورام ، نادرا ما تم استخدام هذا الإجراء في الأدبيات. استخدمت بعض المجموعات p16Ink4a luciferase أو مراسلي الفلورسنت لتحديد الخلايا الهرمة في أنسجة الفئران ، مع مراسلي الفلورسنت الذين يمكنون فرز FACS في بعض الدراسات29،30. تتفق النتائج بشكل عام على أنه بغض النظر عن عامل الحث أو نوع الورم ، فإن TIS في الأورام يحدث جزئيا إلى نادر الحدوث ، ونادرا ما يصل إلى 100٪ من الخلايا السرطانية31. يسمح فرز الخلايا FACS باستخدام طريقة DDAOG بسهولة بجمع خلايا TIS النادرة من الأورام ، دون الحاجة إلى التعبير عن التركيبات المعدلة وراثيا.

حاليا ، يتم إجراء معظم أبحاث الشيخوخة في نماذج الفئران خارج الجسم الحي باستخدام مزيج من X-Gal وعلامات الكيمياء الهيستولوجية المناعية32,33. ومع ذلك ، فإن تقييم TIS خارج الجسم الحي باستخدام أنسجة الورم يمكن أن يكون عملية طويلة ، خاصة عند استخدام X-Gal. يتطلب هذا الإجراء حفظ الورم بالتبريد ، والتشريح بالتبريد على الشرائح ، وتلطيخ X-Gal ، وتركيب غطاء الزجاج ، والتجفيف ، والتصوير ، وتسجيل الخلايا "الزرقاء" - وهو نهج متعدد الأيام على الأقل. الكيمياء الهيستولوجية المناعية ليست أسرع أو أسهل بكثير ، ويجب استخدام أقسام الأنسجة المختلفة وتسجيلها لكل علامة بالإضافة إلى X-Gal في كل ورم ، ما لم يتم تحسين التحليل المتعدد ، مما يضيف المزيد من الوقت في الواجهة الأمامية للعملية. أقسام الأنسجة عينة فقط مقطع عرضي رفيع واحد من الورم ، في حين أن الخلايا الهرمة (مثل العديد من أنواع الخلايا) قد يتم توزيعها بشكل غير متساو في الفضاء 3D في جميع أنحاء الأورام29. هناك حاجة ماسة في هذا المجال للابتعاد عن طرق الأنسجة البطيئة التي عفا عليها الزمن نحو اختبار شيخوخة أسرع وقابل للقياس الكمي للأورام. باستخدام قياس التدفق الخلوي DDAOG ، يمكن فصل مجموعة من 15 ورما وتلطيخها للحصول على بيانات شيخوخة كمية قاطعة في أقل من يوم واحد من التدريب العملي بعد حصاد الورم. تمت معالجة نصف الورم لكل عينة ، مما أدى إلى تحسين أخذ عينات من مساحة 3D لكل ورم. يعد نهج قياس التدفق الخلوي DDAOG أسرع بكثير وأكثر موثوقية من الطرق القائمة على شرائح الأنسجة لتقييم TIS في الأورام.

مع مزاياه العديدة على X-Gal وطرق أخرى ، فإننا ندعو إلى بروتوكول DDAOG ليصبح اختبار الشيخوخة القياسي الذهبي الجديد. يستخدم كلا من علامة الشيخوخة المقبولة تقليديا ، SA-β-Gal ، والكشف الخالي من الملصقات للتركيز البؤري التلقائي المرتبط بالعمر كعلامة ثانية. هذه الفلوروفورات متوافقة مع معظم مقاييس التدفق الخلوي القياسية. يتضمن الفحص بقعة صلاحية لاستبعاد الخلايا الميتة والحطام باستخدام عينات تم الحصول عليها بسهولة من خطوط الخلايا المستزرعة المعالجة بالعقاقير أو الأورام. يمكن اختياريا تثبيت عينات الخلايا الحية بالمذيبات أو حفظها بالتبريد لتسهيل التحليل المجمع للدراسات الكبيرة ، على سبيل المثال ، استخدام النقاط الزمنية لتقييم بداية TIS بمرور الوقت باستخدام عوامل متعددة تستغرق عملية التلوين أقل من نصف يوم من العمل المختبري لإكمالها ، وعادة ما يكون الحصول على البيانات <5 دقيقة لكل عينة. تحليل البيانات سريع ومباشر بالمثل ، مما ينتج بيانات كمية عن النسبة المئوية لخلايا TIS لكل عينة دون تسجيل الخلايا وعدها مملة. يمكن فرز العينات بواسطة FACS لاستعادة المجموعات المخصبة من خلايا TIS ، مما يقلل من الضوضاء الناتجة عن عدم التجانس الخلوي في التحليلات النهائية. نعتقد أن مقايسة DDAOG يمكن ، في كثير من الحالات ، أن تحل محل X-Gal ، مما يسهل فحص العوامل التي تحفز TIS و senolytics في المختبر وفي الجسم الحي ، مما يؤدي إلى اكتشافات أسرع وأكثر موثوقية في مجال أبحاث الشيخوخة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عن هذه الدراسة.

Acknowledgments

نشكر المرفق الأساسي لقياس الخلايا والأجسام المضادة في جامعة شيكاغو على الدعم في أجهزة قياس التدفق الخلوي. قدم مركز أبحاث الحيوان في جامعة شيكاغو مساكن للحيوانات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bafilomycin A1 Research Products International B40500
Bleomycin sulfate  Cayman 13877
Bovine serum albumin (BSA) US Biological A1380
Calcein Violet 450 AM viability dye ThermoFisher Scientific 65-0854-39 eBioscience
DPP4 antibody, PE conjugate Biolegend 137803 Clone H194-112
Cell line: A549 human lung adenocarcinoma American Type Culture Collection CCL-185
Cell line: B16-F10 mouse melanoma American Type Culture Collection CRL-6475
Cell scraper Corning 3008
Cell strainers, 100 µm Falcon 352360
DDAO-Galactoside Life Technologies D6488
DMEM medium 1x Life Technologies 11960-069
DMSO Sigma D2438
DNAse I Sigma DN25
Doxorubicin, hydrochloride injection (USP) Pfizer NDC 0069-3032-20
Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP) Sun Pharmaceutical NDC 47335-049-40
EDTA 0.5 M Life Technologies 15575-038
Etoposide  Cayman 12092
FBS Omega  FB-11
Fc receptor blocking reagent Biolegend 101320 Anti-mouse CD16/32
Flow cytometer (cell analyzer) Becton Dickinson (BD) Various LSRFortessa
Flow cytometer (cell sorter) Becton Dickinson (BD) Various FACSAria
GlutaMax 100x Life Technologies 35050061
HEPES 1 M Lonza BW17737
Liberase TL Sigma 5401020001 Roche
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin/Streptomycin 100x Life Technologies 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) 1x Corning MT21031CV Dulbecco's PBS (without calcium and magnesium)
Rainbow calibration particles, ultra kit SpheroTech UCRP-38-2K 3.5-3.9 µm, 2E6/mL
RPMI-1640 medium 1x Life Technologies 11875-119
Sodium chloride 0.9% (USP) Baxter Healthcare Corporation 2B1324
Software for cytometer data acquisition, "FACSDiva" Becton Dickinson (BD) n/a Contact BD for license
Software for cytometer data analysis, "FlowJo" TreeStar n/a Contact TreeStar for license
Trypsin-EDTA 0.25% Life Technologies 25200-114

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy. Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).
  2. Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent cells in cancer therapy: friends or foes. Trends in Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).
  3. Prasanna, P. G., et al. Therapy-induced senescence: Opportunities to improve anticancer therapy. Journal of the National Cancer Institute. 113 (10), 1285-1298 (2021).
  4. Velarde, M. C., Demaria, M., Campisi, J. Senescent cells and their secretory phenotype as targets for cancer therapy. Interdisciplinary Topics in Gerontology and Geriatrics. 38, 17-27 (2013).
  5. Ou, H. L., et al. Cellular senescence in cancer: from mechanisms to detection. Molecular Oncology. 15 (10), 2634-2671 (2021).
  6. Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. Hallmarks of cellular senescence. Trends in Cell Biology. 28 (6), 436-453 (2018).
  7. Bojko, A., Czarnecka-Herok, J., Charzynska, A., Dabrowski, M., Sikora, E. Diversity of the senescence phenotype of cancer cells treated with chemotherapeutic agents. Cells. 8 (12), 1501 (2019).
  8. Mikuła-Pietrasik, J., Niklas, A., Uruski, P., Tykarski, A., Książek, K. Mechanisms and significance of therapy-induced and spontaneous senescence of cancer cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (2), 213-229 (2020).
  9. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  10. Itahana, K., Itahana, Y., Dimri, G. P. Colorimetric detection of senescence-associated β galactosidase. Methods in Molecular Biology. 965, 143-156 (2013).
  11. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  12. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  13. Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
  14. Tung, C. -H., et al. In vivo imaging of β-galactosidase activity using far red fluorescent switch. Cancer Research. 64 (5), 1579-1583 (2004).
  15. Gong, H., et al. beta-Galactosidase activity assay using far-red-shifted fluorescent substrate DDAOG. Analytical Biochemistry. 386 (1), 59-64 (2009).
  16. Terman, A., Brunk, U. T. Lipofuscin: Mechanisms of formation and increase with age. APMIS. 106 (2), 265-276 (1998).
  17. Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging. 5 (1), 37-50 (2013).
  18. Wang, B., Demaria, M. The quest to define and target cellular senescence in cancer. Cancer Research. 81 (24), 6087-6089 (2021).
  19. Appelbe, O. K., Zhang, Q., Pelizzari, C. A., Weichselbaum, R. R., Kron, S. J. Image-guided radiotherapy targets macromolecules through altering the tumor microenvironment. Molecular Pharmaceutics. 13 (10), 3457-3467 (2016).
  20. Maciorowski, Z., Chattopadhyay, P. K., Jain, P. Basic multicolor flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 117, 1-38 (2017).
  21. Fan, Y., Cheng, J., Zeng, H., Shao, L. Senescent cell depletion through targeting BCL-family proteins and mitochondria. Frontiers in Physiology. 11, 593630 (2020).
  22. Kim, K. M., et al. Identification of senescent cell surface targetable protein DPP4. Genes and Development. 31 (15), 1529-1534 (2017).
  23. Flor, A. C., Kron, S. J. Lipid-derived reactive aldehydes link oxidative stress to cell senescence. Cell Death Discovery. 7 (9), 2366 (2016).
  24. Jochems, F., et al. The Cancer SENESCopedia: A delineation of cancer cell senescence. Cell reports. 36 (4), 109441 (2021).
  25. Fallah, M., et al. Doxorubicin and liposomal doxorubicin induce senescence by enhancing nuclear factor kappa B and mitochondrial membrane potential. Life Sciences. 232, 116677 (2019).
  26. Kasper, M., Barth, K. Bleomycin and its role in inducing apoptosis and senescence in lung cells - modulating effects of caveolin-1. Current Cancer Drug Targets. 9 (3), 341-353 (2009).
  27. Muthuramalingam, K., Cho, M., Kim, Y. Cellular senescence and EMT crosstalk in bleomycin-induced pathogenesis of pulmonary fibrosis-an in vitro analysis. Cell Biology International. 44 (2), 477-487 (2020).
  28. Flor, A. C., Wolfgeher, D., Wu, D., Kron, S. J. A signature of enhanced lipid metabolism, lipid peroxidation and aldehyde stress in therapy-induced senescence. Cell Death Discovery. 3, 17075 (2017).
  29. Burd, C. E., et al. Monitoring tumorigenesis and senescence in vivo with a p16(INK4a)-luciferase model. Cell. 152 (1-2), 340-351 (2013).
  30. Liu, J. Y., et al. Cells exhibiting strong p16 (INK4a) promoter activation in vivo display features of senescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2603-2611 (2019).
  31. Wang, L., Lankhorst, L., Bernards, R. Exploiting senescence for the treatment of cancer. Nature Reviews Cancer. 22 (6), 340-355 (2022).
  32. Baek, K. -H., Ryeom, S. Detection of oncogene-induced senescence in vivo. Methods in Molecular Biology. 1534, 185-198 (2017).
  33. González-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Muñoz-Espín, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).

Tags

أبحاث السرطان ، العدد 187 ، الشيخوخة ، السرطان ، العلاج الكيميائي ، قياس التدفق الخلوي ، مسبار الفلورسنت ، تعدد الإرسال
مسبار β-galactosidase المرتبط بالشيخوخة الفلورية الحمراء البعيدة لتحديد وإثراء الخلايا السرطانية الهرمة عن طريق قياس التدفق الخلوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Flor, A., Pagacz, J., Thompson, D.,… More

Flor, A., Pagacz, J., Thompson, D., Kron, S. Far-Red Fluorescent Senescence-Associated β-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (187), e64176, doi:10.3791/64176 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter